1. Tartalomjegyzék

1. TARTALOMJEGYZÉK 1 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 2 3. BEVEZETÉS 3 4. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 5 4.1. SZIKES TAVAK 5 4.2. NÁD ÉS NÁDAS 9 4.3. NÖVÉNY-ASSZOCIÁLT BIOFILMEK 12 4.4. SZIKES TAVAK MIKROBIÁLIS DIVERZITÁSA 15 5. CÉLKITŰZÉSEK 23 6. VIZSGÁLATI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 24 6.1. MINTAVÉTEL 24 6.2. BAKTÉRIUMKÖZÖSSÉGEK SZÉNFORRÁS HASZNOSÍTÁSON

ALAPULÓ FENOTÍPUSOS UJJLENYOMATA 26 6.3. TENYÉSZTÉSEN ALAPULÓ VIZSGÁLATOK 27 6.3.1. CSÍRASZÁMBECSLÉS ÉS BAKTÉRIUMTÖRZSEK IZOLÁLÁSA 27 6.3.2. A BAKTÉRIUMTÖRZSEK FENOTÍPUSOS JELLEMZÉSE 29 6.3.3. A BAKTÉRIUMTÖRZSEK GENOTÍPUSOS JELLEMZÉSE 31 6.3.4. TENYÉSZTÉSTŐL FÜGGETLEN KÖZÖSSÉGI DNS IZOLÁLÁSON

ALAPULÓ MÓDSZEREK 35 7. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 43 7.1. A VELENCEI-TAVI NÁD BIOFILM VIZSGÁLATOK 43 7.1.1. BIOLOG KÖZÖSSÉGI SZÉNFORRÁS ÉRTÉKESÍTÉSI VIZSGÁLATOK 43 7.1.2. DGGE VIZSGÁLATOK 52 7.1.3. TENYÉSZTÉSES VIZSGÁLATOK 54 7.1.4. A KLÓNOZÁS EREDMÉNYEI 69 7.2. A KELEMEN-SZÉK ÉS A NAGY-VADAS NÁD BIOFILM

VIZSGÁLATÁNAK EREDMÉNYEI ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 75 7.2.1. BIOLOG KÖZÖSSÉGI SZÉNFORRÁS ÉRTÉKESÍTÉSI VIZSGÁLATOK 75 7.2.2. DGGE VIZSGÁLATOK 79 7.2.3. TENYÉSZTÉSES VIZSGÁLATOK 81 7.2.4. KLÓNKÖNYVTÁRAK VIZSGÁLATA 98 8. ÖSSZEFOGLALÁS 106 9. KIVONAT 113 10. ABSTRACT 115 11. FELHASZNÁLT IRODALOM 117 12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 133 13. FÜGGELÉK 134

1

2. Rövidítések jegyzéke Általános rövidítések DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis TGGE Temperature Gradient Gel Electorphoresis ARDRA Amplified Ribosomal DNS Restriction Analysis TRFLP Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphism PCR Polimerase Chain Reaction PCA Principal Component Analysis PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria EPS exopoliszacharid MPN Most Propable Number SRB Sulfate Reducing Bacteria CFU Colony forming unit Egyéb rövidítések O/F médium Hugh-Leifson oxidatív-fermentatív glükóz-hasznosítási médium TSY Trypticase soy yeast agar BLAST Basic Local Alignment and Search Tool IPTG izopropyl-béta-D-thiogalactopyranozid X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-béta-D-galacto-pyranozid PAA poliakrilamid APS Ammónium-perszulfát TEMED N,N,N',N'-tetrametil-etilén-diamin Velencei-tavi mintavételek, 2000. április és 2001. július FTK, FTB Fürdető belső és külső nádasállományból izolált törzs GTK, GTB Agárd-Gárdony Hosszútisztás belső és külső nádasállományból izolált törzs LTK, LTB Lángi-tisztás belső és külső nádasállományból izolált törzs FNE, FNA Fürdető egyéves és több éves nádasállományból izolált törzs GNE, GNA Agárd-Gárdony Hosszútisztás egyéves és több éves nádasállományból izolált

törzs LNE, LNA Lángi-tisztás egyéves és több éves nádasállományból izolált törzs Velencei-tavi mintavételek, 2003 és 2006 FB Fürdető, biofilm minta GB Agárd-Gárdony Hosszútisztás, biofilm minta LB Lángi-tisztás, biofilm minta Alföldi szikes tavak mintavételei, 2004. április, 2005-2006 KB Kelemen-szék nád biofilmjéből izolált törzs, illetve bifilm minta VB Kelemen-szék nád biofilmjéből izolált törzs, illetve bifilm minta

2

3. Bevezetés

A szigorúan védett szikes élőhelyek Magyarországon jelentős természeti értéket

képviselnek egyedülálló geológiai, hidrológiai, botanikai és zoológiai sajátságaiknak

köszönhetően. A nagy nyíltvízi felülettel és állandó vízborítottsággal jellemezhető Fertő és

Velencei-tó mellett különleges szikes környezetek a kiskunsági „székek”, melyek igen sekély,

nyár végén gyakran teljesen kiszáradó, alkalikus és enyhén sós vízterek. Hazánk másik nagy

kiterjedésű szikes térsége a Tiszántúlon található, melynek sekély vizű szikes tavait

viszonylag magas ionkoncentráció, lúgosság, sófelhalmozódás, nagyfokú egyedi és szezonális

változatosság jellemzi.

A nád (Phragmites australis /Cav./ Trin et Steudel) Európa és Magyarország

különböző tájainak flóraleíró munkáiban közönséges fajként szerepel. Nagy kiterjedésben

megtalálható nagy tavaink (a Balaton, a Fertő, a Velencei-tó) és az alföldi szikes tavak parti

régiójában. A tó és tágabb környezete életében a nádasok egyrészt víztisztító funkciójuk,

másrészt trofikus kapcsolatokban játszott szerepük miatt nagyon jelentősek. Az ELTE

Mikrobiológiai Tanszékén a nádasok környezetének megismerését célzó mikrobiológiai

kutatások elsőként a Fertő és a Velencei-tó esetében kezdődtek meg. Ezek a vizsgálatok

elsősorban a nádnövénnyel kapcsolatban álló aerob és anaerob baktériumközösségek faji

összetételét és anyagcsere aktivitását vizsgálták. Az alföldi szikes vízterek esetében eddig

csak az üledék aerob baktériumközösségek feltérképezése történt meg. A nádszárak víz alatti

részén kialakuló biofilmek aerob baktériumközösségeinek faji struktúrájára, a nádnövénnyel

kialakított lehetséges szerepére vonatkozó ismereteink azonban meglehetősen szórványosak.

A nád biofilm szerkezetének és működésének ismerete az adott víztérben azért lényeges, mert

felépítése és összetétele alapján jól elkülöníthetők a környezettanilag különböző élőhelyek,

minőségének és mennyiségének alakulása pedig a vízminőségi állapotot, illetve annak

megváltozását tükrözi. Természetes környezetekben betöltött szerepének ismerete nagyon

fontos lehet a szennyvízkezelési célból létesített mesterséges vizes élőhelyek mikrobiológiai

folyamatainak optimalizálásában, hatékonyságának növelésében.

Munkánk során a Velencei-tó és az alföldi Kelemen-szék és Nagy-Vadas nád biofilm

felépítésében résztvevő baktériumközösségek faji összetételének feltérképezését és a

közösségi anyagcsere mintázat megismerését tűztük ki célul, tenyésztésen alapuló és

tenyésztéstől független módszerek alkalmazásával.

3

4. Irodalmi áttekintés

4.1 Szikes tavak

A szárazföldek felszínének 1/15-ét borító vizes élőhelyek adnak otthont a legdiverzebb

élővilágnak, különösen a mérsékelt éghajlati övezetben. A felszíni vizek hidrológiai

tulajdonságaik alapján állóvizekre és vízfolyásokra oszthatók. Az állóvizek morfometriájuk

alapján lehetnek mély- és sekély vízterek, valamint vizes élőhelyek (wetlands). A sekély

vízterekre és a vizes élőhelyekre a litorális régió meghatározó aránya a jellemző a

pelágikussal szemben (Lakatos és mtsai, 1998).

A sekély vízterek és vizes élőhelyek különleges csoportját alkotják a sós vizek, melyen

belül vízkémiai tulajdonságaik alapján elkülönülő egységet képeznek az alkalikus kémhatású

szikes vizek. A Föld minden lakott kontinensén találunk elszórtan (gyakran szélsőségesen

kontinentális viszonyok között kialakuló) sós, szikes tavakat, melyek becsült víztérfogata

(104000 km3 – 125000 km3) megközelíti az édesvizekét (Boros, 1999).

A sós tavak lehetnek tengeri eredetűek, vagy tengertől független, athalasszohalin

kialakulásúak, neutrális, enyhén savas vagy lúgos kémhatásúak. Az athalasszohalin

kialakulású, alkalikus sós tavakat nevezik szikes vizeknek. E víztestek közös jellemzője, hogy

meghatározó anionjuk a CO32- és komplexei. A karbonát ionok eredetére vonatkozóan sok

teória látott már napvilágot, melyek közül ma a legelfogadottabb, hogy a szikes tavak

alapkőzete nagy mennyiségű Na2CO3-ot tartalmaz, ami a talajvíz kimosódása révén a tavak

medencéjében akkumulálódik. A vízben így a Na+ és a HCO3-/CO3

2--ionok disszociált

állapotban tartanak egyensúlyt, lúgos hidrolízisük okozza az alkalikus kémhatást. Mivel a

HCO3-/CO3

2--ionok koncentrációja jóval meghaladja a Ca2+ és a Mg2+-ionokét, így azok csak

kis mértékben képesek a karbonátot sóként kicsapni. Nagy Ca2+ koncentráció esetén neutrális

sós tavak keletkeznek, pl. Nagy Sós-tó (USA). Ha a Ca2+ mellett jelentős mennyiségű Mg2+ is

jelen van enyhén savanyú sós tavak (pl. Holt-tenger) keletkeznek (Grant, 1992).

A szikes tómedrek jellemzője a felszíni lefolyás hiánya, aminek következménye, hogy

a nagyarányú párolgás miatt vizükben sófelhalmozódás mehet végbe. A lefolyástalan

medencék kialakulása általában komplex folyamat eredménye, melyben szerepet játszhat a

vulkáni működés (pl. a törökországi Van-tó), a tektonikus mozgás (pl. a Kelet-afrikai

árokrendszer tavai, az egyiptomi nátron tavak izolációja a Nílustól), valamint a szél és a

4

folyók medencealakító tevékenysége (pl. kiskunsági és tiszántúli szikes tavak) is (Grant,

1992; Duckworth és mtsai, 1996; Tamásné, 1999).

A Föld szikes tavai közül legintenzívebben a Kelet-afrikai árokrendszer tavait, a

kaliforniai Mono-tavat és a közép-ázsiai szikes tavakat vizsgálták. A tektonikusan aktív Kelet-

afrikai árokrendszer tavai (pl. az Elementeita, a Magadi és a Natron-tó) Ca2+-ban és Mg2+-ban

szegény, Na+-ban gazdag vulkáni kőzetek mélyedéseiben alakultak ki (Baker és mtsai, 1971).

Észak-Amerika legismertebb szóda tava a Mono-tó (Kalifornia), mely szintén vulkanikus

eredetű mélyedésben jött létre, vizét a Na+, Cl-, CO32- és SO4

2- ionok sói, valamint jelentős

mennyiségű BO33- és K+ ion jellemzi, erősen alkalikus (pH 10) kémhatású (Humayoun és

mtsai, 2003). Az ázsiai szikes tavak közül a transz-bajkáli, a mongóliai (Baer-tó) és a szibériai

tavakat kutatták részletesen (Sorokin és mtsai, 2003; Ma és mtsai, 2004).

Európában a kifejezetten kontinentális jellegű szikes vizek a keleti területekre

korlátozódnak, melyek legnyugatibb tagjai a Kárpát-medencében találhatók. Jelentős részük

áldozatul esett a belvízrendezési, csatornázási és mezőgazdasági tájátalakító (meliorációs)

tevékenységeknek. A megmaradt szikes élőhelyek Európa-szerte kiemelkedő jelentőségű

természeti értéket képviselnek egyedülálló geológiai, hidrológiai, botanikai, zoológiai

tulajdonságaiknak köszönhetően. Megőrzésük érdekében 1996-ban minden hazai

természetközeli állapotban fennmaradt szikes tavat országos jelentőségű védett területnek

nyilvánítottak (Boros, 1999).

A Kárpát-medence két legnagyobb sekély szikes víztere a Fertő és a Velencei-tó,

számos szikes vizes élőhely található azonban az Alföldön is. A magyarországi szikes tavak

többsége a nagytavak és szárazföldek közötti átmeneti jellegű vizes élőhelyek (wetland)

csoportjába sorolható. Vizüket a világ más szikes tavaihoz képest a viszonylag alacsonyabb

sótartalom (0,5-7,5 g l-1), de az igen magas lúgosság jellemzi. Meglehetősen ingadozó

négykomponensű rendszerek, melyekben a Na2CO3, NaHCO3, Ca(HCO3)2 disszociált

állapotban és a CaCO3 oldatlan állapotban tart egyensúlyt. A tiszántúli szikesekben a Na+

mellett a SO42- is jelentős lehet. A Kárpát-medencében előforduló szikes víztereket a

sekélytavak (pl. Velencei-tó, Fertő), kistavak (ezt a csoportot szokták leggyakrabban „szikes

tavakként” említeni, pl. Kelemen-szék, Zab-szék), fertők (pl. szegedi Gyevi-fertő), szikes

mocsarak, és kisvizek kategóriákba sorolják (Boros, 1999).

A Velencei-tó Magyarország második legnagyobb szikes tava, területe kb. 24,5 km2

(1. kép). Korát 10-12 ezer évesre becsülik. Mai alakja a századforduló tájékán a Nádas-tó

lecsapolásával alakult ki. A szélsőséges vízjárású, lápi és szikes jelleget is magán viselő

sekély tó az idők során természetes úton eutrofizálódott, melynek eredményeképpen az 1950-

5

es évek végére a tó medre feliszapolódott, elmocsarasodott és vízfelületének 60%-át nád

borította. A rekreációt megelőzően a tavat egymástól nádassávokkal elzárt belső tisztások

jelenléte jellemezte, melyek között gyakorlatilag nem volt vízcsere. Így azoknak sajátos,

egyedi vízminősége volt, a tó egésze pedig mozaikos jelleget öltött. Míg a tó DNy-i részén

humin anyagokban gazdag, kevés lebegőanyagot tartalmazó, fenékig átlátszó barna vizeket,

addig a tó középső részén a hullámzás miatt gyakran felkeveredő üledéktől kevéssé átlátszó

szürke vizeket taláhattunk. Az ÉK-i területek vize az algák tömeges elszaporodása miatt zöld

színű volt (Buckó és Schmidt, 1995).

A kor igényeit követve, a tó egy részének üdülő tóvá, másik részének

természetvédelmi területté való átalakítása érdekében 1960-tól átfogó rekreációs munkálatok

kezdődtek: sor került a tó partszabályozására, mederrendezésén keresztül vízszint

szabályozására. Ezeken felül nád- és hínárirtást is végeztek (Reskóné, 1999; Reskóné ésmtsai,

2001).

1. kép A Velencei-tó látképe

A beavatkozás hatására a tó állapotában kedvezőtlen változások sora kezdődött. A

mederkotrás és a nádasirtás következtében a planktonikusan oligotrófnak tartott víz fokozott

mértékben eutrofizálódott (hínárosodás, algásodás), romlott a vízminőség, hiszen a

megfogyatkozott partmenti makrofita öv nem tudta ellátni természetes víztisztító funkcióját. A

fent említett negatív ökológiai folyamatok hatását tovább súlyosbította az 1980-as évek

végén, 1990-es évek elején jelentkező száraz, aszályos periódus, aminek következtében a tó

vízszintje lecsökkent, vize betöményedett, az eutrofizálódási folyamatok felgyorsultak.

Komoly problémát jelentett a Microcystis aeruginosa toxintermelő kékalga és a Cladophora

glomeratus zöldalga tömeges elszaporodása is. A nádasszegély körül felhalmozódó algatömeg

6

a nádasállomány súlyos károsodásához vezetett. A csapadékhiány felerősítette a munkálatok

utóhatásaként jelentkező erőteljes szikesedési folyamatot, a tó lápi jellege csökkent. A

vízhiány miatt erősen károsodott élővilágot és lényegében magát a kiszáradásnak indult tavat

is csak mesterséges vízpótlással lehetett megmenteni A nádasállományok felszámolásával a

tisztásokat egymással közlekedővé tették, ami az egyes vízterek közti éles határvonalak

megszűnését eredményezte. Ezt az alga-élőbevonat vizsgálatai is alátámasztják: a tó

különböző pontjairól származó bevonatok fajösszetétele és dominancia-viszonyai igen

hasonlóvá váltak (Reskóné és mtsai, 2001).

Alföldi asztatikus jellegű szikes vizeinket a szél és a folyók medencealakító

tevékenysége hozta létre. A tavakat tápláló talajvizek nagy területről gyűlnek össze, és

folyamatos áramlásban vannak a mélyebben fekvő szikes tómedrek felé. A nyári aszályos

időszakban az erőteljes párolgás miatt csökken a víztestek térfogata, sótartalmuk

koncentrálódik. A párolgás következtében kialakuló szívó hatás a mélyebb rétegekből is

megindítja a talajvíz feláramlását, és növeli a felszíni sófelhalmozódást. Télen ezzel szemben

sokszor fenékig befagynak ezek a sekély tavak.

A víz színe alapján alföldi szélsőségesen sekély vizű szikes tavainknak két típusát

különböztethetjük meg. Az élőhelyek szukcessziós folyamatában a „fehér vizű tavak” a

legfiatalabb képződmények. Tejfehér vizük a kolloid mészsóktól állandóan zavaros, így a

napfény csak a felső pár centiméteres rétegbe tud behatolni, s ez nagymértékben korlátozza a

fotoszintetizáló szervezetek elterjedését. Aljzatukat szürkésfehér karbonát-mésziszap borítja,

szezonális kiszáradáskor medrükön „kivirágzik” a sziksó, azaz a szóda. A fehér vizű tavak

feltöltődésével jönnek létre a „fekete vizű tavak”, melyek átlátszó sárgásbarna színét a benne

oldott humuszanyagok okozzák. A víztestbe a vörös tartományba eső napsugarak hatolnak be

leginkább, és szolgáltatnak energiát a primer produkció számára. Ezekben a víztestekben már

gazdag vízi és mocsári növényzet jelenik meg. A két forma egyazon mederben is megjelenhet

az egyenlőtlen feltöltődés következtében (Boros, 1999).

A kiskunsági székek medrét az ősi Duna-völgyben a folyó és a szél együttes munkája

alakította ki. Miután a Duna elhagyta Szeged felé tartó folyásirányát a Duna-Tisza közén a

folyóvízi feltöltődés megszűnt, és futóhomok, helyenként lösz rakódott le. A medencéket az

ősi folyóágak pangó vize töltötte meg, vízutánpótlásuk jelenleg egyrészt csapadék eredetű,

másrészt a jó vízáteresztő homokbuckák felől a mederbe áramló talajvízből származik. A

szikesedési folyamatok 8-10 ezer évvel ezelőtt indultak meg, a tavak meszes-szódás jellege a

homokból kioldott kalcitnak köszönhető. Mivel a víztömeg nagy felületen kis

rétegvastagságban oszlik szét, a víz hőmérséklete szorosan követi a levegőét, kémhatása és

7

sókoncentrációja pedig a vízborítottság függvényében szélsőséges ingadozásokat mutat. A

csekély vízmélység, és a szél keltette hullámzás következtében a víztest fizikai és kémiai

tekintetben homogén és oxigén ellátottsága jó (Boros, 1999; Megyeri, 1999; Tamásné, 1999).

A Kiskunsági Nemzeti Park (KNP) területén található Kelemen-szék (2. kép) nátrium és

hidrokarbonát ion dominanciájú, az átlagos sótartalom 700–1200 mg l-1 (Schmidt, 2003).

2. kép Kelemen-szék látképe

Magyarország legnagyobb összefüggő szikes területe a Tiszántúlon található, a tavak

jelentős része UNESCO Bioszféra Rezervátum, illetve a Ramsari Egyezmény alapján is

nemzetközi védettséget élvez.

A tiszántúli szikes vizes élőhelyek és puszták mintegy 20 ezer évvel ezelőtt jöttek létre

a Tisza megjelenésének köszönhetően. A Tisza mederrendszere kettévágta a terület

Kárpátokból érkező észak-déli irányú folyóit, melyek közül a jobb partiak mellékfolyókká

váltak. A bal parti terület azonban folyóvízellátás nélkül maradt, aminek következtében a

Tisza áradása során jelentősen emelkedett, majd visszaesett a talajvízszint. A fluktuáló

talajvízszint következtében az ártéri üledék karbonátja feloldódott, és a talajvíz igen lúgossá

vált, melyben az üledék Na+ és K+-ion tartalmú szilikátjai (pl. földpátok) mállásnak indultak.

A széteső szilikátokból a különböző kationok felszabadultak és hidratálódtak, a

talajvíz alkáliákban dúsulni kezdett. A csökkenő talajvízszint kialakította a talaj kapilláris

szerkezetét, így a párolgás hatására a víz és a benne oldott anyagok a gravitáció ellenére is

képesek voltak a felszín felé vándorolni, ezáltal a vízben oldott anyagok, köztük a kovasav, a

felszínen vagy a felszín közelében kicsapódhattak (Rónai, 1985; Sümegi és mtsai; 2000).

8

3. kép Nagy-Vadas látképe

A Hortobágyi Nemzeti Park kezelésében lévő, a Hortobágy, a Hajdúság és a Nyírség

területén fekvő szikes tavak közül előzetes terepbejárást követően a Nyíregyháza közelében

fekvő Nagy-Vadast (3. kép) választottuk kutatási területként.

4.2 Nád és nádas

A nád (Phragmites australis /Cav./ Trin et Steudel) az egész Földön elterjedt, fásodó

gyöktörzsű, kemény, de hajlékony szárú, a pázsitfűfélék (Graminales) családjába tartozó

nedvességigényes növény. Hosszú, akár több méteres rizómái révén vegetatív szaporodásra is

képes. A kifejlődő új növényegyedek az anyanövénnyel összeköttetésben maradnak, és

kedvező feltételek mellett nagymértékben elősegítik a nádasok (Scirpo-Phragmitetum)

terjedését a sekély vizek litorális zónájában, valamint a természetes és a mesterséges vizes

élőhelyeken egyaránt (Buckó és Schmidt, 1995; Lakatos és mtsai, 1998; Kiviat és Hamilton,

2001).

A nádasok a vizes élőhelyeken nagyon sokrétű feladatot töltenek be. A vizek

anyagforgalmában és természetes öntisztulási folyamataiban mechanikai szűrőként működve,

illetve tápanyagfelvételük révén közvetlenül, a társulás emerz makrofitonjainak víz alatti

részein kialakuló élőbevonat aktivitása révén pedig közvetve vesznek részt. Ezen kívül

költőhelyet biztosítanak a vízimadarak, ikrázóhelyet a halak és kedvező biotópot a vizek

számos más élőlénye számára (Szabó és mtsai, 1993; Amann és mtsai, 1998).

9

A nádasállomány mechanikai szűrő funkciója egyrészt abban áll, hogy feltartóztatja a

szárazföld felől érkező hordalékot, másrészt az áramlási sebességet lecsökkentve elősegíti a

víztérben az üledékképződést, gátolja a főként elhalt szerves anyagokból álló üledék

felkeveredését. A víztestben szabadon hozzáférhető tápanyagok mennyiségének ilyen

módon/módokon való csökkentésével megakadályozza a fitoplankton feldúsulását is, és

mérsékli az eutrofizálódási folyamatokat (Brenner és mtsai, 1999; Madsen és mtsai, 2001).

A nádasok tápanyagaik egy részét a vízi üledékből veszik fel, így azok a növények

biomasszájába épülve kivonódnak a vízből. A Balatonon végzett vizsgálatok szerint az üledék

elemtartalmának növekedésével párhuzamosan a nád földfeletti szerveiben (szár, levél)

nagyobb mennyiségű elem halmozódik fel. A levél nitrogén tartalma 1-3% között változik, de

a szennyvízzel terhelt partszakaszokon a levelekben 1,5-2-szer, a szárban 2,5-3-szor nagyobb

mennyiségű nitrogén mutatható ki. Ezek az adatok is igazolják, hogy a vegetációs időszakban

a nád jelentős mennyiségű elemet képes a szerveiben felhalmozni, és ezáltal azokat

meghatározott időre kikapcsolja a vízterek biogeokémiai ciklusából. A téli aratással a

vegetációs időszakban mért elemmennyiségnek mintegy a 30-40%-a eltávolítható (Kovács és

mtsai, 1998).

A vízi ökoszisztémák tájképileg is meghatározó társulásaival, a nádasokkal

kapcsolatban meg kell említenünk a világszerte egyre jobban terjedő nádpusztulás jelenségét,

melynek következtében a nád uralta élőhelyek fokozatosan zsugorodnak. A pusztulás

következményeként az eredetileg zárt nádasállományok a nyíltvíz oldaláról nádas foltokra

szakadoznak, „babásodnak”. A károsodott nádegyedek alacsonyak, vékonyak, gyakran

elágazók, törékenyek. Fejlődésük rendszerint vegetatív állapotban megreked (Dinka és

Szeglet, 1999). A jelenség több mint 25 éve Magyarországon is felütötte fejét, de komolyabb

károsodásokat csak a 80-as évek elejétől regisztráltak. A nádpusztulás okainak felderítésére az

EUREED Project keretében az 1990-es években átfogó kutatómunka kezdődött nemzetközi és

hazai szinten egyaránt (Ostendorp, 1989). A nyíltvíz és a nádas közötti egyensúly

kulcsfontosságú a vizes élőhelyek ökológiai minőségének fenntartásában, így a nádelhalás

messzemenő következményekkel járhat. Kihatása van a természetes élőhelyek

fennmaradására, a szárazföldi és a vízi ökoszisztéma közötti pufferzóna megmaradására, a

folyók és tavak partszegélyének stabilitására (Lakatos és mtsai, 1998; Szabó és mtsai, 1993).

A nádasok eltűnése káros hatással lehet a vizek természetes öntisztulási folyamataira

is, ami a vízminőség leromlásához vezethet. A jó minőségű nádasok nádszárainak

élőbevonatában a kovaalgák a legelterjedtebbek. A pusztuló nádasokban a békanyál

(Cladophora glomerata) és más fonalas zöldalgák tömeges elszaporodása jellemző, ami

10

megakadályozza a fiatal nádszárak kihajtását. Buczkó és Ács (1998) a Velencei-tavon végzett

összehasonlító vizsgálatukban a degradálódó nádon a Fragilaria pulchella, Rhoicosphaenia

abbreviata, Amphora pediculus és Nitzschia fajok, míg az egészséges nádon az Achnanthes

minutissima, Gomphonema olivaceum, Cymbella lacustris és Cymbella lanceolata fajok

nagyarányú jelenlétét találták. Lakatos és munkatársai hazai sekély tavainkban (Balaton,

Fertő, Velencei-tó) a nád-perifiton komplex nehézfémtartalmának vizsgálata során azt találták,

hogy az antropogén terhelésnek jobban kitett területeken a nád és a hozzá kapcsolódó

perifiton nehézfémtartalma különösen magas volt, ami a nád-biofilm komplex biofilter

szerepét igazolja (Lakatos és mtsai, 1999).

Korábban a természetes ökoszisztémák öntisztító folyamataik révén képesek voltak

megbirkózni az akkor még jóval alacsonyabb szintű szennyezéssel. A szennyező anyagok

mikrobiális transzformációja és mineralizációja azokat ismét hozzáférhetővé tette az

elsődleges produkció számára. A korszerűnek számító biológiai szennyvízkezelési eljárások

napjainkban is ezeknek a komplex mikróbaközösségeknek az összehangolt tevékenységén

alapulnak. Hatékony szennyvíztisztító rendszert létrehozni még ma is a természetben

fellelhető folyamatok kihasználását, azok megfelelő tér- és időbeli összehangolását jelenti

(Amann és mtsai, 1998).

Ma már világszerte elterjedt a mesterséges vizes élőhelyek szennyvíz tisztítási célból

történő alkalmazása. Ezeknek a rendszereknek szerves részei a szennyvíz tisztításában sokrétű

szerepet betöltő vízi makrofitonok (Brix, 1987; Reed és mtsai, 1988). Az adott környezeti

tényezők és a hipertróf viszonyok toleranciáján, valamint a stressztűrésen túl általános

elvárások az alkalmazott növényfajokkal szemben, hogy nagy szennyezőanyag-eltávolító

kapacitással bírjanak egyrészt közvetlen módon tápanyagfelvételük és raktározásuk,

közvetetten pedig a mikrobiális tevékenységek elősegítése révén (Tanner, 1996). A nád vizes

élőhelyeken betöltött sokrétű szerepe mellett nagy produktivitása, gyors szaporodása és

terjedése miatt egyike a gyakran és széles körben alkalmazott növényfajoknak (Cooper,

1993). Az ilyen rendszerek nagy szennyezőanyag-eltávolító kapacitása tehát közvetlenül a

növények tápanyagfelvételének és raktározásának, közvetett módon pedig a mikrobiális

átalakító tevékenységnek (pl. nitrifikáció és denitrifikáció) köszönhető (Tanner, 1996).

