На правах рукописи

КАРАМЫШЕВ Алексей Владимирович

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПОЛИАНИЛИНА, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ОКСИДОРЕДУКТАЗАМИ

02.00.15 - катализ

03.00.23 - биотехнология

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание учёной степени

кандидата химических наук

Москва – 2007

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета

Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

ведущий научный сотрудник, доктор химических наук,

профессор

Сахаров Иван Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

Ямсков Игорь Александрович

доктор химических наук

Сергеев Владимир Глебович

Ведущая организация:

Институт Молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится « 29 » мая 2007 года в 1600 час на заседании диссертационного

совета Д501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете

им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1 стр.11, МГУ,

Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени

М.В.Ломоносова

Автореферат разослан апреля 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук И.К. Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В 2000-м году Нобелевская премия по химии была присуждена

исследователям Хидеки Сиракава (Hideki Shirakawa, Япония), Алану МакДиамиду (Alan G. McDiarmid, США) и Алану Хигеру (Alan J. Heeger, США) за “открытие и развитие области электронопроводимых полимеров’. Электропроводящие полимеры образовали новый класс “синтетических металлов”, обладая исключительными свойствами в сравнении с низкомолекулярными полупроводниками. На настоящий момент они нашли широкое применение в различных областях науки и техники от микроэлектроники (батареи, оптические мониторы) до аналитической практики (сенсоры). Полианилин привлекает наибольшее внимание благодаря своей высокой стабильности и хорошим проводящим характеристикам. Более того, в присутствии хирального индуктора (например, энантиомеров камфорсульфоновой кислоты) он способен образовывать оптически активные вторичные структуры, что может позволить существенно расширить область применения этого полимера, в частности в качестве селектора для разделения оптически активных соединений. К сожалению, основные способы получения (химический и электрохимический) полианилина обладают определенными недостатками, что вызывает необходимость в разработке альтернативных подходов.

В последние годы появляется все больше работ, посвященных ферментативной полимеризации, как альтернативному способу получения полимеров. Ранее была показана принципиальная возможность проведения ферментативной полимеризации анилина с образованием электропроводящих полиэлектролитных комплексов на основе полианилина при использовании пероксидазы хрена как биокатализатора. Однако, как оказалось, в условиях, необходимых для синтеза (кислая среда), этот ферментный препарат быстро теряет свою активность. Таким образом, становятся понятным актуальность диссертационной работы, посвященной ферментативному синтезу полианилина, катализируемого кислотостабильными оксидоредуктазами. Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы явился поиск высокоактивных и кислотостабильных оксидоредуктаз, способных в экологически чистых условиях эффективного катализировать полимеризацию анилина с образованием электропроводящего и оптически активного полианилина.

Основными задачами настоящей работы являлись: Исследование возможности использования лакказы Coriolus hirsitus и

пероксидазы из листьев Королевской пальмы в качестве биокатализаторов для проведения ферментативного синтеза полианилина

Оптимизация методик ферментативного синтеза проводящих полиэлектролитных комплексов полианилина с сульфополистиролом и поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропан)сульфокислота

Изучение ферментативного синтеза хирального полианилина, катализируемого пероксидазой пальмы, на мицеллах додецилбензолсульфоновой кислоты

Определение физико-химических свойств и структуры полианилина, полученного ферментативным путем.

Научная новизна работы и практическая значимость работы.

Впервые проведен ферментативный синтез полиэлектролитных комплексов на основе полианилина с использованием двух кислотостабильных оксидоредуктаз – лакказы Coriolus hirsitus и пероксидазы из листьев Королевской. Показано, что в процессе реакции образуется проводящий полианилин с улучшенными характеристиками в экологически чистых условиях. Впервые проведен ферментативный синтез хирального полианилина на мицеллах додецалбензолсульфоновой кислоты, катализируемый пероксидазой пальмы. Показано, что хиральный полианилин может образовываться в отсутствие хирального индуктора (энантиомера камфорсульфоновой кислоты) при ферментативной полимеризации анилина. Изучена морфология ферментативно синтезированного хирального полианилина, представляющего из себя пористые рисоподобные частицы длиной порядка 180нм. Апробация работы.

Основные результаты работы представлены на международных конференциях: “Биокатализ-2002” (Москва, Россия, 2002), Конференция молодых ученых, аспирантов и стипендиатов фонда им. И.В. Березина “Инженерная энзимология” (Москва, Россия, 2002-2003), “Биотехнология: состояние и перспективы развития”, (Москва, Россия, 2002, 2003 и 2007), “1 European Chemistry Congress, Polymer architecture – from structure to functional control” (Будапешт, Венгрия, 2006) и EUROBIC8 (Авейро, Португалия, 2006). Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 5 тезисов докладов на международных конференциях.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 95 ссылок. Работа изложена на страницах 105 и включает в себя 38 рисунков и 6 таблиц Сокращения, принятые в тексте.

