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MIKAELA RENATA FUNADA

Avaliação de métodos de extração de DNA de Cryptosporidium

spp. em amostras fecais e comparação da nested PCR com

o método coproparasitológico de centrífugo-flutuação

em sacarose

São Paulo

2009

MIKAELA RENATA FUNADA

Avaliação de métodos de extração de DNA de Cryptosporidium spp. em

amostras fecais e comparação da nested PCR com o método

coproparasitológico de centrífugo-flutuação em sacarose

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para a obtenção de título de Mestre em Medicina Veterinária Departamento: Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal Área de Concentração: Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Martins Soares

São Paulo

2009

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.2099 Funada, Mikaela Renata FMVZ Avaliação de métodos de extração de DNA de Cryptosporidium spp. em

amostras fecais e comparação de nested PCR com o método coproparasitológico de centrífugo-flutuação em sacarose / Mikaela Renata Funada. – São Paulo : M. R. Funada, 2009. 76 f. : il.

Dissertação (mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, 2009.

Programa de Pós-Graduação: Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses.

Área de concentração: Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Martins Soares.

1. Cryptosporidium. 2. Diagnóstico (métodos). 3. DNA (extração). 4. Reação em cadeia polimerase. 5. Fezes. I. Título.

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: FUNADA, Mikaela Renata

Título: Avaliação de métodos de extração de DNA de Cryptosporidium spp. em amostras fecais e comparação da nested PCR com o método coproparasitológico de centrífugo-flutuação em sacarose

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para a obtenção de título de Mestre em Medicina Veterinária

DATA _____/______/______

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. ____________________________________ Instituição:________________

Assinatura:__________________________________ Julgamento:_______________





Dedicatória

Aos meus pais Yukio Funada e

Luiza Izuko Funada, pelo carinho e atenção dedicados à minha formação,

direcionado-me na honra, determinação e trabalho

Ao meu esposo Márcio Ribeiro Barbosa, Ser admirável, de coração grandioso. Por fazer parte de minha vida, enchê-la de sonhos e alegrias. Por toda compreensão e paciência.

E desde então, sou porque tu és

E desde então és Sou e somos... E por amor...

Serei... Serás... Seremos... (Pablo Neruda)

Agradecimentos especiais

A DEUS, por ter-me concedido a oportunidade, dentre tantos, de participar de um curso de excelência, dando-me saúde para completá-lo, dando-me paciência

para entendê-lo, não necessitando em nenhum momento humilhar-me, ser desonesta ou abdicar-me de minha honra.

Ao Prof. Rodrigo Martins Soares, pelas oportunidades de aperfeiçoamento profissional,

pelos ensinamentos, incentivos, pela confiança em meu trabalho,

por todo esforço desprendido nesta orientação.

A Profa Solange Maria Gennari, pela oportunidade de ingresso na Parasitologia,

pela confiança, carinho e atenção.

Exemplos de pessoas e profissionais, meus sinceros agradecimentos e eterna admiração.

Agradecimentos

À Dra Hilda Fátima de Jesus Pena, pela amizade e por ter contribuído de forma expressiva em

minha formação profissional na área da Parasitologia.

Ao Prof. Leonardo José Richtzenhain, pela confiança, oportunidade de aprendizado e colaboração

na realização deste trabalho pelo uso do Laboratório de Biologia Molecular Aplicada e Sorologia.

À Dra Adriana Cortez, pela amizade e valiosos ensinamentos em Biologia Molecular.

Ao Prof. Marcelo Vasconcelos Meireles da Universidade Estadual Paulista, pelas sugestões e

participação na banca examinadora.

Ao Prof. Paulo Eduardo Brandão, pelos ensinamentos e disponibilidade em auxiliar prontamente

sempre que precisei.

A todos os demais professores do VPS, em especial, ao Prof. Silvio Arruda Vasconcelos, pelo esforço

no aprimoramento do curso de pós-graduação.

À Profa Alda M. B. N. Madeira e à pós-graduanda Alessandra P. S. Manha do Instituto de Ciências

Biomédicas, pelos esclarecimentos e contribuição material.

Aos Professores Maria Helena Matté e Glavur Rogério Matté, às pós-graduandas Ronalda Silva de

Araújo e Licia Natal Fernandes do Departamento de Prática de Saúde Pública da Faculdade de

Saúde Pública da USP, pelos esclarecimentos, sugestões e contribuição material.

Ao Prof. Eliseu Alves Waldman do Departamento de Epidemiologia da Faculdade de Saúde Pública

da USP, por permitir minha participação em sua disciplina e pelos valiosos ensinamentos.

A Anaiá da Paixão Sevá, Patrícia de Lucca, Leandra Ribeiro Ferreira, Silvio Luís Pereira de Souza,

Helena Arantes, Renata Molina Monteiro, Vanessa Muradian, Lúcia Eiko Oishi Yai,

Alexandre Thomaz, pela amizade e por me auxiliarem sempre que precisei.

À pós-graduanda Tânia Alén Coutinho, pela amizade, auxílio e esclarecimentos nos procedimentos

laboratoriais.

À Sheila Oliveira Souza pelo apoio e sequenciamento das amostras.

Ao José Márcio Sbruzi Cardoso pela amizade e coleta de amostras.

Aos funcionários Renato Caravieri e Pedro César Ferreira, pelo agradável convívio e fundamental

auxílio nos trabalhos.

À Médica Veterinária Marta Brito Guimarães e Profa Lílian Rose Marques de Sá do Departamento

de Patologia.

Aos funcionários da secretaria do VPS, Maria Cristina Paick, Danival Lopes Moreira, Ana Virgínia

P. A. Prado e Tânia Delonero.

Aos funcionários da secretaria de pós-graduação da FMVZ-USP, Cláudia Lima, Dayse M. A. Flexa e

Joana F. D. Vasconcelos.

Aos funcionários da Biblioteca, especialmente à Elena do atendimento e à Elza Maria Rosa

Bernardo Faquim pelo auxílio na revisão da dissertação.

A todos os demais funcionários do VPS.

Aos demais amigos do Laboratório de Doenças Parasitárias, pelo alegre e agradável convívio: Aldo

Francisco Alves Neto, Alex Akira Nakamura, Alessandra Mara Alves Ragozo, Aline A. R. Rodrigues,

Andreas Lazaros Chryssafidis, Daniela Pontes Chiebáo, Eliana M. C. Villalobos, Estela Gallucci

Lopes, Fernanda Sartori Lima de Godoi, Guacyara Tenório Cavalcanti, Juliana Martins, Luciana

Bandini, Luciana Nunes de Oliveira, Luciana Viero da Silva, Luciane Holsback Silveira, Michelle

Klein Sercundes, Patrícia de Oliveira Esmerini, Sandra Mayumi Nichi e Tatiana E. H. Ueno.

Ao Prof. Marcelo Bahia Labruna e aos (ex) pós-graduandos Adriano Pinter dos Santos, Alexandre

Camargo Ataliba, Daniel Moura Aguiar, Elisangela (Lili), Fernanda A. N. Bastos, Guilherme Sakae

Sabatini, Iara Silveira, Jonas Moraes Filho, Maria H. Ogrzewalska, Maurício Claudio Horta, Ricardo

Ramos Cabrera, Richard Campos Pacheco, Simone Rosa, Thaís B. Saito e Thiago Fernandes

Martins.

Aos demais amigos do VPS, Carlos Augusto S. Oliveira, Clarisse, Daniela Carvalho Ribeiro, Enio

Mori, Flávia C. S. Oliveira, Giselle Ayres Razera, Iracema Nunes de Barros, Karen Miyuki Asano,

Lara Borges Keid, Márcio Pinotti Guirao, Maria del Pilar Vejarano Ruibal, Marianna Matrone,

Renata Paixão, Renata Pucci, Rosely Bianca dos Santos, Sibele Pinheiro de Souza, Thaisa Lucas

Sandri, Vanessa Riesz Salgado, Vivianne C. M. Rocha.

Aos pós-graduandos Jorge Luis Chacón e Luciana Cintra do Departamento de Patologia.

A Suzi, Chico, Pinho e Sara, pelo companheirismo e amor incondicionais.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo auxílio financeiro e

concessão da bolsa de mestrado (Processo 06/58352-6).

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa auxílio.

Muito obrigada.

Poema da paz O dia mais belo? Hoje A coisa mais fácil? Equivocar-se O obstáculo maior? O medo O erro maior? Abandonar-se A raiz de todos os males? O egoísmo A distração mais bela? O trabalho A pior derrota? O desalento Os melhores professores? As crianças A primeira necessidade? Comunicar-se O que mais faz feliz? Ser útil aos demais O mistério maior? A morte O pior defeito? O mau humor A coisa mais perigosa? A mentira O sentimento pior? O rancor O presente mais belo? O perdão, O mais imprescindível? O lar A estrada mais rápida? O caminho correto A sensação mais grata? A paz interior O resguardo mais eficaz? O sorriso O melhor remédio? O otimismo A maior satisfação? O dever cumprido A força mais potente do mundo? A fé As pessoas mais necessárias? Os pais A coisa mais bela de todas? O amor. (Madre Teresa de Calcutá)

RESUMO

FUNADA, M. R. Avaliação de métodos de extração de DNA de Cryptosporidium spp. em amostras fecais e comparação da nested PCR com o método coproparasitológico de centrífugo-flutuação em sacarose. [Evaluation of DNA extraction methods of Cryptosporidium spp. in feces and comparison of nested PCR with sucrose centrifugal flotation method]. 2009. 76 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009.

O desempenho de seis métodos de extração de DNA de oocistos de Cryptosporidium spp.

em fezes foram avaliados pela nested PCR do gene SSU rRNA. Os métodos consistem na

combinação com pequenas variações de duas técnicas para a liberação de esporozoítos

(indução de excistamento/E ou choque térmico/C) e três técnicas de purificação de DNA

(fenol-clorofórmio/F, GuSCN-sílica/S ou kit QIAmp DNA Stool Mini/K). Para a

avaliação da sensibilidade analítica, os testes foram realizados a partir de diluições

seriadas de oocistos purificados, na ausência e na presença de 100 μl de fezes bovinas. A

sensibilidade diagnóstica foi avaliada pela comparação com o método microscópico de

centrífugo-flutuação em sacarose (padrão-ouro) em 15 amostras fecais de diferentes

hospedeiros naturalmente infectados. Na ausência de fezes, foram avaliados apenas os

métodos EF, ES, CF e CS, sendo que EF apresentou sensibilidade analítica superior,

possibilitando a detecção de até 1 oocisto. Na presença de fezes, os métodos EF, EK e CK

apresentaram desempenhos equivalentes, com sensibilidade de 104 oocistos. As maiores

sensibilidades diagnósticas foram obtidas pelos métodos EK e CK, que possibilitaram a

detecção de 13 (86,7%) das 15 amostras. Devido à alta sensibilidade analítica de EF em

amostras purificadas, avaliou-se sua sensibilidade diagnóstica em amostras de oocistos

purificados pelo método de centrífugo-flutuacão em sacarose, obtendo-se 100% de

detecção. A presença de inibidores nas amostras fecais reduziu fortemente a sensibilidade

das reações de PCR a partir de DNA extraído pelos métodos avaliados, sendo

recomendável o emprego de técnicas de purificação de oocistos previamente à extração de

DNA. Os resultados apontam para uma melhor eficiência dos métodos de indução de

excistamento e kit QIAmp DNA Stool Mini.

Palavras-chave: Cryptosporidium. Diagnóstico (métodos). DNA (extração). Reação em

cadeia polimerase. Fezes.

ABSTRACT

FUNADA, M. R. Evaluation of DNA extraction methods of Cryptosporidium spp. in

feces and comparison of nested PCR with sucrose centrifugal flotation method.

[Avaliação de métodos de extração de DNA de Cryptosporidium spp. em amostras fecais

e comparação da nested PCR com o método coproparasitológico de centrífugo-flutuação

em sacarose]. 2009. 76 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009.

The performance of six methods for DNA extraction from Cryptosporidium spp. oocysts

in feces were evaluated by nested PCR of SSU rRNA gene. The methods are the

combination with small variations of two techniques for the release of sporozoites

(induction of excystation/E or thermal shock/C) and three techniques for DNA

purification (phenol-chloroform/F, GuSCN-silica/S or QIAmp DNA Stool Mini kit/K).

For the evaluation of analytical sensitivity, tests were made from serial dilutions of

purified oocysts, in absence and in presence of 100 μl of cattle feces. The diagnostic

sensitivity was assessed by comparison with the microscopic method of centrifugal-

flotation in sucrose (gold standard) in 15 fecal samples from different naturally infected

hosts. In the absence of feces, only methods EF, ES, FC, and CS were tested. EF had the

highest analytical sensitivity, enabling the detection of up to 1 oocyst. In the presence of

feces, methods EF, EK, and CK showed similar performance, with sensitivity of 104

oocysts. The highest sensitivities were obtained by methods EK and CK, which enabled

the detection of 13 (86.7%) of 15 samples. Due to the high analytical sensitivity of EF in

purified samples, its diagnostic sensitivity was evaluated in samples of purified oocysts by

the method of centrifugal-flotation in sucrose, resulting in 100% detection. The presence

of inhibitors in fecal samples greatly reduced the sensitivity of the PCR reactions from

DNA extraction methods evaluated, and the use of techniques for purification of oocysts

prior to DNA extraction is recommended. The results show a better performance of the

methods of induction of excystation and QIAmp DNA Stool Mini kit.

Key words: Cryptosporidium. Diagnosis (methods). DNA (extraction). Polymerase chain

reaction. Feces.

LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Eletroforeses em gel de agarose dos produtos das nested PCRs do gene SSU

rRNA resultantes da amplificação de DNA extraído pelos métodos EF, ES, CF e CS, a partir de oocistos purificados. Os valores são referentes ao número estimado de oocistos de C. parvum presente nas amostras submetidas à extração de DNA. PM: Peso molecular, múltiplos de 100 pares de base. ............ 45

Figura 2 – Eletroforeses em gel de agarose dos produtos das nested PCRs do gene SSU

rRNA resultantes da amplificação de DNA extraído pelos métodos de EF, ES, EK, CF, CS e CK, a partir de 100 μl de fezes bovinas contaminadas com oocistos purificados. Os valores são referentes ao número estimado de oocistos de C. parvum presente nas amostras submetidas à extração de DNA. PM: Peso molecular, múltiplos de 100 pares de base. ........................................................... 46

Figura 3 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos da nested PCR do gene SSU rRNA

resultante da amplificação de DNA extraído pelo método EK, a partir de amostras fecais de hospedeiros naturalmente infectados com Cryptosporidium spp. PM: Peso molecular, múltiplos de 100 pares de base. .................................... 48

Figura 4 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos da nested PCR de gene SSU rRNA

resultante da amplificação de DNA extraído pelo método CK, a partir de amostras fecais de hospedeiros naturalmente infectados com Cryptosporidium spp. PM: Peso molecular, múltiplos de 100 pares de base. .................................... 48

Figura 5 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos da nested PCR do gene SSU rRNA

resultante da amplificação de DNA extraído pelo método EF, a partir de amostras de oocistos de Cryptosporidium spp. concentrados e purificados de fezes pela técnica de centrífugo-flutuação em sacarose. PM: Peso molecular, múltiplos de 100 pares de base. .............................................................................. 50

LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Espécies de Cryptosporidium descritas com base em estudos de diferenciação

fenotípica e genotípica dos isolados ..................................................................... 18 Tabela 2 – Seqüências dos primers utilizados nas reações de PCR / nested PCR e seus

respectivos tamanhos de fragmentos amplificados. .............................................. 28 Tabela 3 – Identificação molecular pelo sequenciamento do gene SSU rRNA de isolados

fecais de Cryptosporidum spp. provenientes de indivíduos apresentando intensa liberação de oocistos. ................................................................................ 42

Tabela 4 – Sensibilidades analíticas das nested PCRs do gene SSU rRNA após

amplificação de DNA extraído por diferentes métodos, na ausência e na presença de 100 μl de fezes bovina. As diluições avaliadas continham de 105

a 1 oocisto(s). ................................................................................................... 44 Tabela 5 – Sensibilidades diagnósticas dos diferentes métodos de extração de DNA,

determinadas por meio da nested PCR do gene SSU rRNA de 15 amostras fecais positivas pelo método coproparasitológico de centrífugo-flutuação em sacarose, considerado o padrão-ouro .................................................................. 47

Tabela 6 – Resultados das amplificações pela nested PCR do gene SSU rRNA de amostras

fecais positivas na pesquisa de oocistos de Cryptosporidium pelo método de centrífugo-flutuação em sacarose. As amostras fecais foram submetidas a seis métodos de extração de DNA, resultantes da combinação com pequenas variações de cinco técnicas: excistamento (E), choque térmico (C), fenol-clorofórmio (F), GuSCN-sílica (S) e kit QIAmp DNA Stool Mini (K). As amostras eram provenientes de humanos (H), bovinos (B), cão (C) e gatos (G). .. 49

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 17 2 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 25 2.1 OBJETIVOS GERAIS ..................................................................................................... 25 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 25 3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 26 3.1 OBTENÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum.......................................... 26 3.1.1 Amostras fecais.............................................................................................................. 26 3.1.2 Pesquisa de oocistos de Cryptosporidium spp. pelo método de centrífugo-flutuação em

sacarose (Sheather modificado) .......................................................................... 27 3.1.3 Recuperação de oocistos de Cryptosporidium tipo parvum.......................................... 27 3.1.4 Caracterização genotípica ............................................................................................ 28 3.1.4.1 Extração de DNA ....................................................................................................... 28 3.1.4.2 PCR e nested PCR ...................................................................................................... 28 3.1.4.3 Detecção do produto amplificado............................................................................... 29 3.1.4.4 Purificação do produto amplificado ........................................................................... 29 3.1.4.5 Quantificação do DNA Purificado ............................................................................. 30 3.1.4.6 Reação de Sequenciamento ........................................................................................ 30 3.1.4.7 Precipitação do produto amplificado.......................................................................... 30 3.1.4.8 Sequenciamento.......................................................................................................... 31 3.1.4.9 Alinhamento, tradução das seqüências de nucleotídeos e edição final ...................... 31 3.1.5 Purificação de oocistos de Cryptosporidium parvum ................................................... 31 3.2 TESTE DE SENSIBILIDADE ANALÍTICA .................................................................. 32 3.3 TESTE DE SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA............................................................. 33 3.3.1 Sensibilidade diagnóstica dos métodos de extração de DNA em amostras fecais ........ 34 3.3.2 Sensibilidade diagnóstica do método de excistamento/fenol-clorofórmio em amostras

purificadas ........................................................................................................... 34 3.4 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA.......................................................................... 34 3.4.1 Método 1: Excistamento + fenol-clorofórmio............................................................... 35 3.4.1.1 Excistamento .............................................................................................................. 35 3.4.1.2 Fenol-clorofórmio........................................................................................................ 35 3.4.2 Método 2: Excistamento + tiocianato de guanidina-sílica ........................................... 36 3.4.2.1 Excistamento .............................................................................................................. 36 3.4.2.2 Tiocianato de guanidina-sílica (GuSCN-sílica).......................................................... 37 3.4.3 Método 3: Excistamento + kit QIAmp DNA Stool Mini................................................ 37 3.4.3.1 Excistamento ............................................................................................................. 37 3.4.3.2. kit QIAmp DNA Stool Mini ...................................................................................... 38 3.4.4 Método 4: Choque térmico + fenol-clorofórmio........................................................... 39 3.4.4.1 Choque térmico ......................................................................................................... 39 3.4.4.2 Fenol-clorofórmio...................................................................................................... 39 3.4.5 Método 5: Choque térmico + tiocianato de guanidina-sílica....................................... 39 3.4.5.1 Choque térmico .......................................................................................................... 40 3.4.5.2 Tiocianato de guanidina-sílica................................................................................... 40 3.4.6 Método 6: Choque térmico + kit QIAmp DNA Stool Mini ........................................... 40 3.4.6.1 Choque térmico ......................................................................................................... 40 3.4.6.2 kit QIAmp DNA Stool Mini .......................................................................................40 3.5 CONTROLES NEGATIVOS........................................................................................... 41 3.6 AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO DOS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA ..... 41 4 RESULTADOS .................................................................................................................. 42

4.1 OBTENÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum.......................................... 42 4.2 TESTE DE SENSIBILIDADE ANALÍTICA .................................................................. 43 4.3 TESTE DE SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA............................................................. 47 4.3.1 Sensibilidade diagnóstica dos métodos de extração de DNA em amostras fecais........ 47 4.3.2 Sensibilidade diagnóstica do método EF em amostras purificadas.............................. 50 5 DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 51 5.1 OBTENÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum.......................................... 51 5.2 AVALIAÇÃO DOS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA........................................ 52 5.2.1 Teste de sensibilidade analítica.................................................................................... 54 5.2.2 Teste de sensibilidade diagnóstica ............................................................................... 59 5.2.2.1 Sensibilidade diagnóstica dos métodos de extração de DNA em amostras fecais ..... 59 5.2.2.2 Sensibilidade diagnóstica do método EF em amostras purificadas............................ 62 6 CONCLUSÕES.................................................................................................................. 64

REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 65

17

1 INTRODUÇÃO

A primeira espécie do gênero Cryptosporidium a ser relatada foi C. muris em 1907,

pelo pesquisador americano Ernest Edward Tyzzer, ao descrever um protozoário

freqüentemente encontrado nas glândulas gástricas de seus camundongos de laboratório. Em

1912, o mesmo pesquisador apresentou uma segunda espécie, Cryptosporidium parvum,

também encontrada em um camundongo, mas com desenvolvimento no intestino delgado e

com oocistos menores que C. muris (XIAO et al., 2004).

A descrição de uma nova espécie, C. meleagridis, em perus no ano de 1955 e a

identificação de criptosporidiose em bovinos, no ano de 1971, forneceram os primeiros

relatos de mortalidade e morbidade associados a infecções por Cryptosporidium spp. A

patogenicidade do parasita em humanos foi demonstrada com a descrição de dois casos de

criptosporidiose em 1976 e pela ocorrência na década de 80, de infecções oportunistas em

indivíduos imunocomprometidos, devido principalmente a Síndrome da Imunodeficiência

Adquirida (AIDS) (FAYER, 2004).

A criptosporidiose conquistou maior importância na saúde pública após o surto de

veiculação hídrica que acometeu milhares de pessoas na cidade de Milwaukee (EUA) em

1993 (MACKENZIE et al., 1994). Atualmente é reconhecida como uma das mais graves

patogenias transmitidas pela água, tendo como agravantes as dificuldades do controle da

contaminação ambiental, bem como do tratamento da enfermidade, devido à ausência de

terapias eficazes (DILLINGHAM et al., 2002).

O parasita apresenta distribuição mundial, com relatos de criptosporidiose humana

em mais de 90 países (FAYER et al., 2000). Além de ser reconhecido como parasita de uma

infinidade de animais, incluindo mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes (TZIPORI;

WARD, 2002).

Atualmente, o gênero Cryptosporidium pertencente ao filo Apicomplexa, Classe

Esporozoasida, Subclasse Coccidiasida, Ordem Eucoccidia, Subordem Eimeriina, Família

Cryptosporiidae. No entanto, análises filogenéticas de seqüências do gene SSU rRNA

sugerem a maior proximidade de Cryptosporidium à subclasse Gregarinia (CARRENO et al.,

1999). Essa proposição é sustentada pela existência de estágios extracelulares no ciclo de

vida de Cryptosporidium andersoni e capacidade multiplicativa em meio de cultura isento de

células (HIJJAWI et al., 2002, 2004).

18

Pelo menos 22 espécies do gênero Cryptosporidium foram identificadas por

diferenças na ocorrência e preferência ao hospedeiro, morfologia e sítio de infecção.

Entretanto, somente 15 espécies são consideradas válidas, com base em dados adicionais de

caracterização genética resultantes principalmente do emprego de técnicas de PCR-RFLP e

sequenciamento (XIAO et al., 2004; CACCIO et al., 2005; SUNNOTEL et al., 2006). Além

das espécies reconhecidas, mais de 50 genótipos de Cryptosporidium foram descritos em

animais, sendo que novos genótipos são continuamente descobertos (XIAO et al., 2004;

FENG et al., 2007). Na tabela 1, são descritas apenas as espécies amplamente reconhecidas.

Tabela 1 – Espécies de Cryptosporidium descritas com base em estudos de diferenciação fenotípica e genotípica dos isolados

Espécie Hospedeiro Tamanho oocisto (μm) Localização

C. andersoni Bovinos 5,5 x 7,4 AbomassoC. baileyi Aves 4,6 x 6,2 Bursa de Fabricius, cloaca,

trato respiratório

C. canis Cães, humanos 5,0 x 4,7 Intestino delgado

C. felis Gatos, humanos 4,5 x 5,0 Intestino delgado

C. galli Aves 8,0-8,5 x 6,2-6,4 Proventrículo

C. hominis Humanos 4,5 x 5,5 Intestino delgado

C. meleagridis Aves, humanos 4,5-5,0 x 4,6-5,2 Intestino

C. molnari Peixes 4,7 x 4,5 Estômago

C. muris Roedores, humanos 5,6 x 7,4 Estômago

C. parvum Ruminantes, humanos 4,5 x 5,5 Intestino

C. saurophilum Lagartos, cobras 4,2-5,2 x 4,4-5,6 Intestino e mucosa cloacal

C. serpentis Cobras, lagartos 4,8-5,6 x 5,6-6,6 Estômago

C. suis Suínos, humanos 5,1 x 4,4 Intestino delgado

C. wrairi Porquinho da Índia 4,0-5,0 x 4,8-5,6 Intestino delgado

C. bovis Ruminantes 4,2-4,8 x 4,8-5,4 Intestino delgado(Adaptado de SUNNOTEL et al., 2006)

Em 2008, quatro novas espécies de Cryptosporidium foram descritas, com base em

características biológicas, morfológicas e moleculares. C. fayeri foi isolada de fezes de

cangurus vermelhos (Macropus rufus), apresentando oocistos com dimensões de 4,5-5,1 por

3,8-5,0 μm e similaridade de 90,64% a 97,88% ao C. parvum pela análise multi-locus

(RYAN et al., 2008). C. macropodum foi descrita após a identificação em fezes de cangurus

cinza (Macropus giganteus). Os oocistos medem 4,5-6,0 μm de altura por 5,0-6,0 μm de

comprimento. Análises filogenéticas dos loci SSU rRNA, actina e hsp-70 demonstraram a

19

diferenciação genética de C. macropodum das demais espécies de Cryptosporidium

(POWER; RYAN, 2008). C. fragile foi descrita como parasita estomacal de sapos black-

spined (Duttaphrynus melanostictus). Os oocistos apresentavam dimensões de 5,5-7,0 por

5,0-6,5 μm. A análise filogenética do gene SSU rRNA demonstrou distinção de C. fragile das

demais espécies gátricas, incluindo C. muris, C. serpentis e C. andersoni (JIRKU et al.,

2008). A espécie mais recentemente descrita foi C. ryanae em bovinos (Bos taurus).

Oocistos dessa espécie foram previamente classificados como pertencentes ao genótipo

veado e são similares aos oocistos de C. parvum e C. bovis, mas com dimensões menores

(2,94-4,41 x 2,94-3,68 μm). A espécie se mostrou distinta das outras espécies pela

caracterização dos genes SSU-rRNA, actina e hsp-70 (FAYER et al., 2008).

Cada espécie/genótipo de Cryptospopridium, com raras exceções, é adaptado a um

grupo restrito de hospedeiros relacionados filogeneticamente, indicando que a transmissão

cruzada entre diferentes grupos de animais é limitada. No entanto, as espécies e genótipos,

apesar da adaptação, não são necessariamente específicos a um grupo de hospedeiros, já que

a transmissão pode ocorrer entre espécies de animais que compartilham um mesmo habitat

(FENG et al., 2007).

A espécie C. parvum afeta uma grande variedade de mamíferos, sendo mais

comumente encontrada em humanos e ruminantes e, portanto recebe maior atenção na

transmissão zoonótica da criptosporidiose (XIAO et al., 2004). Embora os bovinos sejam

considerados o maior reservatório de C. parvum, apenas bezerros em período lactente são

frequentemente infectados por essa espécie. Bovinos jovens e adultos são mais comumente

infectados por C. andersoni, C. bovis e genótipo veado (C. ryanae) (XIAO; FENG, 2008).

O contato com bovinos infectados tem sido relatado como causa de pequenos surtos

envolvendo estudantes de veterinária, técnicos de pesquisa e crianças que freqüentaram

eventos e feiras agropecuárias (XIAO; FENG, 2008).

C. parvum e C. hominis são as espécies mais prevalentes em humanos e responsáveis

por todos os surtos em que foi possível a identificação dos isolados (SMITH et al., 2006). A

maioria dos surtos de veiculação hídrica em humanos está associada a C. hominis e poucos

envolveram a espécie C. parvum, tendo como possíveis fontes de contaminação os bovinos

(FAYER et al., 2000; GOH et al., 2004).

Pode-se considerar que existam dois ciclos de transmissão, um antroponótico

envolvendo a espécie C. hominis, mais freqüente em áreas urbanas; e outro zoonótico com

transmissão de C. parvum associado principalmente a ruminantes, com maior ocorrência em

áreas rurais (MORGAN et al., 1999). A maior parte dos casos de criptosporidiose em uma

20

cidade urbana nos EUA foi devido à espécie C. hominis (>75%) (SULAIMAN et al., 1998),

enquanto que C. parvum foi responsável por 61,5% dos casos em uma cidade rural do Reino

Unido (MCLAUCHLIN et al., 2000). No Brasil, também foram relatadas as ocorrências

relacionadas a C. parvum em pacientes residentes em áreas peri-urbanas e C. hominis, em

pacientes de áreas estritamente urbanas (BRANTLEY, 2003; ARAÚJO, 2004).

Outras espécies, incluindo C. felis, C. canis e C. muris foram identificadas, embora

com baixa ocorrência, em amostras clínicas de pacientes imunocomprometidos e em menor

freqüência em indivíduos imunocompetentes (XIAO et al., 2001). Entretanto, a espécie C.

meleagridis foi identificada por diversas vezes em humanos imunocompetentes

(MACLAUCHLIN et al., 2000; PEDRAZA-DIAZ et al., 2001), sendo reconhecida como um

importante parasita humano (XIAO; FENG, 2008). C. suis foi isolado em um paciente HIV

positivo no Peru e em dois pacientes na Inglaterra (XIAO et al., 2002; LEONI et al., 2006).

