Applications de marqueurs immunotoxicologiques en écotoxicologie

Applications de marqueurs immunotoxicologiques en écotoxicologie

PLAN

• Survol historique• Considérations toxicologiques• Approches en immunotoxicologie• Conckusions

SURVOL HISTORIQUE

1884 La phagocytose

1890 Les anticorps

1901 Les groupes sanguins

1950-60 Les bases cellulaires de l’immunité

1970-80 Les bases moléculaires de l’immunité

1975 L’immunopharmacologie

1980 L’immunotoxicologie

· cibles (1983)

· résistance (1985)

Réponse immunitaire non-spécifique

Réponse immunitaire spécifique

Prolifération lymphoblastique

Présentationde l’Ag

Réactions inflammatoires

Phagocytose

Activité cytotoxique

Y YSécrétion d’anticorps

Y

Réponse immunitaire cellulaire

Réponse immunitaire humorale

Tc

Tc Tc

Tc Tc Tc Tc

Tc BB

B

BB

BBBB

Th

Th Th

NK

Réponse immunitaire non-spécifique

Réponse immunitaire spécifique

Prolifération lymphoblastique

Présentationde l’Ag

Réactions inflammatoires

Phagocytose

Activité cytotoxique

Y YSécrétion d’anticorps

Y

Réponse immunitaire cellulaire

Réponse immunitaire humorale

Tc

Tc Tc

Tc Tc Tc Tc

Tc BB

B

BB

BBBB

Th

Th Th

NK

Phénotypage

CONSIDÉRATIONS TOXICOLOGIQUES

Santé humaine ?

Santé des écosystèmes ?

ASPECTS RÉGLEMENTAIRES

CONSIDÉRATIONS TOXICOLOGIQUES

1. Fiabilité et reproductibilité des méthodes

2. Sensibilité des paramètres sélectionnés

3. Allure de la courbe dose-réponse

1. FIABILITÉ ET REPRODUCTIBILITÉ DES MÉTHODES

PROGRAMME INTERNATIONAL D ’HARMONISATION

PROTOCOLE• 10 laboratoires d ’Europe et des États-Unis• Rat• Réponse humorale par la technique des plages de

lyse (PFC)• Azathioprine composé modèle• Résultats exprimés en pourcentage de la réponse

du laboratoire de référence

Réponse immunitaire non-spécifique

Réponse immunitaire spécifique

Prolifération lymphoblastique

Présentationde l’Ag

Réactions inflammatoires

Phagocytose

Activité cytotoxique

Y YSécrétion d’anticorps

Y

Réponse immunitaire cellulaire

Réponse immunitaire humorale

Tc

Tc Tc

Tc Tc Tc Tc

Tc BB

B

BB

BBBB

Th

Th Th

NK

GRM

Complément

Splénocytes

Chambre deCunningham

PRINCIPE DES PFC

PROGRAMME INTERNATIONAL D’HARMONISATION(Réponse humorale)

Lab1

Lab2

Lab3

Lab4

Lab5

Lab6

Lab7

Lab8

Lab9

Lab10

050

100150200250300350400450500

Lab1

Lab2

Lab3

Lab4

Lab5

Lab6

Lab7

Lab8

Lab9

Lab10

Dose 1Dose 2Dose 3

% L

AB

. R

ÉF

ÉR

EN

CE

2. SENSIBILITÉ DES PARAMÈTRES SÉLECTIONNÉS

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

1x10-9 1x10-8 1x10-7 1x10-6 1x10-5 1x10-4

Concentrations (M)

Ind

ex d

e p

hag

ocy

tose

HgCl2

ZnCl2CH3HgCl

CdCl2

EFFET DES MÉTAUX LOURDS SUR LA PHAGOCYTOSE DES COELOMOCYTES

CHEZ LE VER DE TERRE

CdCl2

CI 50 DOSE

ANALYSE DES RÉSULTATSCI 50

0

50

100

150

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

%

rép

on

se n

orm

ale

IMMUNOTOXICITÉ COMPARATIVE DES MÉTAUX CHEZ LE VER DE TERRE (CI 50)

