Projet2:Complexemulti-protéiquedebiosynthèsedel’ubiquinone:étudesbiochimiquesetstructurales

Responsable:MurielleLombard

Permanentsimpliquésdansleprojet(01/11/19):Murielle Lombard (CRCN CNRS), Philippe Simon (IR2 CNRS) Ludovic Pecqueur (IR2 CDF), BrunoFaivre(IECDF)andMarcFontecave(PrCDF)

L’ubiquinone,oucoenzymeQ(CoQouQ),estunlipidedelamembraneplasmiquebactériennequiassureunrôledetransporteurd’électronsdanslachaînerespiratoireainsiqu’unrôleantioxydant.L’ubiquinoneestconstituéed’unnoyaubenzoquinonerédoxactifsubstituéparunechaînepolyisoprénylede8unitéschezEscherichiacoli(Q8),de9 unités chez la levure (Q9) et de 10unités chez l’homme (Q10) (Fig. 1).L’ubiquinone a un rôle crucial pour lefonctionnement de la chaînerespiratoire. Chez l’homme, desdéficiencesprimairesenCoQainsiquedes mutations dans les gènes de sabiosynthèseontétéassociéesàdiversespathologies (myopathies,néphropathies, ataxies cérébellaires,etc).

Fig.1:Structuredel’ubiquinoneetdesesdifférentsétatsredox

LabiosynthèsedeCoQcomporteplusieursétapesdetransformationdesonnoyauaromatique:uneréactiondeprénylation,unedécarboxylation,troishydroxylations,ettroisméthylations(Fig.2).Chez

Escherichia coli, 9 protéines ontété identifiées à ce jour danscette voie de biosynthèse (ubiA-ubiH, ubiX), et des étudesgénétiques réalisées par noscollaborateurs (F. Pierrel, UJF-Grenoble ; F. Barras, Marseille)ont permis d’identifier 3nouvellesprotéines :VisC (UbiI),YigP (UbiJ)etYqiC (UbiK), toutestrois impliquées dans labiosynthèse de l’ubiquinone.Cette voie de biosynthèse est

bienconservéedesprocaryotesjusqu’àl’homme.

Fig.2:Voiedebiosynthèsedel’ubiquinoneproposéechezE.coli

O

O

CH3H3CO

H3COn

n = 6 Saccharomyces cerevisiaen = 8 Escherichia colin = 10 Homo sapiens

n-1PPO

COOH

OH

COOH

OHn

OHn

4HB OHB OPP

OHnHO

OHnH3CO

UbiA UbiX/UbiD

UbiI

UbiG

OHnH3CO

OH

OHnH3CO

OHCH3

OHH3CO

OHCH3

UbiHUbiE

UbiF

Ubiquinone (CoQ)

HO UbiG

n

COOH

OH

Chorismate

O

CH2

HOOC

UbiC

Par ailleurs, ces protéines semblent former un large assemblagemulti-protéique associé à lamembrane,ainsiquecelasembleêtrelecaspourlesprotéinesCoq,quisontlesprotéineshomologuesdesUbibactériennes,etquisontimpliquéesdanslabiosynthèseduCoQ9chezlalevureSaccharomycescerevisiae(Fig.3).

Fig.3:ModèleducomplexedebiosynthèseduCoQchezlalevureS.cerevisiae(ClarkeCF,JBiolChem,2014).

Endépitdel’importancephysiologiquedel’ubiquinonedanslachaînedetransfertd’électronsetl’implicationdanslespathologiesdécritesci-dessus,lafonctiondechacunedesprotéinesUbin’estàcejourpasconnueentièrement,etdetrèsnombreusesincertitudesdemeurentquantàl’identificationdesprotéinesresponsablesdechacunedesétapesdelabiosynthèse,ainsiquedel’ordredecesréactions.Nous avons également peu d’informations biochimiques concernant la spécificité de substrat ou lesmécanismes réactionnels de ces enzymes. Ceci est partiellement dû au fait que les substrats de cesenzymessontdescomposéslipophilestrèshydrophobes,peusolublesdansl’eau,etpeufaciled’accès.Deplus,l’obtentiondedonnéesphysico-chimiquesinvitrosurdessystèmesenzymatiquesfaisantpartied’uncomplexemulti-protéiqueinvivopeutêtredélicat.