O papel dos animais de estimação e selvagens na transmissão zoonótica de

Cryptosporidium spp. aparentemente é inexpressivo (MONIS; THOMPSON, 2003;

APEELBEE et al., 2005). Cães e gatos são mais comumente infectados com espécies que

apresentam maior especificidade ao hospedeiro, ou seja, C. canis e C. felis, respectivamente

(ABE et al., 2002; FAYER et al., 2006; SATOH et al., 2006). Da mesma forma, a maioria

das espécies de Cryptosporidium encontrada em animais selvagens naturalmente infectados é

diferente daqueles que afetam os humanos (APEELBEE et al., 2005). Ainda que outras

espécies e genótipos de Cryptosporidium encontrados em animais possam infectar humanos,

a via de transmissão ainda não foi identificada, havendo a necessidade de estudos

complementares para avaliar a importância da transmissão zoonótica desses animais

(RAMIREZ et al., 2004).

A ingestão de água contaminada é a principal via de infecção por Cryptosporidum spp.

em humanos, podendo ocorrer também por meio de alimentos contaminados. Nos países

desenvolvidos foram relatados diversos surtos envolvendo contaminação de água de beber e

destinada ao lazer (KRAMER et al., 1998). Outra via comum de transmissão é a fecal-oral,

com risco maior a indivíduos que tenham contato com crianças, tratadores de animais e

profissionais da saúde. Embora bastante raros, já houve relatos de transmissão aerógena de

oocistos de Cryptosporidium spp. (HOJLYNG et al., 1987).

Em indivíduos imunocompetentes, a infecção é auto-limitada, com duração de uma a

duas semanas. Os principais sintomas são diarréia aquosa, associada a dores abdominais,

anorexia, perda de peso, náuseas, vômitos, fadiga e febre baixa (RAMIREZ et al., 2004).

Indivíduos imunocomprometidos são freqüentemente acometidos por sintomas mais graves,

21

caracterizados por diarréia crônica, com duração de vários meses, resultando em severa

desidratação e perda de peso, podendo levar a morte (PETERSEN, 1992). Crianças,

sobretudo com idade inferior a cinco anos, parecem ser mais suscetíveis à infecção por

Cryptosporidium spp., possivelmente devido à imaturidade imunológica e ao maior risco de

contrair a doença em decorrência ao menor cuidado com a higiene (GUERRANT, 1997).

Embora a prevalência de criptosporidiose em pacientes com AIDS tenha diminuído

substancialmente com a introdução de terapias antiretrovirais (LÊ MOING et al., 1998), o

parasita ainda representa um grande problema de saúde pública, pelo seu alto potencial

oportunista e freqüente envolvimento em surtos de diarréia em indivíduos

imunocompetentes, tendo a água como principal via de transmissão (SMITH; ROSE, 1998).

A criptosporidiose em animais, além de sua importância clínica e possível transmissão

zoonótica, é responsável por perdas econômicas em animais de produção, favorecidas pela

dificuldade de controle do parasito (RAMIREZ et al., 2004).

Infecções por Cryptosporidium spp. têm sido associadas a diferentes sintomas clínicos

(agudos e crônicos) em uma grande variedade de animais domésticos e selvagens. Animais

jovens parecem ser mais suscetíveis à infecção clínica, com ocorrência de mortalidade

significativa em neonatos de muitas espécies (O’DONOGHUE, 1995). Grande parte das

infecções diagnosticadas em adultos foram assintomáticas ou associadas a sintomas clínicos

de pouca gravidade. No entanto, infecções severas foram verificadas em diversos

hospedeiros imunossuprimidos ou imunodeficientes, principalmente cães, gatos, cavalos e

macacos (O’DONOGHUE, 1995). A maioria dos casos clínicos em mamíferos se caracteriza

por diarréia aquosa, desidratação, perda de peso, febre e inapetência, ocorrendo recuperação

espontânea dentro de uma a duas semanas. Em aves, a enfermidade se manifesta por

distúrbios respiratórios ou entéricos, associados principalmente a infecções por C. baileyi ou

C. meleagridis, respectivamente (RAMIREZ et al., 2004).

A infecção pelo Cryptosporidium spp. inicia-se com a ingestão ou inalação de oocistos

esporulados pelo hospedeiro. O excistamento é facilitado sob determinadas condições de

temperatura, pH, ação de enzimas proteolíticas e sais biliares, liberando quatro esporozoítos.

Os esporozoítos penetram preferencialmente nos enterócitos do jejuno terminal ou íleo (ou

ocasionalmente nos epitélios biliar, respiratório ou conjuntivo), envolvendo-se em um

compartimento extracitoplasmático responsável pela nutrição e fixação do parasita. Os

esporozoítos maduros se diferenciam em trofozoítos iniciando a multiplicação assexual ou

merogonia resultante da divisão nuclear. Dois tipos de merontes são formados: o tipo I com

seis a oito merozoítos, e o tipo II, com quatro merozoítos. Os merozoítos tipo I podem dar

22

origem a novos merozoítos do tipo I ou do tipo II; já os merozoítos tipo II dão origem à fase

sexual do ciclo ou gametogonia com a diferenciação em estágios masculinos (microgametas)

e femininos (macrogametas). Após a fertilização, o macrogameta desenvolve-se em oocisto.

A esporulação ocorre in situ com o desenvolvimento de quatro esporozoítos. Dois tipos de

oocistos podem ser produzidos: um tipo autoinfectante de parede delgada capaz de iniciar um

novo ciclo dentro do mesmo hospedeiro e um de parede espessa altamente resistente às

condições ambientais, que é eliminado nas principalmente nas fezes (DUBEY et al., 1990).

Uma grande variedade de métodos foi desenvolvida para o diagnóstico de

Cryptosporidium spp. em amostras clínicas. A maioria deles envolve a detecção direta por

observação microscópica de tecidos, fezes, aspirado duodenal, bile ou secreções respiratórias,

com o auxílio de técnicas de coloração. As mais conhecidas são coloração por Kinyoun (MA;

SOAVE et al., 1983), álcool-ácido (Ziehl-Neelsen modificado) (HENRIKSEN; POHLENZ

et al., 1981), fucsina carbólica – dimetilsulfóxido (DMSO) (POHJOLA et al., 1984) e

safranina azul de metileno (BARBY et al., 1984). Ainda há métodos de coloração negativa

tais como light green merbromide (CHICHINO et al., 1991) ou verde malaquita (ELLIOT et

al., 1999) que coram o material da lâmina, exceto pelos oocistos de Cryptosporidium spp. As

técnicas de centrífugo-flutuação em solução de Sheather (LEVINE, 1978) e suas

modificações, também são freqüentemente empregadas no diagnóstico em fezes, sendo os

oocistos visualizados em tonalidade rosada. Tais técnicas microscópicas apresentam algumas

limitações decorrentes da reduzida quantidade de oocistos nas amostras e do pequeno

tamanho dos oocistos, o que requer tempo e experiência dos microscopistas.

Técnicas imunológicas como imunofluorescência direta com o emprego de conjugado

anti-anticorpos monoclonais de Cryptosporidium que reconhecem epítopos de superfície nos

oocistos, são rotineiramente utilizadas na detecção e enumeração de oocistos em amostras

ambientais (SMITH; ROSE, 1998) ou fecais (SMITH, 2007). Essas técnicas podem

apresentar variação considerável na sensibilidade e na especificidade diagnósticas, pela

dependência de vários fatores incluindo a pureza do antígeno de Cryptosporidium,

características do anticorpo, enzima ou fluorocromo utilizados (GARCIA; SHIMIZU et al.,

1997). Essas variações podem afetar a intensidade da fluorescência, aumentando a

subjetividade e a necessidade de uma avaliação bastante crítica do diagnóstico (JEX et al.,

2008). A detecção de antígenos de Cryptosporidium em amostras fecais (coproantígenos)

pelas técnicas de ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima) e imunocromatografia

apresenta alta especificidade, mas sensibilidade menor quando comparada às demais técnicas

microscópicas (JOHNSTON et al., 2003).

23

As técnicas imunológicas apresentam maior custo em relação às técnicas de

microscopia óptica e coloração, e não conferem vantagens na sensibilidade e especificidade

que compensem custos adicionais (BIALEK et al., 2002; GARCIA; SHIMIZU, 1997). O

método de microscopia ainda é, portanto, o mais indicado na detecção de Cryptosporidium

spp. em rotinas laboratoriais, podendo ser associado a outros métodos, mas nunca substituído

(MAGI et al., 2006; WEISEL et al., 2006).

O emprego de técnicas de biologia molecular, em particular de métodos baseados na

reação em cadeia pela polimerase (ex. RFLP, AFLP Fingerprinting, Real-time PCR,

sequenciamento), oferece muitas vantagens em relação às demais técnicas por apresentar

maior sensibilidade e especificidade, além de permitir a diferenciação entre genótipos. Os

métodos de PCR, não apenas podem ser aplicados na detecção de um pequeno número de

oocistos, mas também na amplificação de DNA extraído diretamente das fezes ou amostras

ambientais sem a necessidade de se isolar oocistos intactos (WIDMER et al., 2002).

Dessa forma, uma grande variedade de marcadores genéticos tem sido empregada em

estudos de investigação epidemiológica, por meio da caracterização de isolados provenientes

de diversos hospedeiros e regiões geográficas, bem como na investigação de surtos de

criptosporidiose veiculados pela água ou alimento (WIDMER et al., 2002). No entanto, a

presença de inibidores nas amostras e a dificuldade na liberação (lise), extração e purificação

do DNA dos oocistos diminuem drasticamente a eficiência das técnicas de PCR,

especialmente em amostras pobres em oocistos, incorrendo em resultados falso-negativos

(JOHNSON et al., 1995, GOBET et al., 1997).

A presença de inibidores em amostras fecais e ambientais interfere principalmente na

interação entre o DNA e a DNA polimerase, podendo reduzir a sensibilidade da PCR em até

1000 vezes (JOHNSON et al., 1995). Duas abordagens básicas têm sido utilizadas para

eliminar o efeito negativo dos inibidores. Uma delas é empregada antes da extração de DNA

com a purificação dos oocistos por meio de gradientes de densidade em soluções de sacarose,

percoll ou NaCl, cell sorting ou separação imunomagnética, dentre outros métodos. A outra

se procede durante a extração, com a purificação de DNA com o uso basicamente de fenol-

clorofórmio (BALATBAT et al., 1996), spin column (LENG et al., 1996), suspensão de sílica

e tiocianato de guanidina (BOOM et al., 1990), dentre outros. Atualmente, os kits comerciais

(QIAamp DNA Stool Mini kit, DNeasy Tissue kit, FastDNA SPIN Kit for Soil) são um dos

métodos mais comumente empregados, por serem rápidos e de fácil execução.

A dificuldade de ruptura da parede dos oocistos para liberação do material genético

representa uma das maiores limitações no uso das técnicas de PCR. A maioria dos protocolos

24

de extração de DNA utiliza para ruptura da parede do oocisto, ciclos de congelamento e

descongelamento ou pérolas de vidro, em conjunto ou não com proteinase K (CAREY et al.,

2004).

Ward e Wang (2000) comparam pela PCR, dois tratamentos para liberação de DNA em

oocistos Cryptoporidium parvum em fezes congeladas. O primeiro deles consistiu no uso de

ácido taurocólico para indução de excistamento, o segundo envolveu a técnica tradicional de

congelamento e descongelamento, ambas com tratamento adicional de proteinase K. As duas

técnicas resultaram em quantidades semelhantes de DNA extraído, mostrando que a indução

de excistamento pode ser viável na obtenção de DNA para uso nos estudos taxonômicos e

epidemiológicos que envolvem PCR. O excistamento in vitro é largamente empregado nos

estudos de infecção por Cryptosporidium spp. em culturas de células (UPTON et al., 1994;

GOLD et al., 2001; FENG et al., 2006) ou com o objetivo de se verificar a viabilidade de

oocistos a potenciais infecções (CAMPBELL et al., 1992; BLACK et al., 1996; PEZZANI et

al., 1998; WAGNER-WIENING; KIMMING, 1995). Para indução do excistamento, os

oocistos são submetidos a simulações das condições internas do intestino, como temperatura

(37°C), flutuações de pH, concentrações ideais de sais biliares e enzimas pancreáticas

(ROBERTSON et al., 1993).

A caracterização molecular de Cryptosporidium spp. pela análise de oocistos de origem

fecal, tem contribuído de forma expressiva, não somente nos estudos taxonômicos, mas

também na definição dos agrupamentos de hospedeiros de cada espécie/genótipo para

elucidação da dinâmica de transmissão do parasita, na determinação de fatores de risco e no

rastreamento da fonte de infecção em casos de surtos (THOMPSON et al., 2008). Os

principais métodos de caracterização molecular de oocistos são baseados na técnica de

reação em cadeia pela polimerase (PCR), cuja eficácia é dependente da qualidade da amostra

de DNA a ser amplificada. O emprego de métodos de extração de DNA capazes de retirar

substâncias inibitórias de origem fecal, mantendo boa recuperação e integridade do material

genético, é um fator determinante na eficiência de detecção da PCR. Dada a relevância da

escolha do método de extração de DNA, poucos são os estudos comparativos e de avaliação

das técnicas atualmente utilizadas, podendo gerar interpretações e conclusões equivocadas

em estudos com base no diagnóstico molecular de Cryptosporidium spp.

25

2 OBJETIVOS

O estudo teve como objetivos:

2.1 OBJETIVOS GERAIS

• Avaliar o desempenho de métodos para extração de DNA de oocistos de

Cryptosporidium spp. pela nested PCR do gene SSU rRNA.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar o desempenho de quatro métodos para extração de DNA de Cryptosporidium

parvum em oocistos purificados.

• Avaliar o desempenho de seis métodos para extração de DNA em fezes de origem

bovina experimentalmente contaminada com oocistos de Cryptosporidium parvum.

• Verificar a sensibilidade diagnóstica das nested PCRs realizadas com seis métodos de

extração de DNA, tomando como padrão-ouro o teste de centrífugo-flutuação em

solução de sacarose em fezes de diversos hospedeiros naturalmente infectados.

26

3 MATERIAL E MÉTODOS

Com o objetivo de se obter um grande número de oocistos de Cryptosporidium

parvum, foi realizada uma triagem com técnicas de microscopia óptica em amostras fecais de

humanos e bovinos naturalmente infectados. As amostras ricas em oocistos foram

caracterizadas genotipicamente e aquela cujo isolado foi identificado como pertencente à

espécie C. parvum foi submetida à purificação de oocistos. Posteriormente, os oocistos

purificados foram empregados nos testes de sensibilidade analítica dos diferentes métodos de

extração de DNA, assim como foram utilizados na contaminação experimental de amostras

fecais de bovinos livres de Cryptosporidium spp. Da mesma forma, essas amostras fecais

contaminadas com concentrações conhecidas de oocistos foram empregadas na avaliação do

desempenho dos diferentes métodos de extração de DNA. Os testes de sensibilidade

diagnóstica foram realizados a partir de amostras fecais de diferentes hospedeiros

naturalmente infectados por Cryptosporidium spp., previamente diagnosticadas pelo método

de centrífugo-flutuação em sacarose (padrão-ouro).

3.1 OBTENÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium parvum

Os itens que seguem referem-se aos procedimentos laboratoriais envolvidos na

obtenção de amostras de oocistos de Cryptosporidium parvum para realização das

contaminações experimentais.

3.1.1 Amostras fecais

Oocistos de Cryptosporidium spp. foram obtidos a partir de amostras fecais de

humanos e de bovinos. Dezenove amostras de oocistos de fezes de humanos foram

gentilmente cedidas pelo Laboratório de Parasitologia do Instituto de Infectologia Emílio

Ribas (São Paulo, SP), previamente diagnosticadas como positivas para Cryptosporidium

27

spp. Na pesquisa em bovinos, foram analisadas 25 amostras de bezerros com 10 dias a 6

meses de idade, provenientes das cidades de Coronel Macedo e Pirassununga (SP).

