Diagnostic bactériologique Diagnostic bactériologique de de Mycoplasma pneumoniaeMycoplasma pneumoniae
par PCR en temps réelpar PCR en temps réel
Au laboratoire de PellegrinAu laboratoire de Pellegrin
M. pneumoniae with respiratory epithelial cells
● Non commensal : pas de portage sain (sauf période d’épidémie)
● Infections respiratoires aigues, souvent bénignes
● Transmission aérienne
● Enfant > 5ans, adulte jeune-Trachéobronchites +++- Pharyngites- Pneumopathies atypiques- Asymptomatique (20%)
● Mode endémique avec poussées épidémiques Tous les 4-7 ans
Probable : exacerbation de l’asthme chez enfant et adulte
Infections respiratoires à M. pneumoniae
Manifestations extra-respiratoires
● Lésions cutanées +++éruption, exanthème, érythème noueux, Stevens Johnson
● Atteintes neurologiques encéphalites, neuropathies périphériques, Guillain Barré
● Arhrites, arthralgies
● Cardiaques (rares)myocardites, péricardites
● Anémie hémolytiques (rares)
Non spécifiques
Diagnostic biologique
● Recherche directe de la bactérie
- Culture
- PCR
● Recherche indirecte : recherche d'anticorps
Prélèvements pour détection directe
● Mêmes pour culture et PCR
● Respiratoires pvt gorge (infection diffuse)asp. naso-pharyngée (jeune enfant)LBA (formes sévères)expectorations peu adaptées
Autres (rares)
● Milieu de transport- Milieu 2SP (saccharose-phosphate)- conservation +4°C 24 h, puis -70°C
Culture de M. pneumoniae
• Fastidieuse, longue • Exigence nutritionnelles milieux spéciaux enrichis
Hayflick modifié, SP4(20% sérum, extrait levure, -lactamines)Solide ou liquideGlucose 37°C +/- CO2 pendant 2-3 semaines
• Prop. métaboliques en milieu liquideFermentation glucose Changement de couleur du rouge de phénol
• Dilutions indispensables (inhibiteurs)
Détection de la croissance en milieu solide
● Aspect des colonies sur agar (37°C, CO2) Loupe binoculaire, 50-300µm
2-3 sem
● Identification : aspect colonies, hémadsorption, PCR
Détection de la croissance en milieu liquide
● Virage indicateur coloré
- Fermentation du glucose acidification : virage du rouge de phénol : rouge jaune
- 2-3 semaines en primo-isolement
M. pneumoniae
● Sensibilité vs PCR: 60%, spécificité : 100% rare (labo spécialisés)
Détection par biologie moléculaire
● Hybridation par sonde : peu sensible
● 1ère publication de PCR en 1989 (Bernet, JCM, 89)
1989-2003 : 34 articles (Loens, JCM, 03)
● Cibles variées ATPase, gène tuf
ARNr 16S adhésine P1 +++ (meilleure sensibilité)
● Techniques variées- ADN : PCR, PCR multiplex, PCR en temps réel
- ARN : NASBA, RT-PCR
● Extraction d’ADN- phénol-chloroforme et précipitation de l’ADN
+/- SDS, protéinase K- sonication- ébullition- kits commercialisés- Automate (ex: MagNAPure Roche diagnostic)
Sensibilité: 78-92%, spécificité: 92-100%
Détection par biologie moléculaire (2)
Avantages Rapidité Grande spécificité Bonne sensibilité si infection Quantification possible Typage des souches, (groupe 1 et 2) Autres pathogènes respiratoires (PCR multiplex)
Limites Méthodes "maison" Contrôles indispensables
- Négatifs- Internes- Extraction
Présence possible comme commensal? Détection d’organismes non viables
Détection par biologie moléculaire (3)
Diagnostic biologique
● Recherche directe de la bactérie
- Culture
- PCR
● Recherche indirecte : recherche d'anticorps
Diagnostic indirect sérologique
• Très utilisé mais résultat tardif
• Cinétique des ACIgM : 1 sem après début infection, enfants +++IgG : pic à 3 semaines, décroissance plusieurs moisIgA ?
• Différentes techniques- agglutination de particules- immunofluorescence- Fixation du complément- ELISA (différents antigènes)
IgG
IgM
Infection
Temps (semaines)
Qua
ntité
d'A
ntic
orps
Cinétique des anticorps
En résumé
Diagnostic par PCR + sérologie
• Enfants, PCR + IgM (sérum en phase aigue)
degré maximal de certitude diagnostic en 1 ou 2 jours
• Une PCR positive isolée chez enfant avec pneumopathie atypique : très suggestif
• Adultes, PCR + FC ( 1/64) ou IgG X4 entre 2 sérums
Aujourd'hui, recherche de M.pneumoniae
Prélèvement de gorge
Extraction d'ADN automatisée
PCR en temps réel Taqman
Interprétation des résultats
MagNAPure
Prism 7000
Extraction d'ADN automatisée
MagNA Pure LC, Roche diagnostics
Principe
- Lyse cellulaire et dénaturation des protéines
- Digestion des protéines (Protéinase K)
- Liaison de l'ADN à la surface de particules de verre magnétiques
- Lavages (élimination des protéines, membranes, etc…)
- Elution de l'ADN purifié à haute température
Amplification par PCR temps réel
ABI Prism 7000
PCR en temps réel
- Protocole Taqman
- Cible : Adhésine P12 amorces :
P1-204P1-328
1 sonde de 125 bp P1-284R (FAM-TAMRA)
Sondes Taqman - Principe
Hybridation d'une sonde spécifique
Composition de la sonde ● Fluorochrome émetteur (reporter) en 5'Ex : FAM 6-carboxy-fluorescein
● Fluorochrome suppresseur (quencher) en 3' ex : TAMRA 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine
pas d'émission de fluorescence
Cette méthode repose sur deux principes :- la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer)- l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol
Spécificité l’amorce pour la PCR Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan
5’
5’
3’
3’
FP
RP
Reporter Quencher
FAM, VIC TAMRA
Sondes Taqman - Principe
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R Q
Lumière
- FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie),
pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte
Sondes Taqman - Principe
- au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase coupe la sonde libération du reporter
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R
Q
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R
Q
- lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.
Sondes Taqman
Avantage : - Spécificité accrue
Spécificité des primers pour la PCRSpécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan
- Possibilité de multiplexage avec des sondes portant des fluorochromes différents
Inconvénient :- Impossibilité de réaliser des courbes de fusion
Protocole opératoire
- Extraits dilués au 1/10ème
- Préparation du MixAmorcesSondesMix (dNTP, Taq Polymérse, tampon)+ Ajout de l'échantillon extrait au 1/10ème
- Contrôle interne : mélange précédent + culture extraite de Mpn permet de vérifier l'absence d'inhibiteurs de PCR dans l'échantillon
- Amplification d'une gamme de concentrationCulture extraite, pure et dilutions au 1/10ème, 1/100ème et 1/1000ème
- Protocole du thermocycleur10min 95°C15 sec à 95°C1 min à 60°C 40 cycles
Témoin + : culture de Mpn extraite et amplifiée pure, 1/10ème, 1/100, 1/1000ème
pur10-1 10-2 10-3
Interprétation
En rouge : patient positif pour M. pneumoniae
Patient
Conclusion
Y a-t-il infection par M. pneumoniae ?
PCR positive : oui, très certainement
PCR négative : ne permet pas d'éliminer le diagnostic A confronter avec le résultat de la culture et des sérologies