Aulaboratoire,nousnousintéressonsà l’ensembledesprotéinesdelavoiedebiosynthèsedel’ubiquinone chez Escherichia coli d’un point de vue structural et fonctionnel. Nous cherchons àdéterminerdefaçonpréciselafonctionexactedechacunedesprotéinesouenzymesquiconstituentcecomplexemulti-protéique.LacaractérisationbiochimiqueinvitrodesprotéinesUbietladéterminationde leur structure tridimensionnelle devraient permettre de mieux comprendre leur fonction, et leurmécanismeauniveaumoléculaire.Nouscherchonsaussiàdéterminerleurmodedestructurationenuncomplexe de haut poids moléculaire (composition exacte de ce complexe, taille et stoïchiométrie,localisationcellulaire)et leurancragehydrophobeà lamembrane (collaborationF.Pierrel,UMR5163,LaboratoireAdaptationetPathogéniedesMicroorganismes,UJF-Grenoble).Notreobjectifestd’avoirunemeilleureconnaissanceauniveaufondamentaldelavoiedebiosynthèsedeCoQchezE.coli.Pourcela,nousutilisonsune combinaisond’approchesmultidisciplinairesdebiochimie,biophysiquemoléculaire(spectroscopiesouspression,transfertd’énergieparrésonanceFRET,dischroïsmecirculaire,laserflashphotolyse, Djemel Hamdane) biologie structurale (cristallographie RX, Ludovic Pecqueur) et chimieorganique(PhilippeSimon)dontnousdisposonsauseindel’unité.

Nousnoussommesaussilancédanslasynthèsed’analoguesdebiosynthèsedel’ubiquinone,àchainespluscourtespossédant3unitésterpèniques(farnésyl)aulieude8(ubiquinoneUQ8).

EtudebiochimiqueetstructuraledesflavoprotéinesUbiId’E.colietdeCoq6deSaccharomycescerevisiae

NousavonsétudiéUbiI,l’enzymequicatalyselareactiond’hydroxylationenC5du2-octaprenylphenol(OPP).UbiIprésente30%d’identitédeséquenceavecUbiFetUbiH,deuxautresprotéinesdelavoiedebiosynthèsedel’ubiquinone,etquicatalysentelles-mêmeschacuneuneréactiond’hydroxylationdunoyauaromatique(C1pourUbiHetC6pourUbiF).L’étudedesséquencesdecestroisenzymes(UbiI,UbiFetUbiH)montrequ’ellesappartiennenttoutesà lafamilledesmono-oxygénasesàflavine. Nousavons purifié une forme instable d’UbiI qui avait une forte tendance à l’agrégation. Après protéolyselimitée,nousavonsobtenuune formeapo (sansFAD),parfaitementsolubleet tronquéede35acidesaminésauniveauC-terminal.Nousavonsréussiàobtenirdescristauxdecetteformeapoettronquéed’UbiI etnousavonsdéterminé la structure tridimensionnellede l’enzymepardiffractiondeRX (2Årésolution,codePDB4K22).Cetteenzymepartagedefortessimilaritésstructuralesavecuneprotéinedela famille des mono-oxygénases à flavine, la pHBH (p- Hydroxybenzoate hydroxylase) (Fig. 4). Ceciconstituelepremierexempledelastructured’unehydroxylaseUbi.

Fig. 4: A) Structure tridimensionnelle aux RX d’UbiI tronquée et apo d’E.coli (code PDB 4K22) et B)superpositiond’UbiI(bleue)avecPHBH(jaune),codePDB1PBE(HajjChehade,2014).

Nousavonségalement réaliséuneétudedemodélisationmoléculaireparhomologiedeCoq6danslebutdemieuxcomprendrelefonctionnementdel’enzyme.Cetteétudenousapermis,pardescalculsdedynamiquemoléculaireetdedocking, de mettre en évidence trois voies d’accès potentielles dessubstrats(Fig.5).