3.1.2 Pesquisa de oocistos de Cryptosporidium spp. pelo método de centrífugo-flutuação em

sacarose (Sheather modificado)

As amostras foram submetidas ao exame de centrífugo-flutuação em sacarose

(OGASSAWARA; BENASSI, 1980) que consistiu na diluição de aproximadamente 2 ml de

fezes em 11 ml de solução de sacarose (d=1,203g/cm3), filtração em uma camada de gaze e

centrifugação em tubos cônicos a 1.500 rpm por 10 min. Em seguida, uma alíquota da

película superficial foi recuperada com o auxílio de uma alça bacteriológica e disposta em

lâmina. Cobriu-se a preparação com uma lamínula (1x1 cm) para observação em microscópio

óptico (aumento de 400 x) e avaliação da quantidade de oocistos.

As amostras fecais nas quais foi detectado menos de um oocisto por campo de

observação em microscópio (aumento de 400 x) foram classificadas como (+). Aquelas com

detecção de 1 a 5 oocistos por campo foram classificadas como (+ +), de 6 a 10 oocistos

como (+ + +) e mais de 10 oocistos como (+ + + +).

As amostras que foram classificadas como (+ + +) ou (+ + + +) e apresentavam

oocistos com características morfológicas semelhantes ao Cryptosporidium parvum foram

purificadas e caracterizadas genotipicamente.

3.1.3 Recuperação de oocistos de Cryptosporidium tipo parvum

A recuperação dos oocistos foi realizada sobre uma placa de Petri, mediante lavagem da

lâmina e lamínula com 1,5 ml de tampão TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0).

O lavado foi transferido para um microtubo de 1,5 ml e centrifugado a 12.000 g durante 10

min. Desprezado o sobrenadante, seguiu-se um novo processo de lavagem e centrifugação nas

mesmas condições anteriores. Desprezou-se o sobrenadante e o sedimento contendo oocistos

de Cryptosporidium tipo parvum foi imediatamente submetido à extração do DNA ou

armazenado a -20ºC para posterior processamento.

28

3.1.4 Caracterização genotípica

Após a obtenção dos oocistos de Cryptosporidium, foi realizada a caracterização

genotípica pelo sequenciamento do gene SSU rRNA.

3.1.4.1 Extração de DNA

Os oocistos purificados foram submetidos à extração de DNA com o emprego de choque

térmico, proteinase K e fenol-clorofórmio. O procedimento está descrito detalhadamente no

item 3.4.4. As amostras de DNA extraído foram processadas imediatamente ou armazenadas a

-20ºC para posterior amplificação pela PCR.

3.1.4.2 PCR e nested PCR

As amostras de DNA extraído foram amplificadas pela PCR e nested PCR do gene

codificador da subunidade menor do rRNA (SSU rRNA). Os primers utilizados na PCR e

nested PCR estão expostos na tabela 2.

Tabela 2 – Seqüências dos primers utilizados nas reações de PCR / nested PCR e seus respectivos tamanhos de fragmentos amplificados

Primers Seqüências Tamanhos dos

fragmentos (bp)

Referências

SSU-F2 5’-TTC TAG AGC TAA TAC ATG CG-3’ Xiao et al. (1999) PCR

SSU-R2 5’-CCC ATT TCC TTC GAA ACA GGA-3’ ~1300

Xiao et al. (2000)

SSU-F3 5’-GGA AGG GTT GTA TTT ATT AGA TAA AG -3’ Xiao et al. (1999) nested PCR SSU-R3 5’-AAG GAG TAA GGA ACA ACC TCC A-3’

~800 Xiao et al. (1999)

29

As amplificações pela PCR e nested PCR foram realizadas em um volume final de 25

μl. A cada reação de amplificação foram incluídos um controle positivo, previamente testado,

e um controle negativo (água ultrapura autoclavada), tanto para a PCR quanto para nested

PCR.

As reações de amplificação consistiam de 0,3 μM para cada primer, 200 μM de

dNTPs, 2,0 mM de MgCl2, 1x PCR Buffer, 1,25 u de DNA polimerase Platinum Taq

(Invitrogen, Carlsbad, CA) e 2,5 μl de DNA extraído.

As condições utilizadas na amplificação pela PCR foram de 94ºC por 3 min, 35 ciclos

de 94ºC por 45 s, 55ºC por 45 s e 72ºC por 60 s, seguidos de uma extensão final de 72ºC por

7 min.

A nested PCR foi realizada nas mesmas condições da PCR, mas com o emprego do

par de primers SSU-F3 / SSU-R3 e 2,5 μl do produto da primeira reação.

3.1.4.3 Detecção do produto amplificado

Os fragmentos amplificados pela nested PCR foram analisados em eletroforese de

cuba horizontal. Uma alíquota de 10 μl de cada amostra foi disposta em gel de agarose a

1,5%, previamente imerso em tampão TBE (0,045M Tris-Borato; 1mM EDTA).

Após a corrida eletroforética, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (0,5

μg/ml) por 20 min. A visualização das bandas foi feita sob transiluminação com luz

ultravioleta.

As dimensões dos fragmentos amplificados foram comparadas a um padrão de peso

molecular com fragmentos múltiplos de 100 pares de base disposto no gel juntamente com as

amostras analisadas.

3.1.4.4 Purificação do produto amplificado

Após a separação dos produtos amplificados pela eletroforese, as bandas de interesse

foram recortadas e purificadas com o kit GFXTM (Amersham Biosciences), de acordo com as

instruções do fabricante.

30

3.1.4.5 Quantificação do DNA purificado

Uma nova eletroforese foi realizada para estimar a concentração de DNA presente nas

amostras purificadas. Para isso, comparou-se uma alíquota de 5 μl do produto purificado com

o padrão Low Mass DNA Ladder (Gibco BRL-Gaytherburg/USA), utilizando a tabela

fornecida pelo fabricante, obtendo-se a concentração em ng/μl.

3.1.4.6 Reação de sequenciamento

Para a reação de sequenciamento empregou-se o kit BigDye Terminator Cycle

Sequencing Ready Reaction (Perkin Elmer). As quantidades de reagentes foram determinadas

a partir da concentração de DNA purificado. Para uma reação com 10 μl de volume final,

foram utilizados 1 μl de BigDyeTM v.3.1 (Applied Biosystems), 2 μl de tampão Save Money

5x (200mM Tris-HCl; 5 mM MgCl2; pH 9,0), 10 pmoles de primer (senso ou anti-senso) e

24 ng de DNA purificado. Em amostras com concentração de DNA abaixo de 4 ng/μl, o

volume final da reação foi dobrado, assim como as concentrações dos reagentes, exceto a do

primer utilizado.

As condições das reações de sequenciamento consistiram de desnaturação inicial a

96ºC por 1 min e 40 ciclos de 96 ºC por 15 s, 50ºC por 15 s e 60ºC por 4 min.

3.1.4.7 Precipitação do produto amplificado

Após a reação de sequenciamento, os produtos foram purificados por precipitação em

álcool. A cada amostra, adicionaram-se 40 μl ou 80 μl de isopropanol a 65% para reações

com volumes finais de 10 μl e 20 μl, respectivamente. Após a homogeneização, as amostras

foram mantidas em local protegido da luz por 15 min, em temperatura ambiente, e em

seguida, centrifugadas a 14.000 g por 25 min. Descartou-se o isopropanol por inversão de

tubos e o sedimento foi homogeneizado com 300 μl de etanol a 70%. Procedeu-se nova

centrifugação a 14.000 g por 10 min. O excesso de etanol foi cuidadosamente aspirado com o

31

auxílio de pipeta, sendo sua total remoção conduzida em banho-seco a 80ºC por 2 min. As

amostras foram mantidas a -20ºC até o momento do sequenciamento.

3.1.4.8 Sequenciamento

Antes de serem submetidas à eletroforese em seqüenciador automático modelo ABI

PrismTM 377 DNA Sequencers (Applied Biosystems, USA), as amostras foram

homogeneizadas com 3,4 μl de formamida e Blue Dextran-EDTA (Applied Biosystems,

USA) na proporção de 5:1, desnaturadas a 95º por 3 min e colocadas no gelo por 2 min.

3.1.4.9 Alinhamento, tradução das seqüências de nucleotídeos e edição final

As seqüências de nucleotídeos foram analisadas e modificadas com o auxílio do

programa Phred online (http://asparigin.cenargen.embrapa.br/phph/) e BioEdit Sequence

Alignment Editor (HALL, 1999). As seqüências resultantes foram comparadas com

seqüências homólogas disponíveis no GenBank. Os genótipos dos isolados foram

determinados com base nessa comparação.

3.1.5 Purificação de oocistos de Cryptosporidium parvum

A amostra fecal com oocistos pertencentes à espécie Cryptosporidium parvum e que

apresentou previamente a maior quantidade de oocistos pelo exame microscópico (item 3.1.2)

foi submetida a purificação e concentração de oocistos de acordo com o método descrito por

Brien e Jenkins (2007) com algumas modificações.

Inicialmente as fezes (aproximadamente 50 g) foram peneiradas em tamises de 0,5

mm, 150 μm e 45 μm, sendo diluídas aos poucos com 350 ml de água destilada. A suspensão

fecal foi fracionada em 8 tubos cônicos de 50 ml e centrifugada a 1.500 g por 15 min a 4ºC.

Em todo o procedimento empregou-se uma centrífuga com rotor basculante programada para

32

trabalhar em lenta desaceleração. Após a centrifugação, aproximadamente 45 ml do

sobrenadante foram descartados com uma pipeta de 25 ml, e o restante do sobrenadante foi

homogeneizado ao sedimento. As amostras foram reunidas aos pares para que restassem

apenas quatro tubos. A suspensão resultante foi diluída (1:4) em NaCl (360g/L, d=1,21

g/cm3) e centrifugada a 720 g por 20 min. Após as amostras serem deixadas em repouso por

10 min, aproximadamente 20 ml do sobrenadante foram transferidos para outro tubo de 50

ml. A suspensão foi diluída em 1:4 com água destilada e centrifugada a 1.500 g por 20 min.

O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi lavado com água destilada e centrifugado a

1.500 g por 20 min. O sedimento foi diluído em água destilada até o volume final de 40 ml,

homogeneizados fortemente com 8 ml de éter e centrifugado a 1.200 g por 10 minutos.

Observa-se a formação de três camadas: a superior composta pelo solvente, a intermediária

com debris fecais e a camada aquosa inferior. As três camadas foram descartadas com uma

pipeta de 25 ml e o sedimento contendo oocistos foi lavado três vezes em 50 ml de água

deionizada com centrifugações a 1.200 g por 10 min. Após o descarte de aproximadamente

45 ml do sobrenadante de cada amostra, as suspensões restantes contendo oocistos foram

transferidas para um único tubo de 15 ml.

A estimativa da quantidade de oocistos presentes na amostra purificada foi realizada

com o auxílio de uma câmara de Neubauer. Foram realizadas cinco contagens de oocistos,

sendo que se considerou a média dos valores obtidos.

3.2 TESTE DE SENSIBILIDADE ANALÍTICA

Para a determinação da sensibilidade analítica dos métodos de extração de DNA,

foram realizadas diluições seriadas dos oocistos purificados. As amostras de oocistos em

concentrações conhecidas foram testadas na forma purificada e contaminadas em fezes. Cada

método foi avaliado por três vezes, com exceção daqueles que empregavam o kit comercial

QIAmp DNA Stool Mini. As repetições foram realizadas em dias distintos, buscando seguir

os procedimentos padrões previamente estabelecidos.

A partir de uma alíquota da suspensão de oocistos purificados, foram realizadas

diluições seriadas na base 10 (106 a 1 oocistos/ml) em tampão TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0;

1 mM EDTA pH 8,0).

33

Para os testes de sensibilidade analítica em oocistos purificados, alíquotas de 100 μl

de cada suspensão nas sete diferentes concentrações (106, 105, 104, 103, 102, 10 e 1

oocistos/ml) e um controle negativo (tampão TE) foram distribuídos em microtubos de 1,5

ml. Portanto, no volume de 100 μl estima-se que continha(m) 105, 104, 103, 102, 10, 1 e 10-1

oocisto(s) referente(s) a cada concentração das diluições.

Para avaliar a sensibilidade analítica dos métodos na presença de material fecal, uma

amostra de fezes bovina, comprovadamente livre de Cryptosporidium spp., tanto pelo

método de microscopia (item 3.1.2) quanto pela nested PCR (itens 3.1.4.1 a 3.1.4.3), foi

contaminada com oocistos purificados de Cryptosporidium parvum. A amostra fecal foi

aliquotada em volumes de 100 μl, que foram então contaminados com 100 μl da suspensão

de oocistos nas diferentes concentrações.

As amostras foram mantidas a -20ºC para posteriormente serem processadas.

Portanto, os métodos foram avaliados quanto à eficiência de extrair DNA de oocistos de

Cryptosporidium em fezes congeladas.

3.3 TESTE DE SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA

As amostras fecais de humanos foram cedidas pelo Laboratório de Parasitologia do

Instituto de Infectologia Emílio Ribas (São Paulo, SP). As fezes bovinas foram provenientes

de animais da cidade de Coronel Macedo e Pirassununga (SP). As amostras de cão e gatos

foram obtidas no Laboratório de Doenças Parasitárias da Faculdade de Medicina Veterinária

e Zootecnia (USP).

As sensibilidades diagnósticas dos métodos de extração de DNA/nested PCR na

detecção de Cryptosporidium spp. em amostras fecais foram determinadas pela comparação

com o método de centrífugo-flutuação em sacarose, considerado o padrão-ouro.

Foram selecionadas 5 amostras fecais de humanos, 6 de bovinos, 3 de felinos e 1 de

canino. As 15 amostras eram positivas na pesquisa de oocistos Cryptosporidium spp. pelo

método de centrífugo-flutuação em sacarose, como descrito no item 3.1.2. A quantidade de

oocistos presente nas amostras foi estimada pela média de oocistos presentes por campo de

observação em microscópio (aumento de 400x).

34

3.3.1 Sensibilidade diagnóstica dos métodos de extração de DNA em amostras fecais

Para o teste de sensibilidade diagnóstica dos métodos de extração de DNA, foram

separadas alíquotas de 100 μl de cada amostra fecal. As alíquotas foram congeladas a -20 °C

por aproximadamente dois meses.

As amostras foram submetidas aos seis métodos de extração de DNA descritos no

item 3.4.

3.3.2 Sensibilidade diagnóstica do método de excistamento/fenol-clorofórmio em amostras

purificadas

Devido ao alto limiar de detecção observado em amostras de oocistos purificados, o

método de excistamento/fenol-clorofórmio também foi avaliado nas 15 amostras fecais

selecionadas, mas previamente submetidas aos processos de concentração e purificação de

oocistos conforme descritos nos itens 3.1.2 e 3.1.3.

As amostras fecais após serem processadas pelo método de centrífigo-flutuação em

sacarose e dispostas em lâmina, foram observadas ao microscópio para visualização dos

oocistos. As lâminas e lamínulas foram então lavadas em tampão TE. A suspensão de

oocistos foi colocada em microtubos e submetida a lavagens por centrifugação para retirada

da sacarose. O sedimento contendo oocistos e pequena quantidade de material fecal foi

armazenado a -20° por aproximadamente 2 meses.

As amostras foram submetidas somente ao método de extração de DNA por

excistamento/fenol-clorofórmio (item 3.4.1).

