Transkript-Level Bestimmung in der Buche

747

BIOspektrum | 07.09 | 15. Jahrgang

MAREN OLBRICH1, GERHARD WELZL2, JANA BARBRO WINKLER3, KARL-HEINZ

HÄBERLE4, DIETER ERNST1

1INSTITUT FÜR BIOCHEMISCHE PFLANZENPATHOLOGIE, HELMHOLTZ ZENTRUM

MÜNCHEN2INSTITUT FÜR ENTWICKLUNGSGENETIK, HELMHOLTZ ZENTRUM MÜNCHEN3INSTITUT FÜR BODENÖKOLOGIE, HELMHOLTZ ZENTRUM MÜNCHEN4LEHRSTUHL FÜR ÖKOPHYSIOLOGIE DER PFLANZEN, TECHNISCHE UNIVERSITÄT

MÜNCHEN

Ozonstress verändert die Transkriptebene von Pflanzen. Mit einemcDNA-Array wurden für die Europäische Buche (Fagus sylvatica L.) dieInteraktion Pflanze-Stressor und die Gen-Reprogrammierung untersuchtund die Ergebnisse durch quantitative Real-Time-PCR verifiziert.

Ozone stress leads to changes upon transcriptional level of plants. ForEuropean beech (Fagus sylvatica L.), DNA array technology detects inter-action between plant stress and gene changes. Results were verified withquantitative real-time PCR.

Pflanzliche Reaktion auf Ozon

ó Ozon ist als abiotischer Elizitor bei krau-tigen Pflanzen bekannt und löst die Induk-tion Abwehr-verwandter Gene aus [1]. Bei hol-zigen Pflanzen wurde ein Ozon-induzierter„Memory-Effekt“ mit verspäteten Symptom-entwicklungen und persistenten biochemi-schen Antworten beobachtet [2]. Je nach Dau-er, Intensität und Konzentration der Ozon-gabe sowie Empfindlichkeit und Entwick-lungsstadium der Pflanzen werden sie ent-weder anfälliger oder resistenter gegen wei-tere Stressoren wie Pathogene [2]. So ver-frühte die Exposition von jungen Buchen imFreiland mit zweifach ambienten Ozonkon-zentrationen deren Seneszenz [3, 4], adulteBuchen im Waldbestand unter denselbenOzonbedingungen zeigten hingegen kaumveränderte Transkripte [5].

Ozon dringt über die Stomata in das Blattein, im interzellularen Raum zersetzt es sichrelativ schnell. In wässriger Lösung führt eszur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies(ROS) (Abb. 1). Sekundär entstehen durch dieReaktion von Ozon mit Zellwand-gebundenenphenolischen Gruppen äußerst reaktiveHydrogenradikale. Bei der Reaktion mit Plas-mamembranlipiden und -proteinen kommt es

zur Bildung organischer Peroxide. Innerhalbweniger Stunden nach subakuter Ozonexpo-sition bilden sich Signalmoleküle (Ethylen,

Salicylsäure und Jasmonsäure), ROS, Patho-gen-verwandte (PR)-Proteine und antioxida-tive Verbindungen. Ferner kommt es zur Akti-vierung des Polyaminmetabolismus, der Poly-phenol- und der Ligninbiosynthese [6].

Bestimmung von Transkript-

konzentrationen über einen

cDNA-Mikroarray und Ergebnis-

verifizierung mittels quantitativer

Real-Time-PCR (qRT-PCR)

Über eine suppressive subtraktive Hybridi-sierung (SSH) wurden Ozon-regulierte ESTs(expressed sequence tags) isoliert, daraus wur-de eine cDNA-Bank erstellt [7]. Die ESTs wur-den mittels PCR amplifiziert, gereinigt undauf einen Aldehyd-beschichteten Objektträ-ger (Slide) gebracht (Abb. 2).

Nur qualitativ hochwertige RNA sollte fürMikroarray-Analysen sowie für die qRT-PCRzur Erstellung der cDNA verwendet werden.Mithilfe von Superscript III Reverse Trans-kriptase wurde die RNA bei 42 °C in cDNAumgeschrieben. Für die Mikroarray-Analysen

Mikroarrays

Transkriptlevel-Bestimmungin der Buche

˚ Abb. 1: Ozon-induzierte Abwehrantwort im Gewebe einer Pflanzenzelle (modifiziert nach [2]).

Zellwand Ozon und sekundäre ProdukteOzon Stomata

Phenolische Gruppen, ungesättigte Komponenten, AmideROS Salicylsäure, MethylsalicylateEthylen, ACC ROS

Abwehrantwort

Kinasekaskade Proteinaktivierung

Spezifische mRNA Bildung

Geninduktion/ -repression

Anitoxidative Verbindungen, Polyamine, Polyphenole, Ligninbiosynthese, PR-Proteine

PlasmamembranLipidperoxidation

Veränderter metabolischer Status

Erhöhte Anfälligkeit oder Resistenz für nachfolgenden Stress

Wachstumshemmung, Sichtbare Symptome

Hemmung der PhotosynthesePigmentverlust Zytoplasma

ZellkernChloroplast

„oxidative burst“

Signalkette

Jasmonat

Signalkette

Antioxidative Stoffe

Rezeptoren

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748 WISSENSCHAFT · SPECIAL: PCR


wurden Oligo-dT-Primer und für die qRT-PCRRandom-Hexamerprimer eingesetzt. DieqRT-PCR-Spezifität wurde über die Anwen-dung spezifischer Primer erreicht, derenSequenzen aus Datenbanken entnommenwurden.

Für den Mikroarray wurden die cDNAs derKontrollbuchen mit grün- und die der Ozon-behandelten Buchen mit rot-fluoreszieren-dem Farbstoff markiert. Die markierte cDNAder zusammengehörigen Kontroll- und Test-buchen wurde auf einen Slide gegeben, wobeigleiche cDNA an das entsprechende PCR-Fragment des Slides hybridisierte. Das voneinem Scanner ermittelte Farbsignal des Flu-oreszenzfarbstoffs erlaubte die Bestimmungder Transkriptgehalte der Test- relativ zu denKontrollbuchen (Abb. 2).

Die Transkriptmenge der qRT-PCR wurdemittels Comparativer Ct-Methode, unterBenutzung der Formel

2–CtBehandlung –CtKontrolle,

errechnet. Dabei werden die Ct-Werte vonKontroll- und Testmaterial durch ein Re-ferenzgen normalisiert, welches währendder qRT-PCR-Reaktion mitgeführt wird. DieSoftware Primer Express 2.0 (Applied Bio-systems, Darmstadt) erlaubte das Primer-design unter Beachtung der folgenden Fak-toren: (1) Primerlänge von 10 bis 30 bp; (2)Länge des Amplifikates von 50 bis 100 bp; (3)keine Anhäufung der Base Guanin in denPrimern; (4) weniger als zwei Guanin-und/oder Cytosin-Basen am 3’-Ende desNukleotids.

Referenzgene und Primer-Effizienz

Am Blattmaterial der Buche wurden ver-schiedene allgemein benutzte Referenzgenegetestet und die Buchen verschiedenen Stres-soren wie erhöhtem Ozon, erhöhtem CO2,Pathogeninfektion mit dem WurzelpathogenPhytophthora citricola ausgesetzt sowie derEinfluss der Blattmorphologien (Sonnen- ver-sus Schattenblatt) untersucht (Tab. 1). DieProbennahme erfolgte zu zwei Zeitpunkten,für jeden Zeitpunkt wurde ein neues Refe-renzgen zur Normalisierung ermittelt [8]. Obdie jeweilige Behandlung den Transkriptge-halt des Referenzgens beeinflusst, wurdemittels Varianzanalyse geprüft. Bei Buchenunterschiedlichen Alters und Genotyps, dieunter verschiedenen Umweltbedingungenstanden, können die Transkriptgehalte sehrunterschiedlich ausfallen. Deswegen wurdeder Faktor „Baum“ in die statistische Analy-se einbezogen und ein lineares Modell mitgemischten Effekten angewendet [9, 10].

