Quelles  sont  les  probléma0ques  en  bio-­‐informa0que  du  séquençage  haut  débit  

pour  le  diagnos0c  des  maladies  géné0ques

Pr.  Stéphane  BEZIEAU,  service  de  Géné0que,  CHU  Nantes  et  Université  de  Nantes  

La solution technologique : le séquençage nouvelle génération = NGS

Approche « shotgun », on séquence la cible en une seule étape, par petits fragments, puis on assemble par bioinformatique (alignement) puis on compare par rapport à la séquence de référence, encore par bioinformatique.

ADN génomique

Fragmentation puis enrichissement

Séquençage de l’ensemble des fragments en un seul temps (séquençage massif parallèle)

Analyse bioinformatique Assemblage par alignement sur la

séquence de référence, puis analyse

• La technologie existe (exomes & genomes) • Des logiciels sont développés activement pour annoter, trier, classifier les variants

UN GENOME : 3 Milliards 200 millions de paires de bases

EXOME : 1,5 % DU GENOME (23 000 Gènes)

48 MILLIONS DE PAIRES DE BASES

VARIATIONS INTER-INDIVIDUELLES APPELEES POLYMORPHISMES

3 millions par Génome

QU’EST CE QUE L’ON ATTEND POUR L’EXOME EN ROUTINE ?

panel exome génome

…AGCTTTAGGCTAGGGCCCCTTAGTATATATATTATATATGGGTGTGTGTAAGTCCCCAAA….  

…AGCTTTAGGCTAGGGCCCCTTAGTATATATA/GTTATATATGGGTGTGTGTAAGTCCCCAAA….  

INTERET DE L’EXOME : GENES CANDIDATS TROP NOMBREUX

217 genes 25% de mutations délétères identifiées VO3 : 438 gènes dont 250 gènes “qualité diagnostic” A ou B 96 suspectés par d’autres équipes mais non retenus dans VO3

Redin  C,  et  al.  J  Med  Genet  2014;51:724–736.    

Nécessité de faire des choix devant le nombre de gènes candidats mais qualité optimisée pour 238 gènes !

5

 

Family  1:  Iranian  origin  

(Küry S et al, article en cours)

INTERET DE L’EXOME : GENE RESPONSABLE INCONNU

Séquençage Haut-Débit: 2 technologies (aujourd’hui)

Illumina MiSeq, NextSeq and HiSeq series: séquençage par synthèse, lectures 36- 250 pb 2 à 11 jours de run env.; plusieurs déclinaisons de débit: 1Gb > 3 Tb et plus

Life Ion Torrent technology: PGM and Proton Séquençage par semi-conducteur, lectures 100-400pb, ->1 Gb/run, 3h de run (PGM) ; exome (Proton) Le taux d’erreur élevé de cette technologie peut être traité en constitutionnel (on attend des hétérozygotes donc un taux de mutation de 50%) mais plus délicat en somatique.

- Détermination du mode de transmission +++ (pas toujours aisé) -  recherche encadrée sur le plan éthique -  ANONYMISATION DES DONNEES

LA PIPELINE BIOINFORMATIQUE, ENJEU MAJEUR Des solutions pour le NGS ciblé, plus difficile à maîtriser pour l’exome

SOLUTION INTERNE : - Ressource bioinformatique indispensable - Support du département informatique obligatoire - Logiciels commerciaux développées : SeqNext (JSI), Sure Call SOLUTION EXTERNE - Transfert de données brutes (BAM, FASTQ,…) - traitement de données externalisé - Traitement bioinformatique de panel CE-IVD - Ex : Sophia Genetics (avantage : base inter-communicante)

Coût : 30 à 60 euros par patient ! STOCKAGE DES DONNEES (10 ans?)

Séquence  de  référence  

1  read  =  1  fragment  lu  =  ~200pb  

Séquence  consensus  lue  

Couverture  (taille  de  la  séquence  cible)  

Profondeur  (moyenne  du  nombre  de  lectures  pour  chaque  base  ;    exprimée  en  X)  

Analyse bioinformatique

10

NGS ciblé

Mutation SLC39A4 c.192+19G>A

Validation Sanger indispensable

en exome ou en ciblé

Notion indispensable en NGS : couverture et profondeur de couverture (ex : 50 X)

Seuil diagnostic minimum 30 X Exome 50X, 100 X de moyenne

Exemple de défaut de couverture : MLH1 exon 16

Séquençage Sanger obligatoire car région non couverte

Les 2 amplicons du haut chevauchant la jonction des autres amplicons ne sont pas capturés, entrainant une perte de couverture sur 3 bases

Exemple de défaut de profondeur de couverture : SCN5a exon 18

La profondeur et la couverture en exome if  86%  of  the  exome  is  covered  at  20X,      -­‐  2  compound  heterozygous  variants  in  1  gene  will  be  found  in  72.5%  of  the  cases;    -­‐  in  25.3%  of  the  cases,  only  one  variant  will  be  found;    -­‐  in  2.2%  of  the  cases  both  variants  will  be  missed.    