ПАНИ – полианилин, ПП - пероксидаза из листьев Королевской пальмы, СПС – сульфополистирол, ПАМПС - поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропан)сульфокислота, ДБСК – додецилбензолсульфо-кислота, КСК – камфорсульфоновая кислота.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. Ферментативный метод синтеза полиэлектролитных комплексов электропроводящего полианилина, используя грибную лакказу и

пероксидазу пальмы в качестве биокатализаторов.

Так как для образования полиэлектролитного комплекса ПАНИ с анионной полимерной матрицей синтез ПАНИ необходимо проводить при рН ниже рКа аминогруппы анилина (4.6), стабильность фермента в кислых условиях являлась обязательной. На рис. 1 представлены рН зависимости стабильности пяти различных пероксидаз растений. Видно, что при кислых рН наиболее стабильной является пероксидаза, выделеная из листьев Королевской пальмы. Поэтому в качестве одного из используемых биокатализаторов ферментативной полимеризации анилина нами был выбран этот фермент. Другим ферментом, исользованным нами в синтезе ПАНИ, была кислотостабильная лакказа Coriolus hirsitus.

pH2 3 4 5 6 7 8

активность

, %

0

20

40

60

80

100

из бобов соииз корней хренаиз арахиса, катионная изоформаиз арахиса,анионная изоформаиз листьев пальмы

Рис. 1: рН-стабильность растительных пероксидаз

В качестве полимерных матриц для синтеза полиэлектролитных комплексов электропроводящего ПАНИ использовались СПС и ПАМПС. Преимущество использования СПС и ПАМПС заключается прежде в том, что ситезитующийся полианилин, взаимодействуя с такими полимерами, образует стабильные дисперсные растворы полиэлектролитных комплексов, тем самым препятствуя агрегации полианилиновых молекул и выпадению их в осадок. Кроме того, сульфосодержащие матрицы способствуют ориентации молекул анилина таким образом, чтобы полимеризация анилина проходила по

механизму «голова – хвост» с образованием линейных молекул полианилина. Более того, сульфогруппы, содержащиеся в СПС и ПАМПС, допируют образующийся полианилин, делая его электропроводящим.

Для оптимизации условий ферментативного синтеза полианилина были проварьированны кислотность среды и концентрации реагирующих веществ.

На рис. 2 представлена рН-зависимость реакции ферментативной полимеризации анилина, катализируемая ПП. рН-зависимость имеет колоколообразный вид, а оптимальное значение рН

pH2,5 3,0 3,5 4,0 4,5

А40

0нм

0,3

0,6

0,9

Рис. 2: рН зависимость реакции ферментативного синтеза полиэлектролитного комплекса ПАНИ/ПАМПС, катализи-руемого ПП

в этом случае равно 3,5. Аналогичный характер носила и рН-зависимость ферментативной полимеризации анилина, катализируемой лакказой, только в этом случае рН-оптимум лежал при рН 3,5 – 3,7.

Зависимости концентрации анилина на скорость ферментативного синтеза ПАНИ для двух оксидоредуктаз несколько отличались (рис. 3). Так, при повышении концентрации анилина до 75 мМ в реакции, катализируемой лакказой, наблюдается повышение скорости реакции. Дальнейшее же увеличение концентрации анилина приводило к падению скорости реакции, что, по-видимому, было вызвано субстратным ингибированием лакказы. Если же в качестве биокатализатора использовалась ПП, то эффекта ингибирования фермента анилином не наблюдалосься во всем интервале исследуемых концентраций, и скорость реакции ферментативного синтеза ПАНИ увеличивается с увеличением концентрации анилина, что позволяет использовать ПП с максимальной эффективностью.

[анилин], мМ15 30 50 75 100 125

А40

0нм

10

20

30

40

Рис. 3: Влияние концентрации анилина на фермента-тивный синтез ПАНИ, катализируемый лакказой (чер-ные кружки) и ПП (белые кружки).

