Biochemie I Aminokyseliny a peptidy

Biochemie I

Aminokyseliny a peptidy

Aminokyseliny a peptidy

(vlastnosti, stanovení a reakce)

( -COOH, -NH2 nebo -NH-)

prostorový vztah aminoskupiny a karboxylové skupiny:

- (=2-), -(=3-)..... -(= poslední)

-alanin: +H3N-CH2-CH2-COO-

-aminobutyrát (GABA): +H3N-CH2-CH2-CH2-COO-

AMINOKYSELINY

Když se řekne AK

-aminokyseliny: konfigurace (podle Fischera)

COO- COO-

D: H CNH3

+ L: NH3+ CH

R R

Kódované aminokyseliny (20): -aminokyseliny (kromě prolinu – NH2 skupina zabudována do cyklu)). Alfa = aminoskupina na uhlíku, který

nese karboxylovou skupinu.

AMINOKYSELINY

L--aminokyseliny:

kódované (= proteinogenní, viz dále)

nekódované:

- odvozené od kódovaných aminokyselin

-Tyrkatecholaminy (dopamin, adrenalin, tyroxin...)

-vzniklé modifikacemi bílkovin (posttranslační modifikace)

- metabolické meziprodukty (ornithin, citrulin)

AMINOKYSELINY

Kódované aminokyseliny:

Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka

OO-

C

C

H H

NH3

+

OO-

C

C

H CH3

NH3

+

OO-

C

C

H CH

NH3

+ CH3

CH3

OO-

CHCH3

CH3C

C

H

NH3

+

CH2

Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální

GlycinGly

N 

N

AlaninAla

N 

N 

ValinVal

N 

E

LeucinLeu

N 

E

Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka

Kódované aminokyseliny:

OO-

C

C

H CH

NH3

+ CH3

CH2 CH3

OO-

C

C

H CH2

NH2

+ CH2

CH2

OO-

C

C

H CH2

NH3

+

OO-

OHC

C

H CH2

NH3

+

OO-

C

C

H CH2

NH3

+

NH

IsoleucinIle

N 

E

ProlinPro

N 

N

FenylalaninPhe

N 

E

TyrosinTyr

P 

N

TryptofanTrp

N 

E

Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální

Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka

Kódované aminokyseliny:

OO-

C

C

NH3

+

H CH2 NH+

CHNH

C

CH

OO-

OHC

C

H CH2

NH3

+

OO-

C

C

H CH

NH3

+ OH

CH3

OO-

SHC

C

H CH2

NH3

+

OO-

C

C

H CH2

NH3

+

S CH3CH2

HistidinHis

  Z

  N

SerinSer

  P

  N 

ThreoninThr

  P

  E

CysteinCys

  P

  N

MethioninMet

  N

  E

Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální

Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka

Kódované aminokyseliny:

Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální

OO-

C

C

H CH2

NH3

+

CH2 CH2 CH2 NH3

+

OO-

C

C

NH3

+

H CH2 CH2 CH2NH C

NH2

NH2

+

OO-

OO-C

C

H CH2

NH3

+

C

OO-

OO-C

C

H CH2

NH3

+

CH2 C

OO-

ONH2C

C

H CH2

NH3

+

C

OO-

ONH2C

C

H CH2

NH3

+

CH2 C

LysinLys

  Z

  E

ArgininArg

  Z

  N

Asparagová kyselinaAsp

  K

  N

Glutamová kyselinaGlu

  K

  N 

AsparaginAsn

  P

  N

GlutaminGln

  P

  N

Naučit se AK včetně označeníhmotnosti v Tab jsou uváděny o 18 nižší, tedy takové jaké jsou v bílkovinném řetězci

Rozdělení podle chemické povahy postranních řetězců

Funkční skupiny:

Alifatické Aromatické Hydroxylové Sulfhydrylové Kyselé Basické Polární Nepolární

Hydrofobní aminokyseliny

Polární aminokyseliny

Kyselé aminokyseliny

Bazické aminokyseliny

Větvené aminokyseliny

• leucin, valin, izoleucin• energetické substráty• nezbytné v těžkých stavech (sepse, polytraumata)• součástí specializovaných roztoků aminokyselin

Kódované aminokyseliny:

Jednopísmenkové zkratky

Proč jsou v tabulce vzorce s náboji? obojetné ionty = amfionty

celkový náboj amfiontu: součet všech nábojů (pro Gly v pH 7 = 2)

volný náboj amfiontu: algebraický součet nábojů (pro Gly v pH 7 = 0)

OO-

C

C

H H

NH3

+

kyselina: HA H+ + A-

např. CH3-COOH H+ + CH3-COO-

termodynamická disociační konstanta

zdánlivá

Ka a

aa

H A

HA

.

KH A

HAA

+ -

přičemž K Ka A

H A

HA

.

Úvod do teorie elektrolytické disociace:

báze: B + H2O BH+ + OH-

např: CH3-NH2 + H2O CH3-NH3+ + OH-

bazická zdánlivá disociační konstanta:

ale: Kw = [H+] . [OH-] a tedy:

po spojení:

[H2O] zahrnu do konstanty a vypočtu 1/KB:

KBH OH

B H OB

+ -

.[ ]2

[ ][ ]

OHK

H

w

KBH K

B H H OB

w

+

.[ ].[ ]2

1K

B H

BH KB w

][

.[ ]

+

Kyselá disociační konstanta KA ionisované formy báze B (např. CH3-NH3+)

je tedy rovna:

KK

KA

W

B

Úvod do teorie elektrolytické disociace:

-COOH ,-COOH imidazolium -SH -NH3+ fenol -NH3

+ guanidinium

2,5 4,0 6,0 8,3 9,5 10,1 10,5 12,5

KYSELÉ DISOCIAČNÍ KONSTANTY pKA SKUPIN

VYSKYTUJÍCÍCH SE V BÍLKOVINÁCH

-karboxylová C-koncová 1,7 - 2,6 1,8 - 3,6

imidazolová His 6,0 5,6 - 7,0

-aminová Lys 10,53 9,4 - 11,0

sulfhydrylová Cys 8,33 8,3 - 8,6

Funkční skupina

Aminokyselina

Hodnoty pKA nalezené

ve volných aminokyselinách

Hodnoty pKA

nalezené v bílkovinách

,-karboxylová

Asp, Glu 3,86; 4,25 3,0 - 4,7

-aminová N-koncová 8,8 - 10,7 7,9 - 10,6

fenolová Tyr 10,07 9,8 - 10,8

guanidylová Arg 12,48 11,6 - 12,6

Hodnoty pKA disociovatelných skupin v aminokyselinách a bílkovinách (25 oC)

 Mám roztok slabé kyseliny. Jak se bude měnit pH, když budu přidávat NaOH?

   Na začátku: jen HA, množství A- odpovídá množství přidaného louhu.

převedeme na pH: (Hendersonova - Hasselbalchova rovnice)

KH A

HAA

+ -

H KHA

AA

+

-

pH pKA

HAA

log

TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN

TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN

Titrační křivka glycinu

OO-

OO-C

C

H CH2

NH3

+

CH2 C

OO-

C

C

H CH2

NH3

+

CH2 CH2 CH2 NH3

+

OO-

C

C

NH3

+

H CH2 NH+

CHNH

C

CH

Cystin = cystinylcystein

Titrační křivka cystindihydrochloridu

DEFINICE: pH, při němž se amfiont nepohybuje ve stejnosměrném

elektrickém poli (interakce s dalšími ionty, závisí na prostředí - pufr);

označujeme pI

Isoionický bod: pH, při němž je v destilované vodě volný náboj iontu nulový.

ISOELEKTRICKÝ BOD

př.: Gly (titruji Gly.HCl) KA1 KA2

  Z = +1 (Gly1+) 0 (Gly) -1 (Gly-1)

Ale v pH = pI platí: [Gly1+] = [Gly-1] 

takže:

OOH

C

C

H H

NH3

+

OO-

C

C

H H

NH3

+

OO-

C

C

H H

NH2

pH pKGlyA

1log

[ ]Gly

pH pKGly

A

2log

[ ]

Gly

21 2

pH pK pKGly

A A

log

[ ]

Gly

pI pK pKA A

( ) /1 2

2

ISOELEKTRICKÝ BOD

Více disociovatelných skupin: rozhodují ty, které "sousedí" s pI (nutno načrtnout titrační křivku)

 Pro polyionty (např. bílkoviny) tuto rovnici nelze použít (příliš mnoho pKA v

okolí pI) 

Isoelektrické body kódovaných aminokyselin

AK pI AK pI AK pI AK pI

Gly 6,0 Ser 5,7 Phe 5,5 His 7,6

Ala 6,0 Thr 5,6 Tyr 5,7 Lys 9,6

Val 6,0 Cys 5,0 Trp 5,9 Arg 10,8

Leu 6,0 Met 5,7 Asn 5,4 Asp 3,0

Ile 6,0 Pro 6,4 Gln 5,6 Glu 3,2

Absorpce UV záření: aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm Absorpční spektra 1: hovězího sérového albuminu (1 mg/ml), 2: lidského imunoglobulinu (1

mg/ml) a 3: DNA (0,1 mg/ml), optická délka kyvety 1 cm.  

Optická aktivita: konfigurace (nesouvisí přímo se smyslem rotace)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

210 230 250 270 290 310 330

vlnová délka [nm]

abso

rbance

1

23

OPTICKÉ VLASTNOSTI

Chemické reakce AK

Stanovení AK (reakce

aminoskupin): ninhydrin,

Sangerovo činidlo, dansylchlorid

Reakce postranních řetězců: modifikační reakce - různá specifita

např.

značení bílkovin radioaktivním jodem

blokování SH skupin (proti oxidaci a vzniku disulfidových můstků)

O

+ I2OHC

C

H CH2

NH

R2

R1

O

OHC

C

H CH2

NH

R2

R1I

O

+ ICH2-CONH2C

C

H CH2

NH

R2

R1

SH

O

C

C

H CH2

NH

R2

R1

SCH2-CONH2 + HI

Chemické reakce AK

Nejdůležitější reakce (hypothetická): vznik peptidové vazby

CH CNH3

+

R1

OO- CH CNH3

+

R2

OO- OO-+ CHNH3

+C

R1 O

NH CH

R2

C

Chemické reakce AK

Chemické reakce AK

Chemické reakce AK

N- konec (začátek), C-konec (konec) acylaminokyseliny, např. Gly.Ala.His = glycylalanylhistidin

 Pozor: Ala.Tyr Tyr.Ala

OO- OO-CH

CH3

C

O

NH CH C

CH2

NH3

+CH

CH2

C

O

NH CH C

CH3

NH3

+

OH OH

Nomenklatura peptidů

PŘIROZENÉ PEPTIDY

Zvláštnosti struktury:

     nekódované aminokyseliny (ornithin, -alanin ...)

     často i D-aminokyseliny

     někdy i tzv. -peptidové vazby (Glu)

     cyklické struktury (laktamy, disulfidové vazby)

     větvené struktury

blokování konců (pyroglutamát, glycinamid)

• meziprodukty odbourávání bílkovinných prekursorů

• synthesa pomocí speciálních enzymových reakcí

(ne na ribosomech cestou protheosynthesy)

Biosynthesa

     di a tripeptidy (glutathation, umělý aspartám...)

     peptidové hormony (oxytocin, vasopresin....přechod k proteohormonům)

     neuromodulátory: enkefaliny (pentapeptidy), endorfiny (15 - 32 AK)

     peptidová antibiotika (mnoho nekódovaných AK)

     peptidové zoo- a fytotoxiny (hadi, štíři, apamin, falloidiny a amanitiny: Amanita

phalloides)

     protaminy (malé bazické lineární peptidy, mlíčí ryb)

polyaminokyseliny (buněčné stěny bakterií: poly--L-Glu, poly--D-Glu)

Skupiny přirozených peptidů

Skupiny přirozených

peptidů

URČOVÁNÍ CELKOVÉHO AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ

AK1-AK2-AK3 ....AKn kyselá nebo bazická hydrolysa AK1 + AK2 + AK3 +....+ AKn

(určit kvalitativní i kvantitativní jednotlivé aminokyseliny -

chromatografické dělení)

URČOVÁNÍ SEKVENCE AMINOKYSELIN V ŘETĚZCI

Edmanovo odbourávání

Sangerova reakce

URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ

AMINOKYSELINY

URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ

AMINOKYSELINY

Edmanovo odbourávání

a) aktivace (aktivní estery, anhydridy, azidy,

karbodiimidová synthesa)

b) blokování skupin, které nemají reagovat

c) synthesa peptidové vazby

d) odblokování

O-X OO- OO-+CH CNH

R1

" CH CNH3

+

R2

" CHNH3

+C

R1

"

O

NH CH

R2

" C

Q

R10 R10 R10 R10 + HX

SYNTHESA PEPTIDŮ in vitro

Chromatografické metody pro separaci proteinů

• Gelová chromatografie

• Ionexová chromatografie

• Chromatografie s hydrofóbní interakcí

• Afinitní chromatografie

Ionexová chromatografie

• Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj

• Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje

• V případě proteinů hraje zásadní roli pH !

• Celulosové a dextranové ionexy

Ionexy

• Katexy – záporný náboj vazba kationtů

silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3-

slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO-

• Anexy – kladný náboj vazba aniontůslabé – diethylaminoethyl (DEAE)silné – triethylaminoethyl (TEAE)

Ionexová chromatografie proteinů

• Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny

• pH < pI bílkovina nese kladný náboj separace na katexu

• pH > pI bílkovina nese záporný náboj separace na anexu

• pH = pI celkový náboj bílkoviny je nulový nelze provést ionexovou chromatografii

Ionexová chromatografie

• Nanášení vzorku – nízká iontová síla

• Eluce – gradientová• Zvyšováním iontové síly • Změnou pH

Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

Typická ionexová chromatografie

Loading starts

Loading ends,Low salt wash begins

Protein absorbance

Peak of unbound protein

Salt gradient

0

1M

Salt gradient begins

Salt gradient ends

Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II)

and tightly bound (III) proteins

IIIII

I

Roztok obsahující kyselinu asparagovou (pI = 2,98), glycin (pI = 5,97), threonin (pI = 6,53) a lysin (pI = 9,74) v citrátovém pufru pH 3,0 byl nanesen na sloupec Dowex-50 (katex). V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly?

Příklad 1

OO-

C

C

H H

NH3

+

OO-

OO-C

C

H CH2

NH3

+

C

OO-

C

C

H CH

NH3

+ OH

CH3OO-

C

C

H CH2

NH3

+

CH2 CH2 CH2 NH3

+

Na sloupec DEAE-celulosy (anex) byl nanesen vzorek

obsahující sérový albumin, ureasu a chymotrypsinogen

(isoelektrické body pI jsou 4,9; 5,4 a 9,5) v pufru pH 7,0.

V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly?

Příklad 2