Fig.5:ModèleproposédesiteactifdeCoq6(FADenvert)avecuntunneld’accèspotentieldusubstratenviolet(Caver).

A

EtudebiochimiqueetstructuraledesprotéinesdestructureUbiJetUbiKd’E.coli

Nous avons entrepris l’étude biochimique et structurale de deux protéines nouvellementidentifiéesparnoscollaborateurs,UbiJetUbiK,etdont les fonctionsbiologiquessont jusqu’àce jourinconnues.Desétudesantérieuresontmontréqu’UbiKdeSalmonellatyphimuriumpermetl’agrégationdeliposomesinvitro,suggérantuneactivitéfusogéniquedemembrane.UbiKprésente31%d'identitédeséquenceavecBrick1,uneprotéined’assemblageducomplexeWaveducytosquelette,cequilaisseàpenserqu’UbiKpourraitavoirunrôledeprotéinescaffold,ayantunrôleimportantpourlaformation,lastructuration et la stabilité du complexe Ubi. Nous avons montré au laboratoire qu’UbiK forme uncomplexeprotéiqueavecUbiJ,uneprotéineprésentantdeshomologiesdeséquenceaveclesprotéinesdelafamilleSCP2(SterolCarrierProtein2)quisontcapablesdelierdeslipides.

Nousavonsrécemmentobtenu lastructuredudomaineSCP2d’UbiJà1.7Åderésolution.LedomaineSCP2estundimèreforméde5hélicesaetde5feuilletsb,avecunecavitéhydrophobedontleplancherestconstituéparlesfeuilletsbetlesparoisforméesparleshélicesa.Lagéométrieetlataillede la cavité sont en cohérence avec la liaison des intermédiaires lipidiques de la biosynthèse del’ubiquinone(Fig.6).

Fig.6:StructuredudomaineSCP2d’UbiJd’E.coli(1.7Å).A)DimèredeUbiJ-SCP2avecunfolddetypeα/β.B)LessphèresjaunesreprésententlacavitéhydrophobeauseindudimèreUbiJ.C)Modèledelacavitéd’UbiJ-SCP2aveclesrésidushydrophobesbordantlacavitémisenévidenceenjauneetmontrantune densité électronique non modélisée suggérant un site de liaison des lipides intermédaires del’ubiquinone.

Miseenévidenced’unmégacomplexemulti-protéiquede1.2MDade7protéinesUbi

Avecnoscollaborateurs,nousavonsdémontréque laprotéineUbiJestuneprotéinecentralepourlastabilisationd’unmégacomplexeUbiquisetrouvedanslafractioncytosolique.Cemégacomplexecomporte7protéinesdont5enzymes(UbiE,UbiF,UbiG,UbiH,UbiI)et2protéines«scaffold»(UbiKetUbiJ).Cecomplexesetrouvedanslafractioncytosolique,etnonmembranaire.Nousavonségalementmontréquedesintermédiairesdesynthèse,telsquel’OPPetlaDMQ8,s’accumulentdanscecomplexe,alorsquepeudeUQ8setrouvedanscecomplexe.

Ainsi,nouspouvonsproposerunmodèlepour le complexeUbidans lequel les intermédiairesdebiosynthèsedel’UQ8quisetrouventenamontdel’OPPnesontpasassociésauxlipidesmembranairesmaisàUbiJauniveauducytosoldanslelargecomplexeUbi(Fig.6).Danscemodèlel’extrusiondel’OPPde la membrane plasmique pourrait être médiée par la protéine UbiB. En effet, récemment Coq8,l’homologue eucaryote d’UbiB, a été postulé comme étant capable de coupler l’hydrolyse de l’ATP àl’extrusiondestêtespolairesd’intermédiairesdel’UQ8horsdelamembrane.IlestintéressantdenoterqueUbiBcontientunsegmenttransmembranaireetunepartiesolubleetquecetteprotéinenefaitpaspartieducomplexeUbi.