С увеличением концентрации полимерной матрицы происходило снижение скорости ферментативной полимеризации, катализируемой как ПП, так и лакказой (рис. 4). Это, вероятно, объясняется связыванием анилина с СПС и уменьшением концентрации свободного анилина в реакционной среде, который может участвовать в каталитическом цикле ферментов. Необходимо также отметить, что существенным является не просто концентрация матрицы в растворе, а соотношение концентраций

анилина и мономерного звена полимерной матрицы. Так, если это соотношение было меньше 1:1, то образывались стабильные дисперсионные растворы полиэлектролитных комплексов ПАНИ, тогда как при соотношении выше 1:1 наблюдалось выпадение ПАНИ в осадок.

[СПС], мМ0 10 20 30 40 50 6

А40

0нм

00

10

20

30

40

50

Рис. 4: Влияние концентрации полимерной матрицы на реакцию ферментативного синтеза полиэлектро-литного комплекса ПАНИ, катализируемую лакказой

Когда в качестве биокатализатора используется ПП, то в роли окислителя выступает пероксид водорода, который, как известно, при высоких концентрациях ингибирует пероксидазу. На рис. 5 (А) представлена зависимость скорости реакции ферментативного синтеза ПАНИ, катализируемого ПП, от концентрации Н2О2. При концентрации Н2О2 ниже 0,5 мМ скорость реакции растет с увеличением концентрации Н2О2. При более высоких концентрациях окислителя скорость реакции начинает падать. Если же

для той же реакции рассматривать зависимость выхода продукта реакции от концентрации Н2О2 (рис. 5 (Б)), то выход продукта увеличивается с увеличением концентрации окислителя вплоть до 5-15 мМ и лишь при более высоких концентрациях реакция резко снижается. Обнаруженная зависимость объясниться тем, что при концентрации Н2О2 ниже 0,5 мМ реакция идет по традиционному «пинг-понг» механизму пероксидазного катализа, где промежуточными продуктами пероксидазы (Е) являются активные соединения Е1 и Е2 (сх. 1, уравнения (1) - (3)). Затем в интервале концентраций окислителя 0,5 – 15 мМ, когда скорость реакции начинает уже падает, а выход продукта еще увеличивается, происходит образование соединения Е3 (сх. 1, уравнение (4)), которое хотя и менее активно, чем Е1 и Е2, но все же окисляет анилин. И наконец при концентрациях пероксида водорода выше 15 мМ происходит образование неактивной формы пероксидазы – бердопротеина-670 (сх. 1, уравнение

(5)) и реакция прекращается.

[H2O2], мМ

0 5 10 15 20

скорость

реакц

ии, A

400/мин

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

А

[H202], мМ0 5 10 15 20

А40

0нм

0,2

0,4

0,6

Б

Рис. 5: Влияние концентрации пероксида водорода на скорость реакции (А) и выход продукта (Б) при ферментативном синтезе полиэлектролитного комп-лекса ПАНИ/СПС, катализируемом ПП

E + H2O2 → E1 + H2O (1) E1 + S → E2 + P (2) E2 + S → E + P (3) E2 + H2O2 → E3 + H2O (4) E1 + H2O2 ↔ (E1

.H2O2) → P-670 (5) Схема 1: Каталитический цикл пероксидазы и реакции ее инактивации.

На рис. 6 (А) представлена кинетика реакции полимеризации анилина,

катализируемой лакказой. Как видно, реакция продолжалась в течение 6 суток, и практически все это время фермент оставался в активном состоянии. Вместе с тем, несмотря на высокую концентрацию в системе фермента, скорость реакции оставалась невысокой, что связано с низкой концентрацией

растворенного в реакционной среде молекулярного кислорода (0,2 мМ), играющего роль окислителя при полимеризации анилина. В то же время, при ферментативном синтезе полианилина, катализируемом ПП, мы можем использовать более высокие концентрации окислителя (пероксида водорода) и, как видно из кинетической кривой этой реакции (рис. 6 (Б)), скорость процесса при этом значительно возрастает. Более того, после однократного добавления Н2О2 реакция заканчивалась спустя 10 мин, и при добавлении новой порции окислителя вновь продолжается, что говорит о сохранении ферментом своей активности и о возможности проведе-ния макси ффективного окисления анилина.

0 3 6 9 12

10

20

30

40

50

60 А

А40

0нм

t, дни

t, мин0 100 200 300 400 500

А40

0нм

10

20

30

40

50

1500

Б

Рис. 6: Кинетика ферментативного синтеза полиэлектро-литного комплекса ПАНИ/СПС, катализируемого лакка-зой (А) и ПП (Б)

мально э

Таким образом, нам удалось оптимизировать условия ферментативного синтеза полиэлектролитных комплексов ПАНИ, с использованием в качестве биокатализаторов лакказы и ПП. Результаты оптимизации представлены в табл. 1. Таблица 1. Оптимальные условия синтеза полиэлектролитных комплексов полианилина. Фермент рН Анилин, мМ СПС, мМ ПАМПС, мМ Н2О2, мМ лакказа 3.7 50 50 - - ПП 3.5 100 100 - 5 ПП 2.8 50 - 50 0.25

II. Физико-химические характеристики полиэлектролитных комплексов на основе полианилина, синтезированных с помощью

оксидоредуктаз.

После оптимизации условий ферментативного синтеза полиэлектролитных комплексов ПАНИ с помощью оксидоредуктаз нами были приготовлены образцы комплексов ПАНИ/СПС, полученные с помощью лакказы и ПП, и комплекс ПАНИ/ПАМПС, полученный в присутствии ПП.

Часто основной характеристикой ПАНИ является его электронный спектр. На рис. 7 (А) представлен типичный электронный спектр в УФ- и видимой областях для растворов ферментативно синтезированных полиэлектролитных комплексов на основе ПАНИ. Этот спектр имеет три характерных пика поглощения. Первый пик в районе длин волн 320-360 нм соответствует π-π* электронному переходу в бензоидном фрагменте ПАНИ. Второй (400-420 нм) и третий

(760-800 нм) пики характеризуют степень допирования и формирование полярона с компактной конформации цепей электропроводящего ПАНИ соответственно. Следует заметить, что первые два пика накладываются друг на друга и образуют один широкий пик, образование которого многократно было описано в литературе. Единственное различие электронных спектров полиэлектролитных комплексов ПАНИ, синтезированных разными оксидо-редуктазами, заключается в том, что длинноволновый пик в случае лакказы для ПАНИ лежал при 760 нм, в то время в случае ПП этот пик смещается к 800 нм. Это говорит о том, что при катализе ПП синтезируется более допированный ПАНИ.

500 1000 1500 2000 2500

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

300 400 500 600 700 800 900

0,05

0,10

0,15

0,20

поглощ

ение

λ, нм

поглощ

ение

λ, нм

А

Б

Рис. 7: Электронные спектры раствора (А) и пленки (Б) полиэлектролитного комплекса ПАНИ/ПАМПС, синте-зированного с помощью ПП

λ, нм

300 400 500 600 700 800 900

поглощ

ение

0,5

1,0

1,5

pH 10.1

pH 2.9

pH 9.5

pH 8.8

pH 7.5

pH 6.2pH 4.3pH 3.8pH 3.4

pH

pH

Рис. 8: Изменение спектров полиэлектролитного ком-плекса ПАНИ/СПС, синтезированного с помощью лак-казы, в зависимости от рН

При титровании полиэлектролит-ного комплекса ПАНИ соляной кислотой и гидроксидом натрия наблюдалось изменение формы спектра поглощения (рис. 8). Так, при кислых рН изменений электронного спектра

практически не наблюдалось вплоть до рН 6-8, что говорит о том, что ПАНИ находился в протонированном допированном состоянии. Как только рН среды превышает этот интервал, пики при 420 и 760 нм исчезают, и появляется новый пик поглощения при 560 нм, что заметно даже визуально, т.к. раствор становится голубого и даже фиолетового цвета вместо зеленого. Такие изменения связаны с переходом полианилина в дедопированное состояние (сх. 2).

Схема 2: Кислотное допирование ПАНИ.

Спектральные свойства полиэлектролитных комплексов ПАНИ были

изучены не только в виде дисперсионных растворов, но и в виде пленок. Электронные спектры комплексов в растворах и в высушенном состоянии не имели принципиальных различий (рис. 7). Анализируя спектры пленок в ближней ИК-области (рис. 7 (Б)) важно отметить наличие, хотя и невысокого, поглощения при длинах волн, выше 1300 нм, что в литературе трактуется как наличие делокализованных неспаренных электронов, ответственных за проводимость.

Наличие неспаренных электронов в образцах синтезированных комплексов ПАНИ было подтверждено методом ЭПР. На рис. 9 представлен типичный спектр ЭПР растворов полиэлектролитных комплексов ПАНИ независимо от используемой полимерной матрицы и используемого фермента. Значение g-фактора для комплексов полианилина составило 2.002, которое характерно для свободных электронов.

10 G

Рис. 9: ЭПР-спектр полиэлектролитного комплекса ПАНИ / СПС , синтезирован-ного с помощью ПП Электропроводимость комплексов

полианилина различается в зависимости от способа их получения. Так для комплексов ПАНИ, синтезированных с помощью лакказы, проводимость составила 0,2 мС/см. Для образцов комплексов ПАНИ, синтезированных с помощью ПП, проводимость достигала 11,2 мС/см.

