Travaux PratiquesTravaux Pratiques

Tests de chimiosensibilité in vitro : Tests de chimiosensibilité in vitro : un test de un test de phénotypagephénotypage

Milijaona RandrianarivelojosiaMilijaona Randrianarivelojosiamilijaon@pasteur.milijaon@pasteur.mgmg

Avec le concours de Dr Marie Ange Avec le concours de Dr Marie Ange RasonRasonet de M. et de M. HerilalainaHerilalaina AndrianantenainaAndrianantenaina

……, , il est impératif de surveiller la sensibilité/résistance de il est impératif de surveiller la sensibilité/résistance de Plasmodium Plasmodium spsp aux antipaludiques, notamment dans les aux antipaludiques, notamment dans les pays d’endémie.pays d’endémie.

P. falciparum

P. malariae P. ovale

P. vivax

peuvent être résistant aux drogues

Test in vivo(traitement et

suivi)

Echantillon de sang Tests in vitro

Evaluation de la sensibilité de Evaluation de la sensibilité de P. falciparumP. falciparum aux antipaludiquesaux antipaludiques

Test de chimiosensibilité

Génotypage(marqueurs de

résistance)

Test in vivo(traitement et

suivi)

Evaluation de l’efficacité des traitementsEvaluation de l’efficacité des traitements

Evaluation de l’efficacité thérapeutique des Evaluation de l’efficacité thérapeutique des antipaludiquesantipaludiques

Protocoles d’étude- WHO/CDS/CSR/EPH/2002.17- WHO/MAL96.1077

Médicaments- molécules préconisées par la politique nationale- molécules autorisées sur le marché et utilisées dans un pays

Dosage de taux plasmatique des médicaments et/ou des métabolites

Augmentation de taux d’échec:

Alerte !

Evaluation de la chimiosensibilité de Evaluation de la chimiosensibilité de P. falciparum in vitroP. falciparum in vitro

Echantillon de sang Tests in vitro

Test de chimiosensibilité

Génotypage(marqueurs de

résistance)

Test de chimiosensibilité Test de chimiosensibilité in vitroin vitro

Examen microscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001

Colorimétrique (Elisa)Moreno et al, 2001 : LDHNoedl et al, 2002 : HRPII

Méthode isotopiqueDesjardins et al, 1979; Le Bras & Deloron, 1983

Mise en culture des parasites viables

Phénotype résistant + :Alarme !

Cytométrie en fluxPattanapanyasat et al, 1997

Quand aura «Quand aura « facilementfacilement » les anticorps, …» les anticorps, …

des tests seront faisables dans des structures hospitalières (périphériques)

Con

cen

trat

ion

de

dro

gue

Min

Max

Réception des prélèvements

Plaques de culture à fond plat prémédicamentées

Différentes étapes du test de chimiosensibilitéin vitro (1)

Différentes étapes du test de chimiosensibilité in vitro (2)

Milieu de culture

RPMI ; Sérum humain AB+ (ou albumax); Hypoxanthine-3H

Suspension parasitaire

Lavage du culot de globules rouges parasités (GRP) ; préparation et distribution de la suspension de GRP sous la hotte

Différentes étapes du test de Différentes étapes du test de chimiosensibilité chimiosensibilité in vitro in vitro (3)(3)

Mise en culture

Incubation pendant 42h à 37°C; atmosphère humide; en microaérophilie

Congélation et décongélation des plaques de culture

+

Schématisation de l’incorporation de l ’hypoxanthine tritiéedans l’ADN du parasite

HypoxanthineHypoxanthine--33HH

ADN plasmodial ADN plasmodial (au début du (au début du

test)test)ADN plasmodial ADN plasmodial

marqué au marqué au tritiumtritium

Différentes étapes du test de chimiosensibilitéDifférentes étapes du test de chimiosensibilitéin vitro in vitro (4)(4)

Collecte du contenu Collecte du contenu des puits sur un des puits sur un filtre en fibre de filtre en fibre de verreverre

Différentes étapes du test de chimiosensibilité in vitro (5)