Bei der Anwendung der Comparativen Ct-Methode ist die annähernd gleiche Primer-Effizienz von Ziel- und Referenzgen wichtig.Dafür wurde eine Templateverdünnungerstellt und die Regressionskoeffizienten fürdie verschiedenen Gene errechnet. Die Pro-ben stammten aus den Versuchen und wur-den unter denselben Bedingungen gemessenwie die Versuchsproben.

Ergebnisse

Die 18S rRNA, die oft als Referenzgen für dieqRT-PCR von Pflanzenmaterial eingesetztwird, zeigte in unserer Studie allerdings 12Tage nach der Infektion mit P. citricola einenveränderten Transkriptgehalt. Die mRNA-Konzentrationen von GAPDH1 (31 Stundennach der Infektion mit P. citricola, Sonnen-und Schattenblätter am 19.09.05), GAPDH2(CO2-Behandlung am 01.05.05 und am

18S rRNA 0,1079 0,1019 0,0822 0,0458 0,7768 0,1819 0,2565 0,3977

Aktin 0,3812 0,1974 0,2752 0,6422 0,1038 0,3249 0,1295 0,9942

GAPDH1 0,5582 0,3464 0,0398 0,8910 0,3686 0,6691 0,4078 0,0255

GAPDH2 <0,0001 <0,0001 1,0000 0,5685 0,0082 0,5062 0,5164 0,9726

α -Tubulin 0,0203 0,0572 1,0000 0,7995 0,7976 0,8549 0,2947 0,4366

ubiquitin-like protein 0,0304 0,0024 0,9841 0,3675 0,8896 0,7622 0,3897 0,9440

Tab. 1: Beeinflussung der getesteten Referenzgene durch die verschiedenen Behandlungen bzw. der Einfluss der unterschiedlichen Blattmorphologien.

Aufgetragen ist der jeweilige p-Wert, der unter Anwendung des linearen Modells mit gemischten Effekten aus der ANOVA-Tabelle entnommen wurde (rot = signifikante Be-einflussung) [8].

Gen CO2 P. citricola Ozon Sonnen-/Schattenblättern = 6 n = 6 n = 5 n = 5

01.05.05 10.5.05 31 Stunden 12 Tage 27.07.05 29.08.05 12.05.05 19.09.05

˚ Abb. 2: Arbeitsablauf zur Erstellung des Buchen-cDNA-Mikroarrays.

Scannen

W aschen der Slides

Ausw ertung über GenePixPro und Acuity

Hybrid is ierung für mindes tens 18 h

RNA isolieren

Labeln mit Cy-3 und C y-5

cDNA-Herstellung durch RT-PCR

Reinigung des Ansatzes

Auf Array auftragen

Buchenblätter

Amplifizierungs-PCR m it modifizierten M 13-Primern

Herstellung der SS H-Bank

Spotten

Prähybrid is ieren und waschen

Blocken

Sequenzierung der Klone

Klonausw ahl und Plasm idpräparation

Einte ilung der ESTs in funktionelle Gruppen

Reinigung und Kontro lle der PC R-Produkte (cDNA)

Scannen

W aschen der Slides

Ausw ertung über GenePixPro und Acuity

Hybrid is ierung für mindes tens 18 h

RNA isolieren




Auf Array auftragen

Buchenblätter

RNA isolieren




Auf Array auftragen

Buchenblätter

Amplifizierungs-PCR m it modifizierten M 13-Primern

Herstellung der SS H-Bank

Spotten

Prähybrid is ieren und waschen

Blocken

Sequenzierung der Klone

Klonausw ahl und Plasm idpräparation

Einte ilung der ESTs in funktionelle Gruppen

Reinigung und Kontro lle der PC R-Produkte (cDNA)



10.05.05), α-Tubulin (CO2-Behandlung am01.05.05) und ubiquitin-like protein (CO2-Behandlung an beiden Probenahmetagen)waren durch die jeweiligen Behandlungenbeeinflusst (Tab. 1). Aktin war das einzigeunbeeinflusste Gen. Gute Effizienz wurdefür 18S rRNA, Aktin, GAPDH1 und α-Tubu-lin ermittelt, wohingegen GAPDH2 und ubi-quitin-like protein über keine gute Effizienzverfügten (Tab. 2).

Fazit

Abhängig vom Gewebetyp und applizier-tem Stress eignen sich mehrere Gene alsReferenzgen für die qRT-PCR. Für dieBuche kann das Aktin-Gen das Referenz-gen der Wahl sein, da es durch keineBehandlung in dieser Studie beeinflusstwar und eine gute Effizienz besaß. Aller-dings wird die Transkriptkonzentrationvon Pflanzengenen durch viele Faktorenbeeinflusst. Deswegen sollte für jedesExperiment ein geeignetes Referenzgenermittelt werden.

Danksagung

Dank gilt der Deutschen Forschungsge-sellschaft, die den Sonderforschungsbe-reich 607 „Wachstum und Parasitenab-wehr“ unterstützt. ó

Literatur[1] Langebartels C, Schraudner M, Heller W et al. (2002)Oxidative stress and defense reactions in plants exposedto air pollutants and UV-B radiation. In: Inzé D, VanMontagu (eds) Oxidative Stress in Plants. Taylor &Francis, London, 105–135[2] Sandermann H (2000) Ozone/biotic disease interac-tions: molecular biomarkers as a new experimental tool.Environ Pollut 108:327–332[3] Olbrich M, Gerstner E, Welzl G et al. (2009)Transcript responses in leaves of ozone-treated beechsaplings at an outdoor free air fumigation site over twogrowing seasons. Plant Soil 323:61–74

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Korrespondenzadresse:

Dr. Maren OlbrichHelmholtz Zentrum MünchenInstitut für Biochemische PflanzenpathologieArbeitsgruppe für Pflanzlichen abiotischen StressIngolstädter Landstraße 1D-85674 NeuherbergTel.: 089-3187-2719Fax: [email protected]

18S rRNA 0,9968

Aktin 0,9975

GAPDH1 0,9999

GAPDH2 0,3975

α -Tubulin 0,9999

ubiquitin-like protein 0,0122

Tab. 2: Bestimmung der Primer-Effizienz durchErmittlung des Regressionskoeffizienten [8].

Die Regression wurde aus den gemessenen Ct-Werten und der jweiligen Verdünnungsstufe (1:128bis 1:4) ermittelt.

Gene Regressionskoeffizient

AUTOREN

Dr. Maren Olbrich3 ist wis-senschaftliche Mitarbeiterinam Helmholtz Zentrum Mün-chen im Institut für Biochemi-sche Pflanzenpathologie inder Arbeitsgruppe für Pflanz-lichen Abiotischen Stress vonDr. Ernst. Dr. Jana BarbroWinkler4 ist wissenschaftli-

che Mitarbeiterin am Helmholtz Zentrum Mün-chen in der Abteilung für Experimentelle Umwelt-simulation und stellvertretende Abteilungsleite-rin. Dr. Gerhard Welzl1 ist Teamleiter Biostatistikam Institut für Entwicklungsgenetik. Dr. Karl-Heinz Häberle5 ist wissenschaftlicher Mitarbei-ter am Lehrstuhl für Ökophysiologie der Pflanzender TU München. Dr. Dieter Ernst2 ist Leiter derArbeitsgruppe für Pflanzlichen AbiotischenStress am Helmholtz Zentrum München undstellvertretender Institutsleiter am Institut fürBiochemische Pflanzenpathologie.