11

4.3 Növény-asszociált biofilmek

A nád a növényi tápanyagok felvételén és akkumulálásán túl a vízi élőhelyek

öntisztulási folyamataihoz főként a felületéhez asszociálódó élőbevonat (biofilm, biotekton,

perifiton) jelenléte és aktivitása révén járul hozzá (Amann és mtsai, 1998). A mikrobiális

ökológiának nagy múltra visszatekintő és napjainkban is intenzív kutatások tárgyát képező

területe a vízi ökoszisztémákban fellelhető növény-asszociált mikróbaközösségek vizsgálata.

Ezek a mikróbaközösségek kiemelkedően fontos szereppel bírnak az adott vízi környezet

szén- és más tápanyagkörforgalmában, valamint érzékeny indikátorai a környezetükben

bekövetkező változásoknak, lehetővé téve vizsgálati eredményeik monitorozási célú

felhasználását.

Az öntisztulási folyamatok hatékonyságát, a szerves anyagok lebontását

nagymértékben meghatározza a növények felületéhez asszociálódó élőbevonat (biofilm,

biotekton, perifiton) összetétele és aktivitása (Amann és mtsai, 1998). Az alternatív

szennyízkezelésben alkalmazott vízinövények és/vagy a rajtuk kialakuló biofilmek

víztisztításért felelősnek tartott adottságainak és kölcsönhatásainak, a különféle hatásokra

kialakuló változásoknak a felderítésére napjainkban számos kutatás irányul. Tanner

munkájában (1996) több növényfaj, köztük a nád mesterséges szennyvíztisztítókban mutatott

növekedését és tápanyagfelvételét hasonlította össze. Greenway és Woolley (1999)

összehasonlító vizsgálatában eltérő típusú szennyvíztisztító rendszerekben mérték a különféle

növényfajoknak a tápanyagok bioakkumulációjára vonatkozó kapacitását. Mauchamp és mtsai

(2001) vizsgálatának tárgyát az alámerültség mértékének hatása képezte a nád növekedésére,

ami igen fontos tényező az alternatív szennyvízkezelésben.

Bár biológiai szennyvíztisztítást már több mint egy évszázada alkalmazunk, a

szennyvíztisztítási folyamatokban résztvevő növények szennyvíztisztító hatékonyságát és

mértékét alapvetően meghatározó mikróbaközösségek összetételéről és aktivitásáról

elsősorban módszertani korlátok miatt egészen a kilencvenes évekig csak szórványos

ismeretekkel rendelkeztünk. A nádasok és a víz alatti részeiken kialakuló biofilmek

természetes környezetekben betöltött szerepének és az ezekért felelős mechanizmusoknak és

kölcsönhatásoknak az ismerete ugyanakkor fontos információkat nyújthat a szennyvízkezelési

folyamatok optimalizálásában és hatékonyságának növelésében is. A különféle molekuláris

biológiai technikáknak a szennyvizek mikrobiológiai kutatásába való bevezetése tette

lehetővé, hogy meghatározzuk a rendszerek mikróbaközösségeinek összetételét és

dinamikáját és azonosítsuk a kulcsfontosságú mikrobiológiai folyamatokban résztvevő

12

szervezeteket (Wagner és mtsai, 2002). Juretschko és mtsai (2002) például, csoport-specifikus

rRNS-célzott oligonukleotid próbákkal szennyvíztisztító növények mikróbaközösségein

végzett FISH kísérleteikben igazolták, hogy a bakteriális próbákkal detektálható

szervezeteknek csaknem felét β-proteobaktériumok (Zooglea ramigera, Azoarcus sensu lato,

etc.) alkotják. További fontos in situ detektálható csoportok voltak még az α-

proteobaktériumok (nitrifikáló Nitrospira sp.), a γ-proteobaktériumok (polifoszfát-akkumuláló

Acinetobacter sp.), a Planctomycetes és a Chloroflexi törzsek.

A növényi felületeken, leveleken, szárakon vagy gyökérzeten megtelepedő

mikroorganizmusok növény-mikróba interakciókban betöltött funkciójuk alapján lehetnek

fitopatogén (növényi kórfolyamatokat indukáló), szaprotróf (tápelemek körforgalmában,

komposztálásban, etc. résztvevő) vagy növényi növekedést elősegítő szervezetek. A

természetben kialakuló élőbevonatok többségében prokarióta dominancia a jellemző, de az

eukarióta szervezetek: algák, mikrogombák, protozoák és többsejtű állatok jelenléte is

számottevő (Costerton és mtsai, 1995; Davey és O’Toole, 2000). Baktériumok játsszák a

legfontosabb szerepet a kommunális és ipari szennyvizek kezelésében, tisztításában is.

Számban és biomasszájuk tekintetében is dominálnak, továbbá nélkülözhetetlenek a szerves,

illetve szervetlen anyagok eltávolításának folyamataiban (pl. nitrogén és foszfor eltávolítás).

A baktériumok mellett a különféle protozoonok és többsejtű állatok elsősorban a

szennyvízben található partikulumok felszínén való táplálkozásuk révén jelentősek a

szennyvíz szűrésében, derítésében (Amann és mtsai, 1998).

A mikroorganizmusok metabolikus sokféleségének és fenotípusos plaszticitásának

köszönhetően biofilmek biotikus és abiotikus felszíneken egyaránt kialakulhatnak. A

biofilmek olyan közösségi anyagcserére alapozott magasabb szintű szerveződések, melyben a

mikróbafajok koordinált, funkcionálisan is jól tagolt közösséget képeznek. Bár korántsem

rendelkezünk kielégítő ismeretekkel a növény-mikróba kölcsönhatásokban résztvevő

mikroorganizmusok in situ aktivitásáról, azt azonban már ismerjük, hogy e

mikroorganizmusoknak a növényi felületeken való megtelepedése (biofilm képződése)

hasonló stratégiák és mechanizmusok szerint történik (Lugtenberg és mtsai, 2002).

A biofilm kialakulásának korai fázisában a mikróbák aktív vagy passzív mozgással

megközelítik a kolonizálandó felületet, és reverzibilisen kapcsolódnak a korábban főként

szerves anyagokból keletkezett ún. kondicionáló filmhez, majd a megfelelő élő és élettelen

környezet kiválasztását követően irreverzibilisen kötődnek (Davey és O’Toole, 2000). A

végleges kötődés olyan gének expressziójának eredménye, melyek pl. a csillószintézist

leépítik, ezáltal megszüntetnek egy, a biofilmet destabilizáló faktort (Watnick és Kolter,

13

2000). Kezdetben az azonos metabolikus aktivitású csoportok telepednek le egymás mellett,

és a kedvező körülményeknek megfelelően intenzív sejtosztódásba kezdenek. Ennek

eredményeképpen azonos fajhoz tartozó szervezetekből álló mikrokolóniák jönnek létre. A

különböző mikrokolóniák tagjai exopoliszacharidokat (EPS) termelnek, ami mátrixot hoz

létre a sejtek között. A mátrix anyagai a metabolikus aktivitás révén keletkező szerves és

szervetlen anyagokkal együtt további fajok megtelepedését teszik lehetővé. Így az érés során

az egyre heterogénebb, közösségi anyagcsere rendszerekké szerveződő tagokból álló biofilm

strukturálisan és funkcionálisan is tagolttá válik.

A biofilmben található sejtek a teljes szervesanyag-tartalom 10-90%-át, az EPS-

összetevők pedig 50-90%-át tehetik ki (Christensen és Characklis, 1990; Apllegate és Byers,

1991; Nielsen és mtsai, 1997). Az EPS legnagyobb részét poliszacharidok képezik, de egyéb

makromolekulák (fehérjék, nukleinsavak és más heteroploimerek) is előfordulhatnak benne

(Christensen, 1989). A baktériumokat körülvevő és a biofilmszerkezet kialakításában

elsődleges szerepet játszó EPS mátrix homeosztázist és védelmet biztosít a megtelepedő

mikroorganizmusok számára. A mátrix oldott szerves anyagokat képes felületén adszorbeálni,

ezáltal a közösség számára fontos növekedési faktorokat és tápanyagokat koncentrál.

Ioncserélőként működve korlátozza a különféle komponensek bediffundálását a biofilmbe a

környezetből, így megakadályozhatja pl. bizonyos antimikrobiális ágensek, toxinok, fémek

bejutását. Fizikailag védelmet nyújt a környezeti stresszhatásokkal (pl. UV-sugárzás, pH-

eltolódás, ozmotilus sokk és kiszáradás, valamint bakteriofágok) szemben.

Az EPS mátrix mikrocsatornácskái révén a sejtcsoportok kapcsolatot létesítenek

egymással, illetve a környezetükkel. A mikrocsatornácskákon keresztül bonyolódik a biofilm

anyagforgalma: a tápanyag- és oxigénfelvétel, a metabolitok „cseréje”, valamint az

anyagcsere végtermékek leadása. Bár a biofilm belseje többnyire a csatornácskáknak

köszönhetően aerált, a mikrokolóniák belsejében létrejöhetnek mikroaerofil, sőt anaerob

mikrokörnyezetek is. Az érett biofilmben a tagok között szervezett, mutualisztikus jellegű

metabolikus kooperativitás valósulhat meg. A biofilm azért válhat komplex, jól működő,

tagjai számára kedvező élőhellyé, mert a közösség élete szabályozott. Ennek alapját olyan

aktívan vagy passzívan transzportálódó bakteriális termékek biztosítják, melyek

megváltoztatják a szomszédos mikróbák állapotát, fehérje-expresszióját. A szignálmolekulák

lehetnek metabolitok, proteinek, nukleinsavak egyaránt (Watnick és Kolter, 2000).

A biofilm baktériumok körében egyúttal a konjugáció révén megvalósuló intra- és

interspecifikus géntranszfer a szoros közelségben együtt élő fajok között hatékony

14

génkicserélődésre ad módot. Az új genetikai elemek lehetnek például antibiotikum-

rezisztencia faktorok, vagy patogenitási szigetek (Davey és O’Toole, 2000).

4.4 Szikes tavak mikrobiális diverzitása

A szikes tavak talán a legproduktívabb vizes élőhelyek a Földön. Karbonátokban

rendkívül gazdag vizük, a magas hőmérséklet, az intenzív napsugárzás és a nagy

napfénytartam ideális környezetet jelentenek a fotoszintetizáló prokarióták számára. A szikes

tavakban a primer produkciót aerob és anoxigénikus fototróf baktériumok biztosítják, melyek

nagyfokú elszaporodása a domináns fajoktól függően gyakran a zöld, a narancs és a bíbor

legkülönbözőbb árnyalataira „festi” a vizet. A kevésbé alkalikus vizek fő fototróf szervezetei a

cianobaktériumok (pl. Spirulina, Chroococcus, Cyanospira), melyek egyben N2-fixálást is

végeznek, míg az erősen lúgos vagy sós vizekben a cianobaktériumok mellett az anoxikus

fototróf baktériumok (pl. Ectothiorhodospira, Halorhodospira) is megjelennek. Ez utóbbi

csoport feltehetően igen nagymértékben járul hozzá a primer produkcióhoz, de szerepük,

elterjedtségük és diverzitásuk még kevésbé tisztázott.

A hatalmas mértékű primer produkcióra (>10 g C m-2 nap-1) aerob és anaerob

kemoorganotróf baktériumok változatos közössége épül, általában a 105–106 CFU g-1 üledék

értéket is elérve (Grant, 1992; Duckworth és mtsai, 1996; Jones és mtsai, 1998). Az aerob

kemoorganotróf közösségekben a Gram-pozitív és a Gram-negatív szervezetek feltehetően

egyaránt abundánsak. A nagy G+C tartalmú Gram-pozitívokat elsősorban aktinobaktériumok

(Streptomyces nemzetség;), valamint a Dietzia és a Nesterenkonia nemzetség képviseli (Ma és

mtsai, 2004), míg a kis G+C tartalmú Gram-pozitívok jelentős része valószínűleg az obligát

alkalofil Bacillusok közé tartozik, melyek extracelluláris hidrolitikus enzimeik révén a

biopolimerek lebontásában játszanak kiemelkedő szerepet (Duckworth és mtsai, 1996). Az

aerob Gram-negatív kemoorganotrófok többségében a γ-proteobaktériumok közül kerülnek ki,

pl.: Halomonas, Pseudomonas, Aeromonas és Alteromonas nemzetségek (Duckworth és

mtsai, 1996, 2000; Jones és mtsai, 1998).

A szikes tavakban a gyakori oxigén limitáltság miatt az anyagkörforgalmi

folyamatokban az anaerob baktériumközösségek is jelentős szerepet tölthetnek be. Az anaerob

kemoorganotróf közösségek domináns biopolimer bontó képviselői (az ún. elsődleges

fermentálók) főként a Clostridium és a Spirochaeta nemzetségekbe tartozónak bizonyultak.

Az általuk termelt H2-t szulfátredukáló szervezetek (pl. Desulfonatronovibrio

hidrogenovorans), valamint alkalofil metanogének (Methanohalophilus zhilinae), és

15

homoacetogén szervezetek (Natrionella acetigena) hasznosítják. Azonosítottak több

különleges anyagcseréjű baktériumot is, mint például az aminosavakat fermentáló acetogén

ammonifikáló Tindallia magadiensist (Kevbrin és mtsai, 1998).

Haloalkalofil ősbaktériumok, a Halobacteriaceae család tagjainak jelenlétét szintén

számos szikes tóban igazolták, pl.: Natronobacterium, Natronococcus, Natronomonas,

Natrialba, Natronorubrum, Halorubrum nemzetségek (Tindall, 1988; Zhilina és Zavarzin,

1994, Kamekura és mtsai, 1997). Az oldott sók nagy koncentrációjával (>20% NaCl)

jellemezhető vizekben 107-108 CFU ml-1-es értékeket is elérhetnek a haloalkalofil

ősbaktériumok képviselői, melyek növekedésükhöz a szerves tápanyagok különösen nagy

mennyiségét igénylik. Jelenlétük feltehetően a tavak sókoncentrációjának fluktuációjával függ

össze. Amikor az esőzések következtében a tavakban a sókoncentráció átmenetileg lecsökken,

lehetővé válik a kevésbé halofil autotróf szervezetek elszaporodása. Később a csapadékhiány

és a nagyarányú párolgás miatt a sókoncentráció visszaáll az eredeti magas szintre, az

érzékeny algák elpusztulnak, és elhalt anyagaik szénforrásként szolgálhatnak a haloalkalofil

kemoorganotróf mikroorganizmusok számára (Hamamoto és Horikoshi, 1992; Duckworth és

mtsai, 1996).

Kevésbé ismertek a szikeseket kolonizáló kemolitotróf közösségek, melyek közül a γ-

proteobaktériumok csoportjába tartozó obligát autotróf kén-oxidáló baktériumok

(Thioalkalimicrobium, Thioalkalivibrio és Thioalkalispira nemzetségek) bizonyultak a

legdiverzebb és legdominánsabb csoportnak (Sorokin és mtsai, 2000b, 2003). Mellettük

alkalofil metánoxidáló (Methilobacter alcaliphilus), nitrifikáló (Nitrosomonas halophila, β-

Proteobacteria) és NO2-oxidáló fajokat (Nitrobacter alkalicus, α-proteobacteria;), valamint

aerob denitrifikáló hidrogenotróf α-proteobaktériumokat is kimutattak (Khmelenina és mtsai,

1997; Sorokin és mtsai, 2000a).

Magyarországon a szikes, alkalikus környezetek mikrobiológiai kutatása az elmúlt 10

évben vett lendületet. A nem higiénés célú bakteriológiai kutatások a Fertőn indultak meg a

planktonikus és biofilm, valamint az üledék és nád rizóma baktériumközösségek

mikróbaközösségeinek vizsgálatával. A Fertő baktériumközösségeinek részletes, tenyésztésen

alapuló vizsgálata során a tó vizéből és a nád biofilm bevonatáról egyaránt izoláltak

baktériumtörzseket, melyeket részletes fiziológiai-biokémiai tesztekkel karakterizáltak és

azonosítottak. A Fertő vizéből és a nád biofilm bevonatáról izolált és a fenotípusos tesztekben

meglehetősen inaktív, Gram-negatív dominanciájú (59%) törzsek között sok halotoleráns,

alkalitoleráns vagy alkalofil szervezetet mutattak ki. A fenotípusos tulajdonságok alapján

azonosított törzsek a Bacillus, a Micrococcus, a Pseudomonas, a Flavobacterium, az

16

Aeromonas és az Arthrobacter nemzetségekbe tartoztak. Az őszi-téli vizeket elsősorban a

flavobaktériumok jellemezték, a Bacillusok csak az üledéktől felkeveredett vizekben

fordultak elő nagyobb arányban. A nád biofilm bevonatára és a téli jég alól vett vízmintákra

elsősorban a Pseudomonas alcaligenes, míg a nyílt vízterekre a Micrococcus nemzetség tagjai

voltak jellemzőek. A „litter bag” kísérletben a Fertő nádasaiból aratás során felszaggatott

rizómák felületén kialakuló tenyészthető közösségeket egy éven keresztül, negyedévenkénti

mintavételekkel kísérték végig. A tó szikes jellegére való tekintettel egy alkalofil szervezetek

számára ajánlott táptalaj módosított, cellulózzal dúsított változatát is alkalmaztuk az alkalikus

környezethez jobban alkalmazkodott mikroorganizmusok tenyésztésbe vonásához. A törzsek

hagyományos fenotípusos és BIOLOG szénforrás-értékesítési spektumának vizsgálata mellett

a faji szintű azonosításra a 16S rDNS szekvencia analízise révén került sor. Az eredmények

azt mutatták, hogy a Fertő vizében dekomponálódó rizómák felületéről kitenyészthető

baktériumközösségekben jellegzetes változásokat tapasztalhatók az évszakonkénti

mintavételezések során. Nyáron a fakultatív fermentatív anyagcseréjű, meleg eutróf vizekre

jellemző Aeromonas fajok túlsúlya volt jellemző. Az őszi mintában fakultatív fermentatív,

fakultatív kemolitotróf, emellett fakultatív nitrogén-fixáló és cellulolitikus fajok törzseit

izoláltuk, melyek a nyári mintáktól jellegzetesen eltérő szénforrás-hasznosítást mutattak. Csak

az őszi mintából kerültek kitenyésztésre egyes α-proteobacteria (Ancylobacter aquaticus,

Rhizobium radiobacter) és β-Proteobacteria (Hydrogenophaga palleronii, Alcaligenes sp.)

leszármazási vonalba tartozó fajok. A téli és a tavaszi mintavételek alkalmával kitenyésztett

baktériumközösségek faji összetétele nem különbözött egymástól olyan mértékben, mint a

nyári és az őszi mintáké (Kurdi és Borsodi, 1995; Borsodi és Sallai, 1997; Borsodi és mtsai,

1998, Borsodi és Sallai, 1998, Borsodi és mtsai, 2005b).

A Velencei-tó üledékében jelenlévő ammonifikáló, deszulfuráló, aerob tioszulfát-

oxidáló, anaerob fototróf és szulfátredukáló baktériumok hosszútávú mennyiségi változásának

nyomon követésére MPN módszerrel került sor. Az eredmények alapján a tápanyagokban

gazdag üledék mikróbaközösségei nagy aktivitásal rendelkeztek. A tó vizében és üledékében

az ammonifikálók és deszulfurálók közösségei elsősorban a tó lápi területén és a Fürdetőn

voltak jelen legnagyobb csíraszámban és aktivitással. Mennyiségük szerves anyagokban

gazdag külső vagy belső terhelés hatására nőtt, ezért az élőhelyek tápanyag ellátottságának

indikátorai lehetnek. Csíraszámuk dinamikája az élőhely minőségéről tájékoztat: aktivitásuk

jelentősebb változásával az átlagostól eltérő hatásokat jelezhetik (pl. kívülről érkező terhelés,

hullámverés okozta felkeveredés). Az MPN értékek időben való egyenletes lefutása az adott

térség önmaga által szabályozott, zavartalan anyagforgalmára utal (pl. Német-tisztás). A SRB

17

a tó vizében alig fordultak elő, üledékben való egyöntetű elterjedésük és aktivitásuk a

mineralizációban betöltött alapvető szerepükre utal. Az üledék mélységével, annak

minőségétől függően nemcsak aktivitásuk, hanem diverzitásuk is változott. A redukált kén

vegyületek újra oxidálását végző tioszulfát-oxidálók általánosan elterjedtek a tó vizében és

üledékében. Csíraszámuk a SRB-ét meghaladta, aktivitásuk a tó vízszintjének csökkenésével

nőtt. Az anaerob fototrófok a SRB-hoz hasonló csíraszámban voltak jelen. A BIOLOG

szénforrás értékesítés mintázata alapján a Velencei-tó vizének és üledékének

mikróbaközösségét 2001-2003 között vizsgálva, határozott térbeli különbségeket lehetett

megfigyelni. Az első két évben a szezonális különbségek az üledékmintákban nagyobbak

voltak, mint a vízmintákban. Ez alapján feltételezhető, hogy a metabolikusan aktív aerob

kemoorganotróf sejtek aránya az üledékben nagyobb mértékben ingadozott, mint a víztestben

(Reskóné és Borsodi, 2003).

Az üledék aerob alkalofil és anaerob fermentáló és szulfát-redukáló szervezeteinek

aktivitását és szénforrás-értékesítését Borsodi és mtsai (2001, 2003a, 2003b) kutatásai alapján

ismerjük. A Velencei-tó üledékéből izolált baktériumtörzsek tenyésztésére alkalofil

szervezetekre szelektáló táptalajt alkalmaztak. Fenotípusos tulajdonságokon alapuló

numerikus analízist, majd ARDRA csoportosítást követően a reprezentáns törzseket 16S

rDNS-ük parciális szekvenálásával azonosították. A fenotípusos tesztek eredményei ebben a

vizsgálatban is nagy mértékű biokémiai inaktivitásra utaltak, az összes izolált törzs Gram-

pozitív volt. Az identifikált törzsek a legnagyobb hasonlóságot a Bacillus cohnii, a B.

pseudofirmus, a B. halmapalus és a B. marinus fajokkal mutatták, néhány törzs csak kis

mértékű hasonlóságot mutatott a már ismert fajokkal, ezeket új taxonokként valószínűsítették.

A tó nádasainak rizoszféra-asszociált aerob közösségeit Micsinai és munkatársai

(2003) térképezték fel munkájuk során. Az egészséges és pusztuló nádrizómák vizsgálati

eredményei arra utaltak, hogy kora nyáron az egészséges és pusztuló nádasállományok

baktériumközösségei nem különböztek nagymértékben egymástól. A vegetációs periódus

előrehaladtával mindkét közösség struktúrája megváltozott. Az őszi egészséges mintákból

kitenyésztett baktériumközösség a környezeti változásokhoz sokkal adaptívabb metabolikus

potenciállal rendelkezett, mint a pusztulóból nyert: képes volt a respiratórikus és a fermentatív

anyagcsere között is váltani, továbbá a tápanyagok sokkal szélesebb spektrumát volt képes

hasznosítani. A pusztuló nádasállomány baktériumközössége is változott időben, kisebb

arányban voltak jelen fakultatív fermentatív szervezetek, mint az egészséges állományban. A

kora nyári minták az őszi mintákhoz képest sokkal inkább hasonlítanak egymásra, és ez a faji

összetételben is tükröződik. Az identifikáció eredményei arra utaltak, hogy a kora nyári és

18

őszi minták baktériumainak metabolikus aktivitásbeli változása mögött egy faji összetétel-

váltás is meghúzódik. Az egészséges nádasállományok rizómáin az obligát respiratórikus

anyagcserét folytató kora nyári közösség helyét őszre egy döntően fakultatív fermentatív

közösség veszi át (Aeromonas, Erwinia, Pantoea fajok). A pusztuló nádasállománynál nem

ilyen egyértelmű az eltolódás a fakultatív fermentatív anyagcseréjű fajok túlsúlyának

irányába, mégis egészen más fajokat (Acinetobacter, Rhizobium, Brenneria, Curtobacterium)

sikerült kitenyészteni.

A tó nádasainak rizoszféra-asszociált anaerob közösségeit Vladár és munkatársai

(2008) vizsgálták munkájuk során. A Velencei-tóból izolált és identifikált Clostridium fajok

mindegyike előfordult mind az egészséges, mind a pusztuló nádasok rizoszféra

környezetében, az egyes mintavételi helyek között azonban eltérés volt megfigyelhető a

különböző szénforrás hasznosító képességekkel jellemezhető fajok arányában. A

Desulfovibrio alcoholivorans mellett D. fructosivorans, D. desulfuricans és egy

feltételezhetően a tudomány számára új Desulfovibrio- és Desulfotomaculum faj került elő a

rizoszférából A klónozás eredménye a tenyésztéses vizsgálatokkal egybehangzóan

Desulfovibrio dominanciát mutatott, valamint Desulfobulbus nemzetséghez tartozó fajok

kerültek elő számottevő mennyiségben.

A nád biofilm baktériumközösségeinek kutatását megelőzően a Velencei-tó

nádbevonatában található algák vizsgálatát Lakatos és Bartha (1989) kezdték meg. 1988-ban

kisebb-nagyobb kihagyásokkal folytatódott a Velencei-tó bevonatlakó algáinak vizsgálata,

aminek célja egyrészt a tó különböző területein a nádbevonat algaszervezeteinek mennyiségi

és minőségi elemzése, másrészt a tó nádbevonatában bekövetkezett változások megismerése

volt (Lakatos és Ács 1990, Lakatos és mtsai 1991; Ács és mtsai 1991, 1994, 2001; Ács és

Buczkó 1994; Buczkó és Ács 1997, 1998). A Velencei-tó nádbevonatának nemcsak

legfajgazdagabb, de relatív mennyiségét tekintve is legabundánsabb csoportját a kovaalgák

képezik. Esetenként a cianobaktériumok és zöldalgák aránya is nagy. Az Ács és mtsai által

végzett (2007) hosszú távú vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy számos konstans fajjal

jellemezhető a Velencei-tó nádbevonata, melyek a tó két eltérő vízminőségű területén

különbözőek ugyan, de évről évre megtalálhatók a bevonatban. Az utóbbi években az

algavizsgálatokat bakteriológiai és elemtartalom vizsgálatok is kiegészítették, hogy a bevonat

működéséről komplexebb képet kaphassunk (Ács és mtsai, 2003; Kröpfl és mtsai, 2003a, b;

Záray és mtsai, 2005). Elkezdődtek egyes növényvédő szer származékok (acetoklór, atrazin)

lebontását vizsgáló kísérletek is, melyekben a bevonat mikroszervezeteinek a szerepe

elsődleges (Bohus és mtsai, 2005).

19

A Kiskunsági Nemzeti Park területén fennmaradt legjelentősebb szikes tavak

természeti állapotfelmérése 1998-ban kezdődött meg. A térség szikes tavainak nekton-,

mezozooplankton-, makrozoobenton- és Protozoa-közösségeit számos kutatás eredményeiből

ismerhetjük meg (Forró és Boros, 1997; Szabó, 2001, 2003; Andrikovics és Murányi, 2003;

Boros, 2003; Boros és mtsai, 2006). A fehér vizű szikesek fizikai és kémiai környezetének

legutóbbi vizsgálatai (Vörös és V. Balogh, 2003; Vörös és mtsai, 2006) rámutattak, hogy

ezeknek a tavaknak a vizében a fotoszintetikusan aktív sugárzás extinkciójához a fitoplankton

kis mértékben járul hozzá. A magas sótartalmú, zavaros, fehér vizű kiskunsági tavakban

rendkívül sajátos pikoplankton-együttest figyelhető meg, az 1 µm átmérőjű, magányos,

fikocianin dominanciájú pikocianobaktériumok esetenként tömeges előfordulását mutatták ki.

Tengerek és édesvizek vonatkozásában a trofikus státus és a pikoplankton részaránya közötti

összefüggés igen jól dokumentált, eszerint a klorofill-a mennyiségének növekedésével a

pikoplankton részesedése meredeken csökken. A vizsgált szikes tavak azonban nem

„követték” ezt az általános trendet (Vörös és mtsai, 2005). A kiskunsági szikes vizek

bakteriológiai kutatásai az üledék és víz heterotróf baktériumainak vizsgálatával kezdődtek

meg. A Kiskunság szikes tavait tenyésztésen alapuló bakteriológiai vizsgálata során kétféle

táptalajt alkalmazva a Halomonas, a Pseudomonas, a Nesterenkonia, a Micrococcus és az

Agromyces nemzetségek mellett többségében a Bacillus nemzetségbe tartozó törzseket

izoláltak. A fenotípusos tesztek nagy mértékű inaktivitásról tanúskodtak, és a törzsek több

mint 80 %-a Gram-pozitív volt (Szabó és mtsai, 2004; Borsodi és mtsai, 2005a).

A Tiszántúlon található Nagy-Vadas-tó és Fehér-szik üledék baktériumközösségeinek

megismerését, metabolikus és faji diverzitásának feltárását Pollák és munkatársai (2006)

végezték el. A két tó tenyésztéses vizsgálatok során megismert baktériumközösségei nem csak

egymástól, hanem a hozzájuk hasonló vízkémiai paraméterekkel rendelkező kiskunsági

tavaktól is elkülönültek. Az azonosított fajok közel fele 98%-nál alacsonyabb szintű

szekvencia hasonlóságot mutatott már leírt fajokkal, így ezek feltehetően a tudomány számára

új taxonok. A Fehér-szikből elsősorban különböző Bacillus fajok kerültek elő nagy

diverzitásban, míg a Nagy-vadasból a Nesterenkonia és a Pseudomonas nemzetség képviselői.