3.4 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA

As amostras foram submetidas a diferentes técnicas de rompimento de oocistos, lise

de esporozoítos e purificação de DNA:

35

a. Método 1: Excistamento + fenol-clorofórmio (EF)

b. Método 2: Excistamento + tiocianato de guanidina-sílica (ES)

c. Método 3: Excistamento + kit QIAmp DNA Stool Mini (EK)

d. Método 4: Choque térmico + fenol-clorofórmio (CF)

e. Método 5: Choque térmico + tiocianato de guanidina-sílica (CS)

f. Método 6: Choque térmico + kit QIAmp DNA Stool Mini (CK)

3.4.1 Método 1: Excistamento + fenol-clorofórmio (EF)

As amostras foram submetidas ao processo de indução de excistamento descrito por

Ward e Wang (2000) e a purificação de DNA por fenol-clorofórmio (SAMBROOK et al.,

1989).

3.4.1.1 Excistamento

As amostras foram suspensas em 300 μl de ácido taurocólico (Sigma, Nova Zelândia)

1,5% em água e incubadas a 37ºC por 2 h, com agitação de 1.000 rpm por 15 s a cada 5 min.

Após a centrifugação a 15.000 g por 5 min, o sobrenadante foi descartado por inversão de

tubos e o sedimento foi lavado com tampão TE q.s.p. 1,5 ml. Centrifugou-se novamente a

15.000 g por 5 min, sendo o sobrenadante descartado por inversão tubos e o sedimento

suspenso em 500 μl de tampão de lise (100 mM NaCl; 10 mM Tris-Cl pH 8,0; 25 mM

EDTA; 0,5% SDS; 0,1 mg/ml proteinase K). As amostras foram incubadas a 56ºC por 2 h,

com agitação de 1.000 rpm por 15 s a cada 5 min.

3.4.1.2 Fenol-clorofórmio

Para a purificação foram adicionados 250 μl de fenol e 250 μl de clorofórmio às

amostras, que foram então homogeneizadas e centrifugadas a 12.000 g por 10 minutos.

36

Posteriormente 400 μl do sobrenadante foram transferidos a outro microtubo, no qual foram

adicionados 400 μl de propanol absoluto. Após a homogeneização, as amostras foram

mantidas a -20ºC por 2 h. Após esse período, as amostras foram centrifugadas a 12.000 g por

30 minutos a 4ºC. Desprezado o sobrenadante, o sedimento foi suspenso em 1 ml de etanol

70%. Uma nova centrifugação foi feita a 12.000 g por 10 minutos a 4ºC. Desprezou-se o

sobrenadante e os microtubos foram deixados em posição invertida, até a secagem completa,

em temperatura ambiente. As amostras foram homogenizadas com 30 μl de TE (10 mM Tris-

HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0) e incubadas em banho-seco a 56ºC por 10 min. Após a

homogeneização, as amostras foram armazenadas a -20ºC até a sua utilização.

3.4.2 Método 2: Excistamento + tiocianato de guanidina-sílica

Após o processo de indução de excistamento, as amostras foram incubadas apenas em

pK e tampão TE, diferentemente do método 1, no qual a incubação foi realizada em tampão

de lise, contendo não somente a enzima, mas também detergente SDS e outros sais.

Posteriormente, as amostras foram tratadas com solução de tiocianato de guanidina (GuSCN)

e suspensão de partículas de sílica, com base no protocolo descrito por Boom et al. (1990).


As amostras foram homogeneizadas com 300 μl de ácido taurocólico 1,5% em água e

incubadas a 37ºC por 2 h, com agitação de 1.000 rpm por 15 s a cada 5 min. Após a

centrifugação a 15.000 g por 5 min, o sobrenadante foi descartado por inversão de tubos e o

sedimento foi lavado com tampão TE q.s.p. 1,5 ml. Centrifugou-se novamente a 15.000 g por

5 min, sendo o sobrenadante descartado por inversão de tubos. O sedimento foi

homogeneizado com 20 μl de proteinase K (10 mg/ml) e tampão TE q.s.p. 200 μl. As

amostras foram incubadas a 56ºC por 2 h, com agitação de 1.000 rpm por 15 s a cada 5 min.

37

3.4.2.2 Tiocianato de guanidina-sílica (GuSCN-sílica)

As amostras foram homogeneizadas com 1 ml de solução de lise (10 M GuSCN; 0,1

M Tris-HCl pH 6,4; 0,02 M EDTA pH 8,0; 1,3% Triton X-100) e 40 μl de solução carreadora

(20% de Terra Diatomácea em 0,17 M HCl) e deixadas em repouso durante 20 min. Após

serem homogeneizadas novamente, as amostras foram centrifugadas a 15.000 g por 1,5 min.

Descartou-se o sobrenadante por inversão de tubos. O sedimento foi lavado duas vezes com

500 μl de tampão de lavagem (10 M GuSCN; 0,1 M Tris-HCl pH 6,4), duas vezes com etanol

70% e uma vez com acetona 99,5%, sempre com centrifugações a 15.000 g por 2 min e

descarte do sobrenadante por inversão de tubos. Após o descarte da acetona, os microtubos

foram incubados destampados a 37 ºC por 30 min. Após a secagem do sedimento, foram

acrescentados 150 μl de tampão TE (10 mM Tris HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0). As

amostras foram incubadas a 56 ºC por 10 min, homogeneizadas e centrifugadas a 15.000 g por

5 min. O sobrenadante (70 μl) foi disposto em outro microtubo e armazenado a -20 ºC até a

sua utilização.

3.4.3 Método 3: Excistamento + kit QIAmp DNA Stool Mini

As amostras foram submetidas ao método de indução de excistamento e

posteriormente processadas de acordo com as instruções do manual fornecido pelo fabricante

do kit comercial QIAmp DNA Stool Mini (Qiagen, Alemanha). Apenas reduziu-se o volume

do tampão AE de 200 μl para 50 μl.


As amostras foram homogeneizadas com 300 μl de ácido taurocólico 1,5% em água e

incubadas a 37ºC por 2 h, com agitação de 1.000 rpm por 15 s a cada 5 min. Após a

centrifugação a 15.000 g por 5 min, o sobrenadante foi descartado por inversão de tubos e o

38

sedimento foi lavado com tampão TE q.s.p. 1,5 ml. Centrifugou-se novamente a 15.000 g por

5 min, sendo o sobrenadante descartado por inversão de tubos.

3.4.3.2. kit QIAmp DNA Stool Mini

As amostras foram homogeneizadas a 1,4 ml de tampão ASL por 1 min em vórtex. As

suspensões foram aquecidas por 5 min a 95°C, com agitação de 1.000 rpm por 15 s a cada 1

min, homogeneizadas e centrifugadas a 20.000 g por 1 min. O volume de 1,2 ml do

sobrenadante foi transferido para um novo microtubo de 2 ml e o pellet foi descartado. A cada

amostra adicionou-se um tablete InhibitEX, e para que este estivesse em completa suspensão,

as amostras foram homogeneizadas por 1 min em vórtex. Em seguida foram incubadas por 1

min em temperatura ambiente para permitir que os inibidores fossem adsorvidos pela matriz

do InhibitEX. Para sedimentação dos inibidores ligados à matriz do InhibitEX, as amostras

foram centrifugadas a 20.000 g por 3 min. Em seguida todo o sobrenadante foi transferido a

um novo microtubo de 1,5 ml, sendo o pellet descartado. Centrifugou-se novamente a 20.000

g por 3 min para eliminação de resíduos do InhibitEX. Foram transferidos 200 μl do

sobredante a um novo microtubo contendo 15 μl de proteinase K. Após a adição de 200 μl de

tampão AL, as amostras foram homogeneizadas e incubadas a 70° C por 10 min. Em seguida,

adicionaram-se 200 μl de etanol 100% e as amostras foram cuidadosamente transferidas a

uma coluna QIAmp spin sobreposta a um tubo coletor de 2 ml e centrifugadas a 20.000 g por

1 min. A coluna foi sobreposta a um novo tubo coletor de 2 ml e o tubo contendo o filtrado

foi descartado. Adicionaram-se 500 μl de tampão AW1 e centrifugou-se a 20.000 g por 1 min.

A coluna foi sobreposta a um novo tubo coletor de 2 ml e o tubo contendo o filtrado foi

descartado. Foram acrescentados 500 μl de tampão AW2, em seguida as amostras foram

centrifugadas a 20.000 g por 3 min. A coluna foi transferida a um novo microtubo de 1,5 ml e

cuidadosamente acrescentaram-se 50 μl de tampão AE diretamente na membrana QIAmp.

Após uma incubação de 1 min em temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas a

20.000 g por 1 min. O tubo contendo o filtrado foi armazenado a -20° C até a sua utilização.

Todos os reagentes citados compõem o kit QIAmp DNA Stool Mini, com exceção do

etanol 100%.

39

3.4.4 Método 4: Choque térmico + fenol-clorofórmio

As amostras foram primeiramente homogeneizadas ao tampão de SDS, submetidas ao

choque térmico e posteriormente incubadas em pK, para então serem purificadas pela técnica

de fenol-clorofórmio.

3.4.4.1 Choque térmico

As amostras foram homogeneizadas com 500 μl de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0); 25 mM

EDTA (pH 8,0); 100 mM NaCl e 1% SDS. Para ruptura dos oocistos foram realizados cinco

ciclos de congelamento em gelo seco por 5 min e descongelamento em banho-seco a 65ºC por

5 minutos. Adicionaram-se 20 μl de proteinase K (10 mg/ml) com incubação a 56ºC por 2 h,

com agitação de 1.000 rpm de 15 s a cada 5 min.

3.4.4.2 Fenol-clorofórmio

As amostras foram purificadas pelo mesmo método descrito no item 3.3.1.2.

3.4.5 Método 5: Choque térmico + tiocianato de guanidina-sílica

As amostras foram submetidas diretamente ao processo de choque térmico, sem o

acréscimo de reagentes e posteriormente incubadas somente em pK e tampão TE, para então

serem purificadas pela técnica descrita por Boom et al. (1990).

40


As amostras foram submetidas a 5 ciclos de congelamento em gelo seco por 5 min e

descongelamento em banho-seco a 65ºC por 5 minutos. Adicionaram-se 20 μl de proteinase K

(10 mg/ml) e tampão TE q.s.p. 200 μl, com incubação a 56ºC por 2 h e agitação de 1.000 rpm

de 15 s a cada 5 min.

3.4.5.2 Tiocianato de guanidina-sílica

A purificação do DNA foi realizada conforme descrito no item 3.4.2.2.

3.4.6 Método 6: Choque térmico + kit QIAmp DNA Stool Mini

As amostras foram submetidas ao choque térmico previamente acrescidas de tampão

ASL, fornecido pelo kit QIAmp DNA Stool Mini.


Primeiramente as amostras foram homogeneizadas a 1,4 ml do tampão ASL e em

seguida procederam-se os cinco ciclos de congelamento em gelo seco por 5 min e

descongelamento em banho-seco a 65ºC por 5 minutos.

3.4.6.2 kit QIAmp DNA Stool Mini

Após a lise dos oocistos e esporozoítos, as amostras foram processadas com o kit

QIAmp DNA Stool Mini conforme descrito no item 3.4.3.2, apenas levando-se em

41

consideração que o tampão ASL fora adicionado antes dos ciclos de congelamento de

descongelamento.

3.5 CONTROLES NEGATIVOS

A cada cinco amostras submetidas aos métodos de extração de DNA foi incluído um

controle negativo composto de TE, o qual foi processado na mesma forma que as demais

amostras.

3.6 AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO DOS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA

A avaliação das sensibilidades foi realizada pela eficiência das nested PCRs em

amplificar um fragmento do gene SSU rRNA a partir de DNA extraído pelos diferentes

métodos. Os protocolos das reações de amplificação estão descritos no item 3.1.4.2. Os

produtos amplificados foram detectados por corrida eletroforética em gel de agarose (item

3.1.4.3).

42

4 RESULTADOS

O item descreve os dados obtidos na obtenção de oocistos de Cryptosporidium

parvum e nos testes de sensibilidades analítica e diagnóstica dos diferentes métodos de

extração de DNA.


Foram analisadas 25 amostras fecais de bezerros, das quais 3 (12%) apresentaram-se

positivas na pesquisa de Cryptosporidium tipo parvum pelo exame microscópico (item

3.1.2). No entanto, as três amostras positivas apresentavam um número pequeno de oocistos,

sendo inviável submetê-las à purificação de oocistos para avaliação dos métodos de extração

de DNA.

Dentre as 19 amostras de humanos, previamente diagnosticadas como positivas, cinco

apresentavam quantidade satisfatória de oocistos e foram caracterizadas genotipicamente

pelo sequenciamento do gene SSU rRNA (Tabela 3).

Tabela 3 – Identificação molecular pelo sequenciamento do gene SSU rRNA de isolados fecais de Cryptosporidum spp. provenientes de indivíduos apresentando intensa liberação de oocistos

Amostra Espécie (Sequenciamento gene SSU rRNA)

4 Cryptosporidium hominis

28 Cryptosporidium felis

51 Cryptosporidium parvum

83 Cryptosporidium parvum

9N* Cryptosporidium parvum

*Amostra empregada nos testes de sensibilidade analítica.

43

A amostra 9N foi submetida à purificação de oocistos, conforme o item 3.1.3, e

empregada nos testes de sensibilidade analítica dos métodos moleculares deste estudo.

Embora os isolados 51 e 83 também tenham sido identificados como C. parvum, optou-se

por utilizar a amostra 9N, pois além da presença de grande quantidade de oocistos, havia a

disponibilidade de uma quantidade maior de fezes.

A amostra 9N continha aproximadamente 50 g de fezes, sendo que ao final do

processo de purificação, restringiu-se a uma suspensão de aproximadamente 10 ml, com

concentração estimada de 106 oocistos/ml.

4.2 TESTE DE SENSIBILIDADE ANALÍTICA

Os testes de sensibilidade analítica de cada método de extração de DNA foram

realizados em triplicatas, processadas em dias distintos. Somente os métodos com o emprego

do kit QIAmp DNA Stool Mini foram realizados uma única vez.

Os métodos foram aplicados em amostras de oocistos purificados e em amostras fecais

contaminadas com quantidades conhecidas de oocistos purificados, com exceção das técnicas

envolvendo o kit comercial, as quais foram aplicadas somente em amostras fecais.

Nos métodos em que houve a possibilidade de comparação, as sensibilidades das

nested PCRs foram reduzidas na presença de fezes, quando comparada com amostras de

oocistos purificados. O método de extração com o emprego de excistamento e purificação

com fenol-clorofórmio, possibilitou a detecção de até 1 oocisto pela nested PCR. No entanto,

na presença de fezes, a sensibilidade reduziu-se até 10.000 vezes. Nos demais métodos a

redução das sensibilidades analíticas na presença de fezes também foi bastante expressiva,

variando de 1.000 a 10.000 vezes (Tabela 4).

Em amostras purificadas, EF apresentou a maior sensibilidade analítica em amostras

purificadas, possibilitando a detecção de até 1 oocisto. Também proporcionou boa

repetibilidade, sendo obtidos resultados semelhantes nas três repetições. CF e ES

apresentaram sensibilidades similares na ausência de fezes, possibilitando a detecção de 10

oocistos (duas replicatas) e 102 oocistos (uma replicata). O método CS permitiu a detecção de

102 oocistos (duas replicatas) e 103 oocistos (uma replicata).

Em amostras fecais, os métodos que empregaram fenol-clorofórmio e kit QIAmp DNA

Stool Mini mostraram eficiência semelhante, com detecção apenas em amostras com 104

44

oocistos. Somente em uma das replicatas, o método EF possibilitou a detecção de até 103

oocistos. As extrações com GuSCN-sílica foram em média 10 vezes menos sensíveis que os

demais métodos de purificação, com capacidade de detecção de 105 oocistos, exceto por uma

replicata com excistamento, na qual o limiar de detecção foi de 104 oocistos.