• ZnCl2

• CdCl2

• HgCl2

• CH3HgCl

• > 10 x 10-5 M

• 3.0 x 10-5 M

• 1.8 x 10-5 M

• 0.03 x 10-5 M

3. ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE

Dose1: NOEL; 2: dose de référence; 3:dose 50 %

ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE

Eff

et

Adulte

2 1 3

Dose

Eff

et

AdulteEmbryon

1 2 3 4

1: NOEL embryon; 2: dose de référence; 3: NOEL adulte; 4: dose 50%

ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE

APPROCHES

1. MODÈLES CLASSIQUES

2. IN VITRO

3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE

4. TERRAIN

5. COMBINAISON

APPROCHES

1. MODÈLES CLASSIQUES

2. IN VITRO

3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE

4. TERRAIN

5. COMBINAISON

PROTOCOLE

NON TRAITÉ VEHICULE DIELDRIN

1, 4, 7, 10, 14, 28, 42 DAYS

TESTS IMMUNOLOGIQUES

MACROPHAGES B LYMPHOCYTES T LYMPHOCYTES

EFFETS DE LA DIELDRINESUR LES CELLULES PRODUCTRICES

D ’ANTICORPS%

Rép

on

se n

orm

ale

Dose (LD50)

0

20

40

60

80

100

120

1/32 1/16 1/8 1/4 1/2

IMMUNOTOXICITÉ DE LA DIELDRINE

MACROPHAGES B LYMPHOCYTES T LYMPHOCYTES

PHAGOCYTOSE

FLAMBÉE OXIDATIVE

PROCESSING DE L ’ANTIGÈNE

PFC

LPS

Ab

CON A

PHA

MLR

GVH

NON TRAITÉ VEHICULE DIELDRINE

PROTOCOLEMODÈLE DE RESISTANCE

• MURINE HEPATITIS VIRUS 3

• Salmonella typhimurium

RESISTANCE AUX INFECTIONS

ANTI BACTERIENNE ANTI VIRALE

S. typhymurium MHV 3

MORTALITÉ

BACTÉRICIDIE

PHAGOCYTOSE

ANTICORPS

MORTALITÉ

ANTICORPS

EFFETS CYTOPATIQUES

RÉPLICATION

TOXIQUES

Chlorure de mercureChlorure de méthyl mercureChloride de cadmiumChlorure de zinc

DDT, DDE

BPC congenères 138, 153, 168, 180Benzo-a-pyrene

TCDD

Mélanges (synthétiues, effluents, sédiments)insecticides

herbicides

RELATIONS TOXIQUE ET SYSTÈME IMMUNITAIRE

X

AUTOIMMUNITÉ

SOI MODIFIÉ

SOI

SUSCEPTIBILITÉAUGMENTÉE* INFECTIONS* CANCERS

IMMUNOSUPPRESSION

SYSTÈME IMMUNITAIRE

ALLERGIES ELIMINATION

RÉPONSE IMMUNITAIREANTI-X

NON-SOI

IMMUNO COMPÉTENCE?

CANCERSINFECTIONS

CONTAMINANTS

APPROCHES

1. MODÈLES CLASSIQUES

2. IN VITRO

3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE

4. TERRAIN

LISTE DES ESPÈCES

•Mye•Moule•Mactre

•Choquemort•Plie•Truite •Chien

•Chat•Poulet•Aigle•Caille

•Écureuil•Rat•Souris

•Ver de terre

•Phoque•Béluga•Ours polaire

•Cochon•Bœuf•Bœuf musqué•Lama•Élan•Cheval

•Chèvre•Mouton

•Alligator•Grenouille

SENSIBILITÉ DES ESPÈCES HgCl2 CI50 (x 10-5)

• Choquemort 0.08• Truite 0.13• Mye 0.48• Bœuf musqué 1.09• Bœuf 1.24• Lama 1.29• Aigle 1.40

• Élan 1.43• Mouton 1.70• Ver de terre 1.80• Poulet 1.90• Cochon 10.08• Rat 10.20• Humain

100.03

Mercury concentrations (M)

% N

orm

al r

espo

nse

(SI

x 10

0)

0

20

40

60

80

100

120

140

10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4

CH3HgCl

HgCl2

Mercury concentrations (M)

% N

orm

al r

espo

nse

(SI

x 10

0)

0

20

40

60

80

100

120

140

10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4

CH3HgCl

HgCl2

0

20

40

60

80

100

120

140

10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4

CH3HgCl

HgCl2

% p

roli

fera

tion

concentration (ppm)