A klónozás anaerob, illetve kemolitotróf, mixotróf és fototróf szervezetek jelenlétének

igazolásával egészítette ki a tenyésztéses vizsgálatok eredményeit. A BIOLOG vizsgálatok

alapján az egyes minták elsődlegesen évszakonként csoportosultak.

A fenti szerteágazó kutatásokat kiegészítendő kezdtük meg a Velencei-tó, a kiskunsági

Kelemen-szék, valamint a tiszántúli Nagy-Vadas nádasainak biofilm baktériumközösségeinek

20

vizsgálatát hagyományos, tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független módszerek

alkalmazásával.

A hagyományos tenyésztésen alapuló eljárások alapvető fontossággal bírnak a

bakteriológiai kutatásokban, hiszen csak általuk nyílik lehetőségünk az adott környezetben

előforduló baktériumok sokoldalú laboratóriumi vizsgálatára. Ez egyrészt segíthet megérteni

az egyes baktériumok közösségben betöltött szerepét, másrészt közelebb vihet bennünket a

közösség egésze működésének megismeréséhez. A tenyésztéses eljárások során azonban

általános problémaként merül fel, hogy elegendően sokféle táptalaj alkalmazása esetén is az

adott környezetben jelenlévő és aktív baktériumközösségeket alkotó fajoknak csak töredékét,

becslések szerint mindössze 0,1-10%-át sikerül izolálni és tiszta tenyészetben fenntartani

(Amann és mtsai, 1998).

A közösségek biokémiai aktivitási viszonyainak feltérképezésére és a változások

nyomon követésére („anyagcsere ujjlenyomat”) a BIOLOG, Inc. (Hayward, California, USA)

által kifejlesztett gyorsdiagnosztikai eljárás a közösség szénforrás hasznosító képességének

tesztelésével közvetlenül, a mikroorganizmusok tenyésztése nélkül teremt lehetőséget. A

BIOLOG GN2 lemezek 95, az ECO lemezek 31 különféle szénforrást (polimereket,

szénhidrátokat, karbonsavakat, aminosavakat, aminokat, amidokat, stb.) és oxidált állapotú,

színtelen tetrazólium-ibolya redox-indikátort tartalmaznak. A szénforrás hasznosítását követő

színváltozás kolorimetriásan értékelhető, és a minták közti különbségek az adatok

többváltozós statisztikai elemzésével meghatározhatók (Garland és Mills, 1991; Choi és

Dobbs, 1999; Haack és mtsai, 1995, Victorio és mtsai, 1996; Garland, 1997; Konopka és

mtsai, 1998; Smalla és mtsai, 1998).

A baktériumközösségek faji diverzitásának mind teljesebb megismerésére a

molekuláris biológiai technikáknak a mikrobiális ökológiába történő bevezetése és

alkalmazása teremtett forradalmian új lehetőséget (Ferris és mtsai, 1996; Grey és Herwig,

1996; Felske és mtsai, 1997; Teske és mtsai, 1998; Santegoeds és mtsai, 1998). Ma már

rendkívül sokféle molekuláris módszer áll rendelkezésünkre a baktériumközösségek genetikai

diverzitásának és szerkezetének feltérképezésére. Ezek egy része a teljes genetikai

információt vizsgálatára („whole genomic community DNA analyses”) nyújt lehetőséget,

mint pl. a különböző mintákból származó DNS-ek hibridizáltatása vagy a prokarióta DNS-ek

G+C-tartalmának különbözőségét kihasználó denzitás-gradiens módszer (Lee és Furhman,

1990; Holben és Harris, 1995). Más technikák a teljes genom egy részének („partial

community DNA analyses”) a feltárására irányulnak diverzitás becslés és a közösség

összetételének megismerése céljából. A közösségi mintából izolált összes genomiális DNS-

21

nek leggyakrabban a 16S rRNS-t kódoló szakaszát (16S rDNS) szaporítják fel PCR

segítségével, és az így nyert vegyes PCR termékből különféle diverzitásbecslő eljárások

segítségével (klónozás, DGGE, TGGE, ARDRA, TRFLP) következtetnek az előforduló fajok

számára és sokféleségére. A módszerek egy részénél az egyes fajokra jellemző 16S rDNS

szakaszok elkülönítése is megtörténik, ami lehetőséget ad az adott fajokra jellemző 16S rDNS

parciális nukleotid-sorrendjének szekvenálással történő meghatározására, és mód nyílik a

baktériumok nemzetség, vagy faji szintű azonosítására (Stackebrandt és mtsai, 1993; Dunbar

és mtsai, 1999).

A környezeti mintákból közvetlenül nyert közösségi DNS-ből kiinduló diverzitás

becslésre a nagy adatbázis létrehozása miatt meglehetősen időigényes és költséges klónozásos

eljárás mellett molekuláris ujjlenyomat módszerek, pl. a denaturáló gradiens gélelektroforézis

(DGGE) is alkalmazható. A DGGE során kapott csíkok száma, helye és intenzitása

információval szolgál a vizsgált közösség faji struktúrájáról, és így lehetőség nyílik különféle

minták diverzitásának összehasonlítására is (Boon és mtsai, 2002). A módszer hátránya, hogy

főként a mintában dominánsan előforduló fajokra szelektál, így előfordulhat, hogy kevésbé

abundáns, de a közösség szempontjából fontos szereppel bíró fajok „rejtve” maradnak. E

módszer segítségével, melyet természetes környezetek bakteriális közösségeinek vizsgálatára

és mesterséges rendszerek, például szennyvíztisztítók növényeinek baktériumközösségei

megismerésére is használnak, viszonylag gyorsan és költségkímélő módon juthatunk

eredményhez (Muyzer és mtsai, 1997).

Mindazonáltal meg kell jegyeznünk, hogy a molekuláris biológiai technikák más-más

módon és mértékben, mint a tenyésztéses eljárások, de ugyancsak szelektívek (Rainey és

mtsai, 1996; Vallaeys és mtsai, 1997; von Wintzingerode és mtsai, 1997). Ezért a vizsgált

baktériumközösségek minél sokoldalúbb megismerése nem nélkülözheti a molekuláris

biológiai módszerek és a tenyésztésen alapuló klasszikus eljárások ötvözését.

22

5. Célkitűzések

Hazánk nagy tavainak (Balaton, Fertő, Velencei-tó), valamint alföldi szikes vizeinek

parti régiójában található nádasok makrofita társulásalkotó növénye a nád (Phragmites

australis/Cav./Trin et Steudel). A nád és a nádasok szerepét és működését sokan, sokféle

szempontból vizsgálták, azonban a nád szár víz alatti részén kialakuló biofilm

baktériumközösségek faji összetételéről és metabolikus aktivitásáról kevés adat áll

rendelkezésünkre.

Munkánk során hazánk három szikes tava: a Velencei-tó, a kiskunsági Kelemen-szék

és a tiszántúli Nagy-Vadas tó nádasállományainak biofilmjében található

baktériumközösségek metabolikus potenciálját és faji diverzitását kívántuk feltérképezni.

Jelen munka egyik célja a vizsgált biofilm minták közösségi szintű anyagcseréjének és

szezonális dinamikájának megismerése volt. További célként tűztük ki a biofilm minták

baktériumközösségeinek szerkezetében megfigyelhető esetleges területi különbségek, illetve a

szezonális dinamika feltárását. Ennek érdekében tavasszal, nyáron és ősszel végzett évszakos

mintavételeket követően BIOLOG GN2 és ECO lemezek felhasználásával közösségi

szénforrás értékesítési vizsgálatokat végeztünk. A baktériumközösségek genetikai diverzitását

és annak változását dentauráló gradiens gélelektroforézis (DGGE) segítségével

tanulmányoztuk.

Az elvégzett vizsgáltatok másik célja a vizsgált nád biofilmek alkotásában résztvevő,

tenyészthető aerob baktériumközösségek mennyiségi viszonyainak csíraszámbecslés

segítségével történő meghatározása, és a baktériumközösségekből izolált törzsek morfológiai,

fiziológiai és ökológiai tolerancia tesztek alapján történő jellemzése volt.

Célul tűztük ki továbbá mindhárom tó esetében a nád biofilm baktériumközösségek

filogenetikai diverzitásának feltárását, tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független

molekuláris klónozásos vizsgálatok eredményeinek összehasonlításával.

23

6. Vizsgálati anyagok és módszerek

6.1 Mintavétel

A Velencei-tó három pontján, a Fürdető (N 47º14.006’ E 018º39.042’), az Agárd-

Gárdony Hosszútisztás (N 47º12.038’ E 018º35.786’) és a Lángi-tisztás (N 47º11.769’ E

018º33.939’) területén vettünk nádszár mintákat. A Kiskunsági Nemzeti Park területén a

Kelemen-szék (N 46°47´ E 19°11´), a Tiszántúlon a Hortobágyi Nemzeti Park kezelésében

lévő, Nyíregyháza közelében fekvő Nagy-Vadas-tó (N 47°52’; 21°40’E) nádasállományaiból

végeztünk mintavételezést. Az egyes mintavételi területeket a 2. ábra mutatja. A mintavételi

időpontokat és az egyes mintákkal elvégzett vizsgálatokat az 1. táblázat foglalja össze.

Mintavételi hely

Mintavételi időpont

BIOLOG GN2 plate

BIOLOG ECO plate DGGE tenyésztés klónozás

2000. 04. X X

2001. 07. X X

2003. 05. X X

2003. 08. X X

2003. 10. X X

2006. 05. X X X

2006. 08. X X

Velencei-tó

(Fürdető,

Agárd-

Gárdony-

Hosszútisztás,

Lángi-tisztás)

2006. 10. X X

2004. 04. X X

2005. 05. X X

2005. 07. X X

2005. 11. X X

2006. 05. X X

2006. 07. X X

Kelemen-

szék és Nagy-

Vadas

2006. 10. X X

1. táblázat Az egyes területeken végzett mintavételek időpontjai és az elvégzett vizsgálatok

(Az adott minta esetében alkalmazott módszert X jelöli.)

24

Ag á rd - G ár d o n y H o s s zú - t is z tá s

L á n gi- t is z tá s

F ürd e tő

É

1. ábra Mintavételi helyek

25

Mindegyik mintavételi területen a vízfelszín alól kb. 10 cm-es mélységből 5-8 db 15-

20 cm hosszú nádszálat gyűjtöttünk, mind a fiatal, mind pedig a többéves nádasállományból.

A mintákat a 24 órán belül elvégzett feldolgozásig 4-6°C-os hőmérsékleten, steril fiziológiás

sóoldatban (0,9 g NaCl 100,0 ml desztillált vízben) tároltuk. A minták bakteriológiai

feldolgozása során az egyes mintavételi területekről származó párhuzamos mintákból

homogenizált preparátumot készítettünk úgy, hogy a nádszálak külső felületéről steril ecset

segítségével fiziológiás sóoldatba mostuk a bevonatot.

6.2 Baktériumközösségek szénforrás hasznosításon alapuló fenotípusos

ujjlenyomata

A megfelelően szuszpendált és higított mintákból tenyésztés nélkül ún. közösségi

szénforrás értékesítési vizsgálatot végeztünk BIOLOG lemezek (GN2 mindhárom tó, ECO a

Velencei-tó három mintavételi területe esetében) felhasználásával (Függelék 1. ábra).

A BIOLOG gyors identifikációs teszt (Hayward, California, USA) 95 különböző

szénforrás egyidejű bakteriális oxidációjának vizsgálatán alapul. Felhasználásával tiszta

tenyészetek identifikálására, illetve közösségi anyagcsere-mintázat megismerésére és

összehasonlítására van lehetőség. A lemezek mélyedései a dehidratált szénforrásokon kívül

tetrazólium redoxindikátort tartalmaznak. A színtelen indikátor lilásrózsaszín formazánná

történő redukciója jelzi, ha a baktériumtörzs, illetve közösségi vizsgálatok esetén a

baktériumközösség valamely tagjai hasznosítják az adott vegyületet.

A közösségi szénforrás értékesítési vizsgálat során a mintából steril fiziológiás sóoldat

felhasználásával a GN2-NENT standardnak megfelelő sűrűségű inokulumot állítottunk elő. A

szuszpenziók megfelelő denzitását turbidiméterrel állítottuk be. A kb. 20 ml térfogatú mintát

steril műanyag edénybe öntöttük, majd ezekből automata pipetta segítségével 150 µl-nyi

mennyiséget inokuláltunk a BIOLOG GN2, illetve ECO lemezeknek mind a 95, illetve 31

szénforrást és indikátort tartalmazó csövecskéjébe, valamint a kontroll csövecskébe (ez utóbbi

szénforrást nem, csak indikátort tartalmazott). A lemezeket 28°C-on inkubáltuk. A szubsztrát

hasznosítást mutató abszorpció értékeket ELISA Reader (Labsystems Multiscan PLUS)

segítségével OD590 értéken olvastuk le 24, 48, 72, 96 és 120 óra elteltével. Kiértékelésnél a

pozitív reakciót a csövecskékben lévő indikátor bíbor színűvé válása jelezte. Ennek erősségét

a kontrollhoz (A1) viszonyított számérték nagysága határozza meg.

26

Az eredmények értékelésekor a mintákat az értékesített szubsztrátok típusa,

valamint a különböző minták közösségi-szintű mikrobiális szénforrás értékesítési

mintázatának főkomponens analízise (PCA) (Podani, 1997) alapján hasonlítottuk össze. A

mikróba közösségek szubsztrát hasznosítására utaló átlagos színfejlődés mértékét [AWCD

= Σ(i = 1, 95) (Ri−C)/95; ahol C a kontroll csőben (A1) mért adszorpció érték; Ri az i-edik

csőben (A2−H12) mért adszorpció érték] 24, 48, 72 és 96 órás inkubáció elteltével

határoztuk meg. Kiszámítottuk az egyes minták ún. „substrate richness” értékeit, azaz az

adott BIOLOG lemez azon zsebeinek számát, melyek OD-je egy adott alap OD értéknél

nagyobb volt (Gomez és mtsai, 2004). A főkomponens analízis (PCA) az ordinációs

módszerek közé tartozik, melynek segítségével az adatmátrix dimenzióinak a számát új

változók bevezetésével csökkentjük. Ennek során olyan koordináta transzformációkat

hajtunk végre, amivel arra törekszünk, hogy az új tengelyek (komponensek) adataink

összvarianciájának lehető legnagyobb részét megmagyarázzák. Az eredeti változókhoz

képest nagyobb varianciát magyarázó új komponensek létezése a változók közötti lineáris

korrelációknak köszönhető. Ezért amikor az új komponensek függvényében ábrázoljuk az

objektumokat, és azok valamelyik komponens szerinti elkülönülését látjuk, a változók

varianciájának szempontjából a csoporton belül kisebbek a különbségek, mint a csoportok

között.

6.3 Tenyésztésen alapuló vizsgálatok

6.3.1 Csíraszámbecslés és baktériumtörzsek izolálása

A táptalajok kiválasztásánál a következő szempontokat vettük figyelembe:

- növény-mikróba interakciók vizsgálatakor alkalmazott táptalajok a King B (Cowan és Steel,

1974) és Trypticase soy yeast (TSY, DSMZ medium 92);

- a vizsgált tavak vizének kémiai sajátságai miatt Horikoshi-féle alkalikus (Horikoshi, 1991)

táptalaj; az alkalikus táptalaj a vizek kémiai sajátosságait tükrözi: lúgos kémhatás,

magas Na+ és CO32- -ion koncentráció;

- a természetes környezetekben jellemző oligotróf környezeteket modellező oligotróf jellegű

Caulobacter (Poindexter, 1991) táptalaj;

27

- a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas esetében a velencei-tavi mintákhoz alkalmazott és a

fentiekben felsorolt táptalajokat használtuk, a TSY táptalaj kivételével, amely helyett

negyedik táptalajként a mesterséges tengervizes táptalajt (DSMZ medium 246)

alkalmaztuk. A tengervizes táptalaj megemelt koncentrációban tartalmaz ionokat,

kiemelten sok Na+-ot és Cl--ot.

A homogenizált mintákból higítási sorozatot készítettünk, és annak egyes tagjaiból

0,1-0,1 ml-t az alábbi összetételű táptalajokra szélesztettünk:

King B (Cowan és Steel, 1974)

Proteóz pepton No 3. 20,0 g

Glicerin 10,0 g

K2HPO4 1,5 g

MgSO4 x 7H2O 1,5 g

Agar 18,0 g

Desztillált víz 1000,0 ml

pH: 7,0-7,2

sterilizálás: 121°C, 1 atm túlnyomás, 15 perc

Trypticase soy yeast (TSY) (DSMZ medium 92)

Pankreásszal emésztett kazein 14,5 g

Papainnal emésztett szójaliszt 5,0 g

NaCl 5,0 g

Növekedési faktorok 1,5 g

Agar 20,0 g

pH: 7,0-7,2

sterilizálás: 121°C, 1 atm túlnyomás, 15 perc

Caulobacter táptalaj (Poindexter, 1991)

Pepton 12,0 g

MgSO4 0,2 g

CaCl2 2H2O 0,15 g

Agar 20,0 g

pH: 7,0-7,2

sterilizálás: 121°C, 1 atm túlnyomás, 15 perc

28

Horikoshi-féle alkalikus táptalaj (Horikoshi, 1991):

Glükóz 10,0 g Pepszinnel emésztett pepton 5,0 g Élesztőkivonat 5,0 g K2H2PO4 1,0 g MgSO4×7 H2O 0,2 g Na2CO3 5,0 g Agar 20,0 g desztillált víz 1000,0 ml

pH: 9,0 sterilizálás: 121°C, 0,7 atm túlnyomás, 40 perc

Mesterséges tengervizes táptalaj (DSMZ medium 246):

Húskivonat 10,0 g Pepton 10,0 g Agar 20,0 g csapvíz 250,0 ml tengervíz 750,0 ml

tengervíz:

NaCl 28,13 g KCl 0,77 g CaCl2 * 2 H2O 1,60 g MgCl2 * 6 H2O 1,0 g NaHCO3 0,11 g MgSO4 * 7 H2O 3,5 g desztillált víz 1000,0 ml

pH: 7,5 sterilizálás: 121°C, 1 atm túlnyomás, 15 perc

Egy hetes 25°C-os inkubáció után a lemezeken kifejlődő telepek száma alapján

csíraszámbecslést végeztünk, melynek során csak azokat a lemezeket vettük figyelembe, ahol

20-nál több, de 200-nál kevesebb telep jelent meg. A különálló kolóniák közül véletlenszerűen

a lemezekkel azonos összetételű ferde agarra törzseket izoláltunk.

6.3.2 A baktériumtörzsek fenotípusos jellemzése

Kulturális-morfológiai vizsgálatok

A kolóniák izolálása során feljegyeztük az egyes telepek következő tulajdonságait:

29

• kolóniák mérete • alakja • színe • konzisztenciája • oldódó pigment jelenléte.

Sejtmorfológiai vizsgálatok

• sejtek mérete • sejtek alakja • Gram-szerinti festődés (Cowan és Steel, 1974)

Biokémiai-élettani vizsgálatok (Cowan és Steel, 1974)

• oxidáz-teszt • kataláz-teszt • mozgásképesség vizsgálata • Hugh-Leifson-teszt: a glükóz oxidatív és fermentatív értékesítése

(24 órán, illetve 1 héten belül) • gáztermelés glükóz hasznosításakor • kénhidrogén-termelés ciszteinből • indol-termelés triptofánból • metilvörös-teszt • Voges-Proskauer-reakció • eszkulin-hidrolízis • disszimilatív nitrát-redukció • Tween 80 lipolitikus (észteráz) aktivitás • keményítő-hidrolízis • kazeáz-aktivitás • zselatin bontás • Horikoshi-féle alkalikus celluláz teszt (1995).

Ökológiai tolerancia tulajdonságok vizsgálata

A Kelemen-székről és a Nagy-Vadasról származó nád biofilmből izolált törzsek

esetében a pH- és sótűrési vizsgálatokat is végeztünk.

• 0%, 5%, 7%, 12%-os NaCl koncentrációjú és 8-as pH-jú nutrient levesek: NaCl tolerancia vizsgálata.

• 7, 8, 9, 10, 11 pH értékű, 5% NaCl koncentrációjú nutrient levesek: pH tolerancia vizsgálata.

30

6.3.3 A baktériumtörzsek genotípusos jellemzése

A baktériumtörzseket részletes kulturális- és sejtmorfológiai, biokémiai-élettani

vizsgálatoknak vetettük alá. A tisztított baktériumtörzsek fenotípusos tulajdonságait

hagyományos tesztsorozatok segítségével vizsgáltuk. Ezt követően elvégeztük a törzsek

ARDRA analízisét. A pontos faji meghatározás érdekében a csoportreprezentánsok 16S

rDNS-ét parciálisan szekvenáltuk.

Genomiális DNS kinyerése és tisztítása baktériumtörzsből

A genomiális DNS kinyerését és tisztítását a Mikrobiológiai Tanszéken rendelkezésre

álló módszerek és kitek segítségével végeztük. Ez a 2000. áprilisi és 2001. júliusi velencei-

tavi mintákból izolált törzsek esetében Rainey és mtsai (1996) módszerét jelentette, míg a

2004. áprilisában a Kelemen-szék és Nagy-Vadas nád biofilmjéből származó törzsek esetében

a Bacterial Genomic DNA Mini-prep Kit (V-gene) alkalmazását (a gyártó útmutatásának

megfelelően 24 órás baktériumtörzsekből kiindulva). A feltárás során fizikai és kémiai

lépéseket egyaránt alkalmaztunk. Az izolált DNS-t -20°C-on tároltuk. Az egyes módszerek

eredményességüket tekintve nem különböztek egymástól, választásunk az aktuális

laboratóriumi gyakorlat szerint történt.

• 400 µl NaCl-EDTA pufferben (0,15 M NaCl, 0,01 M EDTA Na-sója, pH 8,0) egy kacsnyi baktériumot szuszpendáltunk fel egy 1,5 ml-es Eppendorf-csőben.

• 10 µl lizozimoldatot (10 mg/ml) adtunk hozzá, vortexeltük, majd 30 percig 37 °C-on vízfürdőben inkubáltuk.

• 5 µl Proteináz-K-t (10 mg/ml) és 10 µl SDS-t (25% w/v) adtunk hozzá, vortexeltük és tovább inkubáltuk 60 °C-on 30 percig.

• A mintákat extraháltuk 400 µl TRIS/EDTA-val telített fenol hozzáadásával, majd vortexelés után 4 °C-on, 14000 rpm-en 10 percig centrifugáltuk.

• A felülúszó vizes fázist egy új 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe vittük át és extraháltuk 400 µl kloroform hozzáadásával, majd vortexelés után 4 °C-on, 14000 rpm-en 10 percig centrifugáltuk.

• A felülúszó vizes fázisból 300 µl-t egy újabb 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe vittünk át, majd a DNA Extraction Kit (Fermentas) segítségével tovább tisztítottuk az alábbiak szerint:

• 900 µl Fermentas Binding Solutiont adtunk hozzá és óvatosan összeráztuk. • 7 µl Fermentas Silica Powder Suspension mátrixot hozzáadva, enyhe rázás után

5 percig inkubáltuk 55 °C-on, közben kétszer vortexeltünk. • 5 mp-es lepörgetés után óvatosan elöntöttük a felülúszót.

31

• 500 µl hideg Wash Buffert adtunk hozzá a csapadékhoz, majd vortexelés és 5 mp-es lepörgetés után ismét eltávolítottuk a felülúszót. A műveletet még kétszer ismételtük meg, ügyelve arra, hogy a pelletet mindig tökéletesen reszuszpendáljuk.

• A felülúszó utolsó leöntése után a mintát újból lepörgettük, majd a maradék Wash Buffert pipettás leszívással eltávolítottuk.

• 40 µl HPLC tisztaságú, steril víz hozzáadása és vortexelés után 5 percig 55 °C-on inkubáltuk mintáinkat, majd 2 percig 13000 rpm-en centrifugáltuk.

• 35 µl felülúszót átvittünk egy újabb Eppendorf-csőbe és 4 °C-on tároltuk.

A templát DNS detektálása agaróz gélelektroforézissel

• 1%-os agaróz gélt (90 ml bidesztillált víz + 1 g agaróz + 10 ml 10×TBE puffer) készítettünk, amely 5,0 µl etídium-bromidot tartalmazott.

• 5 µl mintát 3 µl töltőpufferrel (30 V/V% glicerin, 0,25 mM brómfenolkék) kevertünk össze, majd a zsebekbe töltöttük.

• 1 µl DNS molekulasúly markert (λ-fág EcoRI és HindIII restrikciós enzimekkel hasított DNS-e; Fermentas) az egyik szélső zsebbe mértünk, ezáltal megbecsülhettük a templát DNS hosszát.

• 20 percig 100 V-on futattuk a gélt 1×TBE pufferben (107,8 g/l TRIS, 55 g/l bórsav, 7,4 g/l EDTA, pH 8,3).

• UV fényben detektáltuk a DNS-t. Az etídium-bromid a DNS nagy árkába köt, így UV fényben láthatóvá teszi a molekulát.

A 16S rDNS szakasz felszaporítása polimeráz láncreakcióval (PCR)

Mintánként és reakciónként 46 µl premix oldatot mértünk össze 0,2 ml-es PCR

reakciócsövekbe az alábbiak szerint:

• 5 µl 10xPCR puffer (Fermentas) (200 mM TRIS/HCl, 15 mM MgSO4, 100 mM KCl)

• 10 µl dNTP keverék (Fermentas) (1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP)

• 4 µl MgCl2 • 0,5 µl 27 forward primer (5’ GAGTTTGATCCTGGCTCA 3’) (0,5 µg/ml)

(Lane, 1991) • 0,5 µl 1492 reverz primer (5’ TACGGC/TTACCTTGTTACGACTT 3’)

(0,5 µg/ml) (Lane, 1991) • 27 µl steril dH2O Az így összemért premixet vortexeltük, majd rövid ideig centrifugáltuk. Hozzáadtunk

2 µl templát DNS-t, vortexeltük, majd az elegyet centrifugában a csövek aljára pörgettük.

A mintákat Whatman Biometra Tpersonal PCR berendezésbe helyeztük, amelyben a

kezdeti denaturációs lépés (98 °C, 5 percig) után a 94 °C-os hőmérséklet elérésekor a

32

reakcióközeghez 1 µl Taq polimeráz enzimet (LC low concentration Taq, 1 U/µl, Fermentas,)

adtunk.

Az alábbi hőprofil mellett futtattuk le a 28 ciklust:

1. Primer anelláció 52 °C 30 mp 2. Extenzió 72 °C 1 perc 28×(1.; 2.; 3.) 3. Denaturáció 94 °C 30 mp 4. Végső extenzió 72 °C 7 perc

Végül a minták 4 °C-ra hűtése, és ilyen formában esetleges tárolása. A PCR termék

detektálását agaróz gélelektroforézissel a tisztított DNS detektálásánál leírtakkal megegyező

módon végeztük.

A PCR termék tisztítása Viogene PCR-M Clean Up System Kit segítségével

• A gyártó útmutatásának megfelelően. • Az így kapott mintákat további felhasználásig -20 °C-on tároltuk. • A tisztított PCR terméket agaróz gélelektroforézissel detektáltuk a korábban

ismertetett módon.

A PCR termék ARDRA mintázatának elemzése

A PCR termékek restrikciós emésztését Hin 6I és Alu I enzimekkel végeztük

(Fermentas). Egy reakcióra számolva az alábbi premix oldatot készítettük el:

Y+/Tango puffer (Fermentas) 2,5 µl dH2O 15,3 µl Enzim 0,2 µl

• 7 µl tisztított 16S rDNS PCR terméket adtunk a csövekbe szétmért premix

oldathoz és vortexeltük. • min. 12 órán át 37 °C-os vízfürdőben inkubáltuk a mintákat. • Az emésztett DNS termékeket agaróz gélben detektáltuk az alábbi módon: • 100 ml 2%-os agaróz gélt készítettünk, amely 7 µl etídium-bromidot

tartalmazott. • 13 µl emésztett PCR terméket és 4 µl töltő puffert összekevertünk és a

gélzsebekbe töltöttünk. • 2 µl DNS molekulasúly markert 2 µl töltőpufferrel keverve a zsebekbe

töltöttünk. • 80 V-on 70 percig futtattuk a gélt 1×TBE pufferben (107,8 g/l TRIS, 55 g/l

bórsav, 7,4 g/l EDTA, pH 8,3).

33

• A DNS fragmentumok által létrehozott sávmintázatot UV fényben detektáltuk, és lefényképeztük.

• A mintázati csoportokat (ARDRA-csoportok) manuális ellenőrzéssel alakítottuk ki.

Fajmeghatározás

A tisztított 16S rDNS PCR termékek parciális szekvenálását a jelölt terminátorú

ciklikus szekvenálás (Dye Terminator Cycle Sequencing, Perkin Elmer) módszerével és ABI

PRISM 310 automata szekvenátorral (Perkin Elmer) végeztük el.