Highly optimized design for deep coverage of targets in HGMD, OMIM, and ClinVar, 98% at 20x, for highly sensitive variant detection. L’exome en routine diagnostic impose comme le NGS ciblé de connaître la

couverture de ses gènes cibles et de les indiquer au clinicien

SureSelect

Clinical Research Exome

(AgilentR)

DDDCCC?<CCCCDE>DACD;DBDCDC>;C>D?@C9C7@CCDACCADDDAB,=C@ @IL31_4368:1:1:1001:20031/2 AGCAATTAATAGAGTGAAGAGAAAACCTACAAAATGGGAGAAAATATTTGTAAA + ?@FBEFECFCE8EC<>C@AE>CDDEEFCEEE@@+ED=CDDE4EE<@CDD+C?CC @IL31_4368:1:1:1001:7078/2 TGGGTGTGTGTGTGTTTGCGTGCGCGCTTCTGGGTGTAGTTATGTGTGTGTCTG + ??>D7DD?AD?EDECEAB@<@,7@A9'>7><BC;=A31?A.;<>>B)A708>>4 @IL31_4368:1:1:1001:11670/2 AGGATGATGACAGCAACTTTCATATGGATTTCATCGTGGCTGCATCCAACCTCC + ;EEE,FEAEFEFFFECEFCEFA>FCEEC@@ECEBCDFFAFD9E;9E@E?BD@?C @IL31_4368:1:1:1001:15110/2 GGAGTACAAGAAGGAAGGCATTGAGTGGACGTTCATTGACTTTGGGATGGACCT + FCEFCGGEGFECEEGCGCAAFEC=EAFGFEE?8BAA<C=DA=4:EE>9@6;4B> @IL31_4368:1:1:1002:6807/2 AGTCTTTGGACTTGCAAGAGAAGCCCAGCATTAAGAAAGAGACCCTCCTCAAAA +

FASTQ LES  FORMATS  DE  FICHIER  EN  NGS  

$ gunzip -c data.vcf.gz |\ grep -v "##" |\ normalizechrom |\ dnacontext -f hg19.fa |\ awk '($8=".")' #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER . FORMAT CALL LEFT(DNA) CONTEXT(DNA) RIGHT(DNA) chr1 879317 rs7523549 C T 71 0 . GT:GQ:DP:FLT 0/1:34:8:0 GAGTTTTCTA C GTGGCCAGCT chr1 880238 rs3748592 A G 51 0 . GT:GQ:DP:FLT 1/1:51:8:0 AGCCAGCCTT A GAGGTTACTC chr1 880390 rs3748593 C A 99 0 . GT:GQ:DP:FLT 1/0:99:30:0 TGCCCTCCCG C CAGATGGGCT chr1 881627 rs2272757 G A 99 0 . GT:GQ:DP:FLT 1/0:59:20:0 TACAAGGTCA G GGGTGTCCCC chr1 883625 rs4970378 A G 39 0 . GT:GQ:DP:FLT 1/1:39:4:0 GAAGAGCAGG A GAGAGGGCCG chr1 887560 rs3748595 A C 99 0 . GT:GQ:DP:FLT 1/1:99:40:0 CCAGGCTGAC A AGTCAGGCTG (...)

http://vcftools.sourceforge.net/specs.html

VCF format

Par  AS  Denommé,  P  Lindenbaum,  Equipe  R  Redon  Ins0tut  du  Thorax  

Contrôle qualité : 24 laboratoires européens participants

Test du pipeline bioinformatique seul : 60 % de concordance parfaite Dr Simon Patton, EMQN, 7 novembre 2014

L’ANALYSE BIOINFORMATIQUE SE POURSUIT : AIDE A L’INTERPRETATION BIOLOGIQUE

RING BRCTs NES1

NES2

NLS1 NLS2

1 1863

http://www.umd.be/BRCA1/

CLINICIENS MALHEUREUX ! UV

Données base UMD BRCA

Données INCa 2013 : BRCA1 et BRCA2 9,9 % de mutations délétères (avec réarrangements) 7 % d’UV !

A  l’échelle  de  l’exome,  more…..  

Exome

40 639 variants

80 000 avec les artefacts

Localisation des mutations

Tissu Somatique Tissu Germinal

Pas de transmission à la descendance

Transmission à la descendance

Cancer héréditaire Cancer spontané non héréditaire

Autre  challenge  :  Analyse  de  tumeurs  pour  les  thérapies  ciblées    

Autre  challenge  bioinforma0que  aussi  !    UN  DEGRE  DE  COMPLEXITE  SUPERIEUR  

Ovaire sain / tumeur

APRES  L’EXOME,  LE  GENOME  !  -­‐  INTERPRETATION  PLUS  COMPLEXE  

-­‐  MAIS  AVANTAGE  TECHNOLOGIQUE  :  PAS  DE  CAPTURE  DES  EXONS  

-­‐  AUTRE  VARIATIONS  VISIBLES  :  COPY  NUMBER  VARIATION  (CNV)  

-­‐  INTERPRETATION  DES  VARIATIONS  HORS  DES  SEQUENECS  CODANTES  !    

Extrait de « comprendre la génétique et ses enjeux » par G. Matthijs et J. Vermeesch, avec l’aimable autorisation des auteurs