PCB 138

PCB 180PCB 156

PCB 153

IC =89ppmIC =89ppm5050

IC =44ppmIC =44ppm 5050 IC =67ppmIC =67ppm50 50

IC =73ppmIC =73ppm5050

*

*

* **

* **

***

0

25

50

75

100

0

25

50

75

100

10 100 10 100

APPROCHES

1. MODÈLES CLASSIQUES

2. IN VITRO

3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE

4. TERRAIN

5. COMBINAISON

PROCÉDURE EXPÉRIMENTALE

ZnCl210 ug/l50 ug/l

CdCl21 ug/l5 ug/l

Hg/Zn0,3/30 ug/l0,5/50 ug/l

Cd/Zn3/30 ug/l5/50 ug/l

CH3HgCl0,1 ug/l0,5 ug/l

UN METAL

Cd/Hg3/0,3 ug/l5/0,5 ug/l

DEUX METAUX

Cd/Hg/Zn3/0,3/30 ug/l5/0,5/50 ug/l

TROIS METAUX

Truite arc-en-ciel30 jours d ’exposition

PARAMÈTRES

oxidative burst cytométrie

phagocytose cytométrie

macrophage

PHA LPS

ConA

prolifération

H3-thymidine

lymphocyte

lysozymeactivité

colorimétrie

IgMELISA

serum

Rein

CHLORURE DE CADMIUM

-80

0

80

-100

-60

-40

-20

20

40

60

100

120

Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM

% r

épon

se d

u té

moi

n

1ug/l

5 ug/l

* * * * * * * *

* *

* **

*

CHLORURE DE MERCURE

-100-80-60-40-20

020

406080

100120140

Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM

% r

épon

se d

u té

moi

n 0.1 ug/l

0.5 ug/l

* * * * * * * * * * * *

*

CHLORURE DE ZINC

-100-80-60-40-20

020406080

100120140

Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM

% r

épon

se d

u té

moi

n

10 ug/l

50 ug/l

* ** * * *

* *

*

CADMIUM / MERCURE%

rép

onse

du

tém

oin

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM

3/ 0.3 ug/l5/ 0.5 ug/l

* * * * * * * * * *

* *

* *

CADMIUM / ZINC100

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM

% r

épon

se d

u té

moi

nl

3/30 ug/l5/50 ug/l

* * * * * * * *

MERCURE / ZINC%

rép

onse

du

tém

oin

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM

0.3/30 ug/l0.5/50 ug/l

* * * **

CADMIUM / MERCURE / ZINC

-100

-80-60

-40-20

020

40

6080

100120

140

% r

épon

se d

u té

moi

n

Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM

3/0.3/ 30 ug/l5/0.5 /50 ug/l* * *

*

* *nd* * *

*

APPROCHES

1. MODÈLES CLASSIQUES

2. IN VITRO

3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE

4. TERRAIN

5. COMBINAISON

Facteurs confondants

• Nombre d’individus

• Âges

• Sexe

• Sites

Nombre

Nombre d’individus

% V

aria

tion

25

50

75

3 9 126 2518

SITE

% p

hag

ocyt

es/r

ein

5

10

15

Ma Me Hu

Lac

Variations mensuelles%

Ph

agoc

ytes

/rei

n

5

10

15

Juil Sept Oct

Mois

Variations liées au sexe

% P

hag

ocyt

es/r

ein

5

10

15

MM M

Ma Me Hu

Lac

F F F

0

40

60

80

100

20

-9,0 -8,0 -7,0 -6,0 -5,0 -4,0 -3,0

Concentration (M)