A ciklikus szekvenáló reakció

PCR csövekbe az alábbi összetételű premixet és 6 µl (–10 µl) tisztított PCR terméket

mértünk:

Big Dye Terminator Ready Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer) 2 µl

5x hígító puffer (Perkin Elmer) 3 µl

519r primer (5’ G(T/A)ATTACCGCGGC(T/G)GCTG 3’) (0,5 µg/ml) (Stackebarnadt és Liesack, 1993)

1 µl

Steril HPLC minőségű dH2O 6,5 µl

A mintákat 96°C-on PCR készülékbe helyeztük, és az alábbi hőprofil mentén

szaporítottuk fel a DNS szakaszt:

1. denaturáció 96 °C 10 mp 2. primer anelláció 50 °C 5 mp 28×(1.; 2.; 3;) 3. extenzió 60 °C 4 perc

A termékeket az eljárás folytatásáig 4 °C-on tároltuk.

A szekvenáló reakció termékének tisztítása • 0,5 ml-es Eppendorf-csőbe az alábbi összetételű elegyhez 20,0 µl szekvenáló

reakció terméket pipettáztunk: 95% etil-alkohol 62,5 µl

3 M Na-acetát-oldat 3 µl

steril HPLC minőségű dH2O 14,5 µl

34

• A mintákat vortexelés után 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd -20°C-on 20 percig 14000 rpm-en centrifugáltuk, és a felülúszót óvatosan leszívtuk.

• A pellethez 250 µl 70%-os etanolt adtunk, és vortexeltük. • Ismételt centrifugálás után (10 perc, 14000 rpm, 20 °C) a felülúszót pipettával

eltávolítottuk. • A csapadékot vákuumcentrifuga segítségével beszárítottuk (15–20 perc), és

szükség esetén ebben a formában -20 °C-on tároltuk.

A szekvenáló reakció termékének futtatása

• A beszárított terméket 20 µl formamidban vettük fel, vortexeltük, lepörgettük, majd szekvenátor csövekbe vittük át.

• PCR készülékben 3 percig 95°C-on denaturáltuk a DNS-t, és amíg a szekvenáló berendezésbe (ABI PRISM 310 automata szekvenátor, Perkin Elmer) helyeztük jégen tartottuk.

• A kapott szekvenciákat az NCBI internetes adatbázisban (BLAST keresőprogrammal, Altschul és mtsai, 1997) megtalálható szekvenciákkal összehasonlítva azonosítottuk.

• Ezt követıen a 16S rDNS szekvenciákat az ARB (Strunk és mtsai, 1998), és a MEGA3 programcsomag (Kumar és mtsai, 2004) segítségével illesztettük és analizáltuk.

• Az evolúciós távolságok számításához Kimura modelljét (Kimura, 1980), a filogenetikai fák készítéséhez Saitou és Nei (1987) neighbour-joining módszerét alkalmaztuk.

6.3.4 Tenyésztéstől független közösségi DNS izoláláson alapuló módszerek

A biofilm mintákból közösségi DNS-t a Fast DNA® kit for Soil (Bio101®

Systems, Q-BIOgene) segítségével izoláltunk a gyártó által megadott útmutató szerint

kémiai és fizikai feltáró lépéseket alkalmazva. Az így nyert közösségi DNS-t tartalmazó

oldatot a továbbiakban GeneClean® Spin kit (Bio101® Systems, Q-BIOgene) segítségével

tisztítottuk meg a kisebb DNS-daraboktól, RNS-től és egyéb, a PCR-t gátló anyagoktól. A

módszer azon alapszik, hogy a DNS magas sókoncentráció jelenlétében kationhídon

keresztül egy szilikagél-mátrixhoz kötődik, míg alacsony sókoncentrációnál a mátrix

hidratálódik, és a DNS szabaddá válik.

Klónkönyvtár létrehozása és feldolgozása

A 2004. áprilisában a Kelemen-székről és a Nagy-vadasról, illetve a 2006.

májusában a velencei-tavi Lángi-tisztásról vett nád biofilm mintákból izolált közösségi

35

DNS-t a tiszta törzseknél ismertetett módon PCR segítségével szaporítottuk fel a 16S

rDNS régiót parciálisan, az E. coli 27-es és 519-es pozíciója között. A kapott PCR

terméket megtisztítottuk (PCR-MTM Clean Up System kit, Viogene) a tiszta tenyészeteknél

leírtaknak megfelelően. Ez a lépés azért volt szükséges, hogy eltávolítsuk a PCR során

keletkezett primer dimereket, amelyek a klónozás során az általunk bejuttatni kívánt

inzertekhez hasonlóan beépülhetnek a vektorba, rontva ezzel a folyamat hatékonyságát. A

közösségi PCR során kapott termék poliklonális, ezért közvetlen fajmeghatározó

szekvencia-analízisre alkalmatlan. A szükséges DNS-t monomolekuláris klónok

létrehozásával állítottuk elő Promega pGEM-T Easy Vector System® felhasználásával az

alábbi lépésekben:

Ligálás

A gyártó által megadott ligáló elegyet (2x gyors ligáló puffer, pGEM-T vektor, T4

DNS ligáz) összemértük, és 3 µl PCR terméket adtunk hozzá. A ligáló elegyet overnight

inkubáltunk 4 °C-on.

Transzformálás

A ligáló elegyhez hozzáadtuk a gyártó által előírt koncentrációban a kompetens

sejteket, jégen inkubáltuk az elegyet, majd rövid hősokkot követően a megfelelő

médiumban (SOC) felvett sejteket 90 percig 37 °C-os rázó termosztátban inkubáltuk. Ezt

követően a sejtekből ampicillin, X-Gal és IPTG tartalmú lemezekre (LB) szélesztettünk,

melyeket 16 órán át inkubáltunk 37 °C-on.

Átpontozás

A célszekvencia beépülésének sikerességét ún. kék-fehér szelekcióval ellenőriztük.

A vektor plazmidon megtalálható az ampicillin rezisztencia génje, valamint klónozó helye

a β-galaktozidáz enzim N-terminális részét tartalmazza. Ennek következtében a plazmid

bejutásával a baktériumsejtbe (transzformáció) a β-galaktozidáz gén inaktiválódik. A

transzformált sejtek klónjait egy mesterséges galaktozidot, a színtelen X-galt tartalmazó

táptalajra szélesztettük, melyen az inzerttel nem rendelkező sejtekben létrejövő aktív β-

36

galaktozidáz (IPTG indukáló hatására) galaktózra és a baktériumtelepet kékre színező

indigófestékre bontotta. Számunkra tehát azok a telepek voltak a továbbiakban

felhasználhatók, amelyek növekedtek ampicillin tartalmú táptalajon (azaz vektorral

transzformáltak voltak) és X-gal jelenlétében fehér színű telepeket képeztek (azaz

tartalmazták az inzert-DNS-t). Ezeket a fehér telepeket steril fogpiszkáló segítségével új

lemezekre pontoztuk át, hogy megfelelő méretűre növekedhessenek. 37 °C-on, 24 órán

keresztül inkubáltuk őket.

DNS izolálás

Az egyes telepeket 30 µl steril HPLC minőségű dH2O-ba vettük fel, erősen

vortexeltük, 5 percig 98 °C-on cenaturáltuk, majd maximális fordulatszámon

centrifugáltuk. A PCR templátjaként az így kapott felülúszó folyadékot vettük.

Polimeráz láncreakció

A klónokból M13 forward (5’ GTAAAACGACGGCCAGT 3’) és M13 reverz

(5’ GGAAACAGCTATGACCATG 3’) primerek (0,5 µg/ml) (Stratagene, La Jolla, CA,

USA) segítségével vágtuk ki a templátot, melyet egy második PCR során, univerzális,

eubakteriális 27 forward és 519 reverz primerekkel szaporítottunk fel. A két PCR-re azért

volt szükség, mert az univerzális primerek a kompetens E. coli sejt megfelelő szekvenciáját

is fölszaporítanák, ezért előzőleg a templát szekvenciát M13 primerekkel ki kell „vágni”. A

két PCR az alábbi ciklus szerint működött:

1. Kezdeti denaturáció 96 °C 4 perc 2. Denaturáció 94 °C 30 mp 3. Primer anelláció 52 °C 30 mp 32×(2.; 3.; 4.) 4. Extenzió 72 °C 1 perc 5. Végső extenzió 72 °C 10 perc

Faji szintű azonosítás

A PCR termékeket a tiszta tenyészeteknél leírtak szerint ARDRA-mintázatuk

szerint csoportosítottuk, a reprezentáns PCR termékeket tisztítottuk, majd szekvenáltuk és

azonosítottuk.

37

Denaturáló Gradiens Gél Elektroforézis (DGGE)

A különböző mintavételi területekre jellemző baktériumközösségek faji diverzitását és

szezonális dinamikáját DGGE segítségével is vizsgáltuk (Muyzer és mtsai, 1993, 1997). A

DGGE futtatásokhoz szükséges GC-kapoccsal rendelkező PCR termékeket minden esetben

nested PCR reakciókban állítottunk elő. Az izolált teljes genomi DNS-ből (6.3.4 pont)

Eubacteria-specifikus primer párok segítségével felszaporítottuk a bakteriális 16S rDNS egy

nagyobb szakaszát (az E. coli 16S rDNS-ének 27-es és 1492-es pozíciói között). Ezt követően

az így kapott DNS fragmenteket PCR reakció segítségével, belsőbb primer párok

alkalmazásával tovább dúsítottuk (F968fGC-1492r primer párral a 2003-as velencei-tavi

minták, 338fGC-519r primerpárral a többi minta esetében), ahol a forward primer már GC-

kapoccsal rendelkezett. A futtatáshoz 6 (2003-as velencei-tavi minták), valamint 8%-os

(összes többi minta) PAA, 40–70% közötti denaturáló gradiensű (urea és formamid) gélt

alkalmaztunk. Ennek során a közösségi DNS-ből PCR-rel felszaporított, közel azonos

hosszúságú, de eltérő szekvenciájú 16S rDNS szakaszokat tartalmazó vegyes termékeket

viszonylag magas hőmérsékleten (60°C), egy egyenletesen növekvő koncentrációjú

denaturáló ágenseket tartalmazó poliakrilamid gélben futtattuk. Az egyes fajokra jellemző

PCR termékek bázissorrendjüktől és összetételüktől függően különböző denaturáló ágens

koncentrációknál denaturálódtak és mozgásuk a gélben lelassult. A PCR termékek végén

található GC-kapocs azért szükséges, hogy a denaturáció során megakadályozza egy-egy DNS

molekula két szálának szétválását és ezáltal azt, hogy külön fussanak a gélben. A megjelenő

elektroforetikus csíkok száma így tehát a mintákban előforduló fajok számára utal. A módszer

további előnye, hogy a szétválasztott, immár fajokra jellemző DNS a gélből visszanyerhető,

és a szekvenálást követően mód van a faj taxonómiai besorolására is.

GC-farokkal rendelkező PCR termék előállítása nested PCR reakcióval

Templát és primerek

• Templátul a közösségi DNS mintákból származó 16S rDNS PCR termékek szolgálnak, amelyeket a tiszta tenyészetek PCR reakciójában leírtaknak megfelelően nyertünk.

• DGGE-hez szükséges primerek (0,5 µg/ml): 338fGC primer (5’ CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG 3’) (Lane, 1991; Muyzer és mtsai, 1993)

38

F968fGC primer (5’ CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC 3’) (Nübel és mtsai, 1996);

519 reverz primer, illetve 1492 reverz primerek.

Nested PCR reakció

Mintánként és reakciónként a következő premix oldatot mértünk össze 0,2 ml-es

reakció csövekbe:

• 5 µl 10xPCR puffer (Fermentas) (200 mM TRIS/HCl, 15 mM MgSO4, 100 mM KCl)

• 10 µl dNTP keverék (Fermentas) (1mM dATP, 1mM dGTP, 1mM dTTP, 1mM dCTP)

• 4 µl MgCl2 • 338fGC/ F968GC primer (0,5 µg/ml) • 519r/1492r primer: (0,5 µg/ml) • 26,5 µl steril dH2O • 1,5 µl Taq polimeráz (LC Taq, 1 U/µl, Fermentas) • 2 µl templát

Az így összemért premixet vortexeltük, majd rövid ideig centrifugáltuk.

Biometra Tpersonal PCR készülékben az alábbi hőprofil mellett futattuk le a PCR

ciklust:

96°C 3 perc anelláció 62°C→52°C 30 mp ⎫ extenzió 72°C 40 mp ⎬ 10x denaturáció 94°C 30 mp ⎭ anelláció 52°C 30 mp ⎫ extenzió 72°C 30 mp ⎬ 20x denaturáció 94°C 30 mp ⎭ végső extenzió 72°C 10 mp hűtés 4°C ∞

A közösségi DNS mintából kiindulva a tiszta tenyészeteknél leírtaknak megfelelően

PCR reakció segítségével a megfelelő DNS fragmentumokat felszaporítottuk. Az így kapott

PCR termék szolgált templátként a következő PCR reakcióban, ahol a forward primer 5’

végéhez kapcsolt GC-kapocs kerül a PCR termékre (F968fGC-1492r, illetve 338fGC-519r).

39

Elektroforézis, a kapott elektroforetikus mintázat kiértékelése

Felhasznált reagensek:

• 40 %-os akrilamid oldat (Akrilamid - Biszakrilamid 37,5 – 1; BIO-RAD) • 50x TAE puffer (2 M Tris, 1 M ecetsav, 0,5 M EDTA, pH 8,0; BIO-RAD) • Urea (BIO-RAD) • Formamid (BIO-RAD) • TEMED (BIO-RAD) • 10%-os ammónium-perszulfát (APS; BIO-RAD) • HPLC tisztaságú víz • Gél töltőpuffer

(70% glicerin, 0,05% brómfenolkék, 0,05% xilén-cianol; BIO-RAD)

Négy különböző törzsoldatot készítettünk, amelyekből 6 és 10%-os PAA

tartományban a megfelelő poliakrilamid koncentációjú gél előállítható. A törzsoldatok

összemérésére vonatkozó adatokat a 2. táblázat tartalmazza.

6 %-os PAA 6 %-os PAA 10 %-os PAA 10 %-os PAA

Anyagok

0 %-os denaturáló koncentráció

100 %-os denaturáló koncentráció

0 %-os denaturáló koncentráció

100 %-os denaturáló koncentráció

40 %-os akrilamid oldat 15 ml 15 ml 25 ml 25 ml

50x TAE puffer 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml Urea ––––– 42 g ––––– 42 g Formamid ––––– 40 ml ––––– 40 ml

dH2O 83 ml 100 ml-re

kiegészítve 73 ml 100 ml-re

kiegészítve

2. táblázat A DGGE gél elkészítéséhez szükséges törzsoldatok adatai

A grádiens gél megöntése a BIO-RAD gélöntő rendszerrel, a két különböző denaturáló

koncentrációjú oldatból grádiens pumpa segítségével történt. Az oldatok elkészítése a

törzsoldatokból az alábbi mennyiségeket összemérve történt: a 3. táblázat a 2003-ban vett

velencei-tavi minták BIO-RAD Protean II xi készülékben való futtatásához készült gél

40

összetevőit, a 4. táblázat pedig az összes többi, DGGE-vel vizsgált és Ingeny PhorU

készülékben futtatott minták géljének összetételét tartalmazza.

A polimerizációt megindító APS-t csak közvetlenül a gélöntés előtt adtuk az

oldatokhoz. A denaturáló grádiens gél megöntését követően a gél tetejére denaturáló szert nem

tartalmazó töltőgélt rétegeztünk, ezáltal elősegítve a DNS egyenletes bejutását a zsebekből a

poliakrilamid gélbe. A zsebekbe az előzőleg 9 µl töltőpufferrel összekevert 45 µl-nyi nested

PCR termékeket Hamilton fecskendővel juttattuk.

A minták futtatása BIO-RAD Protean II xi, illetve Ingeny PhorU készülékben 60°C-

on, 1%-os TAE pufferben az alábbi feszültség értékek mellett történt: 15 perc befuttatás 60 V-

on, 14 óra futtatás 90 V-on.

Az elektroforézist követően a gélt 45 percig etídium-bromid oldatban festettük, majd

45 perc desztillált vízben történő festéktelenítés után a kialakuló sávmintázatot UV-fény alatt

detektáltuk. Az eredményeket digitális képrögzítéssel dokumentáltuk. A kapott sávmintázatot

a TotalLab (TL 120) v2006 szoftverrel értékeltük ki.

6%-os PAA gél töltő gél (0%) denaturáló szer koncentrációja 40% 70%

6%-os PAA 0%-os denaturáló

koncentráció 7,2 ml 3,6 ml 8 ml

6%-os PAA 100%-os denaturáló

koncentráció 4,8 ml 8,4 ml ––––

10%-os PAA 0%-os denaturáló

koncentráció –––– –––– ––––

10%-os PAA 100%-os denaturáló koncentráció

–––– –––– ––––

TEMED 10 µl 10 µl 8 µl

APS 50 µl 50 µl 35 µl

3. táblázat A 2003-ban vett velencei-tavi minták BIO-RAD Protean II xi

készülékben való futtatásához készült gél összetevői

41

8%-os PAA gél töltő gél (0%) denaturáló szer

koncentrációja 40% 70%

6%-os PAA 0%-os denaturáló

koncentráció 7,2 ml 3,6 ml 3 ml

6%-os PAA 100%-os denaturáló

koncentráció 4,8 ml 8,4 ml ––––

10%-os PAA 0%-os denaturáló

koncentráció 7,2 ml 3,6 ml 3 ml

10%-os PAA 100%-os denaturáló koncentráció

4,8 ml 8,4 ml ––––

TEMED 20 µl 20 µl 6 µl

10% APS 100 µl 100 µl 27 µl

4. táblázat Az Ingeny PhorU készülékben való futtatásokhoz készült gél összetevői

42

7. Eredmények és értékelésük

7.1 A velencei-tavi nád biofilm vizsgálatok

7.1.1 BIOLOG közösségi szénforrás értékesítési vizsgálatok

A BIOLOG lemezek eredeti felhasználási területéből, vagyis a baktériumok gyors

identifikációjából adódóan a felkínált szénforrások sem összetételükben, sem arányaikban

nem tükrözik a természetes ökoszisztémákban általánosan előforduló és a mikróbák számára

szén vagy/és energiaforrásként szolgáló szerves anyagokat. Victorio és mtsai (1996)

ugyanakkor kísérletesen igazolták, hogy a természetes ökológiai rendszerekre jellemző

szénforrások bontásának tesztelésekor, mivel a mikróbaközösségek nagy számban

tartalmaznak a kérdéses szubsztrátokat értékesíteni képes szervezeteket, a közösségek közti

különbségek feltárása nehezebb. Következésképpen a mikróbaközösségek anyagcsere

diverzitására jellemzőbb „anyagcsere ujjlenyomatot” kaphatunk, ha olyan szénforrások

oxidálásának képességét is vizsgáljuk, amire a közösséget alkotó baktériumfajoknak csak

viszonylag kis hányada képes. Bár a szénforrások ilyen spektrumának alkalmazásával nem

nyerhetünk betekintést az adott mikrobiális közösség tényleges „in situ” funkcionális

diverzitásába, mégis a kapott eredmények segítségével nyomon követhetők a

mikróbaközösségek aktivitásában bekövetkező térbeli és időbeni változások.

A Velencei-tó három mintavételi területéről 2000 áprilisában és 2001 júliusában vett

nádminták biofilm közösségeinek szénforrás értékesítési mintázatát BIOLOG GN2 lemezek

felhasználásával hasonlítottuk össze. A megfelelően szuszpendált és higított mintákkal

közvetlenül végzett vizsgálatok során az abszorbancia értékeket 24, 48, 72, 96 és 120 óra

elteltével olvastuk le. A minták többségénél a 96 órás inkubációs idő után már nem volt

számottevő változás az összaktivitásban, vagyis az indikátor színfejlődésének mértékében,

ezért a 96 órás inkubációnál leolvasott abszorbancia értékeket használtuk fel a

mikróbaközösségek anyagcsere ujjlenyomatának összehasonlításához. A főkomponens

analízis során az eltérő mintavételi helyekről származó öt-öt minta szolgált objektumként, a

különféle szénforrások pedig változókként (2. ábra). A mikróbaközösségek anyagcsere

potenciálját az értékesített szubsztrátok típusa (3. ábra a-b) alapján is összehasonlítottuk.

43

2. ábra A Velencei-tavon 2000 áprilisában vett nád biofilm minták ordinációja a mikróbaközösségek BIOLOG GN2 szénforrás értékesítési adatai alapján

(FTB, FTK: Fürdető belső és külső, GTB, GTK: Agárd-Gárdony Hosszútisztás belső és külső, LTB, LTK: Lángi-tisztás belső és külső nádasállomány; 1-5: párhuzamos minták)

A tavaszi minta esetében az ordinációs diagram két tengelyén megjelenített első két

főkomponens magyarázta az összvariancia 57%-át (2. ábra). A Fürdetőről származó kétféle

(külső és belső nádasállományból származó) minta mikróbaközössége rendelkezett a

legnagyobb aktivitással (Axis 1 >1), ugyanakkor ezen közösségek szénforrás hasznosítása

mutatta a legkisebb eltérést egymáshoz képest. A Lángi-tisztásról származó

mikróbaközösségek szintén nagy hasonlóságot mutattak a felkínált szénforrások

értékesítésében. Az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról gyűjtött két mintatípus

mikróbaközössége a második főkomponens mentén mutatott elkülönülést a szénforrás

értékesítési tesztek eredményei alapján: a belső nádasállományból származó

mikróbaközösségek a Lángi-tisztás mintáinak mikróbaközösségeihez hasonló anyagcsere

ujjlenyomattal rendelkeztek, míg a külső, nyíltvízzel érintkező nádról származó párhuzamos

biofilm minták mikrobiális közösségei kevésbé egységes, és a többi mintától is eltérő

szénforrás hasznosítással voltak jellemezhetők. A Fürdetőről származó minták

mikróbaközösségei magas főkomponens értékekkel rendelkeztek, az Agárd-Gárdony

Hosszútisztásról származó párhuzamos minták ordinációs diagramon való elhelyezkedése

Axis 1 (38%)3 2 10-1-2

Axi

s 2 (1

9%)

1

0

-1

-2

LTK-4 LTK-3 LTK-1 LTK-2 LTB-1

LTK-5 GTB-1 GTB-2 GTB-4 GTB-3 FTK-4 LTB -5 FTK-5

LTB-3

-3

GTK-1

GTK-3

GTK-2

GTK-5

GTK-4

LTB-4

LTB-2 GTB-5 FTK-3

FTK-2

FTB-5 FTB-2

FTB-3 FTK-1

FTB-1 FTB-4

44

(negatív főkomponens értékek) a többi minta mikrobiális közösségeihez viszonyított

alacsonyabb metabolikus potenciáljára utalt.

A BIOLOG GN2 lemez szénforrásainak Garland és Mills (1991) szerinti

csoportosítása alapján a szubsztrátok döntő többségét szénhidrátok (31), szerves savak (24) és

aminosavak (20), míg kisebb mennyiségét polimerek (5), aminok/amidok (6) és egyéb

szénvegyületek (észterek, alkoholok, aromások) (9) teszik ki (Függelék). A 96 órás inkubáció

elteltével a vizsgált mikróbaközösségek a felkínált szénforrás csoportok 33-100%-át

hasznosították (3. ábra a-b). Az egyes területekről származó kétféle mintatípus mikrobiális

anyagcsere-ujjlenyomata mindhárom terület esetében hasonló volt egymáshoz. Minden

esetben a polimerek és a szénhidrátok hasznosítására került sor a legnagyobb arányban, ezen

kívül az aminosavak preferált értékesítése is jellemző volt. A szerves savak, valamint az

aminok és amidok hasznosításában mutatkoztak a legnagyobb különbségek. Legkisebb arányú

az aminok, illetve az amidok hasznosítása volt. Ebből a szempontból egyedül a Fürdető

nyíltvizes kapcsolattal rendelkező, külső nádasállományának biofilm mintája volt kivétel,

ebben az esetben a mikróbaközösség a fenti szubsztrátcsoportba tartozó vegyületek több, mint

80%-át hasznosította 96 órán belül.

a)

100 100 100100

8797

88

6371

90 85 9083

33 33

89

6778

0

20

40

60

80

100

FTK GTK LTK

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok/amidok egyéb

b)

100 100 100100 97 97100

79 75

100 100

85

100

33 33

100

7889

0

20

40

60

80

100

FTB GTB LTB

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok/amidok egyéb

c)

0 0

6053

6370

25 25

42

75 80 80

33

67

50

70

50

30

0

20

40

60

80

100

FNE GNE LNE

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok/amidok egyéb

d)

20

40

100

6773

90

3829

50

75 80 75

50

67

5060

5060

0

20

40

60

80

100

FNA GNA LNA

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok/amidok egyéb

3. ábra A Velencei-tavon 2000 áprilisában (a-b) és 2001 júliusában (c-d) vett nád biofilm minták mikrobiális szénforrás hasznosításának összehasonlítása

a BIOLOG GN2 szénforrás típusok értékesítése alapján (FTB, FTK: Fürdető belső és külső, GTB, GTK: Agárd-Gárdony Hosszútisztás belső és külső,

LTB, LTK: Lángi-tisztás belső és külső nádasállomány)

45

A három mintavételi területet összehasonlítva kitűnik, hogy a Fürdető két mintájának

mikrób

őkomponens analízis ordinációs

diagram

forrás értékesítésével összehasonlítva a nyári biofilm

minták

aközösségei hasznosították a legnagyobb arányban az egyes szénforrás csoportokhoz

tartozó vegyületeket. Az Agárd-Gárdony Hosszútisztás külső mintájának biofilm

mikróbaközössége a polimerek és az aminok/amidok kivételével az egyes szubsztrátcsoportok

szénforrásait a többi minta aktivitásával összehasonlítva kisebb mértékben hasznosította. Ez

az eltérés áll a fentiekben tárgyalt főkomponens analízis eredményeinek (a terület kétféle

mintájának elkülönülése az ordinációs diagramon, valamint a GTK minta többihez

viszonyított alacsony főkomponens értékei) hátterében.

A nyári minták abszorbancia értékeivel végzett f

ján a két főkomponens együttesen az összvariancia 48%-át magyarázta (4. ábra).

Ebben az időpontban a három mintavételi terület közül az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról

vett kétféle minta mikrobiális közösségei mutatták a legnagyobb hasonlóságot. A keleti

nyíltvizes régióból (Fürdető) vett kétféle minta mikróbaközösségének szénforrás hasznosítása

egymástól eltérő mintázatot mutatott: a többéves nádszár biofilm mikrobiális közösségei

nagyobb hasonlóságot mutattak az Agárd-Gárdony Hosszútisztáson vett minták

közösségeinek anyagcsere-mintázatához, mint az egyéves nádszáréhoz. A kétféle mintatípus

közösségi szénforrás értékesítési mintázatának eltérése a nyugati, természetvédelmi területen

elhelyezkedő Lángi-tisztás esetében volt a legkifejezettebb. Ez utóbbi közösségeknek az

ordinációs diagramon való elhelyezkedése (Axis 1 >1) arra utalt, hogy a természetvédelmi

területen található, a két másik mintavételi helyhez képest csekély nyíltvizes kapcsolattal

rendelkező Lángi-tisztás biofilm mikróbaközösségei rendelkeztek a vizsgált időpontban a

legnagyobb metabolikus potenciállal.

A tavasszal vett minták szén

mikróbaközösségei az egyes szubsztrátcsoportokba sorolt szénforrásokat kisebb

mértékben hasznosították, egyedül a Lángi-tisztás többéves nádszárairól származó biofilm

mikrobiális közösségek mutattak 100%-os felhasználást polimerek esetében, ezen kívül a

különféle szénhidrátok nagyarányú értékesítése volt megfigyelhető ennél a mintánál a többi

terület biofilm mikróbaközösségeinek metabolikus potenciáljához viszonyítva (3. ábra c-d).

46

4. ábra A Velencei-tavon 2001 júliusában vett nád biofilm minták ordinációja a mikróbaközösségek BIOLOG GN2 szénforrás értékesítési adatai alapján

(FNE, FNA: Fürdető egyéves és több éves nádszár, GTB, GTK: Agárd-Gárdony Hosszútisztás egyéves és több éves nádszár, LTB, LTK: Lángi-tisztás egyéves és több éves

nádszár biofilm minta; 1-5: párhuzamos minták)

A tavaszi mintához hasonlóan a nyáron vett kétféle mintatípus (egyéves és több éves

nádszárról származó biofilm) anyagcsere-ujjlenyomata a Fürdető és az Agárd-Gárdony

Hosszútisztás esetében hasonló volt egymáshoz. Az ezekről a területekről származó többéves

nád biofilm minták mikróbaközösségei mindössze 20-40%-os polimer-hasznosítást mutattak,

míg az egyéves nádról származó minták mikróbaközösségei egyetlen felkínált polimert sem

értékesítettek. A Lángi-tisztáson vett kétféle minta mikróbaközössége a polimer- és

szénhidrát-hasznosítás szempontjából tért el számottevően egymástól (3. ábra c-d), és ez a

különbség a két minta (LNE, LNA) ordinációs diagramon való elhelyezkedésében is

jelentkezett (4. ábra).

