Durchflusszytometrie Apoptoseanalyse Jörn Schulze Strahlenbiologie, Klinik für Strahlentherapie,...

Durchflusszytometrie

Apoptoseanalyse

Jörn SchulzeStrahlenbiologie, Klinik für Strahlentherapie, Campus Mitte

Inhalt

DurchflusszytometerApoptoseAnalyse der Apoptose

Durchflusszytometer- Einleitung -

optisches MesssystemStreulicht- und Fluoreszenzsignale von

Partikeln bzw. Zellengleichzeitige Messung von physikalischen

und biochemischen Parametern: Größe Oberfläche Granularität markierte Proteine

Durchflusszytometer- Geschichte -

50er Jahre: Hämatologiezählgeräte mittels elektrischer Widerstandsmessung

60er Jahre: Durchlusszytometer zur Messung von Tumorzellen, Lymphozyten und Bakterien mit Hilfe von Protein- und DNA-Farbstoffen und fluoreszenzmarkierten Antikörpern

Durchflusszytometer- Lichtstreuung -

Streuung eines Lichtstrahles beim Auftreffen auf eine Zelle

beeinflussende Zelleigenschaften: Querschnittsfläche Refraktionsindex Membranstruktur intrazelluläre Bestandteile

Durchflusszytometer- Lichtstreuung -

Vorwärtsstreulicht

FSC* (axial)

Seitwärtsstreulicht

SSC** (orthogonal)

Intensität FSC >> SSC

Sensitivität Querschnittsfläche Refraktionsindex

Information Zellgröße Granularität

Membranfaltung

Form

* forward angle light scatter

** side scatter

Durchflusszytometer- Komponenten -

Flüssigkeitssystemoptisches SystemSignalverarbeitunssystem

Durchflusszytometer- Flüssigkeitssystem -

Der Probenstrom wird durch eine konische, auf das Lumen der Küvette angepasste Kapillare stark beschleunigt (ca. 7 m/s). Damit wird eine Einzelzellsuspension, ähnlich einer Perlenkette gewährleistet.

1. Laserstrahl

2. Messküvette

3. Trägerflüssigkeit

4. Zellsuspension

5. hydrodynamische Fokussierung

Durchflusszytometer- optisches System -

1. Laserstrahl2. Quarzglasküvette3. Blockerstreifen4. Sammellinse5. Teilerspiegel6. Photodiode7. Lichtfilter8. verschiedene

Photomultiplier

Durchflusszytometer- optisches System -

Anregungsteil für Lichtstrahlformung prismatische Strahlexpander und Linsen Lichtstrahl mit horizontal-elliptischen

Durchmesser (ca. 20 x 60 μm) für hohe räumliche Auflösung und ausreichender Signalintensität

Durchflusszytometer- optisches System -

Detektionsteil Vorwärtsstreulicht Seitwärtsstreulicht Trennung von Seitwärtsstreu- und

Fluoreszenzlicht Zerlegung der Fluoreszenz in verschiedene

Farbbereiche Photoröhren für Seitwärtsstreu- und

Fluoreszenzlicht lichtaktive Photodioden für Vorwärtsstreulicht Umwandlung des Lichtsignals in ein elektrisches

Signal

Durchflusszytometer- Signalverarbeitungssystem -

Schwellenwert Differenzierung von Zell- und Störsignalen

mittels elektronischer Schwelle, bezogen auf einen bestimmten Auslöseparameter (Trigger, z.B. FSC)

Digitalisierung Analog-Digital-Wandler (ADC) registrierte Signalintensität [V] → Kanalzahl

(256 bzw. 1024 Kanäle)

Darstellung der Messergebnisse- einparametrig -

Histogramm bzw. Häufigkeitsverteilungdigitale Messsignale → Kanalwerte von 0

bis 255 bzw. 1023Ordinate: Anzahl der ZellenAbszisse: Kanälelineare und logarithmische Darstellung

Darstellung der Messergebnisse- einparametrig -

Apoptose- Definition -

apo…: <griech> ab, weg, losptosis: <griech> Senkungprgrammierter Zelltod („cell suicide“)aktiver, energieabhängiger Prozess ohne

entzündliche Reaktion (Abgrenzung zur Nekrose)

Apoptose- Definition -

physiologisch: Embryogenese Metamorphose normale Zellerneuerung im Gewebe Entwicklung des Immunsystems terminale Differenzierung myeloischer Zellen

Apoptose- Definition -

pathologisch: ionisierende Strahlung zytotoxische Chemikalien Entzug spezifischer Wachstumsfaktoren (IL-2,

IL-3, Serum, Steroidhormone) zytotoxische T-Zellen natürliche Killerzellen

Apoptose- Definition -

Der programmierte Zelltod ist in wachsenden und regressiven Tumoren nachweisbar. Er beeinflusst die Expansion der Tumor-Zell-Population über das Gleichgewicht von Zell-Gewinn und Zell-Verlust.

Die Apotose ist die Art des Tumor-Zelltodes nach zytotoxischer Therapie.

Apoptose- Morphologie -

Phase I Abnahme des Zellvolumens Auflösen des Zellverbundes Verlust von Membranstrukturen (Mikrovilli,

Pseudopodien) Kondensierung des Zytoplasmas Verdichtung zytoplasmatischer Organellen Auflösung des Nukleoli Kondensation des Chromatins Bildung von Vesikel, Verschmelzung mit der

Zellmembran unveränderte Ribosomen und Mitochondrien keine erhöhte Permeabilität der Membran

Apoptose- Morphologie -

Phase II verstärkte Bläschenbildung auf der Zelloberfläche Zeiose - Lappung der Zelle Karyorrhexis - Fragmentierung des Nukleoli Apoptosekörper: membranumhüllte Kernfragmente mit

Zytoplasma und Organellen einsetzende Phagozytose

Apoptose- Morphologie -

Phase III fortschreitende Degenerierung der restlichen Kern- und

Zytoplasmastrukturen Permeabilität der Membran, mögliche Vitalfärbung

Apoptose- Morphologie -

Apoptose- Differenzierung von der Nekrose -

Analyse der Apoptose

Möglichkeiten der Charakterisierung der Apoptose anhand der

DNA-Schädigung undMembranveränderung

Analyse der Apoptose - Membran -

Cytoskelett bestehend aus MikrofilamentenActin-FilamenteFormgebung (Mikrovilli)Kontakt (Pseudopodien)Beweglichkeit wandernder Zellen

(Zusammenwirkung mit Myosin)

Analyse der Apoptose - Membran -

Actin F-Actin (filamentäres) G-Actin (globuläres)

Polymerisation, ATP

G-Actin F-ActinDepolymerisation, ADP

CalciumMagnesiumProteine

Analyse der Apoptose - Membranveränderung -

Im Prozess der Apoptose kommt es zu einer Reduzierung der Pseudopodien und Mikrovilli und damit zu einer Abnahme des F-Actins.

Analyse der Apoptose - Membranfärbung -

Phalloidin-Fluorescein-Konjugat

Phalloidin: Grüner Knollenblätterpilz (Amanita phalloides) Hepatotoxizität:

Blockierung der m-RNA-Synthese durch Komplexbindung mit der RNA-Polymerase im Zellkern

irreversible Bindung an F-Actin und Hemmung der Depolymerisation

keine Enzym- und Proteinsynthese in der Leber LD50 (Maus)=2 mg/kg KG

Analyse der Apoptose - Membranfärbung -

Phalloidin

Analyse der Apoptose - Membranfärbung -

Phalloidin-Fluorescein-Konjugat

Fluorescein: Fluorochrom FITC (Fluorescein-Isothiocyanat):

Farbstoff für sekundäre Fluoreszenz (Substratbindung über Haupt- und Nebenvalenzen)

grüne Fluoreszenz 495 nm Extinktion 519 nm Emission

Analyse der Apoptose - Membranfärbung -

Fluorescein

stabile Kristallform (li.) und amorphie Verbindung (re.)

Analyse der Apoptose - Membranfärbung -

Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 72 h nach Einsaat

0 Gy2% FITC(-)

20 Gy9% FITC(-)

Analyse der Apoptose - Membranfärbung -

Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 240 h nach Einsaat

0 Gy4% FITC(-)

20 Gy36% FITC(-)

Analyse der Apoptose - Membranfärbung -

Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 240 h nach Einsaat, 0 Gy

Analyse der Apoptose - Membranfärbung -

Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 240 h nach Einsaat, 20 Gy

F-Actin-Verlust DNA-Verlust Polyploidie unregelmäßige Zellform

Analyse der Apoptose - Hinweise zur Methodik -

Die Durchführung der Methodik ist abhängig von der Zellart. Es müssen, i. b. bezüglich der Fixierung, eigene Erfahrungen gesammelt werden.

Toxizität von PhalloidinFITC-PI-BeeinflussungKorrelation der Messergebnisse mittels

Vitalfärbung Hoechst 33342

Analyse der Apoptose - Vitalfärbung -

Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 240 h nach Einsaat, 0 Gy

Analyse der Apoptose - Vitalfärbung -

Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 240 h nach Einsaat, 20 Gy