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EUGEN DOMANN, CAN IMIRZALIOGLU, TRINAD CHAKRABORTY

INSTITUT FÜR MEDIZINISCHE MIKROBIOLOGIE, UNIVERSITÄT GIEßEN

Aufgrund unterschiedlicher Nährstoff- und Wachstumsanforderungen isteine kulturelle Identifizierung von Mischinfektionen oft sehr schwierig.Molekulare Methoden wie die PCR und die DHPLC-Methode bietenschnelle und zuverlässige DNA-Sequenz-basierte Identifizierungen.

Due to different nutrition and growth requirements of mixed infections,the identification by culture is often challenging. Molecular methods suchas PCR and the DHPLC method provide quick and reliable DNA sequence-based identifications.

Polymikrobielle Infektionen oder

Mischinfektionen

ó Gerade heute, wo die Zahl der älteren undimmungeschwächten Patienten zunimmt,beobachtet man auch eine Zunahme von

ungewöhnlichen Erregern und Mischinfek-tionen [1]. Dabei handelt es sich um Infek-tionen, die durch mehr als einen Erreger her-vorgerufen werden und deswegen als poly-mikrobielle Infektionen oder als Mischinfek-

tionen bezeichnet werden. Die bekanntestenMischinfektionen sind Infektionen der Mund-höhle (z. B. Parodontitis, Gingivitis, Karies),Urogenitalinfektionen (z. B. Harnwegsinfek-tionen, Vaginose), Infektionen der Augen unddes HNO-Bereichs (z. B. Konjunktivitis, Otitisexterna, chronische Tonsillitis), Wundinfek-tionen (z. B. Ulcera, Abszesse), intraabdomi-nelle Infektionen (z. B. Cholezystitis, Perito-nitis) und Infektionen des Respirationstrakts(z. B. bei Mukoviszidose). Typischerweise liegteine Mischflora aus aeroben und anaerobenBakterien vor, die meist endogenen Ursprungssind und sich aus der Masse der uns besie-delnden Bakterien rekrutieren [2].

Probleme beim kulturellen Nachweis

von Mischinfektionen

Zum Nachweis und zur Identifizierung vonBakterien mittels Kultur werden geeigneteNährmedien verwendet. Als Untersuchungs-materialien sind alle herkömmlichen Probendenkbar (z. B. Abstriche, Punktate, Biopsien,Sputum, Urin, Stuhl, Blut, Liquor etc.). Da diebeteiligten Erreger in der Regel nicht bekanntsind, werden möglichst Vollmedien eingesetztund diese unter unterschiedlichen Kulturbe-dingungen bebrütet. Allerdings muss dabeimit verschiedenen Problemen gerechnet wer-den: (1) Die Mischflora kann aus aeroben undanaeroben Bakterien bestehen; das heißt dieAnzucht muss unter aeroben und anaerobenBedingungen erfolgen. (2) Die Generations-zeiten der enthaltenen Bakterien könnenstark unterschiedlich sein; das heißt in Flüs-sigkulturen oder auch in Blutkulturen kanneine schnell wachsende Population eine lang-sam wachsende Population überwuchern undsomit sogar verdrängen. (3) Die verschiede-nen Bakterien können stark unterschiedlicheAnsprüche an die Nährstoffe stellen; das heißtbesondere Faktoren (z. B. Vitamine, Wachs-tumsfaktoren) sind erforderlich und müsstenzusätzlich zugegeben werden. (4) Die ver-schiedenen Bakterien können im Wirt in einerArt Vergesellschaftung (Biofilm) existieren;das heißt es kann zu veränderten Genex-pressionen kommen, was sich in einem zwar

Polymikrobielle Infektionen

Nachweis polymikrobiellerInfektionen mittels PCR und DHPLC

˚ Abb. 1: A, Problemdarstellung beim kulturellen und molekularen Nachweis von Mischinfektio-nen. B, Fließdiagramm zur Darstellung der WAVE-Analyse und schematischer Aufbau des16S-rRNA-Gens mit Konsensus-PCR. Die schwarzen Kästchen repräsentieren die hochkonservier-ten und die weißen Kästchen die variablen Bereiche der 16S-rDNA.



lebensfähigen, aber nicht kulti-vierbaren Zustand zeigen kann[3].

Aus diesen zu berücksichti-genden Parametern lässt sichleicht erkennen, dass der Nach-weis und die Identifizierung derbeteiligten Bakterien mittels Kul-tur sehr schwierig und langwierigsein kann und nicht sichergestelltist, dass tatsächlich alle enthal-tenen Bakterien auch wirklichkultiviert wurden (Abb. 1A).

PCR- und DNA-Sequenz-

basierter molekularer

Nachweis von

Mischinfektionen

Schon früh haben deswegen ver-schiedene molekulare Nachweis-methoden auf Basis der geneti-schen Information Einzug in dieMedizinische Mikrobiologiegehalten, von denen die PCR diegrößte Bedeutung hat. Die PCRwurde in erster Linie für die spe-zifischen Nachweise von Bakte-rien aus einer Mischflora, abernicht für die Analyse der Misch-flora selbst eingesetzt. Auch hierergibt sich grundsätzlich die Pro-blematik, dass die prokaryotischeDiversität enorm ist und sehrunterschiedliche Erreger in derProbe enthalten sein können. Esmusste demnach ein Genomab-schnitt gefunden werden, der inallen Bakterien vorkommt, aberdoch heterogen genug ist, umeine Identifizierung zu erlauben.Sehr schnell hat sich das 16S-rRNA-Gen als ein solcher geeig-neter Kandidat herausgestellt.Das 16S-rRNA-Gen besteht aushochkonservierten und variablenNukleinsäuresequenzbereichenund ist meist sogar in mehrerenKopien auf dem Genom der Bak-terien vorhanden. Die konser-vierten Sequenzen kommen inallen Bakterien vor, während dievariablen Sequenzen typisch füreine Bakterienspezies sind (Abb.

1B). Für eine unspezifische PCRaus diesem Gen werden für dieAmplifikation Primer ausgewählt,die in konservierten Bereichenbinden, und die dazwischenlie-

genden variablen Bereiche wer-den sequenziert und für die Iden-tifizierung mittels Bioinformatikund geeigneten 16S-rDNA-Daten-banken verwendet. Bei Reinkul-turen ist diese Art der Identifi-zierung leicht durchführbar. Beieiner Mischflora ergibt sich aller-dings das Problem, dass bei derAmplifikation ein Gemisch ausgleich großen Amplikons entsteht(Abb. 1). Das heißt eine Größen-auftrennung, z. B. mittels her-kömmlicher Agarosegelelektro-phorese, ist nicht möglich. Umsolche Mischamplifikate zu ana-lysieren, wurden verschiedene,DNA-Sequenz-basierte Methodenentwickelt, von denen nur diewichtigsten vorgestellt werdensollen [4, 5]: (1) Klonierung der16S-rRNA-Amplikons in ein geeig-netes Vektorsystem (16S-rRNA-Genbanken) und Sequenzierungder einzelnen Amplikons. (2) Phy-sikalische Trennung aufgrundder unterschiedlichen Nuklein-säurezusammensetzung. DieAmplifikate unterscheiden sich,zumindest in den variablen Berei-chen, in ihrer DNA-Sequenz, waseine gelelektrophoretische Tren-nung mittels Temperaturgradient(Temperature Gradient Gel Elec-trophoresis, TGGE) oder einemdenaturierenden Gradienten(Denaturing Gradient Gel Electro-phoresis, DGGE) ermöglicht. DieDNA-Banden können ausge-schnitten und sequenziert wer-den. (3) Terminale Restriktions-fragment-Längenpolymorphis-men (T-RFLP). Diese Technologiemisst die Größen-Polymorphis-men eines terminalen Restrik-tionsfragmentes von einemmittels PCR amplifizierten Mar-kergen. (4) Hybridisierung vonribosomalen DNA-Sonden aufeinem high-density-Mikroarray(Nukleinsäure-Chip). Die Ampli-kons werden mit den ribosoma-len DNA-Sonden auf dem Chiphybridisiert und anschließendmittels Fluoreszenz und Bioin-formatik ausgewertet. (5) Hoch-durchsatz-Sequenziertechnolo-gien zur Untersuchung von

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mikrobiellen Gemeinschaften auf der Basisder neuesten Sequenziertechnologien undSoftware-Programme zur bioinformatorischenAnalyse (Metagenomanalysen).

Da die genannten Methoden sehr arbeits-intensiv, sehr zeitaufwendig und im Falle derMetagenomanalysen noch recht teuer sind,sind sie für die Routinediagnostik nur bedingt

und vor allem zu Forschungszwecken ein-setzbar. Aus diesen Gründen haben wir eineneue Analyse-Technologie entwickelt, die aufeiner denaturierenden Hochleistungs-Flüs-sigkeitschromatografie (Denaturing High-Per-formance Liquid Chromatography, DHPLC) derWAVE-Plattform (Transgenomic Inc., Omaha,USA) basiert.

Analyse von Mischinfektionen mittels

PCR und DHPLC

DHPLC auf der Basis der WAVE-Plattform wirdweltweit in der Mutationsanalytik (SNP-Ana-lysen) eingesetzt [6]. Das von uns neu entwi-ckelte Verfahren beruht auf der Amplifika-tion der V6- bis V8-Region, eines hypervari-ablen Bereichs der 16S-rDNA auf bakteriel-len Genomen, mittels einer Konsensus-PCR(Abb. 1B). Voraussetzungen für die Entwick-lung dieses Verfahrens war das Design einesuniversell einsetzbaren Konsensus-PCR-Pri-merpaares, die Generierung spezieller Gra-dienten und die Festlegung optimaler Tem-peraturbedingungen für die Analyse [7]. Wirhaben die Methode insbesondere eingesetzt,um bakterielle Harnwegsinfektionen vonPatienten zu untersuchen. Dabei konntezunächst der Nachweis geführt werden, dasskünstliche, aus bis zu fünf Einzelamplifikatenverschiedener uropathogener Bakterien her-gestellte Gemische, mithilfe des DHPLC-Ver-fahrens aufgetrennt werden können (Abb.

2A). Die einzelnen „Peaks“ des erhaltenenProfils wurden mithilfe eines Fraktionen-sammlers isoliert und konnten durchanschließende Sequenzanalyse eindeutig deneinzelnen zur Generierung des Gemischs her-angezogenen Spezies zugeordnet werden. Ineiner ersten Studie wurden zunächst 109Urinproben von Nierentransplantierten ana-lysiert [7]. In einer zweiten Studie wurden1.449 Urinproben von Patienten mit Harn-wegsinfektionen mittels Kultur undPCR/DHPLC untersucht [8]. Dabei zeigte sichzum einen eine hundertprozentige Überein-stimmung zwischen Kultur- und PCR-positi-ven Proben und der Generierung von Peak-Profilen durch DHPLC (Abb. 2B). Darüber hin-aus konnten auch bei solchen PCR-positivenProben Peak-Profile durch DHPLC erhaltenwerden, die sich trotz längerer Inkubation alsKultur-negativ erwiesen hatten.

Anwendungspotenziale

Mit dem beschriebenen DHPLC-Verfahrenwurde eine robuste, schnelle, reproduzierba-re und kostengünstige Methode zur Kultur-unabhängigen Analyse von Mischinfektionen

˚ Abb. 2: A, Analyse künstlicher Amplifikatgemische ausgewählter uropathogener Bakterien.B, Kultur-unabhängige DHPLC-Analyse einer Urinprobe.

A

B



bzw. bakteriellen Gemeinschaftengeschaffen. Das Verfahren, das sich beientsprechender Anpassung auch aufdie Analyse pathogener Viren, Pilze [9]und Parasiten anwenden lassen sollte,erlaubt die Untersuchung komplexerGemeinschaften sowohl über DHPLC-generierte Profile als auch durch DNA-Sequenzierung automatisch separier-ter Einzelpeaks des Profils. Es bietetsomit neue Perspektiven für eine ver-besserte Diagnostik und Therapie inzahlreichen medizinischen Zusammen-hängen, bei denen Mischinfektioneneine Rolle spielen. DHPLC-Profile bietenzudem einen einfachen Ansatz, Verän-derungen der Zusammensetzungmikrobieller Gemeinschaften ohne wei-teren Sequenzieraufwand qualitativund quantitativ zu erfassen [10]. AlsUntersuchungsmaterial sind alle her-kömmlichen Proben geeignet (sieheoben). Erstrebenswert ist die zukünfti-ge Errichtung eines Komplettsystems,das diese DHPLC-Technologie mit auto-matisierten Sequenziertechniken, wiez. B. der Pyrosequenzierung, verbin-det. Eine derartige Plattform sollte rou-tinemäßige Hochdurchsatzanalysen vonkomplexen Untersuchungsmaterialienermöglichen. ó

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Korrespondenzadresse:

Prof. Dr. Eugen DomannInstitut für Medizinische MikrobiologieJustus-Liebig-Universität GießenFrankfurter Straße 107D-35392 GießenTel.: 0641-9941281Fax: [email protected]

AUTORENEugen DomannBiologiestudium an der Uni-versität Würzburg; dort 1989Diplom und 1992 Promotion.1997 Habilitation in Mikrobio-logie an der Universität Gie-ßen; dort 2006 außerplanmä-ßiger Professor für Mikrobio-logie.

Can ImirzaliogluMedizinstudium ander Universität Gie-ßen; dort 2004 Arztund Promotion.2008 Facharzt fürMedizinische Mikro-biologie, Virologieund Infektionsepi-demiologie.

Trinad ChakrabortyBiochemiestudium in London. 1982 Promotion zum Dr. rer. nat. in Ber-lin. 1990 Habilitation im Fach Mikrobiologie an der Universität Würz-burg. 1992 C3-Professur für Infektionsimmunologie an der UniversitätGießen; dort 1998 C4-Professur und Direktor des Instituts für Medizini-sche Mikrobiologie. 2009 Dekan des Fachbereichs Medizin in Gießen.

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Mit welcher Zeitperspek-tive wird man glücklich? Eine Entdeckungsreise zu den Sprachen dieser Welt

Wie der Mensch den Kosmos entdeckte

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756 WISSENSCHAFT · JOURNAL CLUB


ÿ Unspezifischer Rundumschlag – mit Grund!ÿ Vom Teufelszeug zum Heilbringer: Bakterien sagen ja zu NOÿ Zentromer-Regionen in Primaten – neue Möglichkeit zur Untersuchung

der menschlichen Evolutionÿ Metabolomics – Test auf Prostatakrebs?

1 Institut f. Biochemie, Universität zu Köln, Zülpicher Straße 47, D-50674 Köln2 Helmholtz Zentrum München – Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH, Ingolstädter Landstraße 1, D-85764 Neuherberg,

[email protected] Wolfson Institute for Biomedical Research, University College London, The Cruciform Building, Gower Street, GB-London WC1E 6BT, [email protected] Department für Mikrobiologie, Institut für Pflanzenbiologie, Universität Zürich, Winterthurerstrasse 190, CH-8057 Zürich, [email protected] Zentrum für Infektionsforschung – Nachwuchsgruppe 2, Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Josef-Schneider-Straße 2 / D15, D-97080 Würzburg,

[email protected] Genetics and Neurobiology of C. elegans, Jean-Louis Bessereau Laboratory, I.N.S.E.R.M. U. 789, Ecole Normale Superieure, 46, rue d’Ulm, F-75 005 Paris,

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Lothar Jaenicke1 Jochen Graw2

Meist sind biologische Reaktionen hoch

stereospezifisch. Eine wichtige Ausnahme

ist das P-Glykoprotein (P-gp), das in der

Membran von Säugerzellen sitzt und zahl-

lose Stoffe – ob bio- oder pharmakogen,

ob racemisch, links- oder rechtsdrehend,

vom hydrophilen Peptid bis zum hydro-

phoben Steroid – aus dem Zytoplasma

transportiert und dem Abbau zuführt. Das

ist sehr sinnvoll und schützt die Zelle vor

vielen Schäden.

ó P-gp ist eine membrangebundene und-durchtretende ATPase aus der Familie derABC-Kassetten-Transporterproteine. Das zeigtdie von S. G. Aller et al. (Science (2009) 323:1718–1722) angegebene Kristallstruktur desMaus-P-gp in einem künstlichen Membransys-tem. Im Grunde ähneln diese ABC-Transporter-

proteine der Säuger den mikrobiellen multidrugresistance-Proteinen. Man hat daher ange-nommen, dass sie zahlreiche, unterschiedlichstrukturierte Moleküle durch ebenso zahlrei-che, unterschiedliche Zentren erkennen, bin-den und transportieren. Aber das ist bei derwachsenden Menge von Liganden logistischnicht leicht vorzustellen. Daher suchten dieExperten nach allgemeineren Gemeinsamkei-ten dieser Transportmechanismen. Sie postu-lierten eine gerichtete Veränderung des intra-zellulären pH-Werts oder der Membranfluiditätoder aber enzymatische Katalysen des P-gp-Transporters, die den Liganden gemeinsameErkennungs- und damit Transporteigenschaftenaufprägen. Schließlich wurde diskutiert, dassdie Membran für die Stoffe enzymatischundurchlässig gemacht werde.

Unspezifischer Rundumschlag – mit Grund!

Y Die publizierte Röntgenkristallstruktur des12fach gefalteten P-gp auf 3,8 Å stützt das all-gemeine Modell. Die Stoffe werden von derMembran gebunden, von dort in den ca. 6.000Å3 großen Binnenraum der Transportertüteextrahiert, der sowohl hydrophobe wie aroma-tische Wechselwirkungen erlaubt und imAbstand von 30 Å zwei Nukleotid-Bindedomä-nen enthält, durch die die Substrate ungestörtwechselwirkend bearbeitet werden können. Die-se Innenhöhlung ist so groß, dass dort min-destens zwei unterschiedliche Substrate Platzfinden, miteinander zu agieren und dadurchdie jeweiligen Bindungskinetiken zu modulie-ren.

Lothar Jaenicke ó

Neben Eukaryoten besitzen auch Prokary-

oten die Fähigkeit, enzymatisch Stick-

stoffmonoxid (NO) zu bilden. Welche

physiologische Rolle bakterielles NO

spielt, war bislang jedoch rätselhaft –

zumal von menschlichen Immunzellen

gebildetes NO ein hervorragendes Bakte-

rizid darstellt. Umso überraschender

muten neue Ergebnisse an, dass NO den

Bakterien Resistenz gegenüber Antibioti-

ka verleihen kann.

ó Ausgangspunkt der Arbeit von Gusarov etal. (Science (2009) 325:1380–1384) war derBefund, dass Bacillus subtilis nach Entfernungdes Gens der bakteriellen Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) empfindlicher gegen eineReihe von Antibiotika war. Genauere Unter-suchungen brachten wenigstens zwei unter-

schiedliche Erklärungen für dieses Phänomenzutage.

Zum einen kann NO bestimmte Antibiotika,wie z. B. Acriflavin, gezielt durch chemischeReaktion (Nitrosylierung) inaktivieren. Zumanderen stellt NO Teil eines bakteriellenSignalwegs dar, der Zellen vor reaktivenSauerstoffspezies (ROS) schützt. Antibiotika,deren Wirkung zumindest teilweise auf derBildung von ROS beruht (unter anderem Ami-picillin), werden so abgeschwächt.

Die Fähigkeit zur NO-Produktion erlaubtBakterien darüber hinaus, den Lebensraum mitAntibiotika-produzierenden Artgenossen zuteilen und so bestimmte ökologische Nischenzu erschließen. Da auch Problemkeime wieBacillus anthracis und Staphylococcus aureusdas entsprechende Gen besitzen, schlagen

Vom Teufelszeug zum Heilbringer: Bakterien sagen ja zu NO

die Autoren vor, die bakterielle Stickstoff-monoxid-Synthasen als neue Zielstrukturen fürdie Antibiotika-Entwicklung ins Visier zunehmen.Y Im Menschen spielt der Botenstoff NO einewichtige physiologische Rolle. Als Wirkstoff-target würde sich bNOS daher wohl nur eig-nen, wenn potenzielle bNOS-Hemmer die huma-nen NOS-Enzyme nicht zu stark in deren Funk-tion beeinträchtigen. Da auch Immunzellen NOproduzieren und erfolgreich (in Kombinationmit ROS) zur Bekämpfung von Bakterien ein-setzen, stellt sich zudem die Frage, ob bakte-riell gebildetes NO seinen Produzenten unterbestimmten Umständen nicht auch gefährlichwerden kann. Auf diesem Gebiet ist mit weite-ren Untersuchungen zu rechnen.

Christoph Schmitt ó


757


Christoph Schmitt3 Kathrin Riedel4 Sven Krappmann5 Christian Stigloher6 Kurz gefasstó Venters MischwesenWissenschaftler um Craig Venterübertrugen das komplette Erbgut desBakteriums Mycoplasma mycoidesin seinen Verwandten Mycoplasmacapricolum (Lartigue C et al., Scien-ce (2009) 5948:1693–1696). Aller-dings mussten die Wissenschaftlerdas Erbgut erst in einer Hefezelle mitdem passenden Methylgruppenmus-ter versehen und in M. capricolum dasGen für das Restriktionsenzym inak-tivieren. Nun wollen die ForscherGenome für spezifische Aufgabenmaßschneidern und diese in Bakte-rien integrieren.

Anja Störiko

ó Grüner Tee gegen Blasen-

krebs?Eine Vielzahl von Studien berichtenin letzter Zeit über antikanzerogeneEigenschaften von Catechinen in grü-nem Tee bei verschiedenen Maligno-men. Allerdings sind der Wirkmecha-nismus und die Dosisabhängigkeitnicht eindeutig geklärt. B. J. Philips etal. (Biomed Res (2009) 30:207–215)konnten zeigen, dass es bei humanenBlasenkarzinomzellen unter Einflussvon Catechinen im Vergleich zu nor-malen Urothelzellen zu einer dosis-abhängigen Verstärkung der mRNA-vermittelten Suppression von Wachs-tumsfaktoren kommt und hierübereine Wachstumshemmung erreichtwerden kann. Diese Daten liefernerste Hinweise für einen klinischenEinsatz von grünem Tee in der Thera-pie des Harnblasenkarzinoms.

Georgios Gakis

ó Abbau von Alkanen durch

BakterienDie Verunreinigung von Böden undGewässern mit Rohöl stellt auch heu-te noch ein wichtiges Problem dar.Eine Hauptfraktion von Rohöl sindAlkane. Da Alkane zum Beispiel auchin Pflanzenmaterial in größeren Men-gen vorkommen und während desStreuabbaus freigesetzt werden,haben sich im Lauf der Evolution eineganze Reihe natürlich vorkommendermikrobieller Gemeinschaften entwi-ckelt, die Alkane über unterschiedli-che Transformationskaskaden sowohlunter aeroben wie anaeroeben Bedin-gungen abbauen können. In einemÜbersichtsartikel stellt F. Rojo dieseunterschiedlichen Strategien undderen Regulation in unterschiedlichenHabitaten im Boden vor (EnvironMicrobiol (2009) 11:2477–2490).

Michael Schloter

Aktive menschliche Zentromer-Regionen

sind aus α-Satelliten-DNA aufgebaut, die

aus Einheiten von ∼171 bp bestehen und

Wiederholungseinheiten höherer Ordnung

bilden. Sie sind umgeben von weniger

homogenen „monomeren“ αα-Satelliten

und oft durch Transposon-Insertionen

unterbrochen. Das hohe Maß an Identität

und die große Kopienzahl der zentralen

homogenen Region wird vermutlich durch

einen aktiven Prozess aufrechterhalten,

der im Wesentlichen durch verschiedene

Rekombinationsmechanismen angetrie-

ben wird. Valery Shepelev und seine Kolle-

gen aus Moskau (Shepelev VA et al., PLoS

Genet (2009) DOI:10.1371/journal.pgen.

1000641) untersuchten nun die Hypothe-

se, dass die weiter außen liegenden Berei-

che der Zentromerregionen evolutionär

ältere Bereiche sind, die ihre frühere Zen-

tromer-Funktion verloren haben und des-

halb nicht mehr aktiv homogen erhalten

werden.

ó Das Ausmaß der Sequenzunterschiede zwi-schen verschiedenen Primaten sollte deshalbals Maß der evolutionären Entfernung genutztwerden können. Die Autoren haben diese

Hypothese an den Zentromer-Regionen derChromosomen 8, 17 und X getestet und zei-gen, dass die Struktur der Zentromeren nichtnur die evolutionäre Linie zu den Vorläufernlebender Primaten widerspiegelt, sondern auchRückschlüsse auf ausgestorbene Vorläuferzulässt. Interessanterweise ergibt eine ge-nauere Analyse, dass die Evolution dabei inWellen abgelaufen ist: Nach dem Abschaltenhat ein vormals aktives Zentromer zunächsteine Phase von unerwarteter Hypermutabilitätdurchlaufen. Der schichtartige Aufbau der Zen-tromeren legt nahe, dass neue Varianten vonSatelliten-Wiederholungen periodisch expan-dierten; jede Welle betraf dabei alle oder vieleChromosomen und entspricht einer neuenPrimatenart.Y Wenn sich die Hypothese der Moskauer Kol-legen auch bei der Analyse weiterer Zentromer-Regionen von Primaten bestätigt, steht damit eininteressantes neues Instrument zur Untersuchungder menschlichen Evolution zur Verfügung.Außerdem kann diese Hypothese einen Beitragzur Frage der Artbildung leisten, weil sie erklärt,dass Individuen mit unterschiedlichen Zentro-meren nicht mehr in der Lage sind, gemeinsameNachkommen zu haben. Jochen Graw ó

Zentromer-Regionen in Primaten – neue Möglichkeitzur Untersuchung der menschlichen Evolution

Zur gleichen Zeit, wie der Alarmwert des

Prostatakrebs-Fürsorgetests mittels PSA-

Antigen statistisch hochgradig angezwei-

felt wird, melden A. Sreekumar et al. von

der Michigan Medical School in Ann Arbor

einen neuen Sprung zum Ziel eines ver-

lässlichen Warnsignals über das Vorhan-

densein von Malignomen in der Prostata

an – diesmal durch Metabolomics von

626 Metaboliten (Nature (2009) 457:910–

914).

ó Sie zielen auf Metabolite von Sarkosin, eindurch eine (S-Adenosylmethionin)-N-Methyl-transferase gebildetes N-Methylglycin, dasZellen beweglich macht und dadurch normaleZellen in invasive umwandelt. Damit hoffen sie,

die wirklich aggressiven Prostatakarzinomedurch einen Urintest frühzeitig entdecken zukönnen, ohne vorzeitig blinden Alarm aus-zulösen.Y Das zweite grundsätzlich Interessante –durch die sich immer stärker entwickelnde Kom-merzialisierung von Spezial-Diagnosemethodengestützt – an diesem neuen Vorgehen ist, dass esnicht auf einen Stoff gerichtet ist, sondern auf dieSkala einer ganzen Klasse von Metaboliten,deren Spektrum sich in Blut und Urin ändert.Sarkosin ist auch eine Substanz, die Fliegen-maden ausscheiden. Ihr wird die Heilwirkungvon Maden-Infektionen bei offenen Wundendurch Aktivierung von leukozytären Fresszellenzugeschrieben. Lothar Jaenicke ó

Metabolomics – Test auf Prostatakrebs?


758 WISSENSCHAFT · JOURNAL CLUB


ÿ Spiegelkarpfen und Spiegel-Zebrafische – molekulare und evolutionsbiologische Prozesse derSchuppenbildung

ÿ Neutrophilen-Navigation – grob und fein

Nicolas Rohner und Kollegen haben auf

der Suche nach Veränderungen der

Erscheinungsform der Schuppen eine

Zebrafisch-Mutante isoliert, die nicht nur

in der Veränderung des Schuppen-Phäno-

typs, sondern bis hin zum dafür verant-

wortlichen Gen dem Spiegelkarpfen ent-

spricht (Curr Biol (2009) 19:1642–1647).

ó Spiegelkarpfen zeichnen sich durch einestarke Verringerung der Schuppenanzahl aus,wodurch sie sich besser für die Speisevor-bereitung eignen. Die entwicklungsbiolo-gischen Veränderungen, die dazu führen, warenbisher auf molekularer Ebene weitgehendunbekannt. Nun hat eine Tübinger For-schungsgruppe zusammen mit mehreren Part-nern das kausale mutierte Gen für den Spie-

gelkarpfen-Phänotyp identifiziert. Dafür ver-wendeten sie als Modellorganismus den Zebra-fisch Danio rerio. In einem Mutagenese-Experiment, bei dem sie gezielt nach Defek-ten der Schuppenbildung in erwachsenenZebrafischen suchten, isolierten sie diespiegeldanio-Mutante. Durch genetisches Map-ping konnten sie den fibroblast growth factorreceptor 1 (fgfr1) als das den Schuppenphä-notyp induzierende Gen isolieren. Genauerbetrachtet ist jedoch nur das fgfr1a-Paralogbetroffen, während das zweite Paralog fgfr1bintakt ist. Diese beiden Paraloge sind wahr-scheinlich durch Duplikation entstanden, undihre Rollen im Organismus wurden im Lauf derEvolution in einem Subfunktionalisierungs-Prozess aufgeteilt. Da fgfr1 auch eine ent-

Spiegelkarpfen und Spiegel-Zebrafische – molekulare und evolutions-biologische Prozesse der Schuppenbildung

scheidende Funktion in der embryonalen Ent-wicklung spielt, wurde durch diese Duplika-tion und Rollenteilung eine Modifikation desadulten Schuppenphänotyps erst möglich, wasbei nur einem fgfr1-Gen wahrscheinlich zueinem frühen letalen Phänotyp geführt hätte.In ähnlicher Weise existieren beim Karpfenmehrere Paraloge des fgfr1-Gens, was wie-derum erst die Zucht von Spiegelkarpfenermöglichte.Y Diese Arbeit zeigt sehr elegant, wie wir mitModellorganismen nicht nur entwicklungsbio-logische Prozesse bis hin zur molekularen Ebe-ne analysieren können, sondern auch Zugangzu einem besseren Verständnis der damit engverbundenen Prozesse der Evolution erlangen.

Christian Stigloher ó

Die beweglichen Neutrophilen kreisen im

Blut, suchen scharf gerichtet und zerstö-

ren alle eingedrungenen Fremdkeime.

Dazu haben sie ein ausgeklügeltes Che-

morezeptorsystem für die vom Eindring-

ling abgegebenen Stoffe. Es löst einen

Sturzbach von Signalen aus, der den Neu-

trophilen rasch zum Ziel bringt. A. Nishiki-

mi et al. (Science (2009) 324:384–387)

zeigen, dass dies auf dem intrazellulären

Richtstrahlsystem durch die zwei Phos-

pholipide der Rac/Rho-Familie der klei-

nen Guanylat(GTP)-Bindeproteine (GTP-

asen), Phosphoinositol-3,4,5-triphosphat

(PIP3) und Phosphatidsäure (PA), beruht.

ó Dies bewirkt rasche Umorganisation undPolymerisierug der Aktinmoleküle innerhalbdes Zytoplasmas. Dadurch wird am Vorderpoldie Membran zu Pseudopodien gerafft und

gestreckt, die Zelle bewegt sich. Eine Haupt-funktion hat dabei der atypische Guanylat-Aus-tauschfaktor DOCK2, der eine Rho-GTPaseohne Signalmotiv ist, stattdessen aber eineHomologieregion-2 (DHR-2) benutzt, um dieZiel-GTPase zu aktivieren. Um die Rho-GTPaseörtlich richtig zu aktivieren, sind sowohl DHR-1als auch DHR-2 nötig.

DOCK-Moleküle haben stets etwas mitZellpolarität zu tun, z. B. bei Myoblasten,Phagozyten, Apoptose. Alle DOCK-Proteinebinden PIP3 (das auf dem üblichen Weg, ver-mutlich durch positive Rückkopplung, raschals Antwort auf den chemotaktischen Reizerzeugt wird und sich am Ort des stärkstenReizes anhäuft), und zwar an die DHR-1-Regionan ein polybasisches Feld nahe dem C-Ende.Dadurch sammelt sich dort DOCK2 undaktiviert Rac. Wenn diese Proteine plangerecht

Neutrophilen-Navigation – grob und fein

zusammenwirken, akkumulieren die DOCK-Proteine am Empfangsende des Neutrophilen.Es wird somit zum Geschäftsende, zunächstohne die sphärische Form des Areals zu ändernund den Chemorezeptor zur Fremdzelle aus-zurichten. Wenn dann aber PA aus der Phos-pholipase D-Hydrolyse des Membranphos-phatidylcholins hinzutritt, steifen sich dieDOCK2-Moleküle aus, sodass der Chemo-rezeptor nun in Richtung des Ziels weist. Folg-lich treibt sich die rasch kreisende Fresszelledorthin.Y Mit dieser Zweistufen-Navigation – erst grobdurch PIP3, dann fein durch PA – richtet sichdas Pseudopodium exakt in Richtung Ziel, dasihm bei seiner relativen Geschwindigkeit nunnicht mehr entkommen kann.

Lothar Jaenicke ó


Bakterielle Kommunikationssysteme

(quorum sensing, QS) koordinieren die

Expression bestimmter Gene in Abhängig-

keit von der Zelldichte; dabei prägen sich

bestimmte bakterielle Eigenschaften nur

dann aus, wenn eine genügend große Zell-

zahl vorhanden ist. Bisher ging man

davon aus, dass QS das Verhalten aller

Mitglieder einer mikrobiellen Gemein-

schaft gleichermaßen synchronisiert.

ó Das marine Bakterium Vibrio harveyi ver-fügt über ein Zwei-Komponenten-QS-System,das verschiedene Verhaltensweisen (darunterBiolumineszenz) mittels einer Phosphorylie-rungs-kaskade, die durch mehrere Signal-moleküle gesteuert wird, reguliert. C. Anetz-berger et al. (Mol Microbiol (2009) 73:267–277) haben das Verhalten einzelner Zelleninnerhalb einer QS-aktivierten Populationuntersucht und fanden heraus, dass der Anteillumineszenter Zellen bei lediglich 60 bis70 Prozent liegt. Die Zugabe artifizieller Sig-

nalmoleküle erhöhte den Anteil lumineszenterZellen dagegen auf 98 Prozent; offensichtlichproduziert V. harveyi weniger Signalmoleküle,als zur Sättigung des Systems benötigt wer-den. Interessanterweise bilden sowohl eineQS-defiziente Mutante als auch eine Mutante,die über ein konstitutiv aktiviertes QS-Systemverfügt, deutlich weniger Biofilm als derWildtyp. So konnte erstmals gezeigt werden,dass QS die Biofilm-Bildung in V. harveyipositiv reguliert und dass Zellen, die Dank ihrergeringen Lumineszenz Energie einsparen, einengrößeren Beitrag zur Biofilm-Bildung leistenals Zellen, deren QS-System vollständiginduziert ist.Y Die Erkenntnis, dass QS-gesteuerte bakte-rielle Populationen nicht etwa gleichgeschal-tet sind, sondern eine erhebliche Heterogenitätaufweisen, verändert unsere bisherige Vorstel-lung von QS als uniformem Regulationssystemgrundlegend.

Kathrin Riedel ó

Bakterielle Kommunikation: Arbeitsteilung stattGleichschaltung

No man is an island. Dass diese geistrei-

che Erkenntnis nicht nur auf Forscher,

sondern auch auf Mikroorganismen zu-

trifft, verdeutlicht eine Veröffentlichung

über den Einfluss eines Actinomyceten

auf die Sekundärmetabolit-Produktion

des Gießkannenschimmels Aspergillus

nidulans.

ó Schimmelpilze sind als Produzenten einerVielzahl biologisch aktiver Naturstoffe bekannt.Diese werden oft im Sekundärmetabolismuserzeugt; meist sind jedoch die Substanzen, dieein filamentöser Pilz herstellen kann, derenchemische Strukturen oder deren Biosyn-thesebedingungen nur unzureichend er-forscht. Einem Jenaer Forscherteam um AxelBrakhage und Christian Hertweck vom Hans-Knöll-Institut ist es nun gelungen, die Biosyn-these eines simplen phenolischen Polyketidsim Modellorganismus Aspergillus nidulans wäh-rend der Kokultivierung mit einem boden-

bewohnenden Streptomyceten aufzuklären(Schroeckh V et al., Proc Natl Acad Sci USA(2009) 106:14558–14563). Nach Expres-sionsanalysen stellte sich heraus, dass nur imdirekten Kontakt von A. nidulans mit einemS. hygroscopicus-Stamm die Biosynthese vonOrsellinsäure und ihren Derivaten stattfindet.Die Analyse des hierfür verantwortlichenGenclusters ermöglichte darüber hinaus dieModellierung des bislang unbekannten Bio-synthesewegs.Y Die Autoren zeigen eindrucksvoll, wie sichmithilfe postgenomischer Methoden und engerZusammenarbeit bislang unentdeckte Synthe-seleistungen eines Schimmelpilzes aufklärenlassen. Darüber hinaus unterstreicht der expe-rimentelle Ansatz, wie wichtig es ist, die Wech-selwirkungen von Mikroorganismen in ihremnatürlichen Kontext zu berücksichtigen, um soauch Auswirkungen mikrobieller Kommuni-kation zu erfassen. Sven Krappmann ó

Bodenständige Intimitäten – Streptomyces-induzierte Wirkstoffsynthese in Aspergillus

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May 26 -- 29, 2010Halle (Saale), Germany

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SET_09-0310_Anz-56x297mm-Rahmen.indd 1 22.10.2009 13:02:06 Uhr


ÿ Bakterielle Kommunikation: Arbeitsteilung statt Gleichschaltungÿ Bodenständige Intimitäten – Streptomyces-induzierte

Wirkstoffsynthese in Aspergillus


760 WISSENSCHAFT · AKTUELL


ÿ Ein SNP im Intron des Tnni3k-Gens von Mäusen bewirkt dramatische Unterschiede der Überlebensrateÿ Serotonin vermittelt die Wirkung von Leptin auf den Appetit und die Knochenÿ Bakterielle Sonnenkollektoren: Nanoröhrchen aus Bakteriochlorophyll

Gen in den Schlagzeilen

Herzversagen: Ein SNP im Intron des Tnni3k-Gens von Mäusen bewirktdramatische Unterschiede der Überlebensrate

ó Herzversagen ist ein häufiges Ergebnis aku-ter und chronischer Herzerkrankungen; derVerlauf ist variabel, allerdings oft mit tödlichemAusgang. Ein bekanntes Modell für Herzer-krankungen ist eine transgene Maus mit derÜberexpression von Calsequestrin (Gensym-bol Csq); die Mäuse bilden viele Erschei-nungsformen menschlicher Herzerkrankungenab. Ferrin Wheeler und ihre Kolleginnen undKollegen von der Duke Universität in Durham(North Carolina, USA) (PLoS Genet (2009)DOI: 10.1371/journal.pgen.1000647) beob-achteten allerdings deutliche stammspezifi-sche Unterschiede in Bezug auf den Verlaufvon Herzerkrankungen bei Csq-Mäusen. Sozeigen Mutanten auf dem Hintergrund desStammes C57BL/6 häufig einen fatalen Krank-heitsverlauf, wohingegen Mäuse auf demDBA/2J-Hintergrund eher einen milden Ver-lauf aufweisen. Der entsprechende modifizie-rende Locus befindet sich auf dem Chromo-

som 3, und nach detaillierten Haplotyp-Ver-gleichen haben die Autoren einen Polymor-phismus (rs49812611) im Intron 19 des Tnni3k-Gens (cardiac Troponin I-interacting kinase) alsUrsache identifiziert. Dieser A/G-Polymor-phismus befindet sich 9 bp unterhalb desExons 19; das G-Allel bewirkt ein alternativesSpleißen, das zu vier zusätzlichen Basen imTranskript führt (auf Proteinebene bedeutetdas eine zusätzliche Aminosäure und dannsofort ein Stopp-Codon). Dieses alternative

Transkript repräsentiert bei DBA/2J-Mäusen(und den verwandten Stämmen A/J, C3H/HeJund BALB/c) etwa 70 Prozent der Tnni3k-mRNA und wird bei C57BL/6-Mäusen ebensowenig beobachtet wie in den verwandten Stäm-men AKR, 129 und MRL. Das alternative Trans-kript ist allerdings instabil und wird abgebaut,sodass die DBA/2J-Mäuse insgesamt deutlichweniger Tnni3k-mRNA aufweisen.Y Die Variabilität des Tnni3k-Gens der Maushat bei Wildtyp-Mäusen keinen Einfluss aufden Verlauf von Herzerkrankungen. Erst dieÜberexpression von Csq führt bei Mäusen miteiner hohen Tnni3k-Transkriptkonzentrationzu einem fatalen Verlauf von Herzerkrankun-gen, wohingegen Mäuse mit niedrigen Tnni3k-Transkriptkonzentrationen einen leichten Ver-lauf zeigen. Die Arbeit ist ein exzellentes Bei-spiel für die Analyse von Genen, die einenKrankheitsverlauf modifizieren können.

Jochen Graw, Neuherberg ó

ó Leptin ist ein Peptidhormon, das vor allemim Fettgewebe gebildet wird und im zentralenNervensystem das Hungerfühl hemmt und denFettstoffwechsel reguliert. Die initiale Hoff-nung, dass der Eingriff in die Leptin-Signal-transduktion zu appetitzügelnden Arzneistoffenführt, hat sich bisher nicht verwirklicht. Dasmag zu einem Teil daran liegen, dass die viel-fältigen biologischen Wirkungen von Leptinnoch immer nicht exakt entschlüsselt sind.Yadav und Koautoren zeigen nun in eineraktuellen Publikation (Cell (2009) 138:976–989), wie Leptin im Zentralnervensystem denAppetit und die Knochendichte reguliert (Abb.).

Leptin hemmt die elektrische Aktivität vonserotoninergen Neuronen in den Raphekernendes Hirnstamms. Diese Serotonin-Neuroneinnervieren im Hypothalamus zwei verschie-dene Kerngebiete, die über unterschiedliche

Rezeptoren den Appetit und den Knochen-stoffwechsel modulieren. Serotonin 5-HT2c-Rezeptoren aktivieren den Sympathikus, derüber β2-adrenerge Rezeptoren in Osteoblas-ten den Knochenanbau hemmt. Auf der ande-ren Seite reduzieren 5-HT1a/2b-Rezeptoren imHypothalamus das Appetitgefühl und bremsenso die Nahrungsaufnahme.Y Die Ergebnisse belegen eindrücklich denZusammenhang zwischen Leptin, Serotoninund der gemeinsamen Steuerung des Energie-und Knochenstoffwechsels. Auf diesem Wegewird auch plausibel, wie die selektiven Seroto-nin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI), die alsAntidepressiva eingesetzt werden, als „Neben-wirkung“ den Appetit und das Körpergewichtsteigern. Die verwendeten Modelle könntenauch helfen zu klären, wie SSRIs die Kno-chendichte beeinflussen. In klinischen Studien

wurde eine erhöhte Knochenbruchrate nachEinnahme von SSRIs berichtet. Es ist bemer-kenswert, wie präzise das ZNS in die Steuerungdes Energie- und Knochenstoffwechsels ein-greift.

Lutz Hein, Freiburg ó

Arzneimittel in den Schlagzeilen

Serotonin vermittelt die Wirkung von Leptin auf den Appetit und die Knochen

Herzmuskel undhistologische Schnitte


ó Grüne Schwefelbakterien machen,was Ingenieure erträumen: Mit ihrenungewöhnlichen Photosynthesekomple-xen, den Chlorosomen, fügen sie Bakte-riochlorophyll (BChl) zur leistungsfähig-sten Lichtsammelstruktur zusammen.Ein einzelnes Chlorosom enthält bis zu250.000 Moleküle BChl c, d und e, diesich ohne Beteiligung von Proteinen intubuläre Strukturen (rods) organisieren.Diese Heterogenität verhinderte bisherdie Strukturbestimmung. Nun wurdedurch Kombination von Kryo-Elektro-nenmikroskopie, Festkörper-NMR undModellrechnungen aufgeklärt, wie Chlo-rophyll in einer Mutante von Chloroba-culum tepidum mit homogener BChl-Aus-stattung angeordnet ist (S. Ganapathyet al., Proc Natl Acad Sci USA 106 (2009)8525–8530). Die Moleküle liegen alter-nierend in syn- und anti-Orientierung vorund winden sich zu Ringen, die etwa150 nm lange Nanoröhrchen bilden. IhrDurchmesser ist variabel (10–50 nm)und sie schachteln sich konzentrischineinander (Abb.). Die unterschiedlichenBChl-Seitenketten im Wildtyp bewirkeneine Umorientierung der syn-anti-Stapel.Sie sind nicht mehr senkrecht, sondernparallel zur Röhrchenachse ausgerich-tet. Es ergeben sich helikale BChl-Strän-ge, die den Zylindermantel umlaufen; bis-herige Vorstellungen gingen von plana-ren BChl-Schichten aus. Die natürlichzusammengesetzen BChl-Nanoröhrenarbeiten effizient, denn sie überspanneneinen großen Spektralbereich.Y Die Aufklärung der Kernstruktur derChlorosomen fasziniert in mehrfacherHinsicht: Der Aufbau des Antennen-komplexes der Chlorobiaceae war eineder unbezwungenen Bastionen der Photo-synthesesysteme; der Komplex ist die sen-sitivste natürliche Lichtsammelstrukturmit der höchsten BChl-Dichte, derenMechanismus nun untersucht werden

kann; er unterscheidet sich fundamen-tal von analogen Systemen, denn er ent-steht selbstorganisiert, beteiligt keineGerüstproteine und ist wegen dieserEigenschaften technisch reizvoll. Dienächsten Herausforderungen liegen inder Aufklärung des Energietranfers aufdas Reaktionszentrum und des moleku-laren Aufbaus der Chlorosomen. Natür-lich beflügelt die Entdeckung biotechno-logische Visionen. So würde man mit demChlorobiensystem nur einen Bruchteilder Anbaufläche von Energie-Nutz-pflanzen benötigen. Allerdings sind diegrünen Schwefelbakterien dafür unge-eignet, solange sie Sulfid oxidieren undSulfat ausscheiden.

Harald Engelhardt, Martinsried ó

Mikroorganismus in den Schlagzeilen

Bakterielle Sonnenkollektoren:Nanoröhrchen aus Bakteriochlorophyll


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