A szezonális változások nyomon követésére tavaszi, nyári és őszi mintavételezéseket

követően 2003-ban GN2 lemezek, 2006-ban pedig ECO lemezek felhasználásával végeztünk

BIOLOG anyagcsere ujjlenyomat vizsgálatokat. Mivel a korábbi (2000-es és 2001-es)

időpontokban a közösségi szénforrás hasznosítás eredményei elsősorban a mintavételi

területek és nem a különféle mintatípusok eltéréseit mutatták, ezekhez a szezonális

vizsgálatokhoz mindhárom mintavételi helyen a nyíltvízzel érintkező külső nádasállományból

Axis 1 (35%)54 3210-1-2

Axi

s 2 (1

3%)

3

2

1

0

-1

-2

-3

LNE-4

FNE-1 LNE-3 LNA-3

-4

GNE-4 GNE-1

GNE-5

GNA-4

GNA-2

FNA-2

GNA-3GNA-5 GNE-3 FNA-1 LNE-5

LNA-5 LNE-1 FNA-3

GNE-2

FNA-4

GNA-1 FNA-5 FNE-2

FNE-3

LNE-2 LNA-1 LNA-2 LNA-4 FNE-4

FNE-5

47

gyűjtöttünk fiatal és többéves nádszárakat vegyesen, és a párhuzamos lemezek számát

mintánként háromra csökkentettük. A szezonális különbségek áttekinthetőbb megjelenítése

érdekében az egyes lemezeken mért abszorbancia értékek átlagát használtuk fel a

főkomponens analízis során (5. ábra). A korábbiakhoz hasonlóan a minták

mikróbaközösségeinek szénforrás hasznosítását az értékesített szubsztrátok típusa (6. ábra a-

c) alapján is összehasonlítottuk.

5. ábra A Velencei-tavon 2003-ban három időpontban vett nád biofilm minták ordinációja a

Az ordinációs dia

46%-át

3 210-1-2 -3

Axi

s 2 (1

7%)

2

1

0

-1

-2

LB0310

GB0310

FB0310

LB0305

FB0305

GB0308

05

LB0308

FB0308

Axis 1 (29%)

GB03

mikróbaközösségek BIOLOG GN2 szénforrás értékesítési adatai alapján (FB: Fürdető, GB: Agárd-Gárdony Hosszútisztás, LB: Lángi-tisztás;

0305-május, 0308-augusztus, 0310-október)

gramon (5. ábra), amelyen az első két főkomponens az összvariancia

képviselte, jól megfigyelhető a tavaszi, nyári és őszi biofilm minták

mikróbaközösségeinek egymástól való elkülönülése. Az első főkomponens mentén az őszi

minták határozottan elkülönültek a tavaszi és nyári mintáktól, míg a második főkomponens

mentén ez utóbbi minták is szétváltak egymástól (a Fürdető nyári mintájától eltekintve).

Tavasszal a tó különböző részéről származó mintákat nagyfokú hasonlóság jellemezte, míg a

nád biofilm közösségek szénforrás értékesítése szempontjából (a második főkomponens

mentén) nyáron a Fürdető, ősszel az Agárd-Gárdony Hosszútisztás elkülönülése volt jellemző.

48

a)

0

20

40

60

80

100

FB0305 GB0305 LB0305

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

polimerekszénhidrátokszerves savakaminosavakaminok/amidokegyéb

b)

0

20

40

60

80

100

FB0308 GB0308 LB0308

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

polimerekszénhidrátokszerves savakaminosavakaminok/amidokegyéb

c)

0

20

40

60

80

100

FB0310 GB0310 LB0310

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

polimerekszénhidrátokszerves savakaminosavakaminok/amidokegyéb

d)

0

20

40

60

80

100

FB0605 GB0605 LB0605

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

polimerekszénhidrátokszerves savakaminosavakaminokfenolos vegyületek

e)

0

20

40

60

80

100

FB0608 GB0608 LB0608

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

polimerekszénhidrátokszerves savakaminosavakaminokfenolos vegyületek

f)

0

20

40

60

80

100

FB0610 GB0610 LB0610

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

polimerekszénhidrátokszerves savakaminosavakaminok fenolos vegyületek

6. ábra A Velencei-tavon 2003-ban (a-c) és 2006-ban (d-f) vett nád biofilm minták mikrobiális szénforrás hasznosításának összehasonlítása

BIOLOG GN2 és BIOLOG ECO lemezek szénforrás típusainak értékesítése alapján (FB: Fürdető, GB: Agárd-Gárdony Hosszútisztás, LB: Lángi-tisztás nád biofilm minta;

0305-május, 0308-augusztus, 0310-október; 0605-május, 0608-augusztus, 0610-október)

A felkínált szénforrások közül valamennyi minta mikróbaközösségére a polimerek és a

szénhidrátok preferált hasznosítása volt jellemző. A szerves savak és aminosavak

hasznosulása kisebb mértékben, de szintén minden vizsgált mikróbaközösség esetében

megfigyelhető volt. A fenti szubsztrátokhoz képest az aminok, illetve amidok és egyéb

szénforrások értékesítésére került sor a legkisebb arányban. A szezonális különbségek

kapcsán említésre érdemes, hogy míg tavasszal a polimereken és a szénhidrátokon túl az

aminosavak hasznosítása a vizsgált mikróbaközösségek közös sajátsága volt, addig az őszi

minták mikrobiális aktivitására – szintén a polimereken és a szénhidrátokon kívül – inkább a

szerves savak értékesítése volt jellemző. Az egyes területek szezonális mintái anyagcsere-

ujjlenyomatának összehasonlításakor kitűnik, hogy mindhárom esetben a tavaszi és őszi

minták mutattak hasonlóságot egymáshoz, alapvetően a polimerek és szénhidrátok

hasznosításában. A nyári biofilm minták közösségeire a Fürdető kivételével inkább a könnyen

hasznosítható szénhidrátok értékesítése volt jellemző, a polimerek bontása kisebb arányban

49

ment végbe. A Lángi-tisztás és az Agárd-Gárdony Hosszútisztás tavaszi és őszi mintáinak

mikróbaközösségei hasonló anyagcsere-ujjlenyomattal rendelkeztek, és a nyári mintáik

mikrobiális közösségeinek szubsztrát értékesítési profilja is csak a szerves savak, illetve az

aminosavak felhasználásának mértékében tért el számottevően egymástól. A Fürdető

mindhárom szezonális mintájának mikrobiális szénforrás hasznosítása alapvetően a

polimerek, az aminok/amidok és egyéb szénforrások hasznosításában mutatott eltérést a másik

két mintavételi helyhez képest.

A velencei-tavi nád biofilm mikrobiális közösségek szénforrás értékesítési

jellegz

n vett nád biofilm minták ordinációja a

etességeit 2006-ban BIOLOG ECO plate segítségével vizsgáltuk. Ebben az évben is

három mintavételre került sor, a korábban már vizsgált három mintavételi területről. Az

eredetileg bakteriális izolátumok azonosítására kifejlesztett GN2 lemezek mellett – a

környezeti mintákkal dolgozó kutatók igényeit kielégítendő – az ECO jelzésű lemezek

háromszoros ismétlésben összesen 31 különféle szénforrást tartalmaznak (közülük 25

megtalálható a GN2 lemezek szubsztrátjai között is) (Choi és Dobbs, 1999).

7. ábra A Velencei-tavon 2006-ban három időpontba

Axis 1 (63%)210-1-2

Axi

s 2 (1

5%)

2

1

0

-1

GB0608

LB0610

FB0608

GB0610

FB

LB0605 LB0608

GB06

FB0605

05 0610

mikróbaközösségek BIOLOG ECO szénforrás értékesítési adatai alapján (FB: Fürdető, GB: Agárd-Gárdony Hosszútisztás, LB: Lángi-tisztás;

0605-május, 0608-augusztus, 0610-október)

50

A 96 órás inkubációt követő mérések adataival készült ordinációs diagram (7. ábra)

első két főkomponense a GN2 plate eredményeinek ordinációjához képest nagyobb, az

összvariancia 78%-át magyarázta. Ugyanakkor ebben az esetben a minták szezonális

csoportosulása kevésbé volt kifejezett. A minták mindkét főkomponens szerinti szétválása a

nyári minták esetén volt a legszembetűnőbb. A minták közül mindhárom időpontban a Lángi-

tisztás különbözött leginkább a másik két mintavételi területtől. Az ősszel vett mintákat - a

GN2 lemezek eredményeihez hasonlóan – alacsony (Axis 1 < 0), a tavasziakat magas

(Axis 1 > 0) főkomponens értékek jellemezték.

A szubsztrátok hasznosításának összehasonlításakor (6. ábra d-f) kitűnik, hogy - a

GN2 lemezekkel nyert eredményekhez hasonlóan - mindhárom mintavételkor a polimerek és

a szénhidrátok preferált hasznosítása volt jellemző. Fenolos vegyületeket sem a Lángi-tisztás,

sem az Agárd-Gárdony Hosszútisztás biofilm mikróbaközösségei nem értékesítettek, ezzel

szemben a Fürdető esetében mindhárom minta mikróbaközössége 50%-os hasznosítást

mutatott. Az egyes területek tavaszi és őszi mintáinak mikrobiális anyagcsere-potenciáljának

hasonlósága a GN2 lemezeknél megfigyelhetőhöz hasonlóan kimutatható volt, egyedüli

kivételt ez alól az aminok/amidok értékesítése képezett az Agárd-Gárdony Hosszútisztás és a

Lángi-tisztás esetében.

A GN2 és az ECO lemezekkel végzett vizsgálataink is a közösségi szintű szénforrás

hasznosítási mintázatok mintavételi területek szezonális dinamikájára engedtek következtetni.

Az ECO lemezek adatai alapján nagyobb főkomponens értékeket kaptunk, mint a GN2

lemezek esetében. Vízminták mikrobiális anyagcsere potenciáljának GN2 és ECO lemezekkel

történő összehasonlító vizsgálatakor hasonló jelenséget tapasztaltak Choi és Dobbs (1999).

51

7.1.2 DGGE vizsgálatok

Az egyes mintavételi területekre jellemző baktériumközösségek genetikai

diverzitásának szezonális változását és az egyes fajok relatív abundanciáját 2003-ban és 2006-

ban DGGE-vel vizsgáltuk. A gélfotókon megfigyelhető sávmintázatok alapján TotalLab (TL

120) v 2006 szoftver felhasználásával végeztük el a minták csoportosítását és

összehasonlítását (8-9. ábra).

Mindkét gélfotón látható, hogy az eltérő helyekről és különböző időpontokban gyűjtött

minták baktériumközösségeit reprezentáló csíkok fő sávjaikban megegyeznek, ami a

baktériumközösségek hasonló domináns fajösszetételét jelzi. A sávok intenzitásában

megfigyelhető jelentős eltérések ugyanakkor az egyes fajok abundanciájának változására

utalnak. A legnagyobb hasonlóságot 2003-ban és 2006-ban is az ugyanarról a mintavételi

területről eltérő időpontokban gyűjtött minták baktériumközösségeinek sávmintázatai

mutatják. A nád biofilm minták fajösszetétele a DGGE mintázatok alapján tehát időben

kisebb, de térben nagyobb mértékben tért el egymástól. Ez alól 2003-ban a Lángi-tisztás őszi,

2006-ban az Agárd-Gárdony Hosszútisztás nyári biofilm közössége képezett kivételt. Ezek a

mikróbaközösségek a párhuzamosan végzett BIOLOG szénforrás értékesítési vizsgálat során

a legkisebb anyagcsere aktivitást mutatták.

8. ábra A Velencei-tavon 2003-ban szezonálisan vett nád biofilm minták DGGE sávmintázatának összehasonlítása alapján készült UPGMA dendrogram

(FB: Fürdető, GB: Agárd-Gárdony Hosszútisztás, LB: Lángi-tisztás 0305-május, 0308-augusztus, 0310-október)

52

9. ábra A Velencei-tavon 2006-ban szezonálisan vett nád biofilm minták DGGE sávmintázatának összehasonlítása alapján készült UPGMA dendrogram

(FB: Fürdető, GB: Agárd-Gárdony Hosszútisztás, LB: Lángi-tisztás 0605-május, 0608-augusztus, 0610-október)

A 2003-as DGGE gélfotó alapján készített dendrogramon (8. ábra) jól látható, hogy a

Lángi-tisztásról tavasszal és nyáron vett minták baktériumközösségei mutatták a legnagyobb

eltérést az ősziekhez képest, ami megegyezik a párhuzamosan végzett BIOLOG közösségi

szénforrás értékesítési vizsgálatok eredményeivel. Nem szabad figyelmen kívül hagynunk azt,

hogy a két évben mind az anyagcsere (GN2, illetve ECO lemezek), mind a DGGE (kétféle

elektroforézis készülék) ujjlenyomatmódszer esetében eltértek az alkalmazott eszközök.

Utóbbi elsősorban a felbontás mértékében eredményezett eltéréseket. Meg kell továbbá azt is

említenünk, hogy a BIOLOG szénforrás értékesítési tesztekben a biofilm teljes

mikróbaközösségének aktivitását detektáltuk, míg a DGGE a bakteriális közösség

szerkezetének különbségei alapján tesz különbséget.

53

7.1.3 Tenyésztéses vizsgálatok

A velencei-tavi nád biofilm tenyészthető baktériumközösségeinek megismerése

céljából tavasszal és nyáron végeztünk mintavételezést. A három mintavételi területről

(Fürdető, Agárd-Gárdony Hosszú-tisztás, Lángi-tisztás) származó minták csíraszám

becslésének eredményeit az 5. táblázat mutatja táptalaj típusonként.

táptalaj

mintavételi terület King B Trypticase soy yeast Caulobacter

Horikoshi-féle

alkalikus

FTK 4,20*106 6,37*106 1,32*107 2,37*106

FTB 1,48*107 1,06*107 2,87*107 4,52*106

GTK 4,34*105 4,07*105 1,40*106 2,00*105

GTB 4,34*105 6,13*105 1,58*106 2,71*105

LTK 3,06*105 8,48*105 1,36*106 2,78*105

LTB 7,46*105 8,47*105 2,93*106 2,40*105

FNE 1,03*105 9,95*104 1,54*105 5,25*103

FNA 1,76*105 3,90*104 2,40*104 3,13*103

GNE 2,25*105 1,78*105 9,23*104 1,26*103

GNA 5,18*105 4,60*104 5,83*104 4,20*104

LNE 1,53*105 1,40*105 1,31*105 9,20*104

LNA 2,40*104 3,25*103 1,20*105 6,30*104

5. táblázat A velencei-tavi nádasállományok biofilmjéből 2000 áprilisában és 2001 júliusában

tenyésztéssel becsült baktérium csíraszám értékek (CFU/g) (FTB, FTK: Fürdető belső és külső, GTB, GTK: Agárd-Gárdony Hosszútisztás belső és külső, LTB, LTK: Lángi-tisztás belső és külső nádasállomány; FNE, FNA: Fürdető egyéves és több

éves nádszár, GTB, GTK: Agárd-Gárdony Hosszútisztás egyéves és több éves nádszár, LTB, LTK: Lángi-tisztás egyéves és több éves nádszár biofilm minta)

A tavasszal és nyáron vett nád biofilm minták csíraszám értékeinek

összehasonlításakor megfigyelhető, hogy a tavasszal vett minták értékei a nyári mintákhoz

képest több nagyságrenddel magasabbak voltak. Tavasszal a legmagasabb csíraszám értéket a

Caulobacter táptalajon a Fürdető belső nádasállományának biofilm mintájából, a

legalacsonyabb csíraszámot az Agárd-Gárdony Hosszútisztás külső nádasállományának

54

biofilmjéből becsültük. A nyári minták esetében mind a legnagyobb, mind a legkisebb

csíraszámot az Agárd-Gárdony Hosszútisztás mintáiban észleltük.

A Fürdetőről származó tavaszi minták csíraszám értékei több esetben is egy

nagyságrenddel magasabbak voltak az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról és a Lángi-tisztásról

származó mintákénál. A nyári minták különböző területeinek csíraszám értékei között nem

volt nagyságrendi különbség.

Az egyes területekről származó mintatípusok összehasonlításakor tavasszal egyedül a

Fürdetőről vett kétféle minta csíraszám értékei mutattak nagyságrendi eltérést a szerves

anyagban gazdag táptalajokon (King B, TSY). A nyári minták kétféle mintáját

összehasonlítva kitűnik, hogy mindhárom területen volt olyan táptalaj, amelyen a vizsgált két

mintatípus becsült csíraszámai egy nagyságrendnyi különbséget mutattak.

A négyféle táptalajon megfigyelt értékeket összehasonlítva a laboratóriumi

tenyésztéshez általánosan alkalmazott King B és a biofilmre jellemző oligotróf közeget

modellezni hivatott Caulobacter táptalajokon magasabb, míg a Horikoshi-féle alkalikus

táptalajon a többi táptalajhoz képest alacsony csíraszám értékeket detektáltunk. A tavaszi

minta esetében a TSY táptalaj bizonyult a leghatékonyabbnak a nád biofilm tenyészthető

baktériumközösségeinek feltérképezésére: a legnagyobb diverzitást (17 bakteriális

nemzetség/faj) ezen a médiumon detektáltuk. A Horikoshi-féle alkalikus táptalajon izolált

baktériumtörzsek többségét nem sikerült hosszú távon laboratóriumi körülmények között

fenntartani. Ez a tápközeg bizonyult a legszelektívebbnek: az erről a táptalajról izolált

baktériumtörzseket összesen 6 baktériumfaj képviselőjeként azonosítottunk. A nyári biofilm

mintákból izolált törzsállományok esetében nem volt számottevő különbség az azonosított

fajok számában az egyes táptalajok tekintetében, a kizárólag egyféle táptalajról izolált

törzs(ek) csak néhány fajt képviselt(ek).

A 2000. áprilisában végzett mintavételt követően több mint 250 izolátumot hoztunk

létre. Tiszta tenyészetben összesen 173 baktériumtörzset sikerült fenntartanunk, közülük 53

származott a Fürdető, 64 az Agárd-Gárdony Hosszútisztás, valamint 56 a Lángi-tisztás nád

biofilm mintájából. (Számos Horikoshi-féle alkalikus táptalajról izolált törzs hosszú távon

nem bizonyult fenntarthatónak laboratóriumi körülmények között.)

A 2001. júliusi mintavételt követően összesen 251 törzset sikerült izolálni és tiszta

tenyészetbe vinni. Az izolátumok területenkénti megoszlása a következő volt: 78 törzs

származott a Fürdetőről, 67 az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról és 106 a Lángi-tisztásról vett

nádszár biofilm mintából.

55

10. ábra. A velencei-tavi mintavételi területekről származó nád biofilm mintákból izolált törzscsoportok elkülönülése a hagyományos tesztekben mutatott pozitív eredményeik alapján

(FB: Fürdető, GB: Agárd-Gárdony Hosszútisztás, LB: Lángi-tisztás; T: 2000 tavaszi minta, N: 2001 nyári minta)

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.

Gra

m re

akci

ó

oxid

áz a

ktiv

itás

kata

láz

aktiv

itás

D-g

lükó

z ox

idat

ív h

aszn

osítá

sa (2

4h)

D-g

lükó

z fe

rmen

tatív

has

znos

ítása

(24h

)

gázt

erem

lés O

/F m

édiu

mba

n

D-g

lükó

z ox

idat

ív h

aszn

osítá

sa(1

hét

)

D-g

lükó

z fe

rmen

tatív

has

znos

ítása

(1 h

ét)

amm

onifi

káci

ó

moz

gás

H2S

cis

ztei

nből

indo

l trip

tofá

nból

NO

3-N

O2

NO

3-N

2

NO

3-N

H3

met

ilvör

ös re

akci

ó

Vog

es-P

rosk

auer

reak

ció

eszk

ulin

hid

rolíz

is

kaze

in h

idro

lízis

zsel

atin

hid

rolíz

is

kem

ényí

tő h

idro

lízis

twee

n 80

has

znos

ítás

cellu

láz

aktiv

itás

FBT 4 62 53 34 34 28 38 34 36 77 9 30 58 0 57 8 32 53 43 55 32 55 0GBT 38 31 80 41 39 25 61 50 2 34 5 23 47 8 28 27 31 56 55 63 42 47 0LBT 34 46 70 38 34 29 48 43 5 46 2 30 50 0 20 25 30 54 52 64 41 50 0FBN 50 37 76 33 27 5 65 58 5 24 0 10 10 0 37 49 23 77 67 71 24 29 0GBN 51 33 81 6 6 6 51 28 28 25 22 0 22 0 0 7 4 51 40 39 25 37 0LBN 54 33 58 48 25 3 73 56 12 26 8 0 27 1 1 41 18 70 73 71 11 35 0

6. táblázat A velencei-tavi nádasállományok biofilmjéből izolált baktériumtörzsek hagyományos tesztekben mutatott összesített százalékos pozitív eredményei

Axis 18060 40200-20-

40-60-80

Axi

s 28070605040302010

0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70

FBT

LBT GBT

GBN

FBNLBN

4 16 20

8515 1917

18 7 12

6 13 10 212 14

122 3

11

9

56

A tavasszal és nyáron vett biofilm minták tenyészthető baktériumközösségeit a

fenotípusos tesztekben mutatott eredményeik (6. táblázat) alapján főkomponens analízis

(PCA) segítségével (10. ábra) hasonlítottuk össze. Mivel celluláz aktivitást egyik minta

törzsei sem mutattak, ez a tulajdonság nem került be a főkomponens analízis alapjául szolgáló

tulajdonságok közé.

Az ordinációs diagramon a tavaszi és a nyári mintákból izolált törzscsoportok az első

főkomponens mentén különültek el egymástól. Ez leghatározottabban a Fürdető területéről

származó törzscsoportok esetében volt megfigyelhető. A Lángi-tisztásról izolált

baktériumtörzsek tavasszal az Agárd-Gárdony, nyáron a Fürdető törzseinek fenotípusos

tulajdonságaival mutattak nagyfokú hasonlóságot.

A tavaszi mintákból izolált baktériumtörzsek döntően Gram-negatív, aktív mozgásra

képes szervezetek voltak, ez a két tulajdonság a Fürdetőről vett minta izolátumai esetében volt

a legnagyobb százalékban jellemző. A tavaszi biofilm mintákból származó törzsek jellegzetes

tulajdonságaként említhetjük meg a fermentációs aktivitást olyan tesztekben, mint például a

glükóz 24 órán belül történő hasznosítása, melyben a glükóz heves fermentációja gyakran

gázképzéssel is együtt járt, illetve a Voges-Proskauer teszt butilén-glikolos fermentációja.

Mindezek mellett a tavaszi minták esetében nagyobb számban voltak jelen a nitrátot nitritig,

illetve ammóniáig redukálni képes szervezetek. A szubsztrátok közül a keményítő és a

tween 80 hasznosítása volt jellemző.

A nyári mintákból kitenyésztett baktériumközösségeket Gram-pozitív dominancia

jellemezte. A glükóz hasznosítására inkább az egy hét alatt megfigyelhető, lassú fermentációs

aktivitás volt jellemző, valamint a vegyes savas fermentáció (metilvörös teszt). Ebből a

szempontból a Gárdonyról származó törzsek képzetek kivételt, amelyek a peptonból

ammóniát képeztek és a ciszteinből kénhidrogént termeltek. A vizsgált szubsztrátok közül a

nyári minták törzsei nagy arányban voltak képesek az eszkulin és a kazein hidrolízisére,

ezekben a tesztekben a tavasszal izolált törzsek kisebb arányú aktivitást mutattak.

A DNS izolálást és a 16S rDNS régió PCR-el való felszaporítását követően a törzseket

ARDRA mintázatuk alapján csoportosítottuk Az eltérő hasítási mintázatok alapján a tavasszal

izolált törzsek esetében összesen 38, a nyári törzsek esetében 23 különböző ARDRA

csoportot hoztunk létre. Ezt követően került sor a csoportonként kiválasztott törzsek 16S

rDNS szekvencia analízisen alapuló identifikációjára (Függelék 1-2. táblázat). A velencei-tavi

nádasok biofilmjéből izolált törzsek taxonómiai hovatartozását a 16S rDNS parciális

szekvencia adatok alapján neighbor-joining módszerrel készült filogenetikai fákon mutatjuk

be (11-12. ábra).

57

A tavaszi és a nyári minták tenyésztéssel nyert faji összetételét vizsgálva

megállapítható, hogy mindkét törzsállományban jelen voltak az α- és γ-proteobaktériumok,

valamint a kis és nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok képviselői. A tavaszi

mintában ezen felül előfordultak még a β-proteobaktériumok csoportjába tartozó törzsek is.

A 2000 áprilisában vett nád biofilm minták közül a tó nyugati részén található Lángi-

tisztásról és a tó középső részén található Agárd-Gárdony Hosszútisztásról közel azonos

számú (18 és 16) taxont sikerült azonosítani. Az oligotróf édesvizekben gyakori β-

proteobaktériumok jelenlétét kizárólag erről a két területről sikerült kimutatni. A Fürdető

tavaszi törzsei összesen 10 fajt képviseltek, amelyek többsége az édesvizekben közönséges

előfordulású α- és γ-proteobaktériumok közül került ki. A 2001 júliusában történt

mintavételek eredményeként az identifikált fajok száma alapján a két nyíltvizes terület

hasonlított egymáshoz. A Fürdető és az Agárd-Gárdony Hosszútisztás esetében 14 és 15

különböző fajt detektáltunk. Nyáron a legtöbb, 21 taxont a Lángi-tisztásról származó törzsek

között azonosítottuk.

58

0.10

LTB-26 (AM263534)LTK-8 (AM263532)LTB-60 (AM263533)Agrobacteri um vitis (D12795)Agrobacterium tumefaciens (M11223)

GTB-37 (AM263538)Delftia acidovorans (AF149849)

LTK-7 (AM263539)Acidovorax delafieldi i (AF078764)

FTK -20 (AM263536)Hydrogenophaga palle ronii (AF019073)

LTK-12 (AM263537)Rhodoferax fermentans (D16211)

FTB-40 (AM263519)LTK-92 (AM263520)LTK-102 (AM263521)FTB-35 (AM263523)

FTB-34 (AM263522)FTK-60 (AM263524)Pseudomonas anguilliseptica (X99540)

FTK-55 (AM263525)Pseudomonas marginalis (Z76663)

GTB-14 (AM263526)Pseudomonas fragi (D84014)

GTB-87 (AM263527)Pseudomonas putida (Z76667)Pseudomonas graminis (Y11150)

Pseudomonas fluorescens (Z76662)LTK-87 (AM263528)LTB-21 (AM263529)Aeromonas sobria (X60412)

Aeromonas salmonicida (X71836)FTB-38 (AM263530)

Shewanella put refacie ns (AF170300)LTK-90 (AM263531)Aeromonas veronii (X74684)

GTB-41 (AM263535)Psychrobacter phenylpyruvicus (U46144)

GTB-67 (AM263544)Marinibacillus marinus (AJ237708)Marinibacillus campisalis (AY190535)

GTB-86 (AM263545)GTB-34 (AJ875425)GTK -61 (AM263543)

Bacillus pumilus (X60637)LTK-22 (AM263540)LTK-100 (AM263541)LTK-43 (AM263542)Bacillus cereus (D16266)

GTB-46 (AM263546)GTB-47 (AM263547)

Paenibacillus apiarius (U49247)GTB-19 (AM263548)

Brevibacillus agri (D78454)GTK-22 (AM263549)

Exiguobacterium aurantiacum (X70316)GTK-28 (AM263550)

Kocuria roseus (X87756)Kocur ia ery thromyxa (Y11330)

GTB-43 (AM263551)Kocuria palustris (Y16263)

LTB-37 (AM263553)LTB-45 (AM263552)Arthrobacter c rystallopoi etes (X80738)Micrococcus lute us (M38242)

LTK-14 (AM263555)Microbacterium imperiale (X77442)Microbacterium arborescens (AB007421)

GTK-6 (AM263554)Aureobacterium kitamiense (AB013919)

Desulfovibrio fructosivorans (AF050101)

Firm

icut

es(k

is G

+C t

arta

lmú

Gram

- poz

itív

bakt

ériu

mok)

Akt

inob

akté

rium

ok(n

agy

G+C

tarta

lmú

Gra

m- p

ozití

v bak

tériu

mok)

α- p

rote

obak

tériu

mok

β

-pro

teob

akté

riumo

k γ-

prot

eoba

ktér

ium

ok

11. ábra. A Velencei-tó nád biofilm mintáiból 2000 áprilisában izolált baktériumtörzsek, valamint a velük közvetlen rokonságban álló baktériumok neighbor-joining módszerrel

készült dendrogramja (A méretarány 10% nukleotid különbséget jelöl.)

59

(A M397637)LNE72 (AY190535)Marinibacillus campisalis (AM397638)GNE53

(AJ237708)Marinibacillus marinus (AM397639)GNE46 (D16268)Bacillus firmus A M397640)FNA10 ( (AB020208)Bacillus pumilus

(AM397641)LNE42 (D31739)Bacillus licheniformis (AM397642)LNE7 (AF290548)Bacillus cereus

(AM397643)GNA22 (AY548954)Bacillus fusiformis

(AM397645)LNA82 (X87756)Kocuria rosea

(AM397644)GNA51 (Y16263)Kocur ia palustris

(AM397654)LNA21 (X80742)Arthrobacter ramosus

AM397646)LNA60 ( sp. (AJ313024)Micrococcus

(AM397647)FNE36 sp. (AJ876685)Microbacterium (A M397648)LNE4

(AB007414)Microbacterium impe riale (AM397655)FNE2 (A B013920)Aureobacte rium k itamiense (AM397649)GNA34 (AJ237967)Rhodococcus erythropolis

(AM397656)LNE51 (AJ132378)Defluvibacter lusatiae

(AM397650)FNE10 (D16428)Rhodobacter c apsulatus

(Af200329)Aeromonas salmonicida (AM397652)FNE1 (AJ223180)Aeromonas popoffii

(AM397653)FNA26 (AM397651)GNA20 (AY043391)Klebsiella pneumoniae

(AJ297946)Serratia marcescens (AM397657)LNE35

(AM397658)LNE12 (AF074384)Pseudomonas gessardii

(AF095892)Pseudomonas putida AM397659)GNE25 (

(AF050101)Desulfovibrio fructosivorans

0.10

Firmicutes(kis G+C tartalmú Gram pozitív baktériumok)

Aktinobaktériumok(nagy G+C tartalmú Gram pozitív baktériumok)

α- proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

12. ábra. A Velencei-tó nád biofilm mintáiból 2001 júliusában izolált baktériumtörzsek, valamint a velük közvetlen rokonságban álló baktériumok neighbor-joining módszerrel

készült dendrogramja (A méretarány 10% nukleotid különbséget jelöl.)

