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Dottorato di Ricerca in Biologia Cellulare e Molecolare (Cellular and Molecular Biology)

Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie Collegio dei Docenti: AMBROSETTI Davide CAPRANICO Giovanni CIURLI Stefano Luciano CONTESTABILE Antonio DELANY Isabel FRANCIA Francesco GARGIULO Giuseppe MAESTRINI Elena PERINI GiovannI PESSION Annalisa RUGOLO Michela SCARLATO Vincenzo SPARLA Francesca TROST Paolo Bernardo VENTUROLI Giovanni ZANNONI Davide ZUCCHERI Giampaolo Tematiche e progetti Temi di Ricerca: Il Dottorato di ricerca affronta varie tematiche di Biologia e Fisiologia Cellulare e Molecolare. L’attività sperimentale del dottorando sarà svolta all’interno di uno dei gruppi di ricerca rappresentati nel collegio dei docenti i cui argomenti ed obiettivi generali sono brevemente delineati qui di seguito. I temi di ricerca e studio saranno sviluppati presso laboratori ad indirizzo biotecnologico a livello cellulare, molecolare e genetico. Tali laboratori garantiscono la possibilità di svolgere ricerche in tutti i campi della più avanzata biologia molecolare e cellulare anche applicata allo studio di patologie, quali autismo, epilessia, encefalopatie spongiformi, di varie malattie neurodegenerative, quali il morbo di Parkinson, di Alzheimer, e le neuropatie ottiche mitocondriali, ed anche dei tumori. Le tematiche includono ricerche biomolecolari nell'ambito fisiopatologico, della fisiologia vegetale e anche dei vaccini batterici. La complessità degli argomenti di ricerca richiede necessariamente un approccio interdisciplinare ed in particolare una intensa interazione tra discipline biologiche, biotecnologiche, chimiche e biochimiche allo scopo di affrontare aspetti di natura biotecnologica di base ed applicativi e caratterizzati da elevate conoscenze funzionali e molecolari. Le attività di ricerca includono tematiche di microbiologia, fisiologia e biologia molecolare integrate da tematiche e supporti chimici e biochimici che costituiscono la piattaforma per l’identificazione di nuovi meccanismi cellulari e molecolari, utilizzabili per lo sviluppo di nuove applicazioni dell’industria farmaceutica e per il miglioramento della salute dell’uomo. Specifiche tematiche di ricerca:

1. Regolazione dell’espressione genica da parte di meccanismi della riparazione del danno al DNA (Prof. Capranico)

2. Struttura e funzione di proteine coinvolte nel metabolismo dei metalli (Prof. Ciurli) 3. Espressione, regolazione e analisi funzionale dei fattori di virulenza batterici e strategie genetiche

per lo sviluppo di nuovi vaccini (Prof. Delany) 4. Studio delle basi molecolari di alcune malattie neurodegenerative (Prof. Monti) 5. Meccanismi molecolari di trasduzione dell’energia in complessi proteici di membrana (Prof. Francia) 6. La Drosophila come sistema modello per lo studio della funzione genica nello sviluppo e nei tumori

(Prof. Gargiulo) 7. Fattori genetici nella patogenesi dell’autismo (Prof. Maestrini)

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8. Regolazione dell’espressione genica nei tumori (Prof. Perini) 9. Cancer modeling in Drosophila (Prof. Pession) 10. Basi molecolari di alcune malattie neurodegenerative a patogenesi mitocondriale e mutazioni del

genoma mitocondriale nella tumorigenesi (Prof. Rugolo) 11. Basi genetiche e molecolari della patogenicità batterica (Prof. Scarlato) 12. Meccanismi molecolari di segnalazione redox e regolazione del metabolismo energetico delle piante

