Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik
Teil 14Untersuchung von
DNA-Polymorphismen
Prof. Dr. Ralf LichtinghagenMedizinische Hochschule Hannover
Klinische ChemieTel.: 0511-5323940
Gliederung
•Methodische Grundlagen der DNA/RNA-Analyse
•Anwendungen der molekularen Diagnostik:
Assoziation von DNA-Polymorphismen mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken
Pharmakogenetik
Grundlagen zur DNA
•Struktur
•Wichtige EnzymeDNA-PolymerasenRestriktionsenzyme
•DNA-Isolierung
•DNA-Auftrennung
Desoxyribonukleinsäure: Grundlagen
Doppelhelix
Basenpaarungen über Wasserstoff-brückenbindungen
A T
G CSchmelzpunkt des A/T-Paares ist niedriger.
Berechnung des Schmelzpunktes kleiner DNA-Fragmente :2°C (A/T) vs. 4°C (G/C)
DNA-Polymerasenbenötigen:•DNA-Matrize mit Startpunkt (5’ 3’)•Nukleotide (dNTP)•Salze: Mg2+
•opt. pH-Bereich•opt. Temperaturbereich
O NRO
OR
123
4
5
5‘
5‘
3‘
3‘
(5‘-) AGCGATTGAA AGGTAGGCCC TGAACGTGAC GTAGGGAAAA AGTTA (-3‘)
Restriktionsenzyme
...G A A T T C...
... C T T A A G...
5’ 3’
3’ 5’
Bsp.:Restriktionsendo-Nuklease Eco RI
Sequenzspezifische(Hexamer)Spaltung von DNA
DNA-Isolierung
Methoden:
Proteinase K-VerdauungPhenol/CHCl3-ExtraktionEthanol-Fällung
Proteinase K-VerdauungAdsorption an GlaspartikelSäulenreinigung
Elektrophoretische Trennung von DNA
23 kb
9,4 kb
6,6 kb
4,4 kb
•Agarosegel-Elektrophorese
•InterkalierenderFluoreszenz-farbstoffEthidiumbromid
•Detektion unter UV-Licht (312 nm)
⊕
Untersuchung von DNA
•Southern-Blot•Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-PCRAllel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung
Sreeningmethoden für Punktmutationen„Single-Strand Conformation Polymorphism PCR“
•DNA-Sequenzierung
Southern Blotting
Transfer der DNA auf eine Membran
Southern Blotting: Anwendungen
Mst II..CCTNAGG..
β-Globingen..CCTGAGG..
Mutation..CCTGTGG..
PolymerasePolymerase Chain Chain ReactionReaction (PCR)(PCR)
Prinzip der PCR
1111
cyclecycle 11 cyclecycle 22
94°C1 min 72°C
1 min
55°C1 min
94°C1 min 72°C
1 min
55°C1 min
denaturationdenaturation annealingannealing elongationelongation
11
22
11
22
11
22
11
2211
2222
11
22
22
DNA-Template, Primer (sense, antisense)Nukleotide, Puffer, Mg2+, thermostabile DNA-Polymerase
Prinzip der PCR5’-...AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGC...-3’3’-...TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG...-5’
ds DNA
Denaturierung94°C
Neusynthese72°C
5’-...AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGC...-3’
5’- AGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’ Annealing3’-...TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG...-5’ ca. 60°C
5’-AGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’ (Oligonukleotid 1)
5’-...AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGC...-3’3’-...TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG...-5’
5’- AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGC...-3’3’-...TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG...-5’
Prinzip der PCRPrimäre Produkte
Sekundäre Produkte
Hauptprodukte(Kurze Fragmente)
Bedeutung der Effizienz
N = N0 x En
Effizienz der Reaktion wichtig (oft 70-80%): 80% Effizienz bedeutet 4% der theoretischen Ausbeute
Protein-Polymorphismus in einer Population
Ursache: Akkumulation verschiedener Mutationen (Genpolymorphismen) im Genpool einer Population
Die Phänotyp-Verteilung in einer Population hängt von der Art der zugrunde liegenden Mutation ab
SNP: „single nucleotide polymorphisms“
Mutationstypen
Ermittlung eines Genotypsdurch die Analyse einer
bekannten Mutation
•RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)-PCR(Häufigkeit des Einsatzes etwa 25%)
•Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung(Häufigkeit des Einsatzes etwa 50%)
Genchip-Analyse zur gleichzeitigen Erfassungvieler unterschiedlicher Mutationenkommerziell bedingt erhältlich (z.B. CYP450-Array
mit 33 versch. Mutationen)
Ermittlung eines Genotypsdurch die Analyse einer
bekannten Mutation
•RFLP-PCR
•Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung
Ausstattung für RFLP-PCR
RFLP-PCRGenotypisierung über Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen
Ermittlung der Punktmutation (C/T) bei Nukleotid 677 im MTHFR-Gen(Methylentetrahydrofolsäurereduktase)
100200300
MN N N N N HO HE NHE
bp
•Amplifikation des DNA Bereiches•DNA-Fragment von 198 bp•Verdauung der DNA mit Hinf I
•Wildtyp: 198 bp•Homozyg. Mutation: 175 bp•Heterozyg. Mutation: 175+198 bp
Allelspezifische Hybridisierung
Real-Time-PCRBsp.: Glaskapillar-Thermocycler
Real-Time-PCRFluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)
zwischen Hybridisierungssonden
•Methode geeignet zur Quantifizierung von PCR-ProduktenMessung eines zunehmenden Fluoreszenzsignals während der laufenden PCR. Beginn des Signalanstiegs ist das Maß für die Ausgangskonzentration des betreffenden DNA-Bereiches.