A fenti csoportokat képviselő izolátumok számának összehasonlításakor szembetűnő

különbségek figyelhetők meg. A tavaszi mintákat a Gram-negatív baktériumok túlsúlya

(128 törzs) jellemezte. A legtöbb (92) törzs a γ-proteobaktériumok körébe tartozott, a β-

proteobaktériumokat képviselte a legkevesebb (12) törzs. Közel azonos számú törzs nyert

besorolást az α-proteobaktériumok (24), a kis (21) és a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív

baktériumok közé. Ezzel szemben a nyári minták egyértelmű Gram-pozitív dominanciát

(180 törzs) mutattak. Ezen törzsek közül 83 a kis, 97 pedig a nagy G+C tartalmú Gram-

pozitívok csoportjába tartozott. Jóval kevesebb törzs képviselte az α- (30 izolátum) és γ-

proteobaktériumokat (41 izolátum). A tavaszi és nyári mintákból származó törzsek

csoportosításának és azonosításának eredményeit a Függelék (1-2. táblázat) tartalmazza.

A tavaszi mintában az α-proteobaktériumokat az Agrobacterium nemzetség képviselte.

Az oxidatív anyagcserét folytató törzsek többsége képes volt az eszkulin hidrolízisére.

Képviselőik elsősorban a kétszikűek potenciális növénypatogénjeként ismertek. Az

Agrobacterium tumefaciens hatására a növények gyökerén, de földfeletti szárán is sejt- és

60

szövetburjánzások keletkezhetnek. A tumort indukáló gének a baktérium egy nagyméretű

plazmidjában (Ti plazmid) lokalizálódnak; az apatogénekben ez hiányzik (Érsek és

Gáborjányi, 1998). Az Rhizobium (Agrobacterium) vitis a szőlő kórokozója. Micsinai és mtsai

(2003) is izoláltak az ebbe a nemzetségbe tartozó baktériumokat egy őszi mintavétel során a

Velencei-tó pusztuló nádasainak rizómáiról. Az Agrobacterium tumefaciens a nemzetség

egyetlen nitrogénfixációra képes tagja (Eady, 2001), és amennyiben nem kórokozó - és

inkább ez valószínűsíthető - szerepe feltehetően az asszociatív nitrogén fixációban

nyilvánulhat meg (Kovács, 2001).

A nyári biofilm mintákból az α-proteobaktérumok két másik nemzetségét

azonosítottuk. A törzsek közös tulajdonságaként az eszkulin hidrolízisét említhetjük meg. A

Rhodobacter nemzetségbe tartozó baktériumok anaerob fotoorganotróf és aerob

kemoorganotróf növekedésre is képesek. A sötétrózsaszín telepeket képező baktériumok

fényben, anaerob körülmények között szerves anyagokat (malátot, acetátot) használnak

elektron donorként, de egyes törzseik képesek szulfidot és/vagy tioszulfátot hasznosítani. Ily

módon fontos szerepet játszhatnak a tavi és tengeri ökoszisztémák lokális kén-

körforgalmában, csakúgy, mint a szerves anyagok ásványosítási folyamataiban (Sinha és

Baneriee, 1997). A Rhizobiales rendbe tartozó nemzetség általunk is megtalált képviselője a

szigorúan aerob Defluvibacter lusitae, amelyet szennyvíziszapból izoláltak először (Fritsche

és mtsai, 1999).

A β-proteobaktériumok négy nemzetségének (Acidovorax, Delftia, Hydrogenophaga,

Rhodoferax) tagjait kizárólag a tavaszi mintákból származó törzsek képviselték. A β-

proteobaktériumok közönséges előfordulásúak vízi környezetekben, képviselőiket nagy

számban mutatták ki szennyezett vizekből és szennyvíziszap mintákból is. Szennyező

anyagokkal szembeni toleranciájuk és metabolikus képességeik sokfélesége révén ezek a

szervezetek fontos tagjai a szennyezett vizek mikróbaközösségeinek (Brümmer és mtsai,

2003). Az Acidovorax genusz tagjai elsősorban szénhidrátokat oxidálnak aerob körülmények

között, de egyes fajaik (például az A. delafieldii és az A. temperans) denitrifikációra is

képesek (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1994). Acidovorax fajokat aktivált

szennyvíziszap mintákból is kimutattak fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) segítségével

(Schulze és mtsai, 1999). A β-proteobaktériumok egyes általunk is meghatározott

nemzetségeiről (pl. Acidovorax, Hydrogenophaga) ismert, hogy képesek fakultatív

kemolitotróf anyagcserére, melynek során molekuláris hidrogént használnak elektron

donorként (Willems és mtsai, 1989). Jelenlétüket Makk és mtsai (2003) is kimutatták dunai

nád biofilmből.

61

A γ-proteobaktériumok közül Pseudomonasokat mind a tavaszi, mind a nyári

mintából, mindhárom mintavételi területről azonosítottunk. A tavaszi mintákból származó

törzseket a pozitív oxidáz és kataláz teszt jellemezte, míg más tesztekben (pl. nitrát-redukció,

ammonifikáció, kénhidrogén termelés, valamint különféle biopolimerek bontása)

variábilisnak mutatkoztak. A nyáron izolált törzsek közös tulajdonságaként a kazein és a

tween 80 hidrolízisét említhetjük, míg pl. ammonifikáció, nitrtrát-redukció és kénhidrogén

termelése szempontjából – hasonlóan a tavaszi törzsekhez –variábilisak voltak. A nemzetséget

reprezentáló törzsek, illetve az identifikált fajok számában szembetűnő eltéréseket lehetett

megfigyelni. A tavaszi mintákból kitenyésztett 41 törzs a nemzetség 4 faját (P.

anguilliseptica, P. fragi, P. marginalis, P. putida), míg a nyári mintákból összesen

17 izolátum 2 fajt (P. gessardii, P. putida) képviselt. Az egyetlen faj, amelyet mindkét

időpontban sikerült kitenyészteni, a P. putida volt. A velencei-tavi Pseudomonas törzsek és

fajok számának (a tavaszihoz képest nyáron megfigyelt) csökkenésében feltehetően az érett

biofilm struktúrára jellemző fluktuáló aerob-anaerob mikrokörnyezetek mellett a

vízhőmérséklet jelentős emelkedésének is szerepe lehetett. A szigorúan respiratórikus

anyagcseréjű Pseudomonasok elsősorban az őszi-téli időszakban tipikusak vízi

környezetekben, talajokban és növény-asszociált mikróbaközösségekben (Borsodi és mtsai,

1998; 2003a, 2003b; Makk, 2003; Smit és mtsai, 2001). A Pseudomonas nemzetség tagjai

lehetnek szaprotrófok, de közöttük humán-, állat- és növénypatogéneket is számon tartanak.

Terminális elektronakceptoruk az oxigén, de egyes fajaik, mint például a P. stutzeri és P.

fluorescens anaerob körülmények között alternatív elektronakceptorként nitrátot is képes

elfogadni. Katabolikus sokféleségük miatt, főként szerves savak és aminosavak oxidációja

révén, és mert magas szerves anyag koncentrációt is tolerálnak, fontos szerepük van a szerves

anyagok mineralizációjában. Néhány fajuk fakultatív kemolitotróf, ezek hidrogént is

hasznosíthatnak elektrondonorként (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1994).

A P. angulliseptica fajt, melyet halak kórokozójaként tartanak számon, a tavaszi minták közül

zömében a Fürdető mintájából izoláltuk. A szintén csak a tavasszal vett mintákból

kitenyésztett P. marginalis és P. fragi fajok képviselői potenciális növénypatogén

baktériumokként ismertek. A P. putidaként identifikált velencei-tavi törzseket az Agárd-

Gárdony Hosszútisztásról mind a két szezonban, a Fürdetőről tavasszal, a Lángi-tisztás

területéről pedig nyáron izoláltuk. A Fürdető és a Lángi-tisztás területéről származó nyári

mintákból tenyésztettük ki a P. gessardii faj képviselőit. Ezt a fajt először természetes

ásványvizekből izolálták (Verhille és mtsai, 1999). Az ún. fluoreszcens csoportba tartozó

Pseudomonas fajokról ismert, hogy részt vesznek a növényi kórokozó mikroorganizmusok

62

eliminálásában. Vashiányos körülmények között fluoreszkáló sziderofórokat állítanak elő,

melyek megkötik a vasat, ami ezáltal más szervezetek, köztük a patogének számára is

hozzáférhetetlenné válik, így azok képtelenek tovább fejlődni, populációik mérete erősen

csökken (Kloepper és mtsai, 1980). Berg és mtsai (2002) a P. putida izolátumokat, Benhamou

és mtsai (1996) a P. fluorescens törzseket találták hatékonynak egyes fertőző ágensek

ellenében. Fluoreszcens pigmentet termelő Pseudomonasokat korábban Makk és mtsai (2003)

téli dunai nádminták biofilmjéből, Micsinai és mtsai (2003) őszi velencei-tavi egészséges

nádrizómák külső és belső felületéről is kimutattak.

A γ-proteobaktériumok körébe tartozó Aeromonas nemzetség, ugyancsak mind a

tavaszi, mind a nyári nád biofilm minták tenyészthető közösségalkotójának bizonyult.

Valamennyien hasonló anyagcsere képességekkel rendelkeztek, amit a nitrát nitritig történő

redukciója, az intenzív oxidatív és fermentatív, gyakran gázképződéssel járó glükóz

hasznosítás, a pozitív Voges-Proskauer teszt és számos biopolimer bontásának képessége

jellemzett. Abundanciájukban a Pseudomonasokhoz hasonló szezonális eltérést tapasztaltunk.

Az A. sobria fajt képviselő 43 (mindhárom mintavételi területről izolált) törzs képezte a

tavaszi törzsek legnagyobb csoportját, 4 törzs képviselőjét A. veroniiként azonosítottunk.

Ezzel szemben nyáron mindössze 16 törzs képviselte a nemzetséget. Az A. popoffiit (1 törzs)

nyáron a Fürdető mintájából izoláltuk, emellett az A. salmonicida fajt 15 (mindhárom

mintavételi területről izolált) törzs képviselte. Az Aeromonasok közönségesek édesvizekben

(Langó és mtsai, 2002), szennyvizekben, sőt az ivóvízben is előfordulhatnak. Humán- és

állatpatogének is ismeretesek közöttük (Kaper és mtsai, 1981; Seidler és mtsai, 1980, Fehr és

mtsai, 2007). Az Aeromonasok gyakorisága, valamint a hőmérséklet, a foszfát, a nitrogén, a

szerves szén és a klorofill-a koncentráció növekedése között egyenes arányosság, míg az

oldott oxigén vonatkozásában fordított arányosság figyelhető meg (Rhodes és Kator, 1994).

Anaerob vagy mikroaerofil körülmények közötti szaporodásukat az teszi lehetővé, hogy

oxidatív és fermentatív metabolizmusra egyaránt képesek. Ilyen környezetben elsősorban

egyszerű cukrokat fermentálnak, de hasznosítanak aminosavakat is. Monfort és Baleux (1990)

szerint az A. sobria faj feltehetően az eutróf ökoszisztémák autochton tagja. Az A.

salmonicida természetes környezetben halparazita, lazacok és pisztrángok megbetegedéséért

tehető felelőssé (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1994).

A γ-proteobaktériumok más nemzetségeinek jelenlétét vagy csak a tavaszi, vagy

kizárólag a nyári mintákból sikerült kimutatni. Ilyenek a tavaszi mintákból származó,

Shewanella és Psychrobacter nemzetségbe sorolt törzsek. A mindössze négy törzsre az

oxidáz- és kataláz pozitivitás, valamint a nitrát nitritig történő redukciója volt jellemző. A

63

Shewanella putrefaciens faj reprezentánsai gyakoriak vizes élőhelyeken. Kemoorganotróf

növekedésük során főként szerves savakat (például hangyasavat, ecetsavat, tejsavat,

piroszőlősavat) értékesítenek, de fakultatív kemolitotróf életmódra is képesek, ekkor hidrogén

oxidálásával biztosítják az energiát életfolyamataik számára. Aerob körülmények között az

oxigén a végső elektronfelvevőjük, az oxigén alacsony parciális nyomása mellett viszont a

következő szervetlen elektronakceptorokat redukálhatják: NO32-, Fe3+, Mn4+, S0, SO3

2- és

S2O32-. Ennek következtében fontos szerepet tölthetnek be a vas, a mangán és a kén

biogeokémiai ciklusában is (Lee és mtsai, 1977; Lovley és mtsai, 1989; MacDonell és

Colwell, 1985; Widdel és Pfenning, 1992).

A Psychrobacter nemzetség tagjai hidegtűrő, halotoleráns szervezetek, amelynek

számos faját mutatták ki tengervízből és alga-asszociált mikróbaközösségekből is (Yoon és

mtsai, 2005; Lee és mtsai, 2006). Két kifejezetten halofil fajt, a P. submarinust és a P.

marincolat szintén tengeri környezetből izolálták és írták le elsőként Romanenko és

munkatársai (2002). A nemzetséget képviselő két velencei-tavi törzset TSY táptalajról

izoláltuk, közös sajátságuk a glükóz oxidatív és fermentatív hasznosítása, valamint a kazein,

zselatin és keményítő bontásának hiánya volt. A reprezentáns törzset mindössze 95%-os

szekvencia hasonlósági szinten sikerült a nemzetség tagjaként azonosítanunk, ezért

feltételezhetően új fajt képvisel.

Az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumokat csak a nyári mintákból sikerült

izolálni, mind a három mintavételi területről. Ezen izolátumok közös fenotípusos tulajdonsága

a glükóz oxidatív és fermentatív hasznosítása, a nitrát nitritig történő redukciója, valamint az

eszkulin hidrolízise volt. A Klebsiella nemzetség képviselői (3 törzs) kizárólag King’s B

táptalajról származtak. Egyes fajaik humán patogénekként ismeretesek (Podschunn és

Ullmann, 1998), ugyanakkor néhány természetes környezetben előforduló képviselőjükről

leírták, hogy nitrogén fixációra is képesek (Schmitz és mtsai, 2002).

A Serratia marcescenst 5, a Lángi-tisztásról és az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról

származó törzs képviselte. Ezek a baktériumok talajokban és vizes környezetekben is

megtalálható, fermentációra is képes szervezetek. Egyes törzseiket a biológiai

növényvédelemben is tesztelték növénypatogénekkel szemben (Roberts és mtsai, 2005).

A tenyésztésen alapuló vizsgálatok eredményei a kis G+C tartalmú Gram-pozitív

baktériumok abundanciájában és diverzitásában szintén szezonális különbségeket tártak fel.

Az áprilisi minták mindössze 23 törzse nyert besorolást ebbe a csoportba, amelyek a vizsgált

fenotípusos tesztekben törzsenként változó, de általában nagy aktivitást mutattak. A Gram-

pozitív dominanciával jellemezhető nyári minták törzsállományából azonban már 83 izolátum

64

képviselte a csoportot. Ezek a Gram-variábilisan festődő törzsek lassú vegyessavas

fermentációra (pozitív metilvörös teszt), valamint az eszkulin és egyes polimerek, például a

kazein és zselatin hidrolízise képes szervezetek voltak. A fenotipikai tesztek eredményeivel

végzett PCA analízis kapcsán korábban említésre került, hogy a nyári mintavétel alkalmával

kitenyésztett közösségekre inkább a lassú, egy héten belül megfigyelhető fermentatív aktivitás

volt jellemző, ennek egyik feltételezhető oka többek között a Bacillus és rokon

nemzetségekbe tartozó törzsek nagy száma lehet.

A tavaszi minták kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumai összesen öt nemzetségbe

nyertek besorolást. A Bacillus nemzetség tagjain (B. cereus) kívül közelrokon nemzetségek,

mint a Brevibacillus, a Paenibacillus és Marinibacillus, valamint az Exiguobacterium is

képviseltették magukat. Az utóbbi nemzetségekhez tartozó törzsek mindegyikét az Agárd-

Gárdony Hosszútisztás mintájából, TSY táptalajról izoláltuk. A Brevibacillus és a

Paenibacillus nemzetség faji szinten nem identifikált tagját reprezentáló törzsek alacsony

szekvencia-hasonlósági értékei arra utalnak, hogy ezek az izolátumok esetleg a fenti

nemzetségek új fajait képviselik. A nyáron vett mintákból a Bacillus (B. pumilus, B. cereus,

B. licheniformis, B. firmus és B. fusiformis) és a Marinibacillus (M. marinus és M. campisalis)

nemzetségek fajait sikerült azonosítani. A mintavételi területek szempontjából nem volt a

tavaszi mintákhoz hasonló elkülönülés, említésre méltó azonban, hogy a Marinibacillus

marinust képiselő mindkét törzs az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról származott, míg a B.

cereus és B. licheniformis fajok jelenlétét egyedül a Lángi-tisztás biofilmjében sikerült

kimutatni.

A Bacillus nemzetség képviselői általánosan előfordulnak talajokban, üledékekben,

gyökérkörnyezetben, ezért a nádszár biofilmjében való előfordulásuk nem meglepő. Az

általunk izolált Bacillus fajok majdnem mindegyikét kimutatták már növények környezetéből.

Kovács (2001) a keskenylevelű gyékény (Typha angustifolia) gyökérkörnyezetében a Gram-

pozitív baktériumok között tenyésztéses módszerekkel domináns fajként írta le az

alkalitoleráns B. pumilust. Ugyanez a faj a tenyészthető baktériumok között a Fertő

üledékében is dominánsként szerepelt (Borsodi és Sallai, 1998). A Velencei-tó üledékéből

Borsodi és mtsai (2003b) több Bacillus fajt is kimutattak, köztük az általunk is identifikált

alkalofil és pszichrofil Marinibacillus marinust. A dunai nád biofilm baktériumközösségeiben

szezonálisan változó Bacillus fajok jelenlétét mutatták ki Makk és mtsai (2003), és

Bacillusokat kovamoszatokhoz asszociált baktérium közösségekből is leírtak (Makk, 2002).

A Bacillusok endospóráik révén a kedvezőtlen körülményeket is képesek átvészelni,

bár éppen e képességük révén a tenyésztéses módszerekkel nyert eredmények alapján nehezen

65

dönthető el, hogy valós számukról és aktivitásukról kapunk-e képet. Molekuláris

módszerekkel történő vizsgálatok során azonban gyakran alulreprezentáltak maradnak, főként

nehezen lizálható sejtfaluk és/vagy endospóra burkuk miatt (Smit és mtsai, 2001). Számos

fajukról ismert a polimerek (cellulóz, keményítő, zselatin) bontásának képessége is (Pourcher

és mtsai, 2001). Mások nitrogénkötő képességüknél fogva (Melnikova és mtsai, 2000)

képesek lehetnek az igen magas C:N aránnyal (Boschker és Cappenberg, 1998) jellemezhető

nádtörmelék környezetében az elemi nitrogén ammóniává történő redukciójára, majd ez

utóbbi asszimilációjára.

A Bacillus fajok között számosat, mint növényi növekedést serkentő rizobaktériumot

(ún. PGPR fajt) tartanak számon (Shishido és mtsai, 1995; Petersen és mtsai, 1996; Bach és

mtsai, 2001; Joo és mtsai, 2004), többek között fent leírt tulajdonságukból adódóan, de egyes

törzsek növénypatogénekkel szembeni antagonista tulajdonságokkal is rendelkeznek (Berg és

mtsai, 2002). Elsősorban a B. pumilus és B. subtilis fajokról ismert, hogy hatékony gyökér-

kolonizáló szervezetek (Benhamou és mtsai, 1996; Juhnke és mtsai, 1987). A B. pumilusról

kimutatták, hogy a rizs magjának endofitájaként elősegítheti a rizsnövény fejlődését egyrészt

a gyökér korai kolonizációjának, másrészt a rizoszférában a növény-mikróba interakciók

szabályozásán keresztül (Bacilio-Jiménez és mtsai, 2001). A B. cereus fajról paradicsom

növényen végzett kutatások során kiderült, hogy növényvédő szerepe lehet – a patogén

mikroorganizmusok szupresszióján keresztül – egyes betegségek kialakulásának

megakadályozásában (Smith és mtsai, 1999).

A Bacillus nemzetségből különválasztott Paenibacillus nemzetség tagjai szintén

általános előfordulásúak talajokban és növények gyökérkörnyezetében (von der Weid és

mtsai, 2000; Berge és mtsai, 2002). Számos biopolimert és egyéb anyagot képesek

transzformálni, többek között PAH-okat (Daane és mtsai, 2002), cellulózt (Wenzel és mtsai,

2002; Pourcher és mtsai, 2001), pektint (Sakiyama és mtsai, 2001). Egyes fajaik továbbá

antifungális anyagok termelésére is képesek (Beatty és Jensen, 2002; Chung és mtsai, 2000),

valamint meglehetősen gyakori atmoszférikus nitrogén-kötő tulajdonságuk is (Seldin és mtsai,

1998; Rosado és mtsai, 1998).

Az Exiguobacterium aurantiacum faj típustörzsét egy burgonya feldolgozó üzem

szennyvizéből írták le, és jellegzetes tulajdonsága a széles pH tartományban való szaporodás

(optimum pH 9, növekedés a pH 6,5-11 tartományban) (Collins és mtsai, 1983). A Velencei-

és a Fertő-tó nádrizómáiról szintén kitenyésztették ezt a fajt (Micsinai és mtsai, 2003; Borsodi

és mtsai, 2005b).

66

A Gram-negatív dominanciával jellemezhető tavaszi mintákban a törzsek kis számban

(24) képviselték a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokat. Ezekre a törzsekre a

zselatin hidrolízise volt jellemző. Az egy kivételével az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról és a

Lángi-tisztásról származó törzsek reprezentánsait 5 nemzetségbe (Micrococcus,

Microbacterium, Aureobacterium, Arthrobacter, Kocuria) tartózóként identifikáltuk. Ezzel

szemben a nyári törzsállományon belül mind a három mintavételi területről előkerült nagy

G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok képezték a legnagyobb csoportot (97 törzs). A

tavaszi mintákból azonosított nemzetségeken kívül a Rhodococcus nemzetség képviselte a

nyáron izolált törzsek egyik legnagyobb (22) törzsszámú csoport. A Micrococcus és

Microbacterium nemzetségek tagjaiként azonosított reprezentánsok csoportjaiba szintén

nagyszámú (24, illetve 28) törzs tartozott. Néhány kivételtől eltekintve az eszkulin, a zselatin

és a kazein hidrolízise, valamint a metilvörös reakció és a glükóz egy héten belül történő

oxidatív és fermentatív felhasználása voltak a törzsek jellemző pozitív tesztjei.

A Micrococcus nemzetség tagjai a nyugodt nyílt víz tipikus lemezelhető baktériumai

(Kotsis és mtsai, 1982), melyek obligát aerob anyagcserét folytatnak, és jól tolerálják a

környezet sókoncentrációjának ingadozását. A Fertő nádasainak biofilmjéből a M. luteus faj

jelenlétét mutatták ki Borsodi és mtsai (1998a). Lilley és munkatársai (1996) cukornád

gyökérkörnyezetét vizsgálva detektálták e nemzetség több képviselőjét.

A vízi környezetekben közönségesen előforduló Microbacterium nemzetség tagjai

közül a tavaszi minták közül két Lángi-tisztásról származó törzs képviselte a M. imperiale

fajt. A nyári, mindhárom területről származó törzsek szintén ezzel a fajjal mutattak nagy

szekvencia-hasonlóságot. Egyetlen, Lángi-tisztásról izolált törzset azonosítottunk M.

(korábban Aureobacterium) flavescensként. A két nemzetség képviselői monofiletikus

leszármazásúak, legtöbb fenotípusos és kemotaxonómiai sajátságukban hasonlítanak

egymásra, alapvetően a sejtfalszerkezetükben megnyilvánuló különbségek alapján különülnek

el egymástól (Takeuchi és Hatano, 1998). Az Aureobacteriumok főként oxidatív

anyagcseréjű, de fermentációra is képes szervezetek. A nemzetség tagjai közül az A.

kitamiense faj képviselőit sikerült mindkét mintavétel során kitenyészteni.

A nagy G+C tartalmú Gram-pozitív Aureobacteriumok, Microbacteriumok, valamint

Rhodococcusok jelenlétét cukornád gyökeréről kitenyésztett aerob heterotróf

baktériumtörzsek zsírsav-metilészter gázkromatográfiás (FAME-GC) vizsgálata is igazolta

(Lilley és mtsai, 1996). Humuszban előforduló baktériumok növényi növekedést elősegítő

tulajdonságait és egyes boreális fafajok gyökerének kolonizációs képességét vizsgálva Elo és

mtsai (2000) az Arthrobacter, Nocardia, Rhodococcus és Bacillus nemzetségek gyakori

67

jelenlétét mutatták ki. A Rhodococcus erythropolisról igazolták nitrogén fixációs képességét

is. A nemzetségbe tartozó baktériumok metabolikus sokféleségük révén számos szerves

anyag, többek között különféle xenobiotikumok bontására is képesek (Larkin és mtsai, 2005).

Mind a tavaszi, mind a nyári mintából kimutatható volt a Kocuria rosea és a Kocuria

palustris fajok jelenléte. Az aerob respiratórikus anyagcserével bíró K. rosea tipikus

előfordulású talajokban és vízi környezetekben, az egyes környezeti tényezők értékeinek (pl.

sókoncentráció, pH vagy hőméréséklet) széles skáláját képes tolerálni (Borsodi és mtsai,

2007). Kovács és mtsai (1999) a keveskenylevelű gyékényről a tudomány számára két új

Kocuria fajt írt le: a K. palustrist és a K. rhizophilat. Nitrátlégző és keményítőbontó

képességük révén valószínűleg aktívan bekapcsolódnak a nádrizóma felületein kialakuló szén-

és nitrogén anyagcserébe is. Érdekes, hogy nagy számban voltak kimutathatók a nádrizómák

belső felületein is (Micsinai és mtsai, 2003), ami egybevág Andrews és Harris (2000)

feltételezésével, mely szerint a Kocuriak növényi növekedésserkentő gyökérbaktériumok

(PGPR) is lehetnek.

Az Arthrobacter nemzetség két faját, az A. crystallopoietest a Lángi-tisztásról tavasszal,

az A. ramosust a Lángi-tisztásról és az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról nyáron azonosítottuk.

A Gram-pozitív, aerob oxidatív anyagcserét folytató nemzetség képviselői talajokban

általános előfordulásúak, de megtalálhatók édesvizekben, tengervízben és szennyvízben

egyaránt. Komplex poliszacharidokat bontó képességüknél fogva a növényi szerves anyagok

lebontásában is szerepet játszhatnak. A növények gyökerét is közvetlenül képesek kolonizálni

(Sato és Yiang, 1996), sőt egyes fajok opinok katabolizmusára is képesek (Gardener és de

Brujin, 1998). A legtöbb Arthrobacter képes nitrogént fixálni (Jones és Keddie, 2000). A

nemzetség egyes tagjai herbicidek degradálására is képesek (Tixier és mtsai, 2002).

68

7.1.4 A klónozás eredményei

A Velencei-tó természetvédelmi területén található Lángi-tisztás a másik két

mintavételi területhez képest háborítatlan, széles összefüggő nádasövvel határolt térség. A

2000-es és 2001-es tenyésztésen alapuló és BIOLOG közösségi szénforrás értékesítési

vizsgálatok, valamint a 2003-as anyagcsere és genetikai ujjlenyomat vizsgálatok eredményei

is azt mutatták, hogy az itt található nád biofilm közösség gazdag fajösszetételű és széleskörű

metabolikus aktivitással rendelkezik, ezért 2006-ban a három mintavételi hely közül ezt a

területet választottuk a tenyésztéstől független, molekuláris klónozásos módszerrel történő

vizsgálatra.