Em oocistos purificados, os procedimentos de extração de DNA com o emprego da

técnica de indução de excistamento apresentaram melhor sensibilidade analítica, quando

comparados aos de choque térmico. Na presença de fezes, a melhora com a técnica de

excistamento foi inconsistente, tendo um aumento de 10 vezes em apenas uma das replicatas,

tanto associada ao fenol-clorofórmio, como a GuSCN-sílica. Da mesma forma, EK e CK

apresentaram mesma sensibilidade.

As sensibilidades diagnósticas dos métodos de extração de DNA avaliadas pela nested

PCR do gene SSU rRNA são apresentadas na tabela 4.

Tabela 4 – Sensibilidades analíticas das nested PCRs do gene SSU rRNA após amplificação de DNA extraído por diferentes métodos, na ausência e na presença de 100 μl de fezes bovina. As diluições avaliadas continham de 105 a 1 oocisto(s)

Métodos de extração de DNA Oocistos Oocistos + Fezes

1. Excistamento / Fenol-clorofórmio 1 1 1 103 104 104

2. Excistamento / GuSCN-sílica 10 102 10 105 104 105

3. Excistamento / Kit QIAmp DNA Stool Mini NR NR NR 104 NR NR

4. Choque térmico / Fenol-clorofórmio 10 10 102 104 104 104

5. Choque térmico / GuSCN-sílica 102 102 103 105 105 105

6. Choque térmico / Kit QIAmp DNA Stool Mini NR NR NR 104 NR NR

NR: não realizado.

As fotos apresentam os resultados dos testes de sensibilidade analítica em gel de

agarose, depois de realizada corrida eletroforética dos produtos amplificados pela nested

PCR do gene SSU rRNA, provenientes de diferentes métodos de extração de DNA em

amostras com diluições conhecidas de oocistos purificados, na ausência (Figura 1) e na

presença de fezes (Figura 2). Nos métodos que apresentaram valores de sensibilidades

analíticas diferentes nas triplicatas, foi ilustrado o resultado que apresentou repetição.

45

Figura 1 – Eletroforeses em gel de agarose dos produtos das nested PCRs do gene SSU rRNA

resultantes da amplificação de DNA extraído pelos métodos EF, ES, CF e CS, a partir de oocistos purificados. Os valores são referentes ao número estimado de oocistos de C. parvum presente nas amostras submetidas à extração de DNA. PM: Peso molecular, múltiplos de 100 pares de base

10-1110102103104105PM 10-1110102103104105PM

Cho

que

térm

ico

-Síli

caC

hoqu

e té

rmic

o -F

enol

Exci

stam

ento

-Fen

olEx

cist

amen

to-S

ílica

PM 105 103104 102 10 1 10-110-1110102103104105PM 10-1110102103104105PM

Cho

que

térm

ico

-Síli

caC

hoqu

e té

rmic

o -F

enol

Exci

stam

ento

-Fen

olEx

cist

amen

to-S

ílica

PM 105 103104 102 10 1 10-1

46

Figura 2 – Eletroforeses em gel de agarose dos produtos das nested PCRs do gene SSU rRNA

resultantes da amplificação de DNA extraído pelos métodos de EF, ES, EK, CF, CS e CK, a partir de 100 μl de fezes bovinas contaminadas com oocistos purificados. Os valores são referentes ao número estimado de oocistos de C. parvum presente nas amostras submetidas à extração de DNA. PM: Peso molecular, múltiplos de 100 pares de base

10-1110102103104105PM 10-1110102103104105PM

Cho

que

térm

ico

-Fen

olEx

cist

amen

to-K

itEx

cist

amen

to-F

enol

Exci

stam

ento

-Síli

caC

hoqu

e té

rmic

o -K

itC

hoqu

e té

rmic

o -S

ílica

Cho

que

térm

ico

-Fen

olEx

cist

amen

to-K

itEx

cist

amen

to-F

enol

Exci

stam

ento

-Síli

caC

hoqu

e té

rmic

o -K

itC

hoqu

e té

rmic

o -S

ílica

PM 105 104 103 102 10 1 10-1PM 105 104 103 102 10 1 10-1

47

4.3 TESTE DE SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA

Para a avaliação das sensibilidades diagnósticas dos métodos de extração de DNA

foram empregadas 15 amostras fecais provenientes de diversos hospedeiros naturalmente

infectados com Cryptosporidium spp. As amostras foram diagnosticadas pelo método

coproparasitológico de centrífugo-flutuação em sacarose, considerado o padrão-ouro.

4.3.1 Sensibilidade diagnóstica dos métodos de extração de DNA em amostras fecais

O kit QIAmp DNA Stool Mini, empregado em conjunto com excistamento e choque

térmico, apresentou os melhores desempenhos nas reações de amplificação do DNA das

amostras avaliadas, com sensibilidades de 86,7% (13/15). CS obteve 66,7% (10/15) de

sensibilidade, enquanto que EF e ES obtiveram 60% (9/15) (Figuras 3 e 4). CF detectou o

menor número de amostras, com apenas 53,3% (8/15) de sensibilidade. A tabela 5 apresenta

os valores das sensibilidades diagnósticas dos diferentes métodos avaliados.

Tabela 5 – Sensibilidades diagnósticas dos diferentes métodos de extração de DNA, determinadas por meio da nested PCR do gene SSU rRNA de 15 amostras fecais positivas pelo método coproparasitológico de centrífugo-flutuação em sacarose, considerado o padrão-ouro

Métodos de extração de DNA N° de

amostras positivas

Sensibilidade diagnóstica

%

1. Excistamento/Fenol-clorofórmio 9 60

2. Excistamento/GuSCN-sílica 9 60

3. Excistamento/kit QIAmp DNA Stool Mini 13 86,7

4. Choque térmico/Fenol-clorofórmio 8 53,3

5. Choque térmico/GuSCN-sílica 10 66,7

6. Choque térmico/kit QIAmp DNA Stool Mini 13 86,7

48

Figura 3 – Eletroforese em gel agarose dos produtos da nested PCR do gene SSU rRNA resultantes da amplificação de DNA extraído pelo método EK, a partir de amostras fecais de hospedeiros naturalmente infectados com Cryptosporidium spp. PM: Peso molecular, múltiplos de 100 pares de base

Figura 4 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos da nested PCR do gene SSU rRNA resultante da amplificação de DNA extraído pelo método CK, a partir de amostras fecais de hospedeiros naturalmente infectados com Cryptosporidium spp. PM: Peso molecular, múltiplos de 100 pares de base

A tabela 6 expõe os resultados das nested PCRs pelo gene SSU rRNA de

Cryptosporidium spp. das 15 amostras fecais positivas submetidas aos diferentes métodos de

extração de DNA, correlacionando com as espécies dos hospedeiros e com a intensidade de

eliminação de oocistos nas fezes.

As cinco amostras fecais de humanos analisadas, apresentaram-se positivas por pelo

menos quatro métodos de extração de DNA, mesmo aquelas que apresentavam poucos

oocistos, como as amostras 5 e 7. Somente a amostra 9, apesar da observação de 6 a 10

151413121110987654 321PM 151413121110987654 321PM

15 141312111098765432 1PM 15 141312111098765432 1PM

49

oocistos por campo na lâmina, apresentou-se negativa pelos métodos que empregaram fenol-

clorofórmio. As amostras 6 e 8 foram negativas somente pelo método CF.

De forma semelhante, as seis amostras fecais de bovino analisadas apresentaram

resultados positivos em todos os métodos de extração de DNA. Exceto pelas amostras 4 e 15,

que não foram amplificadas quando extraídas pelos métodos que empregaram a GuSCN-

sílica, e as amostras 11 e 14, negativas pelo método EF.

Contrariamente, as amostras de cão e gatos apresentaram-se negativas para a maioria

dos métodos de extração de DNA, mesmo aquelas como a 3 e a 10, com mais de 6 oocistos

por campo de observação em lâmina. Os métodos ES e CF não foram eficazes na purificação

de nenhuma das amostras desses hospedeiros.

Tabela 6 – Resultados das amplificações pela nested PCR do gene SSU rRNA de amostras fecais positivas na pesquisa de oocistos de Cryptosporidium pelo método de centrífugo-flutuação em sacarose. As amostras fecais foram submetidas a seis métodos de extração de DNA, resultantes da combinação com pequenas variações de cinco técnicas: excistamento (E), choque térmico (C), fenol-clorofórmio (F), GuSCN-sílica (S) e kit QIAmp DNA Stool Mini (K). As amostras eram provenientes de humanos (H), bovinos (B), cão (C) e gatos (G)

Métodos de extração de DNA Amostra Hospedeiro

Intensidade da eliminação

de oocistos EF ES EK CF CS CK

1 Cão + N N P N N N

2 Gato + P N N N N N

3 Gato + + + + N N P N N P

4 Bovino + P N P P N P

5 Humano + P P P P P P

6 Humano + + P P P N P P

7 Humano + + P P P P P P

8 Humano + P P P N P P

9 Humano + + + N P P N P P

10 Gato + + + + N N N N P P

11 Bovino + N P P P P P

12 Bovino + + + + P P P P P P

13 Bovino + + + P P P P P P

14 Bovino + + + N P P P P P

15 Bovino + + P N P P N P P (Positivo); N (Negativo). (+) < 1 oocisto por campo de observação em microscópio óptico (aumento de 400x); (+ +) 1-5 oocistos por campo; (+ + +) 6-10 oocistos por campo; (+ + + +) > 10 oocistos por campo.

50

4.3.2 Sensibilidade diagnóstica do método EF em amostras purificadas

Todas as 15 amostras fecais submetidas ao processo de purificação e concentração de

oocistos por centrífugo-flutuação em sacarose, antes da extração de DNA pelo método EF,

foram amplificadas pela nested PCR do gene SSU rRNA. Comparando-se a capacidade de

detecção deste método com a técnica de microscopia, considerada como padrão-ouro, a

sensibilidade obtida foi de 100%. A figura 5 ilustra os resultados das nested PCR em gel de

agarose na avaliação da sensibilidade diagnóstica do método de centrífugo-flutuação em

sacarose associado à extração de DNA por excistamento/fenol-clorofórmio.

Figura 5 – Eletroforese em gel agarose dos produtos da nested PCR resultante da amplificação de DNA extraído pelo método EF, a partir de amostras de oocistos de Cryptosporidium spp. concentrados e purificados de fezes pela técnica de centrífugo-flutuação em sacarose. PM: Peso molecular, múltiplos de 100 pares de base

1514 13 1211109876543 21 PM 1514 13 1211109876543 21 PM

51

5 DISCUSSÃO


A obtenção de grande quantidade de oocistos de Cryptosporidium parvum foi possível

somente a partir de amostras fecais humanas, previamente diagnosticadas como positivas

pelo Laboratório de Parasitologia do Instituto de Infectologia Emílio Ribas. As amostras

eram provenientes de pacientes imunocomprometidos pelo vírus da imunodeficiência

humana, e apresentavam infecção oportunista por Cryptosporidium. A amostra 9N foi

selecionada, não somente pela presença de grande quantidade de oocistos, mas também pela

disponibilidade de um volume maior de fezes.

Entre as 25 amostras fecais bovinas analisadas, 3 (12%) apresentaram-se positivas para

Cryptosporidium. No entanto, por serem provenientes de animais com baixa intensidade de

infecção, foi observada eliminação de pequena quantidade de oocistos. Instalada então

infecção experimental em bezerro com uma semana de idade, não se verificou a eliminação

de oocistos (dados não mostrados). Talvez fosse necessário impedir a ingestão de colostro

pelo bezerro ou realizar imunossupressão para que a instalação da infecção fosse consistente.

No processo de purificação de oocistos, buscou-se o emprego de um método acessível e

com eficácia satisfatória na recuperação e limpeza dos oocistos. Embora existam outros

métodos tecnologicamente mais sofisticados e com desempenho superior, o selecionado é de

fácil execução, bem como emprega reagentes e equipamentos comuns a maior parte dos

laboratórios. O método foi descrito por Brien e Jenkins (2007) para purificação de oocistos

em grandes volumes de fezes (no presente trabalho foram realizadas algumas adaptações para

volumes menores). Ao final do processo, verificou-se boa recuperação de oocistos e pequena

quantidade de debris, que pouco prejudicou a visualização em câmara de Neubauer para a

contagem de oocistos. De acordo com os autores, o método é capaz de recuperar um grande

número de oocistos, com mínima contaminação por microorganismos fecais. Ainda é

recomendado para purificação de oocistos destinados a métodos como excistamento, cultura

de célula, análise de proteômica ou infecção experimental.

52

5.2 AVALIAÇÃO DOS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA

Para a avaliação da sensibilidade analítica dos métodos de extração de DNA, foram

empregados oocistos da espécie Cryptosporidium parvum. Esta é considerada a principal

espécie zoonótica e encontra-se em grande variedade de animais domésticos e silvestres. No

entanto, estudos têm apontado que os bovinos em período lactente são o único grande

reservatório de C. parvum aos humanos (GOH et al., 2004; XIAO; FENG, 2008). C. parvum

também é amplamente distribuído entre os humanos, sendo responsável pela maioria dos

casos de criptosporidiose em países desenvolvidos. Além da transmissão zoonótica,

recentemente tem sido demonstrada a transmissão antroponótica de subgenótipos de C.

parvum compartilhados entre humanos e bovinos, principalmente em países em

desenvolvimento (XIAO; FENG, 2008). Na avaliação da sensibilidade analítica do presente

estudo, oocistos de origem humana foram empregados na contaminação experimental de

fezes provenientes de bezerro lactente. A espécie hospedeira na qual foram isolados os

oocistos tem pouca relevância, levando-se em consideração que os oocistos foram

identificados como pertencentes à espécie C. parvum, sabidamente compartilhada entre

humanos e bovinos.

A nested PCR do gene SSU rRNA foi empregada na avaliação qualitativa do

desempenho dos métodos de extração de DNA de oocistos de Cryptosporidium provenientes

de amostras fecais. Apesar do alto risco de contaminação, a realização da nested PCR, e não

somente da PCR, mostrou-se necessária, uma vez que a sensibilidade e especificidade são

aumentadas consideravelmente, propriedade importante quando o diagnóstico é realizado a

partir de amostras fecais. Além da presença de inibidores, o material fecal é composto por

uma microbiota bastante diversificada, muitas vezes, em meio a poucos oocistos de

Cryptosporidium (AMAR et al, 2004), o que requer um método de detecção altamente

sensível e específico. As duas etapas da PCR contribuem para diluição de potenciais

inibidores e fornece quantidade suficiente de DNA alvo para a PCR secundária, já que na

PCR primária, ocorrem algumas amplificações na presença de inibidores, mesmo que não

sejam detectadas pela técnica de eletroforese (MCORIST et al., 2002).

Uma outra forma de quantificar a concentração de DNA extraído pode ser realizada

por meio de espectrofotômetro em luz violeta nos comprimentos de onda 260 e 280 nm,

assim como sua qualidade pode ser verificada pela razão de absorbância a A260/A280. No

entanto, esse método, quando empregado em amostras clínicas tem pequena resolução por

53

não ser capaz de discriminar o DNA extraído de diferentes organismos. A quantificação de

DNA por espectrofotometria ainda pode apresentar baixa correlação em relação ao método

da PCR. Em amostras fecais, a correlação é agravada pela presença e concentrações variadas

de diferentes tipos de inibidores. Dessa forma, amostras com elevadas concentrações de

DNA pela espectrofotometria, podem apresentar resultados negativos nas amplificações pela

PCR, quando comparados ao resultado positivo em pequenas concentrações (ALMEIDA,

2004).

