Contrôle de qualité des antibiotiques dans la Pharmacopée Européenne : évolution récente dans...

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© 2007. Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés Ann Pharm Fr 2007, 65 : 174-182

Contrôle de qualité des antibiotiques dans la Pharmacopée Européenne : évolution récente dans le cas des aminosides

A. Nicolas,

Résumé.

Les aminosides constituent une classe d’antibio-tiques caractérisée par une structure chimique dérivée desucres aminés liés par un pont glycosidique à un noyaucentral aminocyclitol. Plusieurs d’entre eux font l’objetd’une monographie dans l’édition en vigueur de la Pharma-copée Européenne. Le contrôle des impuretés est effec-tué par l’essai des substances apparentées. La nécessitéd’un contrôle plus efficace du profil de qualité conduit àremplacer la chromatographie en couche mince par lachromatographie liquide. Dans le cas particulier des amino-sides se pose alors le problème de la détection car cescomposés sont dépourvus de chromophores. Il est doncimpossible d’utiliser le traditionnel couplage à la détectionUV-visible. Si le contrôle de l’amikacine (base et sulfate)utilise encore une réaction de dérivation précolonne avecdétection à 340 nm, l’approche actuelle privilégie l’analysedirecte des substances pharmaceutiques. Deux modesparticuliers de détection peuvent alors être utilisés : ladétection par ampérométrie pulsée et la détection par dif-fusion de lumière. La présentation discutera les avantageset les inconvénients respectifs de chacun.

Mots-clés :

Aminosides, Contrôle analytique, Pharmaco-pée européeenne, Détection, Chromatographie liquidehaute performance.

Summary.

Aminoglycosides constitute a particular classof antibiotics presenting aminoglycoside moieties linked toa central aminocyclitol ring. Several aminoglycosides aredescribed by a monograph in the European Pharmaco-poeia. The related substances test is used to check forimpurities. For this purpose, thin layer chromatography isnow being replaced by high performance liquid chromato-graphy. In the case of aminoglycosides the main challengeis the detection of these compounds since they do notpossess a chromophore in their structure. Different possi-bilities are proposed in the monographs. Amikacine isdetected at 340 nm after pre-column derivatization. Inmore recent monographs, pulsed amperometry detection isproposed. However, this mode of detection requires skilfulmanipulations. Evaporative light scattering detection could be avaluable alternative. The advantages and drawbacks of eachapproach will be discussed.

Key-words:

Aminoglycosides, Analytic quality control,European Pharmacopoeia, Detection, High-performanceliquid chromatography.

Control of the quality of antibiotics in the European

Pharmacopoeia: recent development in the case of ami-

noglycosides.

A. Nicolas,

Ann Pharm Fr

2007,

65

: 174-182.

Laboratoire de Chimie analytique et Bioanalyse du médicament, Umr Uhp-Cnrs 7561, Faculté de Pharmacie, Université Henri-Poincaré,

5, rue Albert Lebrun, BP 80403, F 54001 Nancy.

Présentation devant l’Académie nationale de pharmacie, séance du 23 mars 2006 délocalisée à Nancy.

Correspondance :

A. Nicolas, à l’adresse ci-dessus.

E-mail : alain.nicolas@pharma.uhp-nancy.fr

Analyse des aminosides

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Introduction

La famille des aminoglycosides (aminosides)occupe une place particulière dans l’arsenal desantibiotiques. Depuis la découverte de la strepto-mycine en 1944 par Waksman [1], plusieursmolécules ont été développées en thérapeutiquehumaine [2]. Malgré leur ancienneté, les amino-sides conservent une activité bactéricide remar-quable vis-à-vis notamment des bacilles à Gramnégatif aérobies. Ils agissent sur les germes enperturbant la synthèse des protéines au niveau dela fraction 30S du ribosome. Leur effet synergi-que avec les bêtalactamines et leur bactéricidierapide sur de nombreux agents pathogènes lesrendent incontournables, malgré leur faible dif-fusion tissulaire, pour le traitement de nombreusesinfections sévères. La streptomycine est notam-ment active sur

Mycobacterium tuberculosis.

Plusieurs d’entre eux font l’objet de monogra-phies dans la Pharmacopée Européenne en vigueur[3].