Les résultats obtenus permettent ainsi d’établir clairement l’existence d’unmétabolon stablepourlabiosynthèsedel’ubiquinone(Fig.7).

Fig.7:Voiedebiosynthèsedel'UQ8etmodèleproposéd'organisationphysiquedesprotéinesUbietdesintermédiairesprénylésdel’UQ8parrapportàlamembraneinterne.UbiBfacilitel'extractiondel’OHBdelamembraneetl’OHBestensuitedécarboxyléenOPPparUbiD-X.L’OPPestliéeparUbiJdanslecomplexeUbi et le métabolon formé par les sept protéines Ubi encerclées en rouge synthétise l'UQ8, qui estfinalementdélivréàlamembrane,oùelleréalisesesfonctionsphysiologiques.

Etude biochimique et structurale des protéines Fe-S UbiU et UbiV impliquées dans labiosynthèseanaérobedel’ubiquinonechezE.coli

Nousavonsmontréquelesvoiesdebiosynthèsedel’ubiquinonedépendantesetindépendantedel'oxygènenediffèrentquepartroisétapesd'hydroxylation,etnousavonsidentifiétroisgènes:ubiT,ubiUetubiV,quisontessentielspourlabiosynthèsedel’ubiquinoneenabsencedel’oxygènechezE.coli.

L'expression, la purification et la caractérisation spectroscopique d’UbiV et du complexehétérodimèreUbiU-UbiVontclairementmontréquechaqueprotéinecontenaituncentre[4Fe-4S].UbiUetUbiVformentuncomplexehétérodimerique,suggérantquecesdeuxprotéinesfonctionnentensemble(Fig.8).

LerôledescentresFe-SdansUbiUetUbiVestinconnuàcestade.Notrehypothèsedetravailactuelleest qu'ils joueraient un rôle de chaînes de transfert d'électrons entre le substrat (l'intermédiairebiosynthétique de l'ubiquinone à hydroxyler) et un accepteur d'électrons non identifié nécessaire àl'activationdusubstrat.Ensemble,nosrésultats identifientUbiUetUbiVcommedesprototypesd'unenouvelleclassed'hydroxylasesindépendantesdel'oxygèneetouvrentunenouvelleportepourl’étudesdesréactionsd’hydroxylationindépendantedel’oxygène.

Fig.8 : A)VoiesdeBiosynthèseaérobiqueetanaérobiquede l’ubiquinonedépendente.LesprotéinesUbiUUbiVetUbiTinterviennentenlieuetplacedeshydroxylasesaerobesflavinedépendantesUbiI,UbiFetUbiH(notéesenrougeici).B)AnalyseparHPLC-ECDdesextraitslipidiquesdessouchesdontlesgènesubiU,ubiVetubiTontétédélétésetcultivésàl’airouenanaérobie.C)OccurrencedesgènesubiU,VetTdans 600 génomes de protéobactéries. D) Spectre d’absorption UV-visible du complexe UbiU-UbiVd’E.coli.E)SpectreRPEducomplexeUbiU-UbiVd’E.coli.

B

A

C

D E

Méthodesetexpertises

- Culturescellulaires:bactéries(E.coli)- Clonage,expressiondeprotéinesrecombinantesprocaryotesoueucaryotes,mutagénèsedirigée,

purificationdeprotéines- Enzymologie(steady-stateetpre-steady-state:stopped-flow)- Spectroscopiesoptiques(UV-visible,fluorescence)- Caractérisationdeproduitsdemétabolismeparspectrométriedemasse- Etudecristallographiquedeprotéines- Synthèseorganique

Collaborationsprincipales

- FabienPierrel,LaboratoireAdaptationetPathogéniedesMicroorganismes,UMR5163,CNRS,UJF-Grenoble

- Frédéric Barras, Unité Adaptation au Stress et Métabolisme chez les entérobactéries,DépartementdeMicrobiologie,IntitutPasteur.