Совместно с д.х.н. И.Н. Курочкиным и его сотрудниками, была изучена морфология полиэлектролитных комплексов ПАНИ/ПАМПС с помощью атомной силовой микроскопии. Как показано на рис.10 (А), «чистый» ПАМПС (контроль) абсорбируется на графитовой подложке, образуя тонкую пленку. Для полиэлектролитных комплексов ПАНИ/ПАМПС также наблюдалось образование тонких пленок ПАМПС с агрегированными молекулами полианилина (рис. 10 (Б)). Эти агрегаты полианилина локализованы на поверхности ПАМПС, не организуя при этом единую полианилиновую цепь, так как агрегаты наночастиц ПАНИ достаточно удалены друг от друга. Размер наночастиц ПАНИ зависит от исходной концентрации ПАМПС. При высоком содержании ПАМПС (при молярном соотношении ПАМПС к анилину – 1:1) размер частиц ПАНИ составил порядка 10-15 нм, а при низком содержании ПАМПС (1:10) – ~ 25 нм. Таким образом, повышение концентрации ПАМПС приводило к увеличению количества сайтов инициации образования полианилина, что приводило к образованию более мелких частиц ПАНИ, т.е изменяя концентрацию ПАМПС, можно варьировать размер образующихся частиц ПАНИ.

Наиболее яркие отличия между полиэлектролитными комплексами с различным содержанием ПАМПС были обнаружены при изучении влияния полимерной матрицы на проводимость пленок полианилина. Как видно из данных рис. 11, с увеличением содержания ПАМПС происходит снижение электропроводимости. Изменение электропроводимости комплексов ПАМПС/ПАНИ хорошо согласовывалось с данными, полученными по изучению их морфологии.

проводим

ость

, мС

/см

0

2

4

6

8

10

12

1:5 2:5 3:5[ПАМПС]/[анилин]

Рис. 11: Зависимость проводимости полиэлектролитныхкомплексов ПАНИ, синтезированных с помощью ПП, отсодержания в них полимерной матрицы

A

ПАМПС B

ПП

ПАНИ

Рис. 10: Морфология комплекса полианилин/ПАМПС, полученная с помощью атомно-силовой микроскопии. (А) – ПАМПС (контороль); (Б) – комплекс полианилин/ПАМПС, полученный ферментативно с помощью ПП при молярном соотношении концентраций мономерного звена ПАМПС к анилину 1:5.

Влияние концентрации ПАМПС в реакционной среде на проводимость синтезированных комплексов ПАНИ можно объяснить тем, что в ходе реакции, когда содержание полимерной матрицы велико, молекулы мономерного анилина равномерно распределяются на них и, тем самым, на одной молекуле ПАМПС количество сорбированных молекул анилина невысоко. Это должно приводит к тому, что при большом количестве центров инициации полимерных цепей должны формироваться короткие цепи полианилина. В случае же низкой концентрации ПАМПС в реакционной среде по тем же причинам должны формироваться более длинные цепи ПАНИ, и, следовательно, должна наблюдаться и более высокая проводимость.

III. Синтез хирального полианилина на мицеллах ДБСК,

катализируемый ПП

Для проведения ферментативного синтеза хирального полианилина в качестве матрицы были выбраны мицеллы ДБСК, способные не только ориентировать анилин с получением линейных молекул полианилина, но и допировать его. Следует отметить, что ДБСК, как и другие детергенты, может разрушать третичную нативную структуру фермента и приводить к его инактивации. Поэтому перед началом работы с ферментативным синтезом хирального полианилина было определено влияние ДБСК на активность пероксидаз. Для этого были определены константы скорости реакции второго порядка (k) для реакции окисления o-дианизидин пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой хрена (ПХ) и ПП, в присутствии ДБСК (17мМ) (табл. 2). Табл. 2: Влияние ДБСК на каталитическую активность ПХ и ПП

Оптимальные условия для катализа ПП и ПХ фермент

[ДБСК], мМ [H2O2], мM [o-дианизидин], мM

k, M-1с-1 *

ПХ - 1.43 0.12 2,9 x 106

ПП - 4.20 0.12 8,9 x 106

ПХ 17 0.72 0.4 1,6 x 106

ПП 17 1.3 0.4 2,7 x 106

Как видно из табл. 2, в отсутствие ДБСК ПП - более активный

биокатализатор по сравнению с ПХ. Введение в реакционную смесь ДБСК частично инактивирует обе пероксидазы, приводя к 2-3-х кратному снижению

каталитической активности обоих ферментов. Эти результаты также показывают, что в присутствии ДБСК ПП проявляет такую же активность, как ПХ в отсутствие ДБСК. Полученные результаты открывают возможность использования ПП в качестве биокатализатора при синтезе хирального полианилина на мицеллах ДБСК.