Structure, origine et propriétés

physico-chimiques des aminosides

Les aminosides sont des sucres aminés liés par unpont glycosidique à un noyau central aminocy-clitol dont la structure permet de distinguer troisgroupes de composés : les streptomycines, lesdésoxystreptamines et les fortimicines. Ils sontd’origine naturelle (streptomycine, kanamycine,tobramycine, gentamicine) ou hémisynthétique(amikacine, nétilmicine)

(tableau I)

.Les aminosides sont des bases polycationiques.

Leur solubilité dans l’eau est améliorée sousforme de sels, généralement des sulfates. Lesprincipaux groupements chimiques réactifs sontdes groupements hydroxyles et des groupementsaminés primaires en nombre variable.

Les aminosides ne possèdent pas de chromo-phores à l’exception de la streptomycine (grou-pements guanidine). La détection de cescomposés et de leurs substances apparentées pré-sente donc des difficultés lors d’analyses mettanten œuvre des méthodes chromatographiquesnécessitant leur détection. Les méthodes actuel-lement utilisées pour le contrôle des substances

apparentées et la détermination de la teneur figu-rent dans le

tableau II

.

Détection après réaction

de dérivation

Les réactions de dérivation consistent à modifierchimiquement la structure des analytes généra-lement pour introduire des propriétés permettantleur détection [4]. Les réactions de dérivationpeuvent avoir lieu soit avant (dérivation préco-lonne), soit pendant (dérivation sur colonne),soit après le processus chromatographique (déri-vation post-colonne).

Le choix du mode de dérivation est fonction dedifférents paramètres : cinétique de la réaction,développement d’une méthode chromatogra-phique propre aux dérivés formés, stabilité desdérivés, automatisation possible de la réactionchimique.

De nombreux réactifs ont été décrits pour obte-nir des dérivés à partir de la fonction amine. Ilspeuvent donner lieu à une détection en UV-visibleou en fluorescence qui sont les deux modes dedétection les plus utilisés en CLHP.

Dérivation précolonne de l’amikacine

par l’acide 2,4,6-trinitrobenzène

sulfonique (TNBS)

Les monographies relatives à l’amikacine (base etsulfate) sont les seules qui utilisent une réactionde dérivation à la fois pour le contrôle des subs-tances apparentées et pour la détermination de lateneur.

L’acide 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique a étéutilisé initialement par Satake

et al

. [5] pour ladérivation des aminoacides et des peptides puisappliqué par Gambardella

et al.

à l’analyse desaminoglycosides [6].

Les conditions d’obtention du dérivé (milieupyridine, 75

°

C, 45 min) sont proches de cellesdécrites par Gambardella

et al

. L’addition d’acideacétique en fin de réaction stabilise les dérivésformés pour une durée minimum de 10 heures.Les solutions sont maintenues à 10

°

C pendantl’analyse et la détection s’effectue à 340 nm.

A. Nicolas

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Tableau I. — Structure chimique et origine des aminosides figurant à la Pharmacopée Européenne [3].Chemical structure and origin of the aminosides described by a monograph in the European Pharmacopoeia [3].

Antibiotique Structure chimique Origine

AmikacineAmikacine (sulfate d’)

Hémisynthèse à partir de ka-namycine A.Acylation de la fonction amine en 1 par l’acide 4-amino-2-hydroxybutyrique.

Framycétine (sulfate de)Néomycine (sulfate de)

Streptomyces fradiae ou Strepto-myces decaris

Gentamicine (sulfate de) Micromonospora purpurea

Kanamycine (monosulfate de) Streptomyces kanamyceticus

Nétilmicine (sulfate de) Hémisynthèse à partir de siso-micine

Analyse des aminosides

177

La séparation des dérivés met en œuvre uneCLHP à polarité de phases inversée en mode iso-cratique. La méthode permet de séparer en40 minutes le précurseur de synthèse (kanamy-cine A) ainsi que les trois isomères de positionobtenus lors de l’hémisynthèse : isomères mono-substitué en 2, disubstitué en 1 et 2, monosubstituéen 3.

Bien que le nombre de groupements aminésdérivés ne soit pas le même pour toutes les impu-retés, la méthode ne propose pas de facteur decorrection. L’injection d’un blanc est nécessaireafin de tenir compte des pics dus à l’excès de réac-tif et à d’éventuels produits secondaires.