A mintából izolált közösségi DNS-ből a 16S rDNS körülbelül 500 bázispár hosszú

szakaszának felszaporítása PCR segítségével történt. Az egyes DNS szakaszok klónozását

követően 140 klónt számláló könyvtárat hoztunk létre. Az inszertet tartalmazó klónokat (126)

az izolált törzsekhez hasonló módon ARDRA segítségével csoportosítottuk, és a klónokat 36

különböző hasítási mintázattal rendelkező csoportotba soroltuk. Ezt követően a csoportonként

kiválasztott reprezentáns klónokat a 16S rDNS szekvencia analízisére alapozva identifikáltuk

(Függelék 5. táblázat). A reprezentatív klónok taxonómiai helyzetét a 16S rDNS parciális

szekvencia adatok alapján neighbor-joining módszerrel készült filogenetikai dendrogramon

mutatjuk be (13. ábra). Összesen 9 szekvencia bizonyult a klónozás során keletkezett ún.

kiméra szekvenciának. Mikrobiális közösségek DNS-alapú klónozással történő vizsgálatakor

a PCR során alkalmazott eubakteriális primerek a feltárt mintában jelen levő növényi-, illetve

alga kloroplasztisz géneket is amplifikálhatják (Normander és Prosser, 2000; Yang és

Crowley, 2000). Jelen vizsgálatunk során mi is kimutattuk, hogy a velencei-tavi nád

perifitonban a baktériumközösségek mellett feltehetően a korábban Ács és munkatársai

(2003) által részletesen tanulmányozott kovaalga, valamint a cianobaktérium közösségek is

fontos szerepet játszhatnak. A klónkönyvtárban 4 csoportba soroltuk a 23 kovaalga

kloroplasztisz, illetve 15 cianobaktérium DNS-ként azonosított klónszekvenciát. Bár a

környezeti mintából izolált teljes közösségi RNS-ből kiinduló klónozásos technika

alkalmazásával kiküszöbölhető a nem kívánt génszakaszok vizsgálata, és e módszerrel a

vizsgált közösség tényleges aktivitásáról is képet kaphatunk, azonban a környezeti mintákból

történő RNS izolálás optimalizációja és amplifikációja az RNS molekula DNS-hez

viszonyított érzékenysége, valamint az RN-ázok általános előfordulásának problematikája

miatt idő- és laborigényesebb, mint a DNS alapú munka (Nikolausz és mtsai, 2004).

69

13. ábra. A velencei-tavi Lángi-tisztás nád biofilmjéből származó klónok neighbor-joining

L119 Rickettsiales bakterium klón (DQ223223)

(U55820)Rickettsia peacockii L18 (AY785128)Sphingomonas kaistensis

L42 baktérium klón (EF540429) L19 Methylophilaceae baktérium klón (AF418951)

Alfa-proteobaktérium klón (DQ432405) L33

(D32241)Paracoccus kocurii (D16428)Rhodobacter capsulatus

L43 Alfa-proteobaktérium klón (EF220748)

L48 Baktérium klón (AY338037)

(DQ287787)Methylobacillus flagellatus L9 Beta-proteobaktérium klón (DQ501338)

(AY879297)Denitratisoma oestradiolicum L96 Beta-proteobaktérium klón (EF417647)

L88 sp. (EF179861)Aquabacterium

(AF035050)Aquabacterium citratiphilum L14 (DQ462462)Lysobacter niastensis (AB161360)Lysobacter brunescens L136 Xanthomonadaceae baktérium klón (EF019778)

L66 Gamma-proteobaktérium klón (DQ351758)

(X72770)Methylococcus capsulatus L65 baktérium klón (AJ548901)

(X91814)Chondromyces comitans L16 Sphingobacteria baktéium klón (EF520603) L83

sp. (DQ530100)Flavobacterium (AM230489)Flavobacterium johnsoniae

L106 Sphingobacteria baktérium klón (DQ003154)

L21 (M58788)Flexibacter ruber

L15 baktérium klón (AJ318142)

sp. (AJ224414)Cytophaga L10 (AJ784892)Haliscomenobacter hydrossis L135 Sphingobacteria baktérium klón (EF520596)

L2 Bacteriodetes baktérium klón (DQ917823)

L29 baktérium klón (EF203206)

Chlorobi baktérium klón (EF562071) L47 baktérium klón (AY940555) sp. (X97096)Spirochaeta L62

Verrucomicrobia baktérium klón (EF220751) (X90515)Verrucomicrobium spinosum

L95 Chloroflexi baktérium klón (EF220771)

(AB109439)Levilinea saccharolytica L129 Gemmatimonadetes baktérium klón (DQ828292) (AB072735)Gemmatimonas aurantiaca L22 Gemmatimonadetes baktérium klón (EF220497)

(AF334601)Termodesulphobacterium thermophilum

100

100

10099

100

86100

100

100

100

100100

99100

100

100

90

6579

100

100

100

100

100

100

100

65100

100

100

100100

100

91100

99

9999

98

97

96

92

54

94

53

52

90

93

90

98

96

99

59

9463

10090

0.05

α- p roteobaktériumok

Bacteriod etes

Gemmatimonadetes

Chlorobi(zöld kén baktériumok )

Chl oroflexi(zö ld nem kén baktér iumok)

Spirochaetes

Verrucomicrobia

γ-proteo baktériumok

β-proteobaktériumok

módszerrel készült filogenetikai dendrogramja (Méretarány: 5% nukleotid különbség.)

70

Az általunk végzett kutatás keretein belül is megkezdődtek a biofilm minták RNS-

alapú

ztásról gyűjtött nád biofilm mintákból származó 79 baktériumklón, és a

korább

el fele tartozott a tenyésztéssel is kimutatott három

proteob

különfé

vizsgálatai, jelenleg a DNS-től mentes RNS-minták kinyerésének optimalizációja

folyik.

A Lángi-tis

an (2000 áprilisában és 2001 júliusában) kitenyésztett 106 törzs nagyobb filogenetikai

csoportonkénti megoszlását (14. ábra) összehasonlítva kitűnik, hogy klónozás révén a nád

biofilm alkotásában résztvevő baktériumközösségek szélesebb diverzitását tártuk fel. Bár a

korábbi vizsgálatok során alkalmazott tenyésztési feltételek és módszerek mellett a kimutatott

klónokhoz hasonló szervezetek kitenyésztésére nem is vállalkozhattunk, mégis meglepő

eredmény volt, hogy a klónszekvenciák nagy része (68 klón) eddig még tenyésztésbe nem

vont szervezetek szekvenciával mutatta a legnagyobb fokú hasonlóságot. Ugyanakkor az is

feltűnő, hogy a klónkönyvtárban egyetlen Gram-pozitív baktériumot sem azonosítottuk. A

kétféle (tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független) módszerrel nyert különböző

eredmények hátterében feltehetően az alkalmazott technikák eltérő szelektivitása áll. A

tenyésztéssel feltárt mikróbaközösségek összetételében gyakran megfigyelhető jelenség a

Gram-pozitív illetve spóraképző szervezetek túlsúlya (Smit és mtsai, 2001). A molekuláris

klónozást megelőző DNS izolálás során előfordulhat egyes baktériumok preferenciális

feltáródása, például a sejtfal-sajátságok eltérései miatt és ennek következtében nagyobb

arányú detektálásuk az adott mintában (von Wintzingerode, 1997; Frostegard és mtsai, 1999;

Martin-Laurent és mtsai, 2001).

A klónszekvenciák köz

aktérium csoport valamelyikébe. Az így nyert egyes csoportok aránya azonban eltérő

volt: legnagyobb részük nem a γ-, hanem az α-proteobaktériumok rokonsági körébe tartozott.

A legnagyobb szekvencia hasonlóságot pl. antarktikus talajból, édesvízből, alkalikus szikes

tavi vízmintából származó bakteriális klónokkal mutatták (Függelék 5. táblázat). Faji szinten a

Sphingomonas kaistensist sikerült azonosítanunk. Ez a szervezet speciális, biotechnológiai

szempontból hasznosítható exopoliszacharidok termelése, valamint egyes xenobiotikumok

bontásának képessége révén gyakran tárgya az alkalmazott kutatásoknak (Seo és mtsai, 2004).

A törzsek és a klónok szintén eltérő arányban képviselték a β-proteobaktériumokat. A

le vízi környezetekből származó klónokkal mutatott hasonlóságon kívül egy ARDRA-

reprezentánst a Lysobacter niastensis faj képviselőiként azonosítottunk, amelyet uborka

növények gyökérkörnyezetéből izoláltak és írtak le először (Weon és mtsai, 2007). Az

Aquabacterium nemzetséget egy ARDRA-csoport klónjai képviselték. Az Aquabacteriumokat

71

polifoszfát-felhalmozó és széleskörű szerves sav hasznosító képességük (Kalmbach és mtsai,

1999) hozzásegíti a biofilmeket jellemző oligotróf környezethez való adaptálódáshoz.

A klónok mindössze 10%-a nyert besorolást a γ-proteobaktériumok közé, amelyek kizárólag

tenyésztésbe nem vont (nehézfémmel szennyezett tengeri üledékből, illetve rezgőnyár

gyökérkörnyezetéből származó) környezeti klónokkal (Függelék 5. táblázat) mutattak

nagyfokú szekvencia hasonlóságot.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

törzsek klónok

α-proteobaktériumok

β-proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

Firmicutes (kis G+C)

Aktinobaktériumok (nagy G+C)

Bacteriodetes

Gemmatimonadetes

Verrucomicrobia

Spirochaetes

Chlorobi

Chloroflexi

14. ábra A velencei-tavi Lángi-tisztás nádasállományának biofilmjéből származó klónok és baktériumtörzsek filogenetikai csoportok közötti megoszlásának összehasonlítása

A klónkönyvtár vizsgálata alapján a különböző baktériumcsoportok képviselőiként

azonosított szekvenciák többsége (35%) a Bacteriodetes csoportba nyert besorolást. Ezek

közül számos klón más tenyésztésbe nem vont klónnal mutatott hasonlóságot, amelyek

különféle környezeti mintákból (pl. édesvízű tavak, ásványi alzaton kialakult biofilm, magas

sótartalmú szennyvíz, stb.) kerültek elő. A törzs képviselői nemcsak vízi környezetekben,

hanem talajokban és növény-asszociált mikrobiális közösségekben is közönséges

előfordulásúak, képviselőiket azonosították pl. egészséges és Erwiniaval fertőzőtt

burgonyanövények, valamint Ni-felhalmozó növények gyökérkörnyezetéből (Reiter és mtsai,

2002; Idris és mtsai, 2004). Ezek a kutatások rámutattak, hogy a növény-asszociált mikrobióta

köztük a gyakran abundáns Bacteriodetes csoport tagjai sokrétű hasznos szerepet tölthetnek

be a növény és szűkebb környezete életében. A Bacteriodetes csoportból a Flexibacter,

Haliscomenobacter és Flavobacterium taxonokat sikerült nemzetség, illetve faji szinten

72

indentifikálnunk. A Flavobacteriaceae családba tartozó nemzetség tagjainak számos faja

tengeri környezetből származik, ahol elsődleges szerepük az elsődleges produkció révén

keletkező szerves anyagok mineralizációjában jelölhető ki (Bowman és Nichols, 2005). A

Flavobacteriumok és a Sphingobacteriumok a tenyésztés körülményeivel (pl. sókoncentráció,

szerves anyag tartalom) összefüggő érzékenységükről ismeretesek, és valószínűleg ez lehet az

egyik oka annak, hogy a tenyésztéshez képest klónozás segítségével nagyobb arányban

azonosítottuk őket. Az adatbázisokban fellelhető viszonylag kevés tenyésztésbe vont

Bacteriodetes baktériumot képviselő szekvencia szintén azt jelzi, hogy a tenyésztésen alapuló

vizsgálatok továbbfejlesztése nagymértékben hozzájárulhat a csoport sokféleségének és

aktivitásának megismeréséhez (Jooste és Hugo, 1999; O’Sullivan és mtsai, 2002).

Több baktériumcsoportot csak klónozással detektálnunk. Ezek az ARDRA csoportok

minden esetben kevés számú (1-5) klónt tartalmaztak és a klónok 1-6%-át képviselték.

Reprezentánsaik a Verrucomicrobia, a Gemmatimonadetes, a Spirochaetes, valamint a zöld

kén (Chlorobi) és a zöld nem kén baktériumok (Chloroflexi) körébe nyertek besorolást. Az

adatbázisokban fellelhető szekvenciák nagy része ezidáig tenyésztésbe még nem vont

képviselőktől származik, a legtöbb irodalmi adat molekuláris biológiai, nukleinsav-alapú

módszerek alkalmazásával nyert eredményekről áll rendelkezésre.

A Gemmatimonadetes és a Verrucomicrobium filogenetikai ág is mindössze 1-1

tenyésztésbe vont fajjal rendelkezik, azonban a környezeti mintákból származó szekvencia

adatok alapján feltehetően széleskörben elterjedt, és meglepően nagy filogenetikai

diverzitással rendelkezik (Schlesner, 1988; Zhang és mtsai, 2003). Borsodi és mtsai (2005a) a

kiskunsági Kelemen-szék molekuláris klónozással történő vizsgálata során a

Gemmatimonadetes csoport 6%-os arányát mutatták ki.

A Spirochaetes csoport tagjai fakultatív vagy obligát anaerob szervezetek, amelyek

tengeri és édesvízi környezetekben egyaránt megtalálhatók. Különleges környezeti

feltételekhez (pl. szélsőséges alkalinitás, sótartalom, hőmérséklet, nyomás) adaptálódott

képviselőik speciális enzimeiknek köszönhetően a biotechnológiai alkalmazás lehetőségét

hordozzák magukban (Hoower és mtsai, 2003). A Lángi-tisztás nád biofilm mintájából olyan

zöld kén és zöld nem kén baktériumok (Chlorobi és Chloroflexi) jelenlétére utaló

szekvenciákat sikerült kimutatnunk, amelyekhez legközelebbi rokon szekvenciák talajokból

és üledékekből származtak (Függelék).

A klónozásos módszer alkalmazásával számos, eddig tenyésztésbe nem vont, illetve az

általunk tenyésztéssel nem kimutatott baktérium jelenlétét sikerült igazolnunk a Lángi-tisztás

nád biofilm baktériumközösségében. Míg tenyésztéses vizsgálatainkkal az aerob heterotróf

73

kemoorganotróf baktériumközösségeket tudtuk vizsgálni, a klónozás rámutatott számos más

metabolizmussal jellemezhető szervezet jelenlétére is, melyek feltehetően igen fontos szerepet

játszanak a nád biofilm közösségi anyagcseréjében. A klónozás a tenyésztéses vizsgálatokhoz

képest gyors, kevés időt igénylő mikrobiális ökológiai módszer. Ez a környezeti mintából

közvetlen, teljes közösségi DNS izolálásán és vizsgálatán alapuló technika hozzájárul a

tenyésztéssel esetlegesen nehezen feltárható és így rejtve maradó diverzitás feltárásához.

74

7.2 A Kelemen-szék és a Nagy-Vadas nád biofilm vizsgálatának

eredményei és értékelésük

7.2.1 BIOLOG közösségi szénforrás értékesítési vizsgálatok

A BIOLOG GN2 lemezek felhasználásával végzett közösségi szénforrás hasznosítási

mintázatok szezonális változásainak nyomon követésére 2005-ben és 2006-ban vettünk nád

biofilm mintákat a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas egy-egy reprezentatív helyéről tavasszal,

nyáron és ősszel. A velencei-tavi mintáknál ismertetett módon az abszorbancia értékeket öt

különböző időpontban (24, 48, 72, 96 és 120 óra inkubációt) követően mértük le. Mindkét

mintavételi hely esetében a 96 órás inkubációt követő adatok bizonyultak megfelelőnek a

mikróbaközösségek anyagcsere-ujjlenyomatának összehasonlításához (a szénforrások

hasznosítása és az indikátor színfejlődése nem nőtt számottevően 96 óra után). Mintánként 3-

3 párhuzamos lemez átlagának leolvasási értékeit használtuk az eredmények kiértékelésekor.

A mintákkal közvetlenül végzett közösségi BIOLOG GN2 szénforrás értékesítési vizsgálat

eredményeit főkomponens analízis (15., 17. ábra), valamint az értékesített szubsztrátok típusa

(16., 18. ábra) alapján hasonlítottuk össze.

A Kelemen-szék esetén az ordinációs diagram első főkomponense mentén az

objektumok határozottan két csoportra váltak szét (15. ábra). A nagy szubsztrát hasznosítással

jellemezhető (Axis 1 > 1) 2005. évi és 2006 őszi minták kerültek az egyik, míg a kis

szubsztrát hasznosítással jellemezhető (Axis 1 < -5) 2006. évi tavaszi és nyári minták a másik

csoportba. A második főkomponens mentén pedig a 2006 őszi minta vált el a többitől. A

felkínált szénforrások közül a 2005 tavaszi és őszi minta mikróbaközösségei hasonló

szénforrás hasznosítással voltak jellemezhetők (16. ábra). A szerves savak és az

aminok/amidok kivételével, amelyeket az őszi közösségek némileg nagyobb arányban

hasznosítottak, az egyes szénforrás típusokat 60% érték közeli arányban értékesítették.

Hasonlóság mutatkozott az egyéb kategóriába sorolt észterek, alkoholok és aromás

vegyületeket alacsony mértékű hasznosításában. A nyári minta mikróbaközösségei a két

másik mintáétól eltérően értékesítették a felkínált szubsztrátokat: a szerves savak

hasznosulása meghaladta a 80%-ot, és az egyéb szénforrások felhasználása a többi szubsztrát

csoporthoz hasonló mértékű volt. A 2006-ban vett nád biofilm minták mikrobiális közösségeit

az őszi minta kivételével az előző évi mintákéihoz képest alacsonyabb aktivitás jellemezte, ezt

75

az ordinációs diagramon való, negatív Axis 1 értékekkel rendelkező elhelyezkedésük is

alátámasztja (15. ábra).

Axis 1 (73%)4 20-2-4 -6 -8

Axi

s 2 (1

1%)

2

1

0

-1

-2

-3

-4

KB_0607

KB_0605

KB_0610

KB_0507 KB_0505

KB_0511

15. ábra A kiskunsági Kelemen-széken vett nád biofilm minták ordinációja a mikróbaközösségek BIOLOG GN2 szénforrás értékesítési adatai alapján

(KB: Kelemen-szék biofilm; 0505, 0507, 0511: 2005 május, július, november; 0605, 0607, 0610: 2006 május, július, október)

A Kelemen-szék két éves eredményei alapján a tavaszi minták mikrobiális szénforrás

hasznosítási profilját a polimerek és szénhidrátok kivételével a felkínált szénforrás típusok

többé-kevésbé hasonló mértékű hasznosítása jellemezte.

0

20

40

60

80

100

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

KB_0505 KB_0507 KB_0511

polimerekszénhidrátokszerves savakaminosavakaminok/amidokegyéb

0

20

40

60

80

100

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

KB_0605 KB_0607 KB_0610

polimerekszénhidrátokszerves savakaminosavakaminok/amidokegyéb

16. ábra A kiskunsági Kelemen-széken vett nád biofilm minták mikrobiális szénforrás hasznosításának összehasonlítása a BIOLOG GN2 szénforrás típusok értékesítése alapján

(0505, 0507, 0511: 2005. május, július, november; 0605, 0607, 0610: 2006. május, július, október)

76

A nyári minták mikrobiótájának közös jellemzője a polimerek kismértékű értékesítése,

valamint az egyéb szénforrások többi mintához viszonyított nagyobb arányú felhasználása

volt. Az őszi minták esetében nem találtunk a mikróbaközösségekre mindkét évben jellemző

szénforrás értékesítési sajátságot.

A 2006-os évben a tavaszi és nyári minták bizonyultak hasonlónak egymáshoz, ezen

minták mikróbaközösségeit az aminosavak és aminok/amidok preferált hasznosítása, valamint

a polimerek és szénhidrátok kismértékű értékesítése jellemezte. Az őszi minta

mikróbaközösségei (a másik két minta csekély hasznosításához hasonlóan) nem értékesítették

egyik felkínált polimert sem, azonban a másik két minta mikrobiótájával ellentétben a

szénhidrátok több mint felét hasznosították 96 órán belül. Szerves- és aminosavakat, valamint

aminokat/amidokat az őszi minta mikróbái is felhasználtak, azonban a másik mintához

viszonyítva kisebb mértékben (16. ábra).

3

17. ábra A tiszántúli Nagy-Vadasból 2004 áprilisában vett nád biofilm minták ordinációja a mikróbaközösségek BIOLOG GN2 szénforrás értékesítési adatai alapján

(VB: Nagy-Vadas biofilm; 0505, 0507, 0511: 2005 május, július, november; 0605, 0607, 0610: 2006 május, július, október)

A Nagy-Vadas mintáinak ordinációs diagramján megjelenített két főkomponens a

szénforrások hasznosításában mutatkozó összvariancia 83%-át magyarázta (17. ábra). A

2005-ben vett három minta a mikrobiális közösségi szénforrás hasznosítási mintázatok

Axis 1 (72%)

6 420-2

-4

Axi

s 2 (1

1%)

2

1

0

-1

VB_0507

VB_0605 VB_0607

VB_0610

VB_0505

-2 VB_0511

77

alapján távol került egymástól. A tavaszi és a nyári minták mindkét főkomponensre nézve

magas értékekkel (Axis 1 > 4) rendelkeztek, míg az őszi és a 2006. évi minták

mikróbaközösségeinek anyagcsere-potenciálját negatív főkomponens értékek (Axis 1 < -1)

jellemezték. A 2006-ból származó három minta a közösségei szénforrás értékesítési profilok

alapján nagyon közeli pozícióba került egymáshoz az ordinációs diagramon (17. ábra).

0

20

40

60

80

100

hasz

nosí

tott

szub

sztrá

tok

(%)

VB_0505 VB_0507 VB_0511

polimerekszénhidrátokszerves savakaminosavakaminok/amidokegyéb

0

20

40

60

80

100

hasn

osíto

tt sz

ubsz

tráto

k (%

)

VB 0605 VB 0607 VB 0610

polimerekszénhidrátokszerves savakaminosavakaminok/amidokegyéb

18. ábra A tiszántúli Nagy-Vadason vett nád biofilm minták mikrobiális szénforrás hasznosításának összehasonlítása a BIOLOG GN2 szénforrás típusok értékesítése alapján

(0505, 0507, 0511: 2005. május, július, november; 0605, 0607, 0610: 2006. május, július, október)

Az egyes szubsztrát típusok 96 órán belüli értékesítésének összehasonlításakor

(18. ábra) kitűnik, hogy a 2005-ben vett minták közül a tavaszi és őszi minták

mikróbaközösségei hasonló értékesítési mintázattal rendelkeztek. Eltérés csak az őszi minta

közösségének néhány százalékkal nagyobb mértékű aminosav-, valamint némileg kisebb

mértékű szénhidrát hasznosításában volt megfigyelhető. A részletes, mind a 95 szénforrás

értékesítési adatainak varianciáját vizsgáló főkomponens analízis során (17. ábra) ez a

hasonlóság a részletesebb adatértékelés révén nem mutatkozott meg. A nyári minta közössége

az előbbi két mintához képest nagyobb arányban értékesítette az egyéb kategóriába sorolt

szénforrásokat, az aminok/amidok felhasználásában pedig a másik két minta közösségeihez

képest alacsonyabb aktivitást mutatott. A 2005-ös minták közösségeihez képest, amelyeket az

egyes szubsztrát csoportok többé-kevésbé kiegyenlített és egymáshoz hasonló mértékű

értékesítése jellemzett, a 2006-ban vett minták közösségeinek közös sajátsága a szerves savak

és aminosavak preferált hasznosítása volt. Az őszi minta kivételével a polimerek hasznosulása

kisebb mértékű volt a többi szénforrás típushoz, valamint a 2005-ben tapasztaltakhoz képest.

A szénhidrátok értékesítése a 2005-ös adatokhoz hasonlóan alakult, ez alól szintén az őszi

minta közösségei képeztek kivételt: a felkínált szénhidrátok mindössze 39%-át hasznosították

a 96 órás inkubációs periódus során. A mérési adatok alapján a tavaszi minta közösségeinek

amin/amid hasznosítása teljesen visszaszorult az egyéb szubsztrát csoportokhoz képest. A két

78

év tavaszi és nyári mintájának mikróbaközösségei alapvetően eltérő szénforrás értékesítési

mintázattal rendelkeztek, eredményeik alapján nem lehetett szezonális jellegzetességet

megfigyelni. Az őszi minták mikrobiális szénforrás hasznosításai azonban hasonlóságot

mutattak a szerves savak és aminosavak preferenciális hasznosításában, valamint a felkínált

polimerek 60%-os arányú értékesítésében.

A BIOLOG GN2 lemezekkel végzett két éves szénforrás értékesítési vizsgálatok

eredményei a módszer alkalmasságát igazolták a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas nád biofilm

mikróbaközösségek összehasonlítására és a szezonális változások nyomon követésére. Az

első két főkomponens mindkét esetben az összvariancia több mint 80%-át magyarázta, ami

sokkal magasabb, mint a 2003-as velencei-tavi minták GN2 közösségi szénforrás

értékesítésekor tapasztaltak.

7.2.2 DGGE vizsgálatok

A két alföldi szikes vízterület nád biofilm baktériumközösségeinek diverzitását, a

közösségi szerkezetben bekövetkező szezonális változásokat és az egyes fajok relatív

abundanciáját DGGE segítségével vizsgáltuk (19-20. ábra).

19. ábra A Kelemen-széken vett nád biofilm minták DGGE sávmintázatának összehasonlítása alapján készült UPGMA dendrogram

(KB: Kelemen-szék biofilm; 0505, 0507, 0511: 2005. május, július, november; 0605, 0607, 0610: 2006. május, július, október)

A Kelemen-szék nád biofilm baktériumközösségeinek sávmintázata alapján készült

(19. ábra) dendrogramon a 2005-ben vett minták alkottak egy csoportot, míg a 2006-ban vett

minták közül a tavaszi és a nyári minták baktériumközösségeinek DGGE sávmintázata

mutatkozott hasonlónak egymáshoz. A 2006 októberében vett minta baktériumközösségének

79

DGGE „ujjlenyomata” a többi mintától elkülönülve inkább a 2005. évi mintákkal mutatott

hasonlóságot.

A Nagy-Vadasról a két egymást követő évből származó szezonális minták

baktériumközösségei DGGE sávmintázatuk alapján kevésbé egyértelmű csoportosulást

mutattak (20. ábra). Mind a 2005-ös, mind a 2006-os minták közül a nyári és őszi minták

baktériumközösségeinek sávmintázata mutatott egymással nagy hasonlóságot, míg a tavaszi

minták közösségei a többi mintától eltérő sávmintázattal rendelkeztek. Mindhárom 2006-ban

vett minta esetében megfigyelhető egy nagy intenzitású sáv, míg a 2005-ös évszakos minták

baktériumközösségeinek sávmintázatában nem figyelhető meg hasonló egységesség.

20. ábra A Nagy-Vadasról 2005-ben (0505-má s, 0507-július, 0511-november) és 2006-ban ju(0605-május, 0607-július, 0610-október) vett szezonális nád biofilm minták DGGE

sávmintázatuk összehasonlítása alapján készült UPGMA dendrogram VB: Nagy-Vadas biofilm

80

7.2.3 Tenyésztéses vizsgálatok

A Kelemen-székről és a Nagy-Vadasról a nád biofilm tenyészthető

baktériumközösségeinek megismerése céljából 2004 áprilisában végeztünk mintavételezést. A

minták négyféle táptalajon becsült csíraszámait a 7. táblázat mutatja táptalaj típusonként.

táptalaj

mintavétel helye King B Mesterséges tengervizes Caulobacter

Horikoshi-féle

alkalikus Kelemen-szék 8.56*106 1.82*107 1,89*107 2,34*106

Nagy-Vadas 3,76*106 7,6*105 1,03*107 2,23*105

7. táblázat A kiskunsági Kelemen-szék és a tiszántúli Nagy-Vadas nádasállományának biofilmjéből 2004 áprilisában tenyésztésbe vont baktériumok csíraszám értékei (CFU/g)

A Kelemen-szék esetében a négyféle táptalajon kalkulált értékeket összehasonlítva a

nagy szerves anyag tartalmú King B és Horikoshi-féle alkalikus táptalajon a többi táptalajhoz

képest alacsonyabb csíraszám értékeket detektáltunk, míg az oligotróf közeget modellezni

hivatott Caulobacter és az ún. mesterséges tengervizes táptalajokon a csíraszám becslés

magasabb értékeket eredményezett. A Nagy-Vadas mintájából a legalacsonyabb

csíraszámokat a mesterséges tengervizes és az alkalikus táptalajokon, a legmagasabbat

Caulobacter táptalajon becsültük.

A 137 Kelemen-székről származó izolátumból a King B és a Caulobacter táptalajról

származók mintegy felét, a mesterséges tengervizes és alkalikus táptalajról izolált törzsek

közel 70%-át (összesen 80 baktériumtörzset) sikerült hosszú távon laboratóriumi

körülmények között fenntartanunk. A Nagy-Vadas nád biofilmjéből random módon izolált

123 tenyészet közül összesen 72 baktériumtörzset tudtunk tiszta tenyészetben fenntartani

laboratóriumi vizsgálatok céljára. A Caulobacter táptalajon izolált törzsek közel 60, a

mesterséges tengervizes és az alkalikus táptalajról származó izolátumok közel 80%-át tudtuk

hosszú távon tenyészetben fenntartani laboratóriumi körülmények között. A King B táptalaj

ugyanakkor kevésbé volt megfelelő a hosszú távú törzsfenntartás szempontjából: az

izolátumoknak mindössze 30%-át sikerült fenntartanunk.

Mindkét mintavételi terület, illetve mind a négy táptalaj esetében voltak olyan

fajok/nemzetségek, amelyeket kizárólag az adott tápközegről izolált törzsek képviseltek,

például az α-proteobaktériumokat csak alkalikus táptalajról izoláltuk a Kelemen-szék

mintájából. α-proteobaktériumokat a Nagy-Vadasról legnagyobb arányban (összesen 8

81

azonosított taxon közül 7) a mesterséges tengervizes táptalajról izolált törzsek esetében

azonosítottunk. A γ-proteobaktériumok, a kis és a nagy G+C tartalmú Gram-pozitívok

képviselői között előfordultak csak a mesterséges tengervizes táptalajról izolált baktériumok a

Nagy-Vadas izolátumai között. A Kelemen-szék izolátumai közül számos kis és nagy G+C

tartalmú Gram-pozitív baktériumként azonosított törzs származott mesterséges tengervizes

táptalajról, illetve erről a tápközegről származó törzsek között sikerült a legnagyobb számú

(10) fajt/nemzetséget azonosítanunk. A fentiek alapján a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas nád

biofilm baktériumainak vizsgálatához a mesterséges tengervizes táptalaj bizonyult a

legalkalmasabbnak a diverzitás tenyésztéses módszerekkel történő feltárására.