A técnica de Real-Time PCR tem sido empregada em estudos comparativos de

métodos diagnósticos envolvendo extração e amplificação de DNA. Apesar de oferecer

diversas vantagens em relação ao PCR convencional, trata-se de uma tecnologia cara, que

emprega equipamentos e regentes de alto custo, não sendo acessível para grande parte das

instituições de pesquisa. Além disso, Higgins et al. (2001) não obtiveram resultados

satisfatórios nas quantificações de DNA de C. parvum em amostras com poucos oocistos e

alta concentração de inibidores, sendo necessário o uso de nested PCR para a detecção de tais

amostras. Embora a técnica de Real-time PCR também seja empregada na identificação de

isolados de Cryptosporidium, a nested PCR associada com outras técnicas como RFLP e

sequenciamento ainda é o método mais comumente utilizado para esse fim.

O gene SSU rRNA foi selecionado como marcador na avaliação do desempenho dos

diferentes métodos de extração de DNA, por ser um gene de cópias múltiplas, o que confere

aumento de sensibilidade às reações de amplificação de DNA, quando comparado a genes de

cópia única. Este marcador é amplamente empregado na identificação das espécies de

Cryptosporidium, por possuir alta variabilidade interespecífica e baixa variabilidade

intraespecífica, quando comparado às seqüências gênicas de outros marcadores, como gp60 e

ITS-2 (JEX et al., 2008). O protocolo de amplificação do gene SSU rRNA foi empregado em

diversos estudos realizados no nosso laboratório (MEIRELES et al., 2006; THOMAZ et al.,

2007; MEIRELES et al., 2007), encontrando-se bem estabelecido e padronizado nas

condições do local de trabalho de nossa instituição.

A avaliação do desempenho dos métodos de extração de DNA foi realizada em

amostras fecais congeladas. O congelamento é uma das formas mais comuns de preservação

de material fecal ou de oocistos previamente purificados (WARD; WANG, 2001). No

primeiro caso, requer métodos que extraiam o DNA do parasita diretamente das fezes

(WARD; WANG, 2001), já que o congelamento de oocistos pode interferir em suas

propriedades físicas e bioquímicas, alterando a eficiência dos métodos de purificação e

concentração realizados previamente à extração de DNA (INOUE et al., 2006).

54

5.2.1 Teste de sensibilidade analítica

A avaliação da sensibilidade analítica dos métodos de extração de DNA foi realizada em

amostras de oocistos purificados e em 100 μl de fezes de bovino contaminadas com oocistos

purificados. As diluições decimais analisadas continham de 105 a 1 oocisto(s). A comparação

entre as sensibilidades na ausência e na presença de fezes não foi possível nos métodos que

empregaram o kit QIAmp DNA Stool Mini, o qual foi avaliado apenas na presença de fezes,

não sendo realizado em amostras de oocistos purificados devido ao seu alto custo.

O presente estudo empregou o kit QIAmp DNA Stool Mini, adicionando algumas

modificações ao protocolo descrito pelo fabricante. As amostras foram primeiramente

submetidas a ciclos de congelamento e descongelamento ou excistamento com ácido

taurocólico, sendo posteriormente processadas de acordo com as instruções do fabricante.

Além disso, na última etapa, o volume do tampão de eluição AE foi reduzido de 200 μl para

50 μl. Os tratamentos adicionais para o rompimento dos oocistos foram considerados

necessários, já que as instruções do fabricante preconizam apenas o aumento de temperatura

de 70°C para 95°C para a lise de células com estruturas mais resistentes, tais como bactérias

Gram-positivas. No entanto, oocistos de Cryptosporidium têm resistência superior, sendo

necessários tratamentos mais rigorosos ou específicos para o seu rompimento.

O emprego do kit em amostras fecais sem purificação prévia resultou em sensibilidade

diagnóstica de 104 oocistos, tanto associado com a técnica de excistamento, quanto com a de

choque térmico. Sensibilidades semelhantes ao kit foram obtidas pelos métodos aplicados em

conjunto com a purificação por fenol-clorofórmio. Pode-se concluir que não houve diferenças

expressivas nas sensibilidades analíticas entre os métodos que empregaram o kit QIAmp

DNA Stool Mini e a técnica de fenol-clorofórmio na extração de DNA em amostras fecais.

No entanto os métodos de GuSCN-sílica foram em média 10 vezes menos sensíveis.

Analisando-se somente os resultados das sensibilidades dos métodos de extração de

DNA em oocistos purificados, verificou-se que a técnica de purificação por fenol-

clorofórmio obteve melhor desempenho em relação à de GuSCN-sílica. Um dos fatores que

pode reduzir a sensibilidade do método de GuSCN-sílica, mesmo em amostras puras, é a

presença de inibidores originados da suspensão de partículas de sílica empregada na extração

de DNA. Esses inibidores aparentemente estão fortemente ligados às partículas de sílica,

assim permanecendo no processo de purificação, sendo eluidos, juntamente com o DNA na

última etapa do procedimento (BOOM et al., 1999). Boom et al. (1990) também relatam que

55

algumas moléculas de DNA falham em se aderir nas partículas de sílica, sendo perdidas

durante as lavagens ou não são eluidas devido a forças físicas irreversíveis.

Na técnica de fenol-clorofórmio as amostras foram incubadas em tampão contendo

detergente SDS, que lisa as células e auxilia na remoção das proteínas do DNA e proteinase

K, responsável pela desproteinização. Resíduos protéicos e lipídicos, além de outros

compostos orgânicos, são removidos pela extração com fenol-clorofórmio, e o DNA

permanece retido na fase aquosa da amostra. A precipitação com álcool auxilia na remoção

de resíduos orgânicos e ajuda a concentrar o DNA da solução aquosa. Essa técnica

demonstrou boa recuperação de DNA, verificada pelo alto limiar de detecção em amostras de

oocistos purificados. No entanto, sua capacidade de remover inibidores é deficiente,

evidenciada pela intensa redução de sensibilidade na presença de material fecal. Ward e

Wang (2001) empregando o método de fenol-clorofórmio obtiveram resultados inconsistentes

em amostras fecais com menos de 104 oocistos. Além disso, a técnica tem como principais

desvantagens a geração de resíduos perigosos e consumir longos períodos de tempo.

Avaliando-se as técnicas de fenol-clorofórmio e GuSCN-sílica quanto ao desempenho

da purificação de DNA, observou-se que na presença de fezes houve uma significativa

diminuição na sensibilidade analítica de todos os métodos avaliados, verificando-se reduções

de 1.000 a 10.000 vezes, quando comparado a sensibilidade em oocistos purificados. A

principal causa dessa redução se deve a presença de inibidores que interferem na interação

entre o DNA e a DNA polimerase (JOHNSON et al., 1995). Os inibidores fecais de PCR

incluem polissacarídeos complexos, sais biliares, produtos da degradação da hemoglobina,

compostos polifenólicos, metais pesados, dentre outros (STAUFFER et al., 2008); e

apresentam variação de acordo com a dieta, flora intestinal e condições de saúde do

hospedeiro (GONÇALVES et al., 2008). O excistamento in vitro também pode ser

parcialmente inibido em oocistos expostos a gorduras fecais que interferem na sinalização,

bloqueando a exposição dos receptores de superfície necessários ao processo de indução de

excistamento (ROBERTSON et al., 1993). Essa inibição pode ser reversível pela exposição

dos oocistos a uma solução de hipoclorito de sódio (1,75-5,25%) ou solução de Hanks

(HBSS), capazes de expor novamente os receptores necessários na sinalização do

excistamento (ROBERTSON et al., 1993).

Em oocistos purificados, os métodos que empregaram excistamento (300 μl de ácido

taurocólico 1,5% a 37°C por 2 h) foram em média 10 vezes mais sensíveis quando

comparados aos métodos que aplicaram o choque térmico (5 ciclos de congelamento em gelo

seco por 5 min e descongelamento a 65°C por 5 min). Na presença de material fecal, as duas

56

técnicas foram eficientemente equivalentes. Ward e Wang (2001) compararam a técnica de

excistamento (100 μl de ácido taurocólico 1,5% a 37°C por 2 h) e choque térmico (3 ciclos de

congelamento em nitrogênio líquido por 2 min e descongelamento a 75°C por 2 min) de

oocistos de Cryptosporidium em amostras fecais, e também não observaram diferenças entre

os desempenhos dos métodos.

Na presença de material fecal, o desempenho do excistamento pode ser melhorado

adicionando-se um tratamento prévio com hipoclorito de sódio ou HBSS para exposição dos

receptores dos oocistos, antes da incubação em ácidos ou sais biliares (ROBERTSON et al.,

1993). Em amostras de oocistos com mínima contaminação, esse tratamento parece ser

desnecessário. De acordo com Gold et al. (2001), o clareamento em hipoclorito de sódio não

aumentou a porcentagem de excistamento, comparativamente ao tratamento isolado com sal

biliar de taurocolato de sódio. Os autores apontam que a variação nos métodos de purificação

e concentração pode influenciar nas propriedades da superfície dos oocistos, fazendo com

que o tratamento prévio com hipoclorito de sódio melhore ou não a porcentagem de

excistamento.

Os mecanismos moleculares e bioquímicos envolvidos no excistamento de

esporozoítos de Cryptosporidium são pouco conhecidos. Sabe-se que fatores do meio interno

do hospedeiro como, temperatura, flutuações no pH, proteases, sais biliares, agentes

redutores, além do tempo de exposição, são importantes na ativação do excistamento de

oocistos. No entanto, o modo como tais fatores de indução estão relacionados e a importância

hierárquica de cada um são pouco compreendidos, em parte pela ausência de padronização

dos métodos empregados nos estudos (SMITH et al., 2005).

Ácidos e sais biliares, tais como ácido taurocólico e taurocolato de sódio, são

comumente empregados na indução de excistamento in vitro, por aumentar a secreção de

proteínas e a mobilidade dos esporozoítos (FENG et al., 2006), mas pouco se conhece sobre o

mecanismo de ação desses agentes (GOLD et al., 2001).

De acordo com Kato et al. (2001) existem basicamente dois métodos pelos quais o

excistamento poderia ser induzido. Em um deles, enzimas armazenadas internamente nos

oocistos ou nos esporozoítos seriam secretadas após estímulos específicos causando abertura

da sutura do oocisto. Pelo outro método, mudanças físicas e químicas externas causariam

modificações na sutura, ocasionando a abertura da parede sem a necessidade de enzimas.

Oocistos que são expostos ao calor (60°C por 5 min) ou folmaldeído (10% formalina) não

apresentam excistamento (JENKINS et al., 1997), o que sugere que a viabilidade dos

esporozoítos é requerida para induzir o excistamento. No entanto, a maioria dos tratamentos

57

que inviabiliza os oocistos, também modifica a conformação da parede e da sutura dos

oocistos. Para avaliar a necessidade de viabilidade dos oocistos para o excistamento, Kato et

al. (2001) analisaram os efeitos da irradiação gama sobre oocistos, a qual é potencialmente

capaz de inativar os esporozoítos sem afetar a estrutura da parede dos oocistos. Os resultados

do estudo sugerem que oocistos irradiados podem manter a capacidade de excistamento e

aparente infecção, perdendo a viabilidade pela provável incapacidade de reprodução dos

esporozoítos. A hipótese de que enzimas têm envolvimento no processo de excistamento

pôde ser sustentada pelo fato de que oocistos irradiados com 5.000 kra foram incapazes de

excistar, sabendo-se que essa dose de irradiação é capaz de inativar enzimas. Assim,

possivelmente o excistamento ocorra mesmo em oocistos sem viabilidade, mas que têm as

propriedades da parede conservadas.

O efeito da temperatura no excistamento de oocistos de Cryptosporidium foi avaliado

por diversos estudos por se tratar de um dos principais fatores determinantes para o processo.

Particularmente o efeito de baixas temperaturas na viabilidade da espécie C. parvum foi

avaliado por Fayer e Nerad (1996) e Kim e Healey (2001). Os primeiros submeteram oocistos

purificados de C. parvum a diferentes temperaturas, sendo que os oocistos congelados foram

considerados viáveis apenas quando parasitas em estágio de desenvolvimento eram

observados microscopicamente nos tecidos de filhotes de camundongos imunossuprimidos.

Todos os camundongos que receberam oocistos congelados a -10ºC por 8, 24 e 168 h

apresentaram parasitas em estágio de desenvolvimento. Os camundongos inoculados com

oocistos congelados a -15ºC por 8 e 24 h apresentaram parasitas em fase de desenvolvimento,

mas não aqueles inoculados com oocistos congelados na mesma temperatura por 168 h.

Todos os camundongos que receberam oocistos congelados a -20ºC por 1, 3, 5 h tiveram C.

parvum em estágio de desenvolvimento, mas não em oocistos congelados por 24 e 168 h. Os

oocistos congelados a -70ºC não foram capazes de se desenvolver. Kim e Healey (2001)

avaliaram a viabilidade de oocistos de C. parvum após congelamento em baixas temperaturas

(-20ºC e -80ºC) por diferentes períodos (2, 7 e 30 dias) na presença e ausência de fezes. A

viabilidade foi determinada por nucleic acid stain, teste de excistamento, infectividade em

cultura de células e em camundongos adultos imunossuprimidos. Os oocistos purificados

antes do congelamento perderam a viabilidade. No entanto quando preservados em fezes a

-20ºC por 2, 7 e 30 dias, foram capazes de se manter viáveis e manter a capacidade de

infectividade. O mesmo não foi observado em oocistos congelados em fezes a -80ºC. Os

resultados desses estudos demonstram que oocistos de C. parvum não perdem a viabilidade

após congelamento em criopreservantes, temperaturas e períodos apropriados.

58

No presente estudo, as amostras de oocistos de Cryptosporidium foram primeiramente

mantidas em solução conservante de bicromato de potássio 2,5% a 4°C por aproximadamente

1 semana, purificadas e congeladas a -20°C por 2 meses. Da mesma forma, as amostras fecais

após serem contaminadas com oocistos purificados e aquelas empregadas nos testes de

sensibilidade diagnóstica foram congeladas nas mesmas condições. Não é possível afirmar se

os oocistos excistaram porque mantiveram a viabilidade após congelamento a -20ºC por

aproximadamente 2 meses ou se o excistamento ocorreu mesmo em oocistos não viáveis. No

entanto, os resultados demostram que a técnica de excistamento tem eficiência superior ou

equivalente à técnica de choque térmico.

Apesar de necessitar de um tempo de execução maior que a técnica de choque térmico, o

método de indução de excistamento é de fácil execução e emprega reagentes de baixo custo.

Já o método de choque térmico é mais trabalhoso e depende da disponibilidade de obtenção

de gelo seco, o qual só pode ser armazenado por breves períodos. Mesmo quando realizado

em nitrogênio líquido requer equipamento sofisticado, suprimento contínuo de N2 e boa infra-

estrutura do laboratório para casos de acidentes com vazamentos. Além disso, os ciclos de

congelamento de descongelamento podem degradar o DNA. Ainda tem como desvantagem o

maior risco de contaminação, já que o processo de choque térmico pode danificar os

microtubos, causando o rompimento das paredes ou abertura das tampas. Portanto o uso da

técnica de excistamento para a liberação de esporozoítos e posterior extração de DNA

mostrou-se bastante eficiente e uma boa alternativa para o método de choque térmico.