В соответствии с литературными данными для образования хиральных структур ПАНИ в реакционную смесь вводились энантиомеры камфорсульфоновой кислоты (КСК) как индукторы хиральности.

Поскольку концентрации анилина, КСК и ДБСК могут существенно влиять на эффективность мицеллярного ферментативного синтеза ПАНИ, была проведена оптимизация условий синтеза. Для оптимизации использовали подход многофакторного планирования эксперимента с тремя независимыми компонентами (анилин, КСК и ДБСК), позволяющий оценить не только влияние каждого

отдельного компонента, но и их взаимное влияние. Область варьирования концентраций каждого компонента представлена в табл. 3. Таким образом, согласно теории построения многофакторного эксперимента были получены 14 образцов полианилина (табл. 4).

Рис. 12: Предположитель-ная вторичная структура хирального полианилина

Сравнение спектров кругового дихроизма (КД-спектры любезно были сняты к.ф.-м..н. Лобачевым В.М. (Институт молекулярной биологии им. Энгельгарда РАН)) полученных образцов ПАНИ показало, что хиральность полианилина в значительной степени зависит от условий синтеза. Некоторые из полученных образцов имели КД спектр в видимой области, характерный для хирального полианилина (рис. 12). В литературе предполагается, что оптическая активность полианилина обусловлена образованием спиралевидной конформации полианилиновых цепей (рис. 13). Важно подчеркнуть, что КД-спектры образцов полианилина, синтезированных в присутствии (R)-КСК и (S)-КСК, были идентичны. Это говорит о том, что в ходе ферментативной реакции образуется спиралевидный ПАНИ, закрученный в одну и ту же сторону. Подобный эффект уже был ранее описан в литературе при ферментативном синтезе полиэлектролитных комплексов хирального полианилина с СПС.

λ, нм

350 400 450 500 5500

2

4

6

8

[ θ],

градусы

/децим

оль*см

2

Рис. 13: КД-спектр хирального ПАНИ, синтезированного на мицеллах ДБСК с помощью ПП

Таблица 3: Уровни варьирования концентраций компонентов при оптимизации условий ферментативного синтеза хирального полианилина в мицеллах ДБСК в присутствии (+) КСК.

Уровни Компоненты Нижний (-1) Центр (0) Верхний (+1)

анилин, мM ( X1)

75 112.5 150

КСК, мM ( X2) 0 75 150 ДБСК, мM (

X3) 12 17 22

Таблица 4: План многофакторного эксперимента по оптимизации условий ферментативного синтеза хирального полианилина в мицеллах ДБСК в присутствии пероксидазы пальмы.

Уровни факторов Номер эксперимента X1 X2 X3

Основной эксперимент

1 -1 -1 -1

2 +1 -1 -1

3 -1 +1 -1

4 +1 +1 -1

5 -1 -1 +1

6 +1 -1 +1

7 -1 +1 +1

8 +1 +1 +1

Дополнительный эксперимент

9 -1 0 0

10 +1 0 0

11 0 -1 0

12 0 +1 0

13 0 0 -1

14 0 0 +1

Обработка результатов эксперимента с многофакторным планированием позволила получить следующую зависимость молярной эллиптичности ([θ]) ПАНИ от варьируемых параметров (с погрешностью до 15%):

[θ] = -0.1[анилин]2 - 0.01[анилин][КСК] - 0.02[КСК]2 + 0.003[КСК][ДБСК] + 5.8[ДБСК]2 +0.005[анилин][ДБСК]+ 23[анилин]+ 2.8[КСК] +193[ДБСК] – 2583

Из полученного уравнения видно, что каждый из компонентов оказывает разное влияние на формирование хиральности полианилина. Дифференцирование полученной функции по каждому из параметров и приравнивание полученных производных к нулю позволили вычислить оптимальные условия ферментативного синтеза хирального полианилина, которые оказались следующими: 125 мM анилина, 17 мM ДБСК и 47 мM КСК.