Az összesített fenotípusos teszteredményekkel elvégzett főkomponens analízis alapján

sem a Kelemen-szék, sem a Nagy-Vadas nád biofilmje estében nem lehetett jellegzetes

elkülönülést megfigyelni az izoláló táptalaj szerint kialakított törzscsoportok között. A

törzseket ezért az ARDRA-t és a reprezentáns törzsek azonosítását követő filogenetikai

hovatartozásuk alapján soroltuk csoportokba és a fenotípusos tesztekben mutatott

eredményeik (8-9. táblázat) alapján főkomponens analízis segítségével (21-22. ábra)

hasonlítottuk össze. Mivel a Nagy-Vadas törzsei közül indol képzésére triptofánból egy sem

volt képes, és egy esetben sem figyeltünk meg gáztermelést O/F médiumban, továbbá egy

törzs sem adott pozitív eredményt a nitrát nitrogénig történő redukciójában, ezek a

tulajdonságok nem kerültek be a főkomponens analízisbe.

A Kelemen-székről származó törzsek Gram-pozitív dominanciával (42 törzs) voltak

jellemezhetők. A hat filogenetikai csoportba sorolt törzseket (a β-proteobaktériumok

kivételével) a kataláz pozitivitás jellemezte. A tween 80 bontására a törzsek többsége képes

volt. Fakultatív anaerob nitrát-redukáló szervezeteket alacsony számban detektáltunk a

törzsek között. A D-glükóz 24 órán, illetve 1 héten belül történő hasznosítására a vizsgált

izolátumoknak szintén csak kis hányada volt képes. Ezen kívül szintén kevés törzs adott

pozitív eredményt a metilvörös- és Voges-Proskauer reakciókban (8. táblázat). A fenti

eredmények a tenyészthető baktériumközösség anyagcseréjének alapvetően aerob légző

jellegére utalnak. A fenti általános jellegzetességeken túl az α-proteobaktériumokra az

eszkulin bontása, β-proteobaktériumokra a mozgásképesség volt jellemző. A γ-

proteobaktériumként azonosított törzsek több mint 50%-a adott pozitív eredményt az oxidáz

tesztben, a D-glükóz egy héten belül történő oxidatív hasznosításában, a nitrát nitritig történő

redukciójában és a kazein bontásában. A Bacteriodetes csoport izolátumainak jellemzője a

nitrát nitrogénig, illetve ammóniáig történő redukciója volt. A kis G+C tartalmú Gram-pozitív

baktériumok esetében a zselatin bontása volt további közös tulajdonság. A legkevésbé aktív

82

törzscsoport a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokat képviselte: az egyetlen teszt,

amelyben többségük pozitívnak bizonyult, az eszkulin hidrolízise volt. Fontos azonban

megemlíteni, hogy az összes cellulóz bontására képes törzs ebbe a csoportba nyert besorolást

(21. ábra).

A Nagy-Vadas nád biofilmjéből származó törzsek többsége (45 törzs) Gram-pozitívnak

bizonyult. A vizsgált törzsek közül majdnem az összes kataláz pozitív volt, több mint 50%-uk

volt képes a zselatin bontására, és a törzsek közel fele hidrolizálta az eszkulint. Fakultatív

anaerob nitrát redukcióra képes szervezetet rendkívül alacsony számban detektáltunk a

törzsek között. Kevés törzs adott pozitív eredményt a metilvörös- és a Voges-Proskauer

reakciókban (9. táblázat). Az α-proteobaktériumok közé sorolt törzsek többsége kataláz

pozitív szervezet volt, a tween 80 bontásán túl a D-glükóz egy héten belüli oxidatív

hasznosítását említhetjük közös tulajdonságukként. A γ-proteobaktériumok oxidáz és kataláz

pozitív izolátumai a többi törzscsoporthoz képest aktívabbnak bizonyultak a vizsgált

tesztekben, többek között egyes biopolimerek bontásában és a nitrát nitritig történő

redukciójában. A kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok körébe sorolt törzsek többsége

mozgásra képes szervezet volt. Ezek a törzsek a γ-proteobaktérium izolátumokhoz hasonló

arányban hasznosították a D-glükózt oxidatív, illetve fermentatív módon. További jellemző

tulajdonságuk a zselatin és a tween 80 bontása volt. A nagy G+C tartalmú Gram-pozitív

baktériumok törzsek csoportja alapvetően inaktívnak mutatkozott a vizsgált tesztekben, az

egyetlen nagy arányban megfigyelt pozitív teszteredmény a D-glükóz egy héten belüli

oxidatív hasznosításában mutatkozott, valamint említésre méltó, hogy az egyetlen celluláz-

pozitív törzs is ebbe a filogenetikai csoportba nyert besorolást (22. ábra, 9. táblázat).

83

21. ábra A kiskunsági Kelemen-székről 2004 áprilisában vett nád biofilm mintából izolált törzscsoportok elkülönülése a hagyományos tesztekben mutatott pozitív eredmények alapján,

standardizált PCA segítségével

8. táblázat A kiskunsági Kelemen-székről 2004 áprilisában vett nád biofilm mintából izolált baktériumtörzsek összesített adatai a hagyományos tesztekben mutatott százalékos pozitív

eredmények feltüntetésével

Axis 1100500-50

Axi

s 2

605040302010

0-10 -20 -30 -40 -50 -60 -70

kis G+C tartalmú

-80

γ-proteobaktériumok

β-proteobaktériumok

BacteriodetesGram-pozitívok

α-proteobaktériumok nagy G+C tartalmú

Gram-pozitívok

15 1 2013 3

19 7 1411

2116

8422 2

10

1217

5 1869 23

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.

Gra

m re

akci

ó

oxid

áz a

ktiv

itás

kata

láz

aktiv

itás

D-g

lükó

z ox

idat

ív h

aszn

osítá

sa (2

4h)

D-g

lükó

z fe

rmen

tatív

has

znos

ítása

(24h

)

gázt

erem

lés O

/F m

édiu

mba

n

D-g

lükó

z ox

idat

ív h

aszn

osítá

sa(1

hét

)

D-g

lükó

z fe

rmen

tatív

has

znos

ítása

(1 h

ét)

amm

onifi

káci

ó

moz

gás

H2S

cis

ztei

nből

indo

l trip

tofá

nból

NO

3-N

O2

NO

3-N

2

NO

3-N

H3

met

ilvör

ös re

akci

ó

Vog

es-P

rosk

auer

reak

ció

eszk

ulin

hid

rolíz

is

kaze

in h

idro

lízis

zsel

atin

hid

rolíz

is

kem

ényí

tő h

idro

lízis

twee

n 80

has

znos

ítás

cellu

láz

aktiv

itás

Alfa 13 38 100 13 25 0 38 38 0 50 0 0 0 0 25 0 0 100 0 38 0 75 0Béta 0 38 38 13 0 0 13 0 13 100 0 0 0 0 13 0 0 13 13 25 13 75 0

Gamma 0 54 77 31 23 15 54 38 15 77 38 23 54 8 46 31 23 31 62 46 15 92 0CFB 56 56 100 33 0 0 44 11 0 56 22 0 11 56 78 11 0 44 11 44 44 78 0

Low GC 87 27 93 13 13 0 33 20 20 67 7 0 40 7 40 13 13 47 40 100 13 73 0High GC 100 11 93 4 4 0 4 4 4 26 4 0 0 0 7 19 0 52 11 37 11 30 22

84

Axis 1100 80 6040200-20-40 -60 -80

Axi

s 2

90 80 70 60 50 40 30 20 10

0 -10 -20 -30 -40 -50

γ-proteobaktériumok

α-proteobaktériumok

Kis G+C tartalmúGram-pozitívok

nagy G+C tartalmúGram-pozitívok

2

19 17

16

9

11

7

4

12

18

10

8

15

5

1420 3

13

6

1

22. ábra A tiszántúli Nagy-Vadasból 2004 áprilisában vett nád biofilm mintából izolált törzscsoportok elkülönülése a hagyományos tesztekben mutatott pozitív eredményeik alapján,

standardizált PCA segítségével

1. 2. 3. 4. 5. 7. 8. 9. 10. 11. 13. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.

Gra

m re

akci

ó

oxid

áz a

ktiv

itás

kata

láz

aktiv

itás

D-g

lükó

z ox

idat

ív h

aszn

osítá

sa (2

4h)

D-g

lükó

z fe

rmen

tatív

has

znos

ítása

(24h

)

D-g

lükó

z ox

idat

ív h

aszn

osítá

sa(1

hét

)

D-g

lükó

z fe

rmen

tatív

has

znos

ítása

(1 h

ét)

amm

onifi

káci

ó

moz

gás

H2S

cis

ztei

nből

NO

3-N

O2

NO

3-N

H3

met

ilvör

ös re

akci

ó

Vog

es-P

rosk

auer

reak

ció

eszk

ulin

hid

rolíz

is

kaze

in h

idro

lízis

zsel

atin

hid

rolíz

is

kem

ényí

tő h

idro

lízis

twee

n 80

has

znos

ítás

cellu

láz

aktiv

itás

Alfa 0 53 100 0 6 59 0 0 41 24 6 12 6 0 47 6 82 6 88 0Gamma 0 80 90 30 10 40 40 20 60 30 40 30 20 0 30 60 100 20 90 0LowGC 78 22 100 11 22 44 44 33 89 22 11 44 0 0 44 22 78 22 78 0High GC 97 6 100 3 8 81 6 3 14 14 6 6 33 3 31 8 44 0 22 3

9. táblázat A tiszántúli Nagy-Vadasból 2004 áprilisában vett nád biofilm mintából izolált baktériumtörzsek összesített adatai a hagyományos tesztekben mutatott százalékos pozitív

eredményeik feltüntetésével

85

A pH- és sótűrés vizsgálatát célzó tesztek eredményei szerint a két mintavételi területről

származó törzsek túlnyomó többsége számára az 5 és 7%-os sókoncentrációk, valamint a

pH 8 érték bizonyultak optimálisnak a növekedéshez. A tenyésztés során sikeresen izoláltunk

halo- és alkalitoleráns, illetve kifejezetten alkalofil törzseket is. Az egyes törzsek eredményeit

a többi fenotípusos teszteredményhez hasonlóan filogenetikai csoportonként hasonlítottuk

össze (23. és 24. a-b ábrák).

a)

0

20

40

60

80

100

pH7 pH8 pH9 pH10 pH11

növe

kedé

st m

utat

ó tö

rzse

k (%

)

α-proteobaktériumok

β-proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

Bacteriodetes

Aktinobaktériumok (nagy G+Ctartalmú Gram-pozitívbaktériumok)Firmicutes (kis G+C tartalmúGram-pozitív baktériumok)

b)

0

20

40

60

80

100

0% NaCl 5% NaCl 7% NaCl 10%NaCl 12% NaCl

növe

kedé

st m

utat

ó tö

rzse

k (%

)

α-proteobaktériumok

β-proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

Bacteriodetes

Aktinobaktériumok (nagy G+Ctartalmú Gram-pozitívbaktériumok)Firmicutes (kis G+C tartalmúGram-pozitív baktériumok)

23. ábra A Kelemen-székről kitenyésztett baktériumtörzsek pH (a) és sótűrése (b), filogenetikai csoportonként összesítve

A 23. a) ábrán látható, hogy a Kelemen-szék Gram-negatív festődésű (proteobaktérium

és Bacteriodetes) törzscsoportok inkább alkalitoleráns sajátságokat mutattak, pH 9 érték felett

a törzseknek csak kis százaléka volt képes növekedni (a Bacteriodetes csoportba sorolt

86

törzsek pH 11 értéknél már egyáltalán nem mutattak növekedést). A mérsékelten alkalofil

jellegeket hordozó (kis és nagy G+C tartalmú) Gram-pozitív festődésű törzscsoportokat a

növekedésükhöz szükséges pH 8 és 9 optimum értékek mellett a törzsek nagyobb százalékára

kiterjedő szélesebb pH tartomány jellemezte. A Nagy-Vadas esetében a két azonosított

proteobaktérium csoport törzsei 7-es és 8-as pH értékű, valamint NaCl-mentes tápközegben

hasonló arányban mutattak növekedést, azonban az ennél magasabb alkalinitási értékek,

illetve sótartalom mellett csak az α-proteobaktérium törzsek jelentős része volt képes

növekedésre. A γ-proteobaktérium törzsek számára a pH 7 és 8 értékek, illetve az 5 és 7%-os

sótartalom volt optimális a növekedéshez. A kis és nagy G+C tartalmú Gram-pozitívok

törzscsoportjai hasonló pH tűréssel rendelkeztek: pH 7 és 9 között 80-100%-uk mutatott

növekedést, pH 10 és pH 11-es értékeknél mindkét csoport törzsei között hasonló arányban

találtunk alkalofil törzseket (24. a ábra).

A Kelemen-szék nád biofilm mintájából izolált törzsek sótűrés vizsgálatának

eredményei (23. b ábra) arra utalnak, hogy az izolált törzsek többsége, a Bacteriodetes csoport

és a β-proteobaktériumok egy részének kivételével NaCl-mentes közegben nem volt képes

növekedni. Az α-proteobaktériumok törzsei a másik két proteobaktérium, illetve a

Bacteriodetes csoporthoz képest nem az 5-7%-os, hanem inkább a 7-10%-os sótartalmú

tápközegben mutatott optimális növekedést. Az α-proteobaktériumokon kívül 10%-os

sókoncentráció mellett a két Gram-pozitív csoport törzsei növekedtek nagy számban, valamint

ezen szervezetek közel 40%-a volt képes a 12%-os sókoncentráció tolerálására is. A Nagy-

Vadas törzsei esetében említésre méltó, hogy sótűrés tekintetében a nagy G+C tartalmú

Gram-pozitív baktériumtörzsek nagy hányada széles sókoncentráció tartományban (5-12%)

volt képes növekedni, ez a kis G+C tartalmú Gram-pozitívok esetében 5 és 10% volt

(24. b ábra).

A törzsek fenti pH-és sótűrési tesztekben mutatott eredményei arra utalnak, hogy a

tenyésztéssel feltárt nád biofilm baktériumok képesek a magas pH és a viszonylag nagy

sótartalommal jellemezhető környezethez való adaptációra.

87

a)

0

20

40

60

80

100

pH7 pH8 pH9 pH10 pH11

növe

kedé

st m

utat

ó tö

rzse

k (%

)

α-proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

Aktinobaktériumok(nagy G+C tartalmúGram-pozitívbaktériumok)

Firmicutes (kis G+Ctartalmú Gram-pozitívbaktériumok)

b)

0

20

40

60

80

100

0% NaCl 5% NaCl 7% NaCl 10%NaCl 12% NaCl

növe

kedé

st m

utat

ó tö

rzse

k (%

)

α-proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

Aktinobaktériumok(nagy G+C tartalmúGram-pozitívbaktériumok)Firmicutes (kis G+Ctartalmú Gram-pozitívbaktériumok)

24. ábra A Nagy-Vadas nád biofilmjéből kitenyésztett baktériumtörzsek pH (a) és sótűrése (b), filogenetikai csoportonként összesítve

A velencei-tavi törzsekhez hasonlóan a DNS izolálást és a 16S rDNS régió PCR-el

való felszaporítását követően a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas nád biofilmjéből származó

törzseit is ARDRA mintázatuk alapján csoportosítottuk (Függelék 3-4. táblázat). Az eltérő

hasítási mintázatok alapján közülük összesen 33 (Kelemen-szék), illetve 20 (Nagy-Vadas)

csoportot hoztunk létre. A két mintavételi terület nádasainak biofilmjéből izolált törzsek

taxonómiai helyzetét a reprezentáns törzsek 16S rDNS parciális szekvencia adatok alapján

neighbor-joining módszerrel készült filogenetikai dendrogramok mutatják be (25-26. ábra).

88

(AM902205)KB135 (DQ363142)Agrobacterium albertimagni

(AM902203)KB119 (AB006899)Paracoccus carotinifaciens

(AM902202)KB40 (AY880181)Acidovorax temperans

(AM902201)KB50 AF332187)Acidovorax delafiledii ( (AM902199)KB18 sp. (AM263536)Hydrogenophaga

(AF078768)Hydrogenophaga taeniospiralis (AM902193)KB13 (AM902196)KB46 (AM263520)Pseudomonas anguilliseptica (AM902197)KB103 (U65012)Pseudomonas stutzeri

(AM902198)KB88 (DQ439976)Pseudomonas fluorescens

(AF366380)Yersinia intermedia (AM902194)KB30 (AJ871363)Yersinia aldovae (AM902262)KB9

(AM902206)KB54 sp. (AY571816)Sphingobacterium

(EF100697)Pedobacter insulae (AM902208)KB87 sp. (AM493418)Flavobacterium

(AM177392)Flavobacterium aquidurense AM902255)KB79 ( (EF571003)Streptomyces flavofungini

(AM902259)KB111 (AJ717374)Dietzia natronolimnea

(AY884570)Cellulomononas terrae (AM902253)KB23 (AM902254)KB113 sp. (Y09656)Cellulomonas

(AM902252)KB26 (AF140036)Cellulomonas flavigena

(AM902258)KB74 (AJ783958)Sanguibacter marinus

(AM902257)KB105 (X79452)Sanguibacter inulinus

(AM902250)KB12 sp. (AM396918)Plantibacter (AY275509)Plantibacter flavus

(AM902256)KB100 (AF440440)Arthrobacter agilis (AM902260)KB123 (AM397645)Kocuria rosea (AY588277)Nesterenkonia sandarakina (AM902249)KB109 sp. (DQ108403)Nesterenkonia (AM902247)KB5 (AY588278)Nesterenkonia luteus

(AM902242)KB89 (AM902243)KB114 sp. (DQ448755)Bacillus (AM902192)KB72 (DQ363137)Bacillus horikoshii

(AM902245)KB104 (AM902244)KB80 sp. (DQ643135)Planococcus (DQ333301)Planococcus maritimus

(AM902239)KB2 (EF423608)Bacillus licheniformis

(AM902240)KB57 (AM902241)KB86 (AJ491843)Bacillus firmus

(AF334601)Thermodesulfobacterium thermophilum

84100

91100

80

96

100

9 798

100

100

100

99

7188

100

100

100

100

100

9 7

99

7188

100

5599

100

72

6887

100

69

78

83

100

86

99

100

68

100

100

77100

100

99

7577

4263

98

78

62

68

81

100

51

100

8665

0.05

α- proteobaktériumok

β-proteobaktérium ok

Bacteriodetes

γ-proteo baktériumok

Aktinobaktériumok(nagy G+C tartalmú Gram pozitív

baktériumok)

Firmicutes(kis G+C tart almú Gram pozitív

baktériumok)

25. ábra A kiskunsági Kelemen-szék nád biofilm mintáiból 2004 áprilisában izolált baktériumtörzsek, valamint a velük közvetlen rokonságban álló baktériumok

neighbor-joining módszerrel készült dendrogramja (A méretarány 5% nukleotid különbséget jelöl.)

89

(AM902237)VB45 sp. (AJ864853)Afipia (AY488508)Bosea thiooxidans

(AM902233)VB43 (AB006899)Paracoccus carotinifaciens

(AM902229)VB93 (AJ564880)Halomonas alkantarctica

(AM902232)VB31 (AM284986)Acinetobacter lwoffii

(AM902231)VB26 (AM263525)Pseudomonas marginalis

(AM902230)VB97 (X81623)Shewanella putrefaciens (AM902227)VB58 sp. (AJ130782)Xanthomonas

(AF123092)Xanthomonas campestris (AM902224)VB23 (AM237353)Microbacterium oxydans (AM902223)VB16 (AB271048)Microbacterium ginsengisoli (AM902225)VB28 (DQ122218)Microbacterium testaceum

(AM902221)VB12

(AM902220)VB114 (AY588277)Nesterenkonia sandarakina

sp. (AM051260)Nesterenkonia (AM902222)VB118

(AY820953)Nesterenkonia halophila (AM902226)VB25 (AF140036)Cellulomonas flavigena

(AM902228)VB72 (AB368714)Nocardiopsis exhalans

(AM902211)VB78 (DQ333301)Planococcus maritimus

(AM902209)VB56 (AJ314745)Planococcus southpolaris

(AM902212)VB91 (AF281158)Jeotgalibacillus alimentarius

(AM902214)VB86 Bacillus firmus (EF032672)

(AM902213)VB98 (D83370)Staphylococcus lentus

AF334601Thermodesulfobacterium thermophilum

99

98100

100

100

100

99

9899

77

60

100

90100

9554

100

99100

100

100

100

100

70

100

100

100

99

100

100

83

72

54

100

72

0.05

α- proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

Aktinobaktériumok(nagy G+C tartalmú

Gram pozitívbaktériumok)

Firmicutes(kis G+C tartalm ú

Gram pozitívbaktériumok)

26. ábra A tiszántúli Nagy-Vadas nád biofilm mintáiból 2004 áprilisában izolált baktériumtörzsek, valamint a velük közvetlen rokonságban álló baktériumok neighbor-joining

módszerrel készült dendrogramja (A méretarány 5% nukleotid különbséget jelöl.)

90

A reprezentáns törzsek azonosítása révén a Kelemen-szék esetében összesen 26, a

Nagy-Vadas esetében 18 különböző fajt/nemzetséget sikerült detektálnunk. A Kelemen-

szék 8, a Nagy-Vadas 7 ARDRA-reprezentánsa alacsony (≤97%) szekvencia-hasonlóságot

mutatott már leírt fajokkal, ennek alapján lehetséges, hogy ezek a törzsek új fajok képviselői

(Függelék 3-4. táblázat).

A kelemen-széki törzsek közül 27 a nagy, 15 a kis G+C tartalmú Gram-pozitív

baktériumokat képviselte. A proteobaktériumok közül a legtöbb (13) törzs a γ-

proteobaktériumok körébe tartozott, az α- és a β-proteobaktériumok közé egyaránt 8-8, a

Bacteriodetes csoportba 9 törzs nyert besorolást. A Nagy-Vadasról származó törzsek közül a

legtöbb törzs (36) szintén a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokat képviselte, míg a

kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokhoz összesen 9 izolátum nyert besorolást. A

proteobaktériumok közül a legtöbb (13) törzs ugyancsak az α-proteobaktériumok körébe

került, míg a γ-proteobaktériumok közé 10 törzs tartozott. A törzsek csoportosításának és

azonosításának eredményeit a Függelék 3. és 4. táblázata tartalmazza. A táblázatokban a

csoportokhoz tartozó törzsek teszteredményeit százalékos formában tüntettük fel.

A törzseknek 10 (Kelemen-szék), illetve 21%-a (Nagy-Vadas) tartozott az α-

proteobaktériumok közé. A Kelemen-székiek mindegyikét alkalikus, a Nagy-Vadasról

származókat alkalikus és Caulobacter táptalajról izoláltuk. pH-tűrés szempontjából

alkalitoleránsnak bizonyultak, míg a sótűrés tekintetében inkább halofil jelleget mutattak. A

sótűrési vizsgálatok eredményeinek hátterében (miszerint az α-proteobaktériumok törzsei

inkább a 7-10%-os sótartalmú tápközegben mutattak optimális növekedést) az állhat, hogy a

csoport törzseinek többségét Paracoccus carotinifaciensként azonosítottuk. A Kelemen-szék

ezen izolátumai jellemzően eszkulin és tween 80 bontására képes szervezetek voltak. A

halofil Paracoccusok speciális, ornitin tartalmú külső membránja szerepet játszhat

sótűrésükben (Wilkinson és mtsai, 1982). A Pholidota articulata epifita trópusi orchidea

gyökérkörnyezetéből származó mikróbaközösségek vizsgálata során a Paracoccus nemzetség

auxin-termelésre képes képviselőit is kimutatták (Tsavkelova és mtsai, 2007).

A Nagy-Vadas összesen 3 törzse az Afipia, egy Kelemen-székről származó törzs pedig

az Agrobacterium nemzetséget képviselte. Utóbbi oxidatív anyagcseréjű törzs képes volt az

eszkulin és a tween 80 hidrolízisére. Az általunk identifikált A. albertimagni faj képviselőit

etiópiai pillangósok családjába tartozó növényfajok gyökérkörnyezetéből is leírták (Wolde-

meskel és mtsai, 2005). Egy vízi makrofita, a fésűs békaszőlő (Potamogeton pectinatus)

felületéről izolálták a faj arzénbontásra képes törzsét (Salmassi és mtsai, 2002). A nemzetség

91

jelenlétét a velencei-tavi nádasállományok biofilmjéből szintén tavasszal vett mintából

sikerült kimutatnunk. A nemzetség növénypatogén fajaival kapcsolatos vizsgálatok

eredményeit számos publikáció tárgyalja, azonban az Agrobacteriumok szerepe egyszikűek

esetében még nem tisztázott.

β-proteobaktériumokat csak a Kelemen-szék nád biofilmjéből sikerült izolálnunk, a

csoport két nemzetségének (Acidovorax, Hydrogenophaga) képviselőit identifikáltuk. Ezek a

törzsek pH 7 és 8 értékek, valamint 5 és 7% sókoncentrációk mellett mutattak optimális

növekedést. Mindegyikük képes volt aktív mozgásra és a tween 80 hidrolízisére. A Velencei-

tó nád biofilmjéből szintén tavaszi mintavétel során izoláltuk a fenti két nemzetség

képviselőit. A Hydrogenophaga nemzetség tagjait kimutatták a nádon kívül más makrofiton

asszociált biofilmekből is (Salmassi és mtsai, 2006). A nemzetség képviselői kemoorganotróf

vagy kemolitoautotróf növekedésre is képesek. Elfogadják energiaforrásként a hidrogént,

szénforrásként pedig a szén-dioxidot (Kämpfer és mtsai, 2005). Az Acidovorax nemzetség

tagjai elsősorban szénhidrátokat oxidálnak aerob körülmények között, de egyes fajaik (pl. az

A. delafieldii és az A. temperans) denitrifikációra is képesek (Bergey’s Manual of

Determinative Bacteriology, 1994). PGPR-baktériumok borsnövényekre gyakorolt hatásának

vizsgálata során többek között az Acidovorax nemzetség képviselőit is azonosították Kang és

munkatársai (2007).

A Velencei-tavon végzett vizsgálatok során mindhárom mintavételi területen, mindkét

időpontból származó nád biofilm mintában sikerült kimutatnunk különféle Pseudomonas

fajokat. A kelemen-széki mintából hasonlóképpen ezeket a szervezeteket izoláltuk a

legnagyobb számban. Jellemző tulajdonságuk az oxidáz és kataláz pozitivitás és kazein bontás

volt. Egyes tesztek (pl. D-glükóz egy héten belül történő hasznosítása, ammonifikáció,

tween 80 bontása) tekintetében variábilisnak mutatkoztak. Optimális növekedést 5 és 7%-os

sókoncentrációk, illetve pH 7 és 8 értékek mellett mutattak. A nemzetség tagjai közül a P.

anguilliseptica, P. fluorescens és a P. stutzeri fajokat identifikáltuk. A nemzetséget a Nagy-

Vadas mindössze két törzset számláló csoportja reprezentálta. A két izolátum variábilisnak

mutatkozott több teszt (pl. D-glükóz hasznosítása, kénhidrogén termelése ciszteinből, nitrát

redukciója) szempontjából. A reprezentáns törzset mint Pseudomonas marginalist

identifikáltuk. Ude és munkatársai (2006) biofilm képzési sajátságaik vizsgálatakor ezt a fajt

más környezeti Pseudomonas izolátumokkal együtt cellulóztartalmú mátrix képzésére találták

képesnek. Metabolikus sokfélesége mellett ez a jellegzetesség fontos tagjává teszi ezt a fajt a

nádfelszíni biofilmek baktériumközösségeiben.

92

A Kelemen-szék nád biofilm mintájából az Enterobacteriaceae család képviselőit is

azonosítottuk. A Yersinia nemzetségbe három, fakultatív anaerob anyagcseréjű törzs került.

Közös sajátságaikként egyedül a tween 80 bontását említhetjük meg. A nemzetség több faja

(Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterolytica) humán- és állatpatogén tulajdonságukról

ismert (Brubaker, 1991; Hinnebusch, 1997; Neubauer és mtsai, 2000), míg az általunk

identifikált Y. aldovae és Y. intermedia fajok széles metabolikus aktivitással rendelkeznek és

közönséges előfordulásúak vízi környezetekben (Brenner és mtsai, 1980; Bercovier és mtsai,

1984).

A Nagy-Vadasról azonosított egyéb γ-proteobaktérium nemzetségeket kisszámú (1-3)

törzs képviselte. A Shewanella putrefaciensként azonosított reprezentáns 3 tagú ARDRA

csoportot képviselt, melyek mindegyikét tengervizes táptalajról izoláltuk, és teszteredményeik

néhány kivételtől eltekintve (pl. zselatin és tween 80 hidrolízis, oxidáz és kataláz teszt)

variábilisak voltak. A fajt a Velencei-tó tavