PROTEİN ÇİPLERİ 1 [Salt Okunur] -...

PROTEİN ÇİPLERİ

MUSTAFA UZUNNİSAN 2007

İnsanlık tarihinin en büyük ve sonuçları

açısından en önemli projelerinden olan

İnsan Genom Projesi (human genom project)

ile elde edilen veriler,insan oğluna

yeni ufuklar sunarken birçok farklı projeninde

başlamasına neden olmuştur.

Diğer taraftan insan genom projesi ile elde edilen bilgilerin çoğu ham bilgilerdir.Bu bilgilerin uygulanabilmesi için, yeni bazı

bilgilere ihtiyaç vardır.Halen hücrede birçok molekülün nereden,hangi koşullar

altında sentezlendiği bilinmemekte ve protein moleküllerinin rolleri

açıklanamamaktadır.

Birçok hastalık; gen kontrolü ile ilgili problemler, transkripsiyon,post-transkripsiyonal modifikasyon ve translasyon sırasında oluşan değişiklikler ile oluşmaktadır.Bu nedenle, nükleik asit bazlı labaratuvar tetkikleri yanında protein bazlı labaratuvar tetkiklerinin de önemi artarak sürmektedir.

Sıklıkla kullanılan geleneksel laboratuvaryöntemleri, genellikle tek bir gen

veya proteinin araştırılmasına yöneliktir.Hastalıkların çoğunda birçok gen

etkilenmekte(multigenik) ve birçok faktöre bağlı

olarak hastalıklar oluşmaktadır (multifaktöriyel)

. Bu da, birçok farklı genin veproteinin bir arada, kolay ve efektif olarak

incelenebilmesini gündeme getirmiştir.

Günümüzde gelişen bilgisayar teknolojisinin

biyolojiye uyarlanması ile karşımıza çıkan DNA çipleri,

bize bu olanağısağlamaktadır.

Mikroarrayler ile etkilenen genlerin ekspresyonları, kanserli bir dokuda aynı anda

çalışılmakta, hücre siklusunu etkileyen yüzlerce genin ekspresyonu takip edilebilmektedir.

Mikroarray, ileri derecede genotip ve gen ekspresyon analizleri için geliştirilmiş bir

tekniktir.Küçük örnek hacimleri kullanılarak tek deneyde

mikroarrayler, SNP’lerin,hastalıklı ve normal fizyolojik koşullardaki modifiye gen

ekspresyonunun (mRNA’daki artış ve azalışlar) hızlı bir şekilde çalışılmasını sağlar.

Gen ekspresyon arrayleri, mRNAseviyelerindeki değişiklikleri,kodlanan protein seviyelerindeki değişikliklerle karşılaştırmak için kullanılırlar. Ancak bu çok doğru sonuç vermez. Gen ekspresyon arrayleri, hücre fonksiyonunu etkileyen protein post translasyonal modifikasyonları(fosforilasyon, glikolizasyon v.b.) hakkında bilgi sağlamaz.Protein seviyesinde ekspresyonu değerlendirmek, ilgilenilen proteinlerle ilgili kalitatif ve kantitatif bilgi gerektirir. Bu nedenle, protein mikroarrayleri geliştirilmiştir.

Bir protein mikroarrayi;

antikorlar, proteinler, protein fragmentleri, peptidler, aptamerler veya küçük yüzeylerde immobilize olmuşveya kaplanmış karbonhidrat monomerlerini içerir.

Çip yüzeyinde yüzlerce spotlar vardır.Her spot üzerinde de binlerce aynı tür problarvardır.Prob türü sadece spottan spota değişir.

Protein Array Tipleri

Antikor-Protein ArrayTek Antikor/İşaretlenmiş Örnek Protein ArrayHücresel Lizat Protein Array

Antikor-Protein Array

Antikor mikroarraylerinde, sandviç tip assayler için eşleşen antikor çifti,işaretli tek antikor ve işaretsiz antikor ligant olarak kullanılarak yapılır ve basit işaretleme metodu vardır.

Birçok yayınlanan çalışmada,sandviç immunoassaymikroarray’lerin kullanılabilirliği ve etkinliği gösterilmiştir.Bu yöntemde antikor çifti aynı proteine bağlandığı için yüksek hassasiyetli analiz gerçekleşir.

Saptayıcı antikor, direkt tanımlayıcıişaretle (enzim, floresan molekül, izotop, vb) modifiye edilir veya işaretli streptavidin ile prob uygulamasından sonra saptama için biotinlenir.

Tek Antikor/İşaretlenmiş Örnek Protein Array

Eşleşmiş antikor çiftleri yoksa, işaretli örnekler içeren tek antikor protein mikroarray

protokolleri kullanılır. Sandviç antikor çift arraylerde olduğu gibi, array platformu arrayi

yapılan antikoru (veya antikorları) içerir.. Buyöntemde, protein örneklerinin daha önceden işaretlenmesi (floresan molekülle, isotop veya

biotinle) gerekir. İşaret, örnekteki bir proteinin mikroarray yapılan bir antikorla ve ilişkili elamanlarla etkileşimi tanımlamayı

kolaylaştırır.

Bu teknik, zayıf karakterli hücre sinyal proteinleri gibi protein hedeflerin

değerlendirilmesinde kullanılır. Ana dezavantajı, spesifik antijen tanımasından

emin olunmasını sağlayan antikor fazlalığının olmamasıdır. Ek olarak, tüm örnek bileşenleri

işaretlendiği için, spesifik olmayan arka plan sinyali artacaktır. Yöntem daha çok primer olarak

karşılaştırma ve kalitatif çalışmalarda kulanılır.

Hücresel Lizat Protein Array

Hücresel proteinlerin mikroarrayleri, kompleks protein karışımları veya saflaştırılmış

fazla miktarda eksprese olmuş proteinlerin arraylerinde kullanılır. Kompleks protein karışım

arrayleri, hücresel lizatları dot blotlar. Saflaştırılmışveya fazla miktarda eksprese olmuş

proteinlerin kitaplıklarından oluşan mikroarraylerinoluşturulması, protein:protein

etkileşimlerinin ve kinaz aktivitelerinin görüntülenmesine olanak verir.

Özelliklerine Karar Verme

Protein arrayler, cam, membran, kütle

spektroskopi plateleri, boncuklar ve diğer

partiküllergibi yüzeylere immobilize

proteinler kullanılarak katı-faz ligand bağlama

denemesistemleridir. Denemeler,

paraleldir ve minyatüre edilebilirler (mikroarray ve

protin çipleri).

Hızlı ve otomatik olmaları, yüksek hassasiyette olmaları, çözeltilerin

ekonomik olması ve tekdenemeyle çok veri elde edilebilmesi bu

yöntemin avantajlarıdır. Elde edilen verilerin

değerlendirilmesi biyoinformatik sayesinde yapılabilmektedir.

Uygulama Alanları

Diyagnostikte, hapsedilen arrayler, paralel olarak birçok denemenin gerçekleşmesine olanak verir.

Proteomikte, bu array, farklı örneklerdeki proteinlerin miktarlarını hesaplamada ve

karşılaştırmada kullanılır..

Arrayde, ligandlardan daha spesifik olan proteinler, protein-protein,

protein-DNA, protein-ilaç, reseptör-ligand, enzim-substrat gibi in vitro fonksiyonel

etkileşimlerin görüntülenmesinde kullanlır. Ayrıca, SNP’lerden doğan polimorfik

değişikliklerle protein fonksiyonu koreleedilebilir.

Protein arraylerin kullanıldığı 4 ana alan vardır.

1. Diagnostik: Kan örneklerindeki antijen ve antikorların saptanması.

2. Proteomik: Protein ekspresyon profili oluşturulması, organ ve hastalık spesifikarrayler.

3.İleri ekspresyon ve maniplasyonlar için display kitaplıklarından bireysel üyelerinizolasyonu protein ve antikorların seçilimi

4.Protein fonksiyonel analizi: protein-protein etkileşimleri, reseptörün ligand bağlamaözellikleri, enzim aktiviteleri, antikor çapraz aktivitesi ve spesifitesi, epitop haritalaması.

Formatlar ve Yüzeyler

Protein arrayler, ELISA ve dot blot gibi metodların minyatürize edilmiş şekli

olaraktasarlanmıştır. Genelde kullanılan fiziksel

destek, cam slaydlar, silikon, mikrokuyular,

nitroselüloz membranlar, manyetik veya diğer boncuklardır.Süspansiyondaki

partiküller, array’lerin temeli olarak kullanılır.

Protein İmmobilizasyonu

Proteinlerin imobilizasyonlarındaki çeşitlilikler çözeltiler ve yüzeyin özellikleridir. İyi birprotein array yüzeyi, kimyasal olarak eşleşme prosesinden önce ve sonra stabil olmalıdır, iyispot morfolojisine izin vermelidir, saptamasistemleri arka planla girişim yapmamalıdır.

Kullanılan immobilizasyon metodutekrarlanabilir, farklı özellikteki proteinlere uygulanabilir, otomasyona yatkın olmalı ve tüm fonksiyonel protein aktivitesini geri kazanabilme yeteneğinde olmalıdır.

Protein immobilizasyonu için hem kovalenthem de non-kovalent metodlarkullanılmaktadır.Yüzeye pasif adsorbsiyon metodolojik olarak basittir ancak az kantitatif ve tekrarlanabilirlikleri azdır.Kovalent bağlanma metodları, stabil bağlanma sağlarlar ve çok geniş özellikte proteinlere uygulanabilirler ve tekrarlanabilirlikleri iyidir.

Kovalent bağlanma substratları amino- veya aldehit içeren silançözeltisiyle kaplanmış cam slaytları içerir. Versalinx™ sistemde [Prolinx], fenildiboronik asitve salisilhidroksamik asit ile türevlenmişproteinler arasındaki etkileşimler yüzeye geridönüşümlü olarak immobilize edilmeyi başarılmıştır.Ayrıca, bu yöntemde daha az arka planbağlanması görülmüştür ve immobilizeproteinlerin fonksiyonlarını kazanmalarısağlanmıştır.

En yaygın kullanımı olan biyolojik eşleme metodu, biotin/streptavidin veya heksahistidin/Ni etkileşimleridir. Biotin, titanyum dioksit gibi bir yüzeyde poli liziniskeletine konjuge olabilir.

Saptama

Saptamada en yaygın olarak floresanişaretleme kullanılmaktadır. DNA

mikroarraylerini okumak için kullanılan metodlar, protein arraylere de

uygulanabilmektedir..

Planarwaveguide technology[Zeptosens] ultrahassas

floresans saptamasısağlar ve yıkama

prosedürünün olmamasıda ayrı bir avantajıdır.

Ayrıca, yüksek hassasiyet süspansiyon boncuklarıve partikülleri ile işaret

olarak fitoeritrinkullanılmasıyla sağlanır.

Diğer alternatif metodlar , yüzey plazmonrezonansı , dönen halkasal DNA

amplifikasyonu [Molecular Staging], kütle spektroskopisi ve atomik kuvvet

mikroskopisidir.

Large-Scale Protein Arrayleri

Large-scale fonksiyonel çipler, çok sayıda saflaştırılan proteinin immobilizasyonu ile geniş miktarda biyokimyasal fonksiyonun (protein-protein etkileşimi, ilaç-hedef etkileşimi, enzim-substrat etkileşimi vs.) denemesinde kullanılırlar.

• www.functionalgenomics.org• www.microarray.swmed.edu• www.arrayit.com/.../protein_chips.html• www1.qiagen.com/products/protein• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi• www.gulhanemedicaljournal.org/pdf.php3?id=243