Comptage de la radioactivité (cpm) à l’aide du Microbeta

Calcul des CI50 (concentration inhibitrice 50%) et des CI90 des antipaludiques

A 3019 3126 3174 3221 3053 3288 2593 2464 3185 2963 3017 3174B 2582 2951 2315 875 1006 870 2472 2446 2484 2570 2772 2608C 1737 1767 1685 102 100 110 1678 1552 1557 1526 1716 1732D 482 415 595 120 106 101 702 651 541 695 762 795E 164 138 192 82 77 85 112 122 119 218 327 276F 96 133 94 90 73 75 66 72 87 110 155 131G 90 108 3040 78 104 3340 105 76 3552 111 122 2943H 103 100 3276 101 114 3045 77 104 3187 113 135 3017

Chloroquine Amodiaquine Mefloquine Quinine

Comptage de radioactivité après un test d’antipaludogramme : illustration

Cellules colorées en jaune = témoin (i.e. puits sans antipaludiques)

Faibleconcentration

Forteconcentration

MAL7P1.27 (www.plasmoDB.org)

PfcrtPfcrt, , marqueur de résistance marqueur de résistance P. falciparum P. falciparum à la chloroquineà la chloroquine

(Fidock et al, 2000)

Drug/substrate

NADP

108

5951

164

PfdhfrPfdhfr, , marqueur de résistance de marqueur de résistance de P. falciparumP. falciparumà la pyriméthamineà la pyriméthamine

pfDHFR

Détections des mutations des Détections des mutations des marqueurs de résistancemarqueurs de résistance

PCR/séquençage

PCR nichée mutation spécifique

Utilisation des sondes

PCR/RFLPAmplification

par PCR

(Ranford-Cartwright et al, 2002)

Génotype mutant + :Alarme !

Stratégie de surveillance (1)Stratégie de surveillance (1)

Analyse des rapports émanant des structures de santé de Analyse des rapports émanant des structures de santé de base, de district, provinciales …base, de district, provinciales …

Suivi de cohortes (sites sentinelles)Suivi de cohortes (sites sentinelles)

Mise en place de réseau (national, régional, …)Mise en place de réseau (national, régional, …)

……

Stratégie de surveillance (2)Stratégie de surveillance (2)

(Randrianarivelojosia et al, 2002)

Pratique de radioprotection Pratique de radioprotection et utilisation de produits et utilisation de produits tritiéstritiés

Exemple du GRP de l’IPMExemple du GRP de l’IPM

parpar

Marie Ange Marie Ange RasonRasonmieange@pasteur.mg

Avec le concours de Dr Milijaona Randrianarivelojosia et de Madagascar-INSTN

Pourquoi la technique isotopique ?Pourquoi la technique isotopique ?

PaludismePaludisme :: problème de santé publique ; avec risque de résistance des parasites, notamment de P. falciparum, aux drogues

Intérêt en santé publiqueIntérêt en santé publique : : surveiller la sensibilité surveiller la sensibilité ou résistance de l’agent causal du paludisme aux ou résistance de l’agent causal du paludisme aux droguesdrogues

Surveillance de la chimiosensibilité des parasite du paludisme à Madagascar

Collaboration entre Ministère de la Santé et du Planning Collaboration entre Ministère de la Santé et du Planning Familial et l’Institut Pasteur de MadagascarFamilial et l’Institut Pasteur de Madagascar

Avec une standardisation de la techniqueAvec une standardisation de la technique

ButBut : : doter Madagascar (et la sous région de l’Océan doter Madagascar (et la sous région de l’Océan Indien) d’un outil d’évaluation de l’efficacité des Indien) d’un outil d’évaluation de l’efficacité des antipaludiquesantipaludiques

Tests in vitroDétection des mutations au niveau des marqueurs Détection des mutations au niveau des marqueurs génétiques de la résistance qui implique une génétiques de la résistance qui implique une amplification par PCR des gènes d’intérêt (technique amplification par PCR des gènes d’intérêt (technique isotopique ou isotopique ou nonnon--isotopiqueisotopique))

AntipaludogrammeAntipaludogramme utilisant le technique de marquage utilisant le technique de marquage isotopique avec l’hypoxanthine isotopique avec l’hypoxanthine tritiéetritiée pour l’étude de la pour l’étude de la sensibilité de sensibilité de Plasmodium falciparum Plasmodium falciparum aux antipaludiquesaux antipaludiques

SurveillanceSurveillance de la sensibilité du parasitede la sensibilité du parasite

HypoxanthineHypoxanthine tritiéetritiée

SourceSource non scellée, aqueuse, rayonnements non scellée, aqueuse, rayonnements ββ--

Faible activitéFaible activité

Période longue (12,4 ans)Période longue (12,4 ans)

Précurseur d’acides nucléiques et est incorporée dans Précurseur d’acides nucléiques et est incorporée dans l’ADN pendant la phase de division des cellules.l’ADN pendant la phase de division des cellules.

Source de rayonnement utiliséeSource de rayonnement utilisée

Mise en culture pendant 48 heures de sang parasité Mise en culture pendant 48 heures de sang parasité (parasites viables dans un échantillon de sang veineux)(parasites viables dans un échantillon de sang veineux)dans du milieu de culture + hypoxanthine dans du milieu de culture + hypoxanthine tritiéetritiée, et en , et en présence de différentes concentrations d’antipaludiques,présence de différentes concentrations d’antipaludiques,

Paramètre utilisée pour classer selon la sensibilitéParamètre utilisée pour classer selon la sensibilité : CI : CI 50% ou concentration inhibitrice du médicament qui inhibe 50% ou concentration inhibitrice du médicament qui inhibe à 50% la croissance du parasite.à 50% la croissance du parasite.

Mise en culture des parasitesMise en culture des parasites

Deux personnes compétentes en radioprotection Deux personnes compétentes en radioprotection

Gestion des produits et des déchetsGestion des produits et des déchets ; protections ; protections individuelles et collectivesindividuelles et collectives

Procédures disponiblesProcédures disponibles ; répartition de taches (et ; répartition de taches (et seules les personnes autorisées peuvent seules les personnes autorisées peuvent manipuler l’hypoxanthine manipuler l’hypoxanthine tritiéetritiée))

IPMIPM :: Pratique de la radioprotectionPratique de la radioprotection

Individuelle : Individuelle : Port des gants et blouse est obligatoire, Port des gants et blouse est obligatoire, masque lors de la dilution des déchets liquidesmasque lors de la dilution des déchets liquides

Collective : Collective : Hotte à flux laminaire pour la culture, hotte Hotte à flux laminaire pour la culture, hotte de chimie pour la collecte, salle spéciale pour la de chimie pour la collecte, salle spéciale pour la radioactivité, matériels à usage unique, pipette radioactivité, matériels à usage unique, pipette automatique, microplaques, papier aluminium et automatique, microplaques, papier aluminium et absorbant, balisage des portes d’entrées, poubelles absorbant, balisage des portes d’entrées, poubelles spéciales, plateaux récupérateurs.spéciales, plateaux récupérateurs.

Moyens de protectionMoyens de protection

LiquidesLiquides :: Stockage dans des bidons plastiques dans la Stockage dans des bidons plastiques dans la salle radioactive en attente des contrôles par salle radioactive en attente des contrôles par MadagascarMadagascar--INSTNINSTN avant le rejetavant le rejet

SolidesSolides :: Compacter et stocker dans des fûts métalliques Compacter et stocker dans des fûts métalliques qui sont supportés par des bois carrés, dans une fosse qui sont supportés par des bois carrés, dans une fosse bétonnée dans l’enceinte de l’IPM.bétonnée dans l’enceinte de l’IPM.

Gestions des déchets radioactifs à l’IPMGestions des déchets radioactifs à l’IPM

Limitation de quantité manipuléeLimitation de quantité manipulée : activité annuelle (totale) : activité annuelle (totale) utilisée = 6,4.10utilisée = 6,4.1088 << 1,2.101,2.101010 Bq (LAI)Bq (LAI)

Contrôle régulier de surface (détection de contamination Contrôle régulier de surface (détection de contamination des plans de travail)des plans de travail)

Autorisation d’utilisation délivrée par Autorisation d’utilisation délivrée par MadagascarMadagascar--INSTNINSTN(et nous avons eu un projet IAEA)(et nous avons eu un projet IAEA)

Inspection fréquente/collaboration des officiers de Inspection fréquente/collaboration des officiers de radioprotection de l’radioprotection de l’INSTNINSTN--MadagascarMadagascar

Suivi médicalSuivi médical (annuel) du personnel(annuel) du personnel

Autorisation, contrôle, inspection, rigueurAutorisation, contrôle, inspection, rigueur