% R

épo

nse

No

rma

le

SENSIBILITÉ AU MERCURE

0 5 10 200

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

Apopka

Woodruff

Con A ug

cpm

x 1

000

Transformation blastique

0

1

2

3

4

5

6

Venise en Qc St-Amable Boucherville Chibouet Fairbanks

Site d'échantillonnage

Nom

bre

de

ph

agoc

ytes

act

ifs

( x

106 ) A

B

B BC

C

Phagocytose de splénocytes de Rana pipiens juvéniles capturées en juillet

Phagocytose de splénocytes de Rana pipiens juvéniles capturées en septembre

0

1

2

3

4

5

6

Venise en Qc St-Amable Boucherville Chibouet Fairbanks

Site d'échantillonnage

Nom

bre

de

ph

agoc

ytes

act

ifs

( x

106 ) A

B

B BC

C

APPROCHES

1. MODÈLES CLASSIQUES

2. IN VITRO

3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE

4. TERRAIN

5. COMBINAISON

BA IE D E S

AN G LAIS

12 3

BAIE-C OM EAU

Q U É BE C

M O N T-JO LI

M ATAN E

B AIE -C O M E A U

* : μg/g sédiment sec

 BPC*

 1

 2

 3

3,3’,4,4’- T4CB 5700 740 86

2,3,4,3’4’- P5CB 29000 3030 280

2,4,5,3’,4’- P5CB 53000 4460 411

3,3’,4,4’,5- P5CB 230 20 2,3

3,3’,4,4’,5- H6CB 3,2 0,5 0,1

BPC dans les sédiments de la Baie-des-Anglais

 Métaux*

 1

 2

 3

Pb 23,65 18,63 16,75

Cd 0,20 0,09 0,06

Ag 0,07 0,04 -

Cu 18,90 18,03 9,12

Hg 0,08 0,03 0,01

* : μg/g sédiment sec

Métaux dans les sédiments de la Baie-des-AnglaisSites

Pro

du

its

de

com

bu

stio

n

(μg/

g sé

dim

ent

sec)

Sites

0

50

25

1 2 3

HAP dans les sédiments de la Baie-des-Anglais

Site 1, 2, 3 Site 1

13 semaines

Protocole expérimental

Protocole expérimental

Effets de l ’exposition in situ

05

10

15202530

3540

Cells MO 1+ MO 3+

No

mb

re d

e ce

llu

les

(107

)

Site 3

Site 2

Site 1

Protocole expérimental

Site 1 sédiment

Sable

1, 2, 3 mois et recouvrementimmunologie, analyse chimique

Nombre de macrophages actifs

0

1

2

3

4

5

6

7

1 mois 2 mois 3 mois Récupération

No

mb

re d

e ce

llu

les

(10

7)

Témoin

Exposé

Pathologies

• Neoplasies 15 17.6%• Pneumonies (vers) 15

17.6%• Infections bactériennes 13

15.3%• Malformations 5 5.9%• Parasitisme 4

4.7%• Infections (virus, autres) 6

7.1%• Non déterminées 18

21.1%• Autres causes 9

10.5%

85 nécropsies de 235 carcasses (1982-97)

Tumeurs décrites

• Adenocarcinomes: intestin, estomac, utérus, glandes salivaires, glandes mammaires

• Carcinome de la vessie

• Lymphosarcome thymique

• Tumeurs de l’ovaire (granulosa, dysgerminoma)

• Hépatocarcinome

• Développement des outils et étude des paramètres immunitaires à partir d’échantillons de sang de bélugas en captivité

• Validation des méthodes et établissement d’une banque de données à partir des animaux de l’arctique

• Étude de la sensibilité aux xénobiotiques par des expositions in vitro

• Étude chez les rongeurs (gras de béluga dans la diète)• Caractérisation des animaux du Saint-Laurent

Programme de recherche

Lymphocytes de bélugas et DDE

Lymphocytes de bélugas et DDT

Expositions in vitro

• Métaux : Pb, Cd, Hg, Ag, Zn, Cu

• TCDD, DDT, DDE

• Congénères de BPC

• Insecticides, herbicides

• Mélanges

Programme de recherche

• Développement des outils et étude des paramètres immunitaires à partir d’échantillons de sang de bélugas en captivité

• Validation des méthodes et établissement d’une banque de données à partir des animaux de l’arctique

• Étude de la sensibilité aux xénobiotiques par des expositions in vitro

• Étude chez les rongeurs (gras de béluga dans la diète) Caractérisation des animaux du Saint-Laurent

Diète pour 90 jours

- Gras de bœuf

- Huile de maïs

- 100 % béluga Saint-Laurent ou Arviat

- mélange 75:25, 50:50, 25:75

Compétence immunitaire

Phagocytose, transformation blastique, phénotypage, NK, PFC

Protocole expérimental

0

2040

6080

100

120140

160

Boeuf 75/25 25/75 100 St

% N.R.

**

**

PFC

*

Maïs 50/50100

Sexe et maturation

Hémolymphe

Estradiol

Testostérone

Progestérone

Sérotonine

PgE2, PgF2

Phagocytose

Time (h)

0 5 10 15 20 25

Flu

ore

scen

ce F

L1

(% c

ells

)

0

10

20

30

40

50

60

70

Mya truncata Siliqua costataMesodesma arctatumSerripes groenlandicusCyrtodaria siliquaElliptio ComplanataMya truncata (Azide)Siliqua costata (Azide)

0

50

100

150

200

250

3001x

10-9

1x10

-8

1x10

-7

1x10

-6

1x10

-5

1x10

-4

1x10

-3

CONCENTRATIONS ( M )

EFFETS SUR LA PHAGOCYTOSE SUITE À DES EXPOSITIONS IN-VITRO

CH3HgCl

HgCl2

CdCl2

ZnCl2

AgNO3

Brousseau et et al., 2000. Toxicology 142 : 145-156.

CMFDACMFDA

CMF

Conjugaison des thiols

Non conjugué

EsteraseEsterase

DA

CMF-SH

PRINCIPE DE LA MESURE DES THIOLS

Effet de la NEM sur la fluorescence induite par la CMFDA

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 40 80 100

Dose de NEM (ug/ml)

Flu

ores

cenc

e m

oyen

ne

EFFET DU MERCURE SUR LE NIVEAU INTRACELLULAIRE DE THIOLS CHEZ LA MYE

Concentrations (M)Inte

nsi

té d

e fl

uo

resc

ence

(F

L1)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 10-8 10-4

Estradiol

Testostérone

Progestérone

Sérotonine

PgE2, PgF2

Sexe et maturation

Phagocytose

Phagocytose

0 5

TémoinN = 15

0.1 XN = 15

[TBT] = 5 µg.L-1

[Atrazine] = 8 µg.L-1

[Diuron] = 0.07 µg.L-1

[E2] = 10-10 M

XN = 15

[TBT] = 50 µg.L-1

[Atrazine] = 80 µg.L-1

[Diuron] = 0.7 µg.L-1

10 XN = 15

[TBT] = 500 µg.L-1

[Atrazine] = 800 µg.L-1

[Diuron] = 7 µg.L-1

[E2] = 10-8 M

Protocole expérimental

débimètre

Contaminants0.2 ml/min.

Eau de mer 200 ml/min.

Mytilus edulis

FiltreMya arenaria

Expositions In vivo

PROTOCOLE - PROTOCOLE - In VivoIn Vivo

HgCl2 CH3HgCl

10-9M 10-8M 10-7M

10-6M 10-5M 0

FILTRE

0 -9 -6

0

200

100

Ch

arge

tis

sula

ire

ug/

g

Corrélation entre l’exposition et la charge tissulaire (14j.)

300

-7-8Dose Molaire

CH3HgCL

HgCl2

0 100 200

0

100

50

Charge tissulaire ug/g

Corrélation entre la charge tissulaire et l ’inhibition de la

phagocytoseP

hag

ocyt

ose

%

Blanc

-

Sablon

Havre-St- Pierre

Carleton

Gaspé

Grande -Rivière

Havre- aux- Maisons

% de phagocytose moules Grande-Rivière transplantées en fonction du temps (2002)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Juin Juillet Août Sept. Octo. Nov. Mois

% d

e p

hag

ocy

tose

1 bille3 billes et +

CONCLUSIONS

Xénobiotiques

Espèces labo.

SI

Espèces fauniques

Espèces fauniques

In vitro

In vivo

In vitro

In vivo

In vivo

Expositions contrôlées(résistance)

Expositions contrôlées

Terrain

1.

CONCLUSIONS

Mécanismes d ’immunotoxicité

Laboratoire Terrain

2.

CONCLUSIONS

3. Biomarqueurs immunologiques en

écotoxicologie

Validation• Espèces laboratoire• Espèces fauniques

Utilisation• Suivi environnemental d ’espèces fauniques

CONCLUSIONS

4. Biomarqueurs immunologiques en

santé humaine

Validation• Etude clinique

Utilisation• Suivi environnemental

Exposition

Fonctions cellulaires

Altérations physiologiques

Santé de l’individu

CommunautéPopulation

Écosystème

Impa

ct é

clog

ique

cro

issa

nt É

chelle de temp

s

Réponses moléculaires et cellulaires

% d

e p

opu

lati

on

Résistance au pathogène

Malades mais vont survivreNe

survivront pas

Pathologie légèrePrésence d’Ab