•Methode geeignet zur MutationsanalyseNach der abgeschlossenen PCR wird das Schmelzverhalten der FRET-Sonden geprüft. Mutation und Wildtyp haben aufgrund von Basen-Fehlpaarungen verschiedene Schmelzpunkte.
Bindung der Fluoreszenz-markierten Sonden
Genotypisierung mittels Schmelzkurvenanalyse
Schmelzkurve45 –75 °C
Ableitung-d[Fluoreszenz]/dT
WTHE
HO
WT
HE
HO
Im Beispiel:FRET-Sonden haben eine 100%ige Übereinstimmung mit der Wildtyp-Sequenz
Genotypisierung mittels Sequenzierungder betroffenen Genregion
Nukleotid 677 imMTHFR-Gen
Einbau von Didesoxynukleotiden (ddNTP) in 4 getrennten Reaktionen,Statistisch verteilte Strangabbrüche, Fragmente elektroph. getrennt,Einbau eines 32P- dNTP (dATP) Autoradiographie
Enzymatische Reaktion (DNA-Polymerase):
Automatisierte DNA-Sequenzierung
Diodenlaserzur Detektion
eines Fluoreszenz-Labels
einer automatisiertenDNA-Sequenzierung
mit Online-Übertragung der Sequenzdaten
Increasing role of genotype at other loci
Incr
easi
ngro
leof
env
ironm
ent
and
stoc
hast
icfa
ctor
s
•Tay Sachs•Duchenne dystrophy
•Huntington disease•Cystic fibrosis
•Sickle-cell anemia
•G6PD deficiency•Hemochromatosis
•Acute intermittent porphyria
• α1-Antitrypsin ZZ
•Phenylketonuria
•Apo E-2/E-2 hyperlipoproteinämie
•Type I diabetes mellitus
Assoziation von DNA-Polymorphismen mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken
• Alpha-1-Antitrypsin
• Angiotensin converting enzyme (ACE)
• Apolipoprotein B100
• Apolipoprotein E
• Faktor II-Leiden (Prothrombin)
• Faktor V-Leiden
• HFE (HLA-H)
• HLA (Klasse I und Klasse II, zur Typisierung)
• MTHFR
• Mukoviszidose
• UDP-Glucuronosyltransferase (Gilbert-Meulengracht)
Häufig untersuchte Gene (Beispiele)
Angiotensin-converting enzyme (ACE)
Insertions (I) / Deletions (D) –Polymorphismus im ACE-Gen
0 20 40 60 80 100 U/l
Häu
figke
it
0
2
4
6
8
10
12
DD
ID
II
Klinische Bedeutung:Labordiagnostik der Sarkoidose:S-ACE als Surrogatmarker erhöht(Polymorphismus beeinflusst Serumkonz.)
Gendefekt: Risikofaktor kardiovaskulärer Erkrankungen??