Publications

11-UbiquinoneBiosynthesisovertheEntireO2Range:CharacterizationofaConservedO2-IndependentPathway.PelosiL,VoCD,AbbySS,LoiseauL,RascalouB,HajjChehadeM,FaivreB,GousséM,ChenalC,TouatiN,BinetL,CornuD,FyfeCD,FontecaveM,BarrasF,LombardM,PierrelF.MBio,2019Jul9;10(4).E01319-19

10-AsolublemetabolonsynthesizestheisoprenoidlipidubiquinoneHajjChehadeM,PelosiL,FyfeC,LoiseauL,RascalouB,BrugièreS,KazemzadehK,VoCDT,AusselL,CoutéY,Ciccone,L,FontecaveM,BarrasF,LombardM,PierrelF.CellChemBiol,2019Apr18;26(4):482-4929-TheUbiKproteinisanaccessoryfactornecessaryforbacterialubiquinone(UQ)biosynthesisandformsacomplexwiththeUQbiogenesisfactorUbiJLoiseauL, FyfeC,Aussel L,HajjChehadeM,HernándezSB,FaivreB,HamdaneD,Mellot-DraznieksC,RascalouB,PelosiL,VeloursC,CornuD,LombardM,PierrelF,FontecaveM,BarrasF.JBiolChem.2017Jul14;292(28):11937-119508- Coenzyme Q Biosynthesis: Evidence for a Substrate Access Channel in the FAD-DependentMonooxygenaseCoq6Ismail,A.,Leroux,V.,Smadja,M.,Gonzalez,L.,Lombard,M.,Pierrel,F.Mellot-Draznieks,Fontecave,M.PLosComputBiol2016Jan;12(1):e1004690

7-Coq6 is responsible for theC4-deamination reaction in coenzymeQbiosynthesis inSaccharomycescerevisiae.OzeirM,PelosiL,IsmailA,Mellot-DraznieksC,FontecaveM,PierrelF.JBiolChem.2015Oct2;290(40):24140-51.6- BiosynthesisandphysiologyofcoenzymeQinbacteria.AusselL,PierrelF,LoiseauL,LombardM,FontecaveM,BarrasF.BiochimBiophysActa.2014Jul;1837(7):1004-11

5-ubiJ,anewgenerequiredforaerobicgrowthandproliferationinmacrophage,isinvolvedincoenzymeQbiosynthesisinEscherichiacoliandSalmonellaentericaserovarTyphimuriumAusselL,LoiseauL,HajjChehadeM,PocachardB,FontecaveM,PierrelF,BarrasF.JBacteriol.2014Jan,196(1):70-9

4-ubiI,anewgeneinEscherichiacolicoenzymeQbiosynthesis,isinvolvedinaerobicC5-hydroxylationHajjChehadeM,LoiseauL,LombardM,PecqueurL,IsmailA,SmadjaM,Golinelli-PimpaneauB,Mellot-DraznieksC,HamelinO,AusselL,Kieffer-JaquinodS,LabessanN,BarrasF,FontecaveM,PierrelF.JBiolChem.2013Jul;288(27):20085-92

3- Overexpression of the Coq8 kinase in Saccharomyces cerevisiae coq null mutants allows foraccumulationofdiagnosticintermediatesofthecoenzymeQ6biosyntheticpathwayXieLX,OzeirM,TangJY,ChenJY,JaquinodSK,FontecaveM,ClarkeCF,PierrelF.JBiolChem.2012Jul6;287(28):23571-81

2-CoenzymeQbiosynthesis:Coq6isrequiredfortheC5-hydroxylationreactionandsubstrateanalogsrescueCoq6deficiencyOzeirM,MühlenhoffU,WebertH,LillR,FontecaveM,PierrelF.ChemBiol.2011Sep23;18(9):1134-42

1-Involvementofmitochondrialferredoxinandpara-aminobenzoicacidinyeastcoenzymeQbiosynthesisPierrelF,HamelinO,DoukiT,Kieffer-JaquinodS,MühlenhoffU,OzeirM,LillR,FontecaveM.ChemBiol.2010May28;17(5):449-59