Наибольшей хиральностью обладали образцы полианилина 2, 6, 10, 11, 13 (рис. 14). В соответствии с разчитанным уравнением все высокохиральные образцы ПАНИ были синтезированы либо в отсутствие, либо в присутствии низких концентрациях КСК. Из этого следует, что введение КСК в реакцию ферментативной полимеризации анилина приводит не к увеличению хиральности, как описано для химического и электрохимического синтезов оптически активного полианилина, а к ухудшению

оптических характеристик образующегося ПАНИ. Возможно, в качестве индуктора хиральности образующегося полианилина выступали либо хиральные молекулы ПП, либо мицеллы ДБСК, структурируя на своей поверхности определенным образом полимерные цепи полианилина. Ранее образование хиральной третичной структуры на мицеллах ДБСК было описано и детально изучено на примере другого электропроводящего полимера (политиофена).

номер образца полианилина1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

сигнал

, %

0

20

40

60

80

100

Рис. 14: Зависимость молярной эллиптичности (чер-ные столбцы) и площади ЭПР-спектра (серые столб-цы) от условий ферментативного синтеза ПАНИ(согласно табл.4)

Сравнение значений площади ЭПР-спектров и молярной эллиптичности полученных образцов полианилина (рис. 14) не позволило выявить никакого соответствия между этими параметрами. Отсюда следует, что оптимальные условия для синтеза электропроводящего полианилина и хирального полианилина различны, что необходимо учитывать при синтезе полианилинов с желаемыми свойствами.

На рис. 15 представлены два вида спектров в области УФ, видимого и ближнего ИК света, которые регистрировались для полианилина, ферментативно синтезированного при варьировании концентраций компонентов реакционной смеси. Как хорошо видно, эти спектры являются

типичными для допированной формы полианилина. Все спектры имеют пик поглощения в области 400-415 нм, свидетельствующий об уровне допирования и образовании полярона полианилина. Основные различия в электронных спектрах наблюдались в длинноволновой области. Так электронные спектры для всех образцов, синтезированных при самой низкой концентрации анилина (75 мМ), имели пик поглощения в районе 800 нм и небольшое поглощение в области ближнего ИК света, что свидетельствует о формировании компактной конформации цепей ПАНИ. В противоположность этому, электронные спектры всех остальных образцов демонстрировали невысокое поглощение в районе 800 нм и значительным поглощение в области ближнего ИК. Этот факт свидетельствует о существенной делокализации электронов и формировании развернутой конформации полианилиновых цепей. Следует обратить внимание, что формирование развернутой конформации полианилина не наблюдалось при ферментативном синтезе полианилина на полимерных матрицах СПС и ПАМПС.

λ, нм

400 600 800 1000 1200

поглощ

ение

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Рис. 15: Электронные спектры образцов ПАНИ, синте-зированных на мицеллах ДБСК с помощью ПП

Морфология полученных образцов полианилина была изучена методами трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) совместно с проф. В.Ю. Поляковым (ИФХБ им. Белозерского, МГУ им. Ломоносова) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) совместно с А.Н. Катасовой (Институт геохимии и аналитической химии им. Вернадского РАН) (рис. 16). Было установлено, что все полученные образцы имели одинаковую морфологию вне зависимости от условий синтеза. На рис. 16 (А) видно, что агрегаты полианилина представляют из себя отдельные ‘рисоподобные’ частицы, размеры которых были равны 140 – 180 нм в длину и 70-100 нм в ширину. Подобные структуры уже были описаны ранее для полианилиновых агрегатов. Более того, СЭМ позволила показать, что поверхность наночастиц полианилина пористая (рис. 16 (Б))

A

Б

Рис. 16: Морфология образцов ПАНИ, полученных на мицеллах ДБСК с помощью ПП: (А) – ТЭМ, (Б) - СЭМ

ВЫВОДЫ

1. Разработан ферментативный экологически чистый метод полимеризации анилина в присутствии водорастворимого полимера (СПС и ПАМПС) для получения полиэлектролитных комплексов электропроводящего полианилина. В качестве биокатализаторов применены кислотостабильные препараты грибной лакказы (Coriolus hirsitus) и пероксидазы из листьев Королевской пальмы. Варьируя концентрации реагирующих веществ и кислотность реакционной среды, оптимизированы условия ферментативного синтеза комплексов полианилина. Исследована кинетика синтеза полианилина, катализируемого обоими ферментами. 2. Используя спектральные методы, охарактеризованы препараты ферментативно синтезированного полианилина. Показано, что электронные спектры в УФ-, видимой и ближнем ИК- областях и спектры ЭПР химически и ферментативного синтезированных комплексов полианилина практически идентичны. Найдено, что степень допированности зарегистрирована выше для препаратов полианилина, полученного при синтезе, катализируемом пероксидазой пальмы, чем при катализе лакказой. 3. Методом атомно-силовой микроскопии исследована морфология полиэлектролитных комплексов полианилина/ПАМПС. Размер наночастиц полианилина зависит от исходной концентрации полимерной матрицы: при высоком содержании ПАМПС (при молярном соотношении ПАМПС/анилин – 1:1) размер частиц составляет порядка 10-15 нм, в то время как при низком содержании ПАМПС (1:10) размер наночастиц полианилина был несколько выше (~25 нм). Показано, что с увеличением содержания ПАМПС в комплексах полианилина происходит также снижение его электропроводимости. Сравнение значений электропроводимости полиэлектролитных комплексов полианилина, полученных различными методами, показало преимущество разработанного нами пероксидазного метода синтеза. 4. Разработан и оптимизирован оригинальный ферментативный метод получения оптически активного полианилина в мицеллах додецилбензолсульфокислоты, где как биокатализатор была использована пероксидаза пальмы. В качестве индуктора хиральности на стадии синтеза были применены энантиомеры камфорсульфоновой кислоты. С помощью метода кругового дихроизма продемонстрировано, что высокохиральный полианилин может быть получен как в присутствии, так и отсутствие камфорсульфоновой кислоты. 5. Методами трансмиссионной и электронной микроскопии определена морфология полианилина, синтезированного в мицеллах додецилбензолсульфокислоты. Найдено, что агрегаты полианилина представляют собой пористые рисоподобные наночастицы, длина и ширина которых равны 140 – 180 нм и 70-100 нм соответственно.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. A.V. Karamyshev, S.V. Shleev, O.V. Koroleva, A.I. Yaropolov, I.Yu. Sakharov. Laccase-catalyzed synthesis of conducting polyaniline. Enzyme Microb. Technol., 2003, v. 33, N 5, 556-564.

2. Ю. М. Мажуго, А. В. Карамышев, С. В. Шлеев, И. Ю. Сахаров,А. И. Ярополов. Ферментативный синтез электропроводного комплекса полианилина и поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропан)сульфокислоты с использованием пероксидазы пальмы и его свойства. Прикл. биохим. микробиол., 2005, 41, 283-287.

3. A.V. Caramyshev, E.G. Evtushenko, V.F. Ivanov, A. Ros Barceló, M.G. Roig, V.L. Shnyrov, R.B. van Huystee, I.N. Kurochkin, A.Kh. Vorobiev, I.Yu. Sakharov. Synthesis of conducting polyelectrolyte complexes of polyaniline and poly(2-acrylamido-2-methyl-1-propane)sulfonic acid catalysed by pH-stable palm tree peroxidase. Biomacromolecules, 2005, 6, 1360-1366.

4. A.V. Caramyshev, Y.N. Firsova, E.A. Slastya, A.A. Tagaev, N.V. Potapenko, E.S. Lobakova, O.Yu. Pletjushkina, I.Yu.. Sakharov. Purification and characterization of Windmill Palm Tree peroxidase. J.Agric.Food Chem., 2006, 54 (26), 9888-9894.

5. A.V. Karamyshev, A.Ch. Vorobiev, J.J. Castillo Leon, I.Yu. Sakharov. Plant peroxidases as catalysts in synthesis of polyanilines. Proc. I Intern. Symр. Biotechnology – state of the art and prospects of development, Moscow, Russia, October 14 -18, 2002, С.6.21.

6. I.Yu. Sakharov, A.V. Karamyshev, I.V. Ouporov, A.Kh. Vorobiev, A.I. Yaropolov, M.G. Roig, J.J. Castillo Leon. Enzymatic synthesis of polyelectrolyte complexes of conducing polyaniline. Proc. II Intern. Symр. Biotechnology – state of the art and prospects of development, Moscow, Russia, November 10 -14, 2003, v.2, p.190-191

7. A.V. Caramyshev, I.Yu. Sakharov. Palm tree peroxidase-catalyzed synthesis of chiral and conducting polyaniline. Proc. 1 European Chemistry Congress, Polymer architecture – from structure to functional control, Budapest, Hungary, 27-31 August 2006, M-OC-85, p. 288

8. A.V. Caramyshev, V.M. Lobachev, I.Yu. Sakharov. Peroxidase-catalyzed synthesis of chiral polyaniline in presence of achiral surfactant. Proc. Conference EUROBIC8, Aveiro, Portugal, 1-6 July 2006, PS7.15

9. I.Yu. Sakharov, V.M. Lobachov, V.M. Makarov, A.V. Caramyshev. Enzymatic synthesis of chiral polyaniline. Proc. IV Intern. Symр. Biotechnology – state of the art and prospects of development, Moscow, Russia, March 12 -16, 2007, v.2, p.246