Détection électrochimique

Si la mise en œuvre de réaction de dérivationrésout des problèmes de détection par un choixapproprié du réactif de dérivation et s’appuie surl’utilisation de méthodes spectroscopiques bien

connues, elle peut néanmoins présenter des limi-tations en terme de quantification des impuretés :cinétique de formation différente, nombre de grou-pements dérivés différents, facteur de réponse dif-férent.

L’approche suivie désormais par la Pharmaco-pée européenne est de privilégier l’analyse dessubstances pharmaceutiques sous forme nativeexcluant la formation de dérivés.

L’analyste se trouve alors confronté au choix dela méthode de détection. En effet, la mise enœuvre de la CLHP ne s’accompagne pas de l’exis-tence d’un mode de détection universel. Si laréfractométrie peut remplir ce rôle, ses limites enanalyse quantitative sont bien connues : impossi-bilité d’utiliser des élutions par gradient, sensibilitéà la température, mauvaise limite de détection.Afin de pouvoir remplacer les méthodes tradi-tionnelles de chromatographie en couche mince(CCM), le passage à la CLHP a nécessité, dans lecas des aminosides, l’introduction de la détectionélectrochimique.

Tableau I (Suite). — Structure chimique et origine des aminosides figurant à la Pharmacopée Européenne [3].Chemical structure and origin of the aminosides described by a monograph in the European Pharmacopoeia [3].

Antibiotique Structure chimique Origine

Streptomycine (sulfate de) Streptomyces griseus

Tobramycine Streptomyces tenebrarius

A. Nicolas

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Celle-ci est désormais utilisée dans plusieursmonographies de la Pharmacopée européenne :framycétine et néomycine, gentamicine, nétilmi-cine, tobramycine.

L’ampérométrie pulsée constitue un mode dedétection particulièrement bien adapté à la détec-tion des sucres et des composés structurellementproches tels que les aminosides [7-14].

À pH élevé (> 12), les sucres subissent uneoxydation électrocatalytique à la surface d’uneélectrode en or porté à un potentiel positif E

1

[15]. Le courant généré est proportionnel à laconcentration en aminosides. Cependant, si onn’applique qu’un potentiel unique à l’électrode,celle-ci s’empoisonne par accumulation desproduits d’oxydation conduisant à une perte dusignal. Ce phénomène est évité par l’applicationd’une série de potentiels pendant des duréesdéterminées (profils de potentiel).

La régénération de l’état de surface passe parl’application d’un potentiel d’oxydation élevé E

2

induisant la désorption des espèces par la forma-tion d’oxyde (AuO). Cependant ces derniers sontinertes et doivent être éliminés par dissolutioncathodique au potentiel négatif E

3

pour restaurerune surface métallique propre et réactive. L’appli-cation répétée de ce cycle de potentiels constituele fondement de la détection par ampérométriepulsée (PAD). Une excellente mise au point surl’optimisation des profils de potentiels a été publiéepar LaCourse et Johnson [16].

Récemment, un profil de potentiel dans lequella désorption des espèces est effectuée à unpotentiel E

2

très négatif (– 1,0 à – 2,0 V) a étéproposé [17-20]. La stabilité du signal à longterme est alors grandement augmentée au détri-ment d’une moins bonne limite de détection paraugmentation du bruit.

L’utilisation de la détection par ampérométriepulsée est facilitée lorsque la séparation chroma-tographique est réalisée en milieu très alcalincompatible directement avec la détection. C’est

Tableau II. — Méthodes actuellement utilisées pour le contrôle des substances apparentées et la détermination de la teneur [3].Methods for relative substances test and assay [3].

Substances apparentées Dosage

AmikacineAmikacine (sulfate d’)

CLHPDérivation précolonne TNBSDétection UV-visible à 340 nm

CLHPMême méthode96,5 à 102,0 pour cent (base)

Framycétine (sulfate de)Néomycine (sulfate de)

CLHPDétection ampérométrique à pulsationsDétection : 0,00 VOxydation : + 0,80 VRéduction : – 0,60 V

Titrage microbiologique

Gentamicine (sulfate de) Composition et substances apparentéesCLHPDétection ampérométrique à pulsationsDétection : 0,05 VOxydation : + 0,75 VRéduction : – 0,15 V

Titrage microbiologique

Kanamycine (monosulfate de) CCM Titrage microbiologique

Nétilmicine (sulfate de) CLHPDétection ampérométrique à pulsationsDétection : 0,05 VOxydation : + 0,75 VRéduction : – 0,15 V

Titrage microbiologique

Streptomycine (sulfate de) CCM Titrage microbiologique

Tobramycine Détection ampérométrique à pulsationsDétection : 0,05 VOxydation : + 0,75 VRéduction : – 0,15 V

CLHPMême méthode97,0 à 102,0 pour cent

Analyse des aminosides

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le cas lorsqu’une chromatographie d’échanged’anions est utilisée [19].

Malheureusement, la Pharmacopée européennea choisi des procédés chromatographiques quinécessitent une alcalinisation post-colonne de laphase mobile par addition d’une solutiond’hydroxyde de sodium concentrée exempte decarbonates. La mise en œuvre globale de laméthode devient alors délicate et le choix d’unpotentiel E

2

positif conduit à une diminution dusignal au cours du temps qui ne permet plus de res-pecter les limites d’exclusion fixées par les mono-graphies (résultats personnels).

Détecteur évaporatif à diffusion

de lumière (DEDL)

Ce type de détecteur a été introduit récemmentdans l’arsenal possible des détecteurs en CLHP[21-23] et ses domaines d’application ont faitl’objet d’une revue récente [24]. Son principerepose sur la possibilité de détecter tout analytemoins volatil que la phase mobile par la mesurede la lumière diffusée par des particules solides[25-27].

Trois étapes principales existent : la nébulisa-tion de l’éluat chromatographique, l’évaporationde la phase mobile, la dispersion de la lumièrepar les particules solides formées.

La nébulisation est généralement assurée parun gaz tel que l’air ou le diazote. Cette étapetransforme la phase liquide en un aérosol de finesgouttelettes. L’évaporation de la phase mobile estréalisée dans un tube chauffé. L’évaporation doitse produire à la température la plus basse possibleafin d’empêcher la perte de substances facilementvolatiles. Dans le cas d’une élution chromatogra-phique par gradient, la température doit être ajus-tée en tenant compte du solvant le moins volatil.Une augmentation de la longueur du tube permetde travailler à une température plus basse. Il estimportant de créer un débit stable de gaz afin dene pas dégrader l’efficacité chromatographique.Les particules solides résultant de l’évaporationde la phase mobile sont capables de diffuser lalumière émise par une source lumineuse poly-chromatique (lampe tungstène/halogène) ou leplus souvent laser.

Plusieurs études se sont intéressées à l’influencedes conditions opératoires [28, 29] et à la naturedu signal obtenu [30, 31].

Il est reconnu que dans un domaine assez largede taille des particules, la surface (A) du picobtenu est reliée à la masse (m) de l’analyte parune relation du type A = am

b

dans laquelle a etb sont des coefficients dépendant des conditionsexpérimentales (nature de la phase mobile, débitde la phase mobile et du gaz, température devaporisation) et du soluté (taille des gouttelettes,concentration).

La linéarisation de la réponse peut être obtenuepar transformation logarithmique : log A = b log m+ log a.

La réponse de ce type de détecteur étant fonc-tion de la quantité de particules diffusant lalumière et non des propriétés individuelles dusoluté, une réponse uniforme est obtenue dansle cas de composés structurellement apparentés.L’optimisation de la composition de la phasemobile de l’étape chromatographique nécessitede n’utiliser que des composés volatils [32]

(tableau III)

.L’application de cette méthode au contrôle des

aminosides est actuellement largement publiée

(tableau IV)

. Elle est essentiellement le fruit del’équipe de Koupparis

et al.

[33-37] et de notreéquipe [38, 39].

La validation des méthodes selon les critères envigueur montre la capacité à remplacer lesméthodes actuelles des monographies lors derévisions futures en proposant une méthodebeaucoup plus simple d’emploi que la détection

Tableau III. — Réactifs volatils utilisables en CLHP-DEDL.Volatile reagents for HPLC-DEDL.

Nature Composés

Acides Acides formique, acétique, trifluoroacétique

Bases Triéthylamine, hydroxyde d’ammonium

Sels Hydrogénocarbonate d’ammoniumFormiate d’ammoniumAcétate d’ammonium

Contre-ions Acide trifluoroacétiqueAcides carboxyliques perfluorés (pentafluoro-propionique, heptafluorobutyrique, nona-fluoropentanoique)Triéthylamine

A. Nicolas

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électrochimique. Le développement des métho-des chromatographiques associées permet égale-ment de transposer ces méthodes en LC/MS

(liquid chromatography/mass spectrometry)

ce quioffre un énorme avantage par rapport aux phasesmobiles actuellement décrites en LC-PAD

(liquidchromatography (PAD)

. Il est également possible defaire un contrôle croisé de la qualité des matièrespremières [38, 39].

L’avantage complémentaire est la détermina-tion quantitative des sels (sulfates dans le cas desaminosides). Pour ce faire, la Pharmacopée euro-péenne propose un dosage titrimétrique indé-

pendant des méthodes chromatographiques.L’utilisation du DEDL permet une déterminationsimultanée des espèces minérales et organiques.

Conclusion

Le contrôle des antibiotiques en tant que subs-tances actives est un véritable challenge analy-tique, notamment dans le cas des composésobtenus par fermentation. La classe des aminosi-des est celle qui pose le plus de problèmes car lesmolécules ne présentent pas de propriétés spec-

Tableau IV. — Analyse des aminosides par CLHP-DEDL.Analysis of aminoglycosides by HPLC-ELSD.

Antibiotique Phase stationnaire/phase mobile DEDL Analytes LOD Ref.

Amikacine sulfate RP-HPLC C18Eau/méthanol(60 : 40, v/v)Acide nonafluoropentanoi-que 18,2 mM

Sedex 75N2 : 3,5 barTtube : 50 °C

AmikacineKanamycine ASulfate

2,2 μg/ml2,5 μg/ml1,8 μg/ml

[37]

Framycétine sulfate RP-HPLC C18 Sedex 75 Néomycine ANéomycine B

Néomycine sulfate Solution aqueuse d’acideTrifluoroacétique 170 mM

N2 : 3,2 barTtube : 60 °C

Néomycine CNéomycine LP-BSulfate

0,25 μg/ml [39]

Gentamicine sulfate RP-HPLC C18Eau/MeOH/CH3CN(990 : 5 : 5, v/v/v)Acides trichloroacétique and trifluoroacétique

Sedex 75N2 : 3,0 barTtube : 50 °C

C1a, C2, C2a, C1Sulfate

1,2 to 2,4 μg/ml

1,4 μg/ml

[33]

Gentamicine sulfate RP-HPLC C18Eau/MeOH (97 : 3, v/v)Acide trifluoroacétique 48,5 mM

Sedex 75N2 : 3,0 barTtube : 60 °C

C1a, C2, C2b, C2a, C1

C1a 0,16 % m/m [38]

Kanamycine monosulfate RP-HPLC C18Eau/acétonitrile(60 : 40, v/v)Acide heptafluorobutyrique 11,6 mM

Sedex 75N2 : 3,5 barTtube : 45 °C

Kanamycine AKanamycine BSulfate

0,20 μg/ml1,4 μg/ml2,3 μg/ml

[36]

Néomycine sulfate RP-HPLC C18Eau/acétone(50 : 50, v/v)Acide heptafluorobutyrique 11,6 mM

Sedex 75N2 : 3,5 barTtube : 45 °C

NéomycineImpuretés A, B et CSulfate

0,6 μg/ml3 μg/ml

[34]

Tobramycine RP-HPLC C18Eau/acétonitrile(55 : 45, v/v)Acide heptafluorobutyrique 11,6 mM

Sedex 75N2 : 3,5 barTtube : 45 °C

Tobramycine 0,33 μg/ml [35]

Analyse des aminosides

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troscopiques intéressantes pour leur détection enCLHP. La difficulté est résolue actuellement parle recours à la PAD. Cependant, ce mode dedétection est relativement peu répandu dans leslaboratoires de routine et nécessite une expertiseparticulière quant à sa mise en œuvre. La détec-tion par diffusion de lumière est la méthode quidevrait à terme se substituer à la détection élec-trochimique. D’utilisation plus aisée, de per-formances identiques, elle offre une grandesouplesse d’utilisation même si des améliorationssont encore possibles [40, 41]. La place desméthodes CLHP est tout à fait reconnue pourdéfinir la pureté des matières premières (substancesapparentées). Il demeure difficile quoiqu’indis-pensable de remplacer les titrages microbiologiquespar des méthodes physicochimiques pour la déter-mination de la teneur. Cette substitution est déjàréalisée dans deux monographies (amikacine ettobramycine) et a été suggérée pour la néomy-cine [42].

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