(Prof. Trost e Prof. Sparla) 13. Ruolo della dinamica conformazionale e dell’interazione proteina-solvente nell’attività fotocatalitica di

centri di reazione fotosintetici (Prof. Venturoli) 14. Aspetti molecolari del biorisanamento microbico (Prof. Zannoni) 15. Metodologie nanobiotecnologiche per lo sviluppo di biosensori e nanostrutture autoassemblanti

basate sul DNA (Prof. Zuccheri) Breve descrizione dei progetti di ricerca. Regolazione dell’espressione genica da parte di meccanismi della riparazione del danno al DNA. Gruppo: Capranico La Top1 è un bersaglio di efficaci farmaci antitumorali e regola la struttura della cromatina e l’espressione genica nelle cellule eucariotiche. Top1 può, in determinate circostanze, indurre rotture singole del DNA con conseguente morte cellulare o alterazioni della stabilità genomica. Questa linea di ricerca ha come obiettivo la definizione dei relativi circuiti di regolazione della trascrizione e della stabilità genomica in cellule umane. Risultati recenti indicano un ruolo inatteso della Top1 nella regolazione della pausa trascrizionale della RNAP II e di RNA antisenso associati a promotori attivi in cellule tumorali umane. Il progetto prevede la definizione di mappe genomiche umane ad alta risoluzione dei siti di legame di proteine coinvolte nella trascrizione e nella riparazione del danno al DNA mediante ChIP-Seq e “quantitative real-time” PCR. La ricerca è inoltre focalizzata alla identificazione delle funzioni di ncRNAs antisenso e associati a promotori divergenti ricchi in CpG. Questi ncRNAs antisenso sono stimolati dalla presenza di rotture del DNA indotte dalla Top1 in regioni attivamente trascritte. La ricerca è volta alla definizione di nuovi meccanismi di regolazione genica e di risposta al danno al DNA al fine di sviluppare nuove strategie terapeutiche anticancro con un potenziale alto impatto medico e sociale. Struttura e funzione di proteine coinvolte nel metabolismo dei metalli Gruppo: Ciurli I metalli di transizione sono fondamentali per un grande numero di processi biochimici, svolgendo numerose funzioni come catalizzatori acido-base e redox, e determinando spesso la struttura delle proteine. Gli argomenti della nostra ricerca riguardano la caratterizzazione delle proteine coinvolte nel metabolismo dei metalli a livello molecolare, biochimico e strutturale. In particolare, sono studiate i) le relazioni tra la struttura e la funzione di metallo-proteine e metallo-enzimi, ii) l’omeostasi ed il traffico intracellulare dei metalli di transizione, e iii) la regolazione dell’espressione genica per mezzo di fattori di trascrizione metallo-dipendenti. Negli ultimi anni la ricerca si è concentrata sul metabolismo del nichel, metallo essenziale nell’idrolisi enzimatica dell’urea catalizzata dall’ureasi, un fattore di virulenza di molti ed importanti batteri patogeni. La ricerca svolta è largamente multi- ed inter-disciplinare, e comprende l’espressione e la purificazione della proteina target con tecniche di DNA ricombinante, lo studio della struttura e della funzione della proteina con tecniche spettroscopiche (UV-vis, dicroismo circolare, fluorescenza, NMR), biofisiche (scattering della luce, calorimetria), cristallografiche ed enzimatiche (saggi di attività in vitro ed in cell). Strategie di modeling della struttura proteica sono inoltre utilizzate di modeling della struttura proteica sono inoltre utilizzate. Lo studio a livello molecolare di queste metallo-proteine è la base per la identificazione di targets per lo sviluppo di nuovi farmaci tramite drug design. Espressione, regolazione e analisi funzionale dei fattori di virulenza batterici e strategie genetiche per lo sviluppo di nuovi vaccini Gruppo: Delany Uno dei principali scopi della nostra ricerca è la comprensione dei circuiti regolatori che permettono ai batteri patogeni di rispondere agli stimoli ambientali che possono incontrare nell’ospite. In particolare studiamo l’ espressione genica in risposta ai segnali molecolari correlati all’ ospite umano, con particolare attenzione alla caratterizzazione molecolare dei meccanismi trascrizionali o post-trascrizionali che controllano antigeni e geni batterici spesso importanti per la virulenza. Utilizziamo studi genetici per caratterizzare il ruolo di fattori di virulenza e di antigeni candidati in sistemi batterici mediante modelli di infezione ex vivo e in vivo. Utilizziamo anche approcci genetici per caratterizzare l’immunogenicità degli antigeni batterici mediante l’identificazione di epitopi batterici funzionali. Inoltre, applichiamo metodologie di genetica batterica per il disegno e la costruzione di ceppi vaccinali innovativi, capaci di generare moduli di antigeni di membrana

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(GMMA) arricchiti in antigeni importanti per il vaccino, che possono essere sfruttati come candidati per la prossima generazione di vaccini acellulari. Studio delle basi molecolari di alcune malattie neurodegenerative Gruppo: Monti Il gruppo di ricerca è coinvolto nello studio di alcuni modelli in vitro ed in vivo di patologie neurodegenerative umane, particolare come il morbo di Parkinson e la sclerosi laterale amiotrofica, nonché di una malattia genetica rara, l’AGC1-deficiency. Nell’ambito di tali ricerche si propone principalmente di evidenziare il ruolo delle interazioni fra neuroni e cellule gliali, specialmente la microglia (cellule immunitarie presenti nel cervello), nei meccanismi di neurodegenerazione e neuroprotezione. Inoltre vengono condotte ricerche sulla modulazione di pathways intracellulari e dell’espressione genica nell’ippocampo di ratto nell’apprendimento e nella memoria Meccanismi molecolari di trasduzione dell’energia in complessi proteici di membrana Gruppo: Francia La linea di ricerca proposta è centrata sulla caratterizzazione cinetica, mediante spettrofotometria risolta nel tempo, dei processi di trasporto di elettroni e protoni in membrane intatte e/o complessi proteici isolati da batteri fotosintetici. Questi sistemi sono facilmente analizzabili tramite spettroscopia risolta nel tempo e permettono di ottenere informazioni sulle reazioni di trasferimento elettronico intra- ed inter-proteina catalizzate dai complessi proteici di membrana. L’alto grado di omologia strutturale tra i complessi deputati alla trasduzione dell’energia permette di riprodurre, in procarioti fotosintetici, mutazioni presenti negli eucarioti che sono all’origine di disfunzioni del metabolismo energetico. Nei cromatofori, vescicole di membrana ottenute tramite frattura meccanica di procarioti fotosintetici è possibile attivare, tramite brevi impulsi di luce, la catena di trasporto degli elettroni e seguire gli eventi di trasferimento di singoli equivalenti riducenti. Questo approccio sperimentale può rivelarsi molto promettente per studiare l’effetto di mutazioni del complesso ubichinolo-citocromo c ossido-reduttasi (complesso bc1) alla base di alcune gravi patologie neurologiche che colpiscono anche l’uomo. La Drosophila come sistema modello per lo studio della funzione genica nello sviluppo e nei tumori Gruppo: Gargiulo Mediante approcci di genetica diretta ed inversa, le ricerche condotte nel laboratorio del Prof. Gargiulo sono incentrate sia allo studio dello sviluppo di Drosophila che nell’utilizzo della Drosophila come sistema modello per lo studio dei tumori. I progetti attualmente in corso includono:

Analisi dei meccanismi molecolari del differenziamento delle cellule germinali di Drosophila.

Controllo traduzionale nello sviluppo di Drosophila.

Studio dei fattori di virulenza nelle interazioni tra insetti parassitoidi ed i loro ospiti, mediante espressione di geni di parassitoidi durante lo sviluppo di Drosophila.

Studio del ruolo dei geni dVHL e awd nella tumorigenesi. Il gene dVHL è l’omologo di Drosophila dell’oncosoppressore umano VHL (von Hippel-Lindau), mentre il gene awd (abnormal wing discs), è l'omologo di Drosophila del gene umano del soppressore delle metastasi Nm23.

Genetica di malattie complesse Gruppo: Maestrini Il gruppo di ricerca si occupa di studiare i fattori genetici implicati in disturbi legati allo sviluppo e al funzionamento del cervello, quali l'autismo e la dipendenza da nicotina. 1) Genetica molecolare dell'autismo. Lo scopo di questo progetto è l'identificazione e caratterizzazione di fattori genetici coinvolti nella patogenesi dell'autismo infantile, un grave disturbo neuropsichiatrico con una complessa base ereditaria e caratterizzato da un alto grado di eterogeneità genetica e clinica. L'Autism Genome Consortium (AGP), è un consorzio internazionale attraverso cui è stata costituita una banca di DNA e relativi dati fenotipici di oltre 2000 famiglie con autismo. Su questi campioni è stata effettuata l'analisi di più di 1 milione di SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) tramite la tecnologia Illumina, utilizzati sia per studi di associazione (genome-wide association study, GWAS), che per l'analisi di Copy Number Variants (CNVs). Da questi studi è emerso che un insieme eterogeneo di varianti rare contribuiscono significativamente alla suscettibilità genetica dell'autismo. A partire dai dati dell'AGP ci occuperemo di:

identificare e caratterizzare CNVs potenzialmente patologici

analisi mutazionale e funzionale dei geni coinvolti in specifici CNV. 2) Analisi della predisposizione genetica nella dipendenza da nicotina. La dipendenza da nicotina dipende dall'interplay di fattori neurobiologici, ambientali e genetici. Il progetto, in collaborazione con l'università di Modena, si propone di studiare il coinvolgimento di polimorfismi nei geni delle subunità dei recettori colinergici nicotinici (nAChR) nel tabagismo, attraverso studi di associazione di SNPs e sequenziamento

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Regolazione dell’espressione genica nei tumori Gruppo: Perini Questa linea di ricerca si occupa dei meccanismi di regolazione trascrizionale mediati dall'oncogene Myc in vari tipi di tumore quali neuroblastoma, osteosarcoma, carcinoma mammario e leucemie mieloidi. In particolare ci si propone di comprendere come Myc sia in grado di reprimere la trascrizione attraverso l'interazione con proteine modificatrici della cromatina quali HDAC e SIRT. Attraverso l'impiego di tecnologie come ChIP-on-chip, ChIP sequencing e utilizzo di librerie codificanti siRNA si andranno ad identificare i geni repressi da Myc, e in particolare ad individuare le componenti cromatiniche coinvolte in tale processo. La comprensione dei meccanismi molecolari di repressione trascrizionale mediata da Myc consentirà di mettere a punto saggi biologici per lo screening di nuovi farmaci anti-neoplastici

Cancer modeling in Drosophila

Gruppo: Pession Il modeling in vivo in Drosophila ha come scopo quello di studiare alcuni geni coinvolti nel differenziamento dei tessuti epiteliali e, data l’alta omologia funzionale esistente tra Drosophila e uomo nei geni che controllano la polarità cellulare e la crescita, questo modello è uno strumento per studiare meccanismi genetici molto complessi, come quelli che sottostanno alla tumorigenesi nell’uomo. Per lo studio sono stati messo a punto una serie di sistemi genetici che permettono di alterare molecolarmente sia il clone sia il background e di visualizzare il comportamento delle cellule del clone e di quelle circostanti in vivo. Malattie neurodegenerative a patogenesi mitocondriale e mutazioni del genoma mitocondriale nella tumorigenesi Gruppo: Rugolo L'attività di ricerca è volta ad indagare i meccanismi molecolari alla base di alcune malattie neurodegenerative umane a patogenesi mitocondriale. La prima è l'atrofia ottica dominante, una neuropatia ottica causata da mutazioni nel gene nucleare OPA1, che codifica una proteina mitocondriale, presente in otto diverse isoforme. Si useranno fibroblasti embrionali murini privi di OPA1, per identificare l’isoforma capace di correggere i vari difetti (contenuto di mtDNA, morfologia del reticolo, supercomplessi respiratori, profilo lipidico, etc). Si correlerà la presenza di delezioni multiple del mtDNA con altre patologie molto gravi come il Parkinson, che è stato associato anche a mutazioni in OPA1. Un’altra classe di patologie mitocondriali è causata da mutazioni nel gene MT-CYB (citocromo b, complesso III), che provocano sindromi multisistemiche molto severe, caratterizzate da danno ossidativo ed alterazioni dei supercomplessi della catena respiratoria. Si analizzerà l’effetto del diverso carico mutazionale sull’assemblaggio dei supercomplessi e sulla efficienza energetica cellulare, correlandoli anche alla presenza di fattori di assemblaggio dei supercomplessi (SCAFs). Cloni cellulari con diverse mutazioni verranno sottoposti ad incubazione in ambiente ipossico o in presenza di antiossidanti, per verificare se in queste condizioni i supercomplessi respiratori siano alterati. Inoltre si determinerà la capacità di tali mutanti di formare colonie in soft-agar, determinandone il profilo metabolico e di segnalazione. I risultati di questo studio potranno avere un significativo impatto medico, evidenziando i meccanismi con cui mutazioni nel genoma mitocondriale possono favorire un fenotipo tumorale benigno. Basi genetiche e molecolari della patogenicità batterica Gruppo: Scarlato Helicobacter pylori è un batterio responsabile di diverse malattie gastriche, ed è associato con lo sviluppo di carcinoma gastrico. Il ruolo dei metalli come elementi essenziali in diversi processi di virulenza nei batteri è ben documentato. Due regolatori trascrizionali, Fur e NikR, sono coinvolti nel controllo dell'espressione genica in modo metallo-dipendente, rispettivamente a ferro e nichel. Il nostro obiettivo è di dissezionare i circuiti di regolazione di Fur e NikR integrando approcci molecolari, biochimici e genomici, identificando prima l'insieme completo delle interazioni regolatore-DNA (attraverso la metodologia ChIP-seq), e poi eseguendo esperimenti di legame-competizione (footprintings, gel mobility shift, etc) utilizzando anche differenti stati delle proteine regolatrici con i metalli, incluse analisi trascrizionali (primer extension, RT-PCR, in vitro transcription). I risultati contribuiranno ad una scrupolosa comprensione dei meccanismi molecolari che sono alla base della risposta e sopravvivenza di H. pylori nella nicchia gastrica. Meccanismi molecolari di segnalazione redox e regolazione del metabolismo energetico delle piante Gruppo: Trost e Sparla La ricerca svolta nel laboratorio di Plant Redox Biology è prevalentemente rivolta al metabolismo primario delle piante coinvolto nella produzione di polimeri ad elevato contenuto energetico, fondamentali per l’alimentazione umana e la generazione di biocarburanti. Gli studi sono focalizzati sui meccanismi di regolazione che intervengono nel bilanciare l’apporto energetico in risposta a stress di natura abiotica. La ricerca si pone l’obiettivo di acquisire una approfondita conoscenza della fisiologia dei flussi del carbonio

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negli organismi fotosintetici al fine di poter intervenire nella loro manipolazione. Gli studi vengono affrontati sia mediante approcci in vivo, che si avvalgono tanto dell’analisi fenotipica di piante mutanti, quanto dell’analisi d’espressione di specifici promotori mediante geni reporter, sia attraverso approcci in vitro, basati sulla tecnologia d’espressione in sistemi eterologhi di proteine ricombinanti ai fini della caratterizzazione biochimica e strutturale. Quest’ultima è fortemente orientata a svelare il ruolo delle modificazioni redox post-traduzionali (ossidazione, glutationilazione, nitrosilazione) nell’omeostasi delle proteine e nella regolazione del metabolismo energetico delle piante. Ruolo della dinamica conformazionale e dell’interazione proteina-solvente nell’attività fotocatalitica di centri di reazione fotosintetici Gruppo: Venturoli L’attività di ricerca del gruppo include essenzialmente due linee: a) lo studio dell’accoppiamento tra dinamica conformazionale e trasferimento elettronico in centri di reazione fotosintetici; b) lo studio dei meccanismi molecolari alla base della bioprotezione in matrici disaccaridiche solide amorfe. La linea a) si avvale di un approccio basato sulla incorporazione di centri di reazione, purificati da ceppi nativi o mutati di batteri fotosintetici, in matrici saccaridiche amorfe. Lo stato di idratazione della matrice governa la dinamica della proteina ospite, simulando a temperatura ambiente e in condizioni di forte disidratazione, l’inibizione della dinamica osservabile a temperature criogeniche. Utilizzando matrici di trealosio e di altri zuccheri è possibile esplorare mediante spettroscopia laser ed FTIR l’interazioni proteina-solvente e la relazione tra dinamica proteica e trasferimento elettronico. La linea (b) utilizza il sistema sopra descritto come sistema modello per chiarire i meccanismi alla base delle straordinarie proprietà stabilizzanti e biopreservanti esercitate in particolare da matrici di trealosio. L’incorporazione in matrici saccaridiche amorfe previene infatti la denaturazione della proteina a temperature elevate (>50°C) e in condizioni di estrema disidratazione ed è alla base di numerose applicazioni in ambito farmaceutico e biotecnologico. Aspetti molecolari del biorisanamento microbico Gruppo: Zannoni L’inquinamento ambientale è un fattore di rischio per la salute dell’uomo. Questo gruppo affronta gli aspetti molecolari legati al metabolismo dei microrganismi (aerobi e fotosintetici) nei processi di biorisanamento ambientale di molecole tossiche e/o cancerogene come i metalli pesanti e/o i policlorobifenili (PCBs). Le ricerche sono focalizzate sul sequenziamento di ceppi Gram positivi e negativi, l'espressione di proteine (proteomica) e metaboliti (metabolomica) legati alla formazione dei biofilm in presenza e assenza di composti tossici organici e/o inorganici. Poiché tra i batteri aerobi utilizzati come modello di studio, il ceppo P. pseudoalcaligenes KF707 è filogeneticamente affine a Bulkholderia cepacia, agente patogeno nei malati di fibrosi cistica, gli studi sulla formazione ed eradicazione dei biofilm di KF707 hanno una evidente ricaduta sull’ambiente e sulla salute dell’uomo. Metodologie nanobiotecnologiche per lo sviluppo di biosensori e nanostrutture autoassemblanti basate sul DNA Gruppo: Zuccheri Questa tematica di ricerca si articola su due linee principali con punti in comune: 1) Sviluppo di biosensori. Sviluppo di sistemi nanostrutturati autoassemblanti mirati all'implementazione del riconoscimento molecolare specifico e all'amplificazione del segnale in procedure di analitica molecolare. Questi sistemi sono progettati e caratterizzati per la rilevazione biosensoristica di interazioni tra tossine o proteine e membrane (come quelle coinvolte nelle proteinopatie degenerative o nell'interazione di farmaci o inquinanti con gli organismi) o nella rilevazione di acidi nucleici (rilevazione di patogeni, di miRNA, o problematiche simili). Tecniche quali la microscopia a forza atomica e la single-molecule force spectroscopy sono impiegate nella caratterizzazione dei sistemi molecolari. 2) ‘Structural DNA Nanotechnology’. Questo filone di ricerca ha come obiettivo l’uso di oligonucleotidi di DNA per la costruzione di nanostrutture tridimensionali a topologia e/o geometria definita per applicazioni nanotecnologiche quali lo sviluppo di biosensori e sistemi di studio per analisi intracellulare, diagnostica, ambientale.