Referenzintervalle (Genotyp-abhängig)
ACE Genotyp DD (ca. 25%) 24-89 U/lACE Genotyp DI (ca. 50%) 13-66 U/lACE Genotyp II (ca. 25%) 7-33 U/l
α1-Antitrypsinmangelα1-Antitrypsin: Akute-Phase-Protein aus Hepatozyten,
Aktivitätshemmung von Serinproteasen(PMN-Elastase)>40 AlleleWildtyp (PiM), Mangelallele: 7% PrävalenzWichtige klinisch relevante Mangelallele:PiZ, PiS, PiNullRisiko korreliert mit vermind. Antitryp.-Konz.high risk: PiZZ, PiZNull, PiNullNullincreased risk : PiSZ
Erkrankungen der Leber (Kindesalter): Sekretionsstörung in Hepatozyten bei PiZZ
Lungenemphysem (Erwachsenenalter):Folge einer nicht inhibierten PMN-Elastase-Aktivität
Hereditäre Hämochromatose (HH)Prävalenz in Mitteleuropa: 1:400, häufigste autos. rez. Erbkrankheit
Manifestationsalter: 40-60 Jahre, Hepatomegalie, Leberzirrhose, D. mellitus, dunkle Hautpigmentierung
Mutationen im HFE-Gen (Typ 1-Hämochromatose)Cys 282Tyr (C282Y) homozygot bei ca. 85-95% der HH-Patienten, Compound-Heterozygotie mit His63Asp (H63D) bei 3-8% der HH-Patienten (Prävalenz dieses H63D-Polymorphismus: 13%)
Typ 2-Hämochromatose (Hepcidin, Hämojuvelin): seltene juvenile Form, vor 30. Lebensjahr manifest, geht mitschwerer Kardiomyopathie und Hypogonadismus einher.
Typ 3: (Transferrinrezeptor 2)Typ 4: (basolateraler Eisencarrier Ferroportin 1)
Diagnoseweg bei V.a. hereditäre Hämochromatose
Klinische Hinweise und Transferrinsättigung >60% und S-Ferritin >250-300 ng/l
Gen-Test: Cys282Tyr-Mutation, gegebenenfalls His63Glu
_ +
Gentest negativ, aber klin. Verdacht,bzw. zur Bestimmung des Ausmaßes
des Leberschadens
Hämochromatose gesichert
Leberbiopsie mit quantitativer Messungdes Lebereisengehaltes
Aderlasstherapie+
FettstoffwechselLipoproteinstoffwechsel maßgeblich durch Zelloberflächenrezeptoren mitbestimmt
LDL-Rezeptor bindet neben ApoB100 auch Apo E Funktion: Regulation der Cholesterinkonzentration
Cholesterinlieferung für zell. Bedarf, Hormonsynthese
Familiäre Hypercholesterinämie:LDL-Rez.defekte: >100 bislang bekannte Mutationen
(DNA-Sequenzierung)
ApoB100: häufigste Mutation: G10699A (Arg3500Gln)Frequenz: 1 auf 700 Kaukasierbei Heterozygotie erhöhtes S-LDL-Cholesterin,gestörte Bindung an LDL-Rezeptor,Risiko kardiovaskulärer Erkrankungen
FettstoffwechselHyperlipoproteinämie Typ III:
ApoE: ApoE2-Homozygotie ist Voraussetzung zur Ausprägung dieser Fettstoffwechselstörung
Aber: Nur ein kleiner Teil der Homozygoten erkrankt!!!Ansonsten korreliert das Allel E2 mit niedrigeren Cholesterinspiegeln.
ApoE-Allele: E2, E3 und E4 durch Mutat. C112R und R158CIsoformen: E2/2 (1%), E3/3(55%), E4/4, E2/3, E2/4, E3/4 (26%)
Rezeptorbindung E2 bindet nicht , Aktivierung des hepat. LDL-RezeptorsE4-Partikel bewirken das Gegenteil, E4 ist somit potentiell artherogen, E2 protektiv
Assoziation mit M. Alzheimer für E4
ThrombophiliediagnostikStudien gerade bei jungen Thrombophilie-patienten ergaben eine Korrelation von verschiedenen genetischen Polymorphismen vor allem in zwei Genen von Faktoren des Gerinnungssystems : Faktor V (G1691A) Prothrombin (Faktor II, G20210A)
Außerdem konnte eine Korrelation mit einem Polymorphismus (thermolabiles Enzym) der Methylentetrahydrofolsäurereduktase(MTHFR; C611T) gezeigt werden.
ThrombophiliediagnostikFaktor V: G1691A (Arg506Gln), autosom. dominant
(nach Entdeckungsort Faktor V/Leiden genannt)Effekt : verlangsamte Spaltung durch aktiviertes Protein C (APC-Resistenz)Prävalenz: 1:20 für heterozygoten Defekt
Weitverbreitester Risikofaktor für venöse ThrombosenHeterozygotie: ca. fünf- bis zehnfache Erhöhung des Thromboserisikos gegenüber der Normalbevölkerung
Homozygotie: Risiko ca. 100fach erhöht
Weitere Risikofaktoren (z.B. Kombinationsdefekte, Nikotinkonsum, Einnahme oraler Kontrazeptiva) können das Thromboserisiko zusätzlich erheblich erhöhen.
(zusätzlich Ausschluss von Prothrombin-Genmutation, Antithrombin III-, Protein C-, Protein S-Mangel).
PharmakogenetikBeschäftigt sich mit den hereditären Grundlagen der Unterschiede in einer Population bezüglich dem Response auf ein Arzneimittel.
DNA-Sequenzen variieren leicht von Individuum zu Individuum
zahlreiche Polymorphismen
Genetische und damit häufig auch Unterschiede in Proteinzusammen-setzungen verursachen daher bei gleicher Medikation verschiedene systemische Konzentrationsniveaus.
Insgesamt abhängig vonAufnahme, Absorption, Metabolismus (Phase I und Phase II Biotransformations-reaktionen), Clearance und Exkretion
PharmakogenetikEnzym Häufigkeit Medikamente ProblemeCytochrom P450CYP2D6 3-10% viele (Antidepressiva Meist verstärkte CYP2C19 2-5% Neuroleptika, Beta-Blocker.....) WirkungCYP1A2 12%
N-AcetyltransferaseNAT2 50% Isoniazid, Sulfapyridin Überempfindlich-
Dapson, Koffein, Hydralazin keitsreaktionenThiopurinmethyltransf.TPMT 0,3% Azathioprin, Mercaptopurin Leukopenie
Dihydropyrimidin-Dehydr. 5% (Het.) 5-Fluoruracil verstärkte Wirkung(DPD, DPYD)
Glukose-6-Phos.-Dehydr. 1% Sulfonamide, Primaquin Hämolyse
Serum-Cholinesterase 0,04% Succinylcholin Apnoe
Ca-Transport im ER 0,005% Inhalationsanästhetika Maligne Hyperthermie
Siehe MHH-Homepage/MHH-Internes/ CYP P450 Tabelle sowie Einrichtungen/Klinische Chemie/ Analysenspektrum/Pharmakogenetik/
Sinn dieser Analysen abh. von klin. Bedeutung + Durchführbarkeit.
Bsp: Die Cytochrom P450-Genfamilie (CYP) umfasst eine Vielzahl von Isoenzymen, die für die Verstoffwechslung diverser Substanzen verantwortlich sind.CYP 2D6: Von diesem Isoenzym (Debrisoquin-Hydroxylase) sind eine Reihe von Allelen bekannt, die zu einem Verlust der Enzymaktivität führen [CYP2D6*1 (Wildtyp)] („extensive (rapid) Metabolizer“).
CYP2D6*3, *4, *5, *6 („poor (slow) Metabolizer (PM)“) sind in 98% aller Fälle an einem Verlust der CYP2D6-Aktivität beteiligt. Zwei Mangelallelemüssen allerdings nachgewiesen werden.
CYP2D6*2 („intermediate Metabolizer“) in Verbindung mit einem Poor-Metabolizer-Allel. Genduplikationen führen zu „Ultrafast Metabolizer“.
Betroffene Pharmaka: Antidepressiva (z.B. Amitriptylin), Neuroleptika (z.B. Haloperidol), Antiarrhythmika (z.B. Propafenon)
Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6
Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6
UM: ultrafast metabolizerEM: extensive metabolizerIM: intermediate metabolizerPM: poor metabolizer
Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6
3025N =polymorphismnon-polymorphism
inpa
tient
trea
tmen
t day
s
200
150
100
50
0
45
40
5
CYP-abhängige Schwierigkeiten bei der medikamentösen Therapie psychiatrischer Patienten spiegeln sich sogar in der stationären Behandlungsdauer wider.
Höhere BehandlungskostenEM PM/IM
Weitere Einsatzmöglichkeitenmolekularbiologischer Diagnostik
DNA-Polymorphismen in Assoziation zu Krankheiten/KrankheitsrisikenPharmakogenetik
HLA-Typisierung
Molekularbiologischer Nachweis von Krankheitserregern Mikrobiologie: z.B. Chlamydia trachomatisVirologie: z.B. HBV, HCV, HIV
DNA-Polymorphismen in Assoziation mit einem erhöhten Tumorrisikoz.B. BRCA1 und BRCA2 (Brustkrebsrisiko)
Nachweis von Tumorzellen über tumorspezifische Genprodukte bzw. -variationenz.B. Cytokeratin-RNA, PSA-RNA….
somatische Mutationen in tumorassoziierten Genen (z.B. p53)DNA-Methylierungsmuster (Epigenetik)
Nachweis von chromosomalen Aberrationen zum Nachweis und zur Differenzierung von Leukämien und Lymphomen (z.B. Philadelphia-Chromosom
BCR-ABL (t(9;22))
Patient, 51 J, rauchgraue Pigmentierung der Haut und Schleimhäute, Verdacht auf Lebererkrankung
Befundbeispiel
Transferrinsättigung: 82%
Hereditäre Hämochromatose, sek. D. mellitus (Bronzediabetes), Zirrhose