Cada teste de sensibilidade analítica dos diferentes métodos de extração de DNA foi

realizado por três vezes, em dias distintos, para verificação da confiabilidade dos resultados,

que é definida pelo grau de estabilidade quando uma medida é repetida em condições

idênticas. Mesmo que um teste apresente altas sensibilidade e especificidade, se este não for

reprodutível, seu valor e utilidade são consideravelmente reduzidos (GORDIS, 2004).

Inúmeros fatores podem contribuir para redução da repetibilidade e acurácia do método. A

distribuição do parasita na amostra pode não ser homogênea, o que é mais evidente em

amostras com baixa contaminação. A própria consistência da amostra não é homogênea,

especialmente em amostras aquosas. O emprego de volumes muito pequenos pode causar o

aumento do viés, causado por diferenças na pipetagem da amostra e dos diferentes reagentes.

59

5.2.2 Teste de sensibilidade diagnóstica

5.2.2.1 Sensibilidade diagnóstica dos métodos de extração de DNA em amostras fecais

Na avaliação das sensibilidades diagnósticas, o kit QIAmp DNA Stool Mini

possibilitou os melhores desempenhos das nested PCRs, em comparação aos outros métodos

analisados. Tanto em conjunto com excistamento ou choque térmico, a sensibilidade analítica

foi de 86,7%.

Embora o kit QIAmp DNA Stool Mini tenha sido utilizado em muitos estudos, não

foram encontrados estudos comparativos desse produto em relação a outros métodos de

extração de DNA em oocistos de Cryptosporidium, somente empregando outros

microorganismos.

McOrist et al. (2002) compararam cinco métodos de extração de DNA das espécies

Lactobacillus acidophilus e Bacteroides uniformis em fezes humanas. O kit QIAmp DNA

Stool Mini apresentou o melhor desempenho quando comparado a outros três kits

(FastDNA®, Bio 101; Nucleospin® C + T, Macherey-Nagal e Quantum Prep® Aquapure

Genomic DNA, Bio-Rad) e o método descrito por Boom et al. (1990).

Subrungruang et al. (2004) avaliaram pela PCR as sensibilidades de três métodos de

extração de DNA de esporos de Enterocytozoon bieneusi em amostras fecais. Os métodos

comerciais QIAmp Stool Mini kit e FTA filter paper apresentaram melhores desempenhos,

quando comparados ao método tradicional de fenol-clorofórmio.

Métodos semelhantes foram comparados na extração de DNA de cistos de Giardia

duodenalis presentes amostras fecais. No entanto, os autores obtiveram melhores resultados

nas amplificações pela PCR com DNA extraído pelo método de FTA filter paper,

comparados com as técnicas de fenol-clorofórmio e QIAmp DNA Stool Mini kit, que

apresentaram desempenho equivalentes (TANG et al., 2007).

A principal vantagem dos kits de extração de DNA é a rapidez com que as amostras

são processadas. Excluindo-se o tempo gasto com o excistamento (~2 horas) e choque

térmico (~1 hora), o processamento de 10 amostras pelo kit QIAmp DNA Stool Mini

consumiu aproximadamente 1 hora. Comparativamente, os métodos de GuSCN-sílica e

fenol-clorofórmio são procedimentos mais demorados, consumindo em média 4 e 6 horas,

respectivamente.

60

No entanto, além do custo elevado, outra principal desvantagem dos kits de extração

de DNA que utilizam tecnologia por spin column é a possibilidade de contaminação cruzada,

devido a formação de aerossóis. O risco de contaminação é maior no kits nos quais as colunas

não são adaptadas firmemente aos tubos coletores (QUEIPO-ORTUÑO et al., 2008). Apesar

do kit QIAmp DNA Stool Mini possuir tubos coletores que se encaixam de forma segura à

coluna, não é fornecida quantidade suficiente para a realização de todas as etapas de

centrifugação, sendo necessária a utilização de microtubos que não se adaptam perfeitamente

às colunas. Deve-se considerar a possibilidade de resultados falso-positivos nas amostras

processadas por esse método, assim com relatado por Fredericks et al. (2005) em amostras de

DNA extraído de fungo.

O fabricante do kit não disponibiliza informações completas acerca da composição

dos regentes, devido aos direitos de patente de alguns componentes do produto. De forma

genérica, o princípio do kit QIAmp DNA Stool Mini se baseia na lise e digestão das amostras

em tampão ASL, adsorção de impurezas pela matriz do tablete InhibitEX, composta por uma

mistura de polissacarídeos, e purificação de DNA pela coluna QIAmp spin. O DNA é

adsorvido por uma membrana de sílica presente coluna QIAmp spin, na presença de

concentrações de sal e condições de pH adequadas. Para isso são utilizados tampões com

agentes caotrópicos capazes de assegurar que resíduos de proteínas digeridas e outras

impurezas não sejam retidas na membrana de sílica.

Princípio semelhante é baseado o método de GuSCN-sílica, descrito por Boom et al.

(1990). Este método apresentou sensibilidade de 66,7% quando associado à técnica de

choque térmico e de 60% quando associado ao excistamento. A técnica foi selecionada para

avaliação neste estudo, como uma alternativa ao emprego dos kits comerciais, pelo menor

custo, e ao uso de solventes orgânicos, como o fenol. Além disso, comparativamente ao

método de fenol-clorofórmio, é realizado em um menor tempo.

No presente estudo, o método de GuSCN-sílica apresentou as menores sensibilidades

analíticas, tanto em oocistos purificados, quanto na presença de material fecal, ao contrário

do método de fenol-clorofórmio que obteve os melhores resultados, possibilitando a detecção

de até 103 oocistos em amostras fecais. No entanto, na avaliação das sensibilidades

diagnósticas, a purificação por GuSCN-sílica mostrou maior eficiência do que a purificação

por fenol-clorofórmio. Essa diferença no desempenho dos métodos pode ter vários fatores.

Possivelmente o mais importante deles seja a grande variabilidade na composição das

amostras fecais. Essa variabilidade é dependente da consistência, dieta, flora intestinal e

condições de saúde endógenas do hospedeiro (GONÇALVES et al., 2008), resultando em

61

concentrações distintas de substâncias inibidoras. A inibição da PCR parece ser reduzida em

amostras fecais provenientes de indivíduos com dieta isenta de vegetais (MONTEIRO et al.,

2001).

Em amostras fecais, a variabilidade na composição, mesmo uma mesma espécie, é

mais acentuada em comparação a outras amostras clínicas, como por exemplo, tecidos e

sangue (MCORIST et al., 2002). Tais características também dificultam a comparação entre

resultados obtidos em diferentes estudos, já que os valores de sensibilidades analíticas são

dependentes da natureza e da quantidade de amostra utilizada.

A diferença na concentração de inibidores, provavelmente devido à natureza de cada

amostra, fez com que em algumas amostras não fosse verificada a correlação entre

quantidade de oocistos e amplificação na PCR. Todos os métodos de extração de DNA

avaliados foram eficientes e permitiram a amplificação da amostra 5 (humano), apesar da

pequena concentração de oocistos detectada pelo método de centrífugo-flutuação em

sacarose. Já a amostra 3 (gato) que apresentava grande quantidade de oocistos, foi

amplificada apenas com a utilização dos métodos de EK e CK.

Apesar das limitações do estudo ocasionadas pelo pequeno número de amostras

analisadas, pôde-se observar que as amostras provenientes do cão e dos gatos proporcionaram

maior dificuldade de detecção pelos métodos, muito provavelmente pela composição do

material fecal. O baixo desempenho dos métodos não é resultante da variabilidade genética

dos oocistos, já que essas amostras, assim como as demais, foram amplificadas ao serem

previamente purificadas pelo método de centrífugo-flutuacão em sacarose, mantidas as

demais condições de extração de DNA e PCR.

O presente estudo teve como objetivo avaliar somente a sensibilidade dos métodos de

extração de DNA, portanto o método de centrífugo-flutuação em sacarose foi selecionado

como padrão-ouro para detecção de amostras positivas. A porcentagem de resultados falso-

positivos por esse método é menor quando comparado a outras técnicas convencionais como

ELISA e imunofluorescência. Os oocistos imersos na solução de sacarose têm coloração

rosada sob a luz do microscópio, o que facilita a sua visualização, apesar do reduzido

tamanho. O método é rápido e de fácil execução, além de não exigir materiais e

equipamentos de alto custo. No entanto, exige experiência do microscopista e não permite o

processamento de muitas amostras, sendo que a leitura deve ocorrer antes da deformação dos

oocistos. Amostras com grande quantidade de gordura necessitam de um tratamento prévio

para sua retirada, caso contrário, a visualização em lâmina é fortemente comprometida.

62

McPherson e McQueen (1993) avaliaram seis métodos de diagnóstico de

Cryptosporidium spp. em fezes: coloração por Giemsa, coloração por Ziehl-Neelsen (ZN),

coloração auramine-rhodamine (AR staining), flotação em solução de Sheather (SSF),

imunofluorescência indireta e método modificado de concentração em solução de sacarose

(MCSF). O método SSF detectou 87% das 54 amostras consideradas positivas, obtendo

desempenho inferior somente ao método de AR staing que possibilitou a detecção de 94,4%

das amostras. Três amostras foram positivas apenas pelo método de Sheather. Apesar de ser

um método rápido e capaz de processar grande número de amostras, AR staining é

considerado complexo e exige monitoramento de qualidade e especialização tecnológica,

além de necessitar de um microscópio de fluorescência e utilizar corante carcinogênico

(MCPHERSON; MCQUEEN, 1993).

Truong e Ferrari (2006) avaliaram métodos de purificação para o isolamento de

oocistos de Cryptosporidum para análise proteômica. Os autores observaram que os métodos

de centrífugo-suspensão e centrífugo-flutuação em sacarose apresentaram maior porcentagem

de recuperação de oocistos, em relação os métodos de gradiente em sacarose e Percoll,

gradiente em cloreto de césio, gradiente em Ficoll e gradiente em sacarose e isopycnic

Percoll.

5.2.2.2 Sensibilidade diagnóstica do método EF em amostras purificadas

Nenhum dos métodos moleculares avaliados foi 100% eficiente na detecção de DNA

das 15 amostras fecais positivas na pesquisa de oocistos de Cryptosporidium pela técnica

microscópica. No entanto, o método de extração de DNA por EF apresentou alta

sensibilidade analítica em amostras purificadas, possibilitando a detecção de até 1 oocisto.

Esse resultado permite considerar o método de excistamento/fenol-clorofórmio eficiente na

lise de oocistos e recuperação de DNA em amostras puras, portanto com baixa concentração

de inibidores.

Foi então realizada a avaliação da sensibilidade diagnóstica do método EF em

oocistos purificados de amostras fecais provenientes de hospedeiros naturalmente infectados.

Das 15 amostras processadas pelo método, todas foram amplificadas pela nested PCR,

resultando em 100% de sensibilidade diagnóstica.

63

O método de purificação selecionado foi descrito no item 3.1.2 e é tradicionalmente

empregado nas pesquisas do Laboratório de Parasitologia (VPS-USP), obtendo-se resultados

satisfatórios.

O método de centrífugo-flutuação em sacarose possibilita a remoção de grande parte

dos inibidores presentes nas amostras fecais, além de concentrar os oocistos. A observação

do parasita em microscópio confere maior segurança quanto a positividade das amostras. A

recuperação dos oocistos pela lavagem da lâmina e lamínula mostrou-se eficiente, uma vez

que o método possibilitou a amplificação de amostras com pequeno número de oocistos,

como por exemplo, as amostras 1, 2, 4, 5 e 8, nas quais foram observados somente 7, 6, 7, 8 e

5 oocistos, respectivamente, em toda área da lamínula (dados não mostrados). Além disso, o

método possibilitou a detecção de DNA das amostras 1, 2, 3 e 10, as quais possivelmente

apresentavam grande quantidade de inibidores, pelo baixo desempenho da nested PCR em

amplificar o DNA extraído pela maioria dos métodos avaliados, em amostras fecais sem

purificação prévia.

Portanto, grande parte dos estudos que emprega técnicas de PCR e extração de DNA

(SAMIEA et al., 2006; COKLIN et al. 2007; KARANIS et al.; 2007; MENDONÇA et al.,

2007; SANTINA et al., 2007), realiza uma etapa prévia de purificação de oocistos das fezes,

com o intuito principal de reduzir a quantidade de inibidores de PCR. Também permite o

emprego de um volume superior de material fecal, possibilitando a recuperação de um maior

número de oocistos. A extração de DNA diretamente das fezes, requer o emprego de volumes

reduzidos de amostra, em parte pela própria técnica, que é padronizada para pequenos

volumes, em parte para reduzir a quantidade de inibidores de PCR.

O emprego de apenas 100 μl de fezes pode ter contribuído para a redução das

sensibilidades diagnósticas dos métodos de extração de DNA em amostras fecais. No entanto,

deve-se considerar que, apesar do emprego de um volume maior de fezes no método de

centrífugo-flutuação em sacarose, ocorrem perdas em várias etapas do procedimento:

filtração da amostra fecal em camada de gaze, centrifugação em sacarose, recuperação de

oocistos pela alça bacteriológica e lavagem da lâmina.

Os resultados do presente estudo ilustram a influência dos métodos de extração de

DNA no rendimento de um experimento e que o uso de métodos apropriados é decisivo para

a eficácia da PCR em amostras clínicas. Além disso, demonstra que a escolha do método

deve levar em consideração o tipo de amostra, grau de contaminação, presença de possíveis

inibidores de PCR e forma de preservação a que foi submetida. Dessa forma, estudos

64

comparativos são necessários para assegurar que os métodos de extração de DNA sejam

otimizados para cada aplicação em particular.

65

6 CONCLUSÕES

• O método de extração de DNA envolvendo liberação dos esporozoítos por

excistamento e purificação de DNA por fenol-clorofórmio (EF) possibilitou a

detecção de até 1 oocisto pela nested PCR do gene SSU rRNA, demonstrando ter alta

sensibilidade quando empregado em amostras de oocistos previamente purificados.

EF apresentou sensibilidade analítica superior aos métodos ES

(excistamento/GuSCN), CF (choque térmico/fenol-clorofórmio) e CS (choque

térmico/GuSCN).

• Na presença de 100 μl de fezes bovina, os métodos EF, EK (excistamento/kit QIAmp

DNA Stool Mini) e CK (choque térmico/ kit QIAmp DNA Stool Mini) apresentaram

desempenhos equivalentes, com sensibilidade analítica de 104 oocistos. Esses

métodos possibilitaram limiar de detecção superior aos demais métodos avaliados

(ES, CF e CS).

• Na presença de fezes, a sensibilidade diagnóstica dos métodos de extração EF, ES,

CF e CS apresentou redução de até 10.000 vezes, quando comparado às

sensibilidades em amostras de oocistos purificados.

• Os métodos EK e CK apresentaram as maiores sensibilidades diagnósticas (86,7%),

possibilitando a detecção de DNA de Cryptosporidium spp. em 13 das 15 amostras

fecais previamente diagnosticadas como positivas pelo método de centrífugo-

flutuação em sacarose, considerado o padrão-ouro. Esses resultados sugerem que a

extração de DNA pelo kit QIAmp DNA Stool Mini possibilita uma melhor

recuperação de material genético e/ou retirada de inibidores de PCR, quando

comparado aos métodos de fenol-clorofórmio e GuSCN-sílica.

• A extração de DNA pelo método EF, a partir de amostras de oocistos previamente

purificados e concentrados das fezes pelo método de centrífugo-flutuação em

sacarose, possibilitou 100% de sensibilidade pela nested PCR. Pode-se considerar que

o emprego dessa técnica de concentração de oocistos e retirada de inibidores,

favorece a sensibilidade dos métodos de extração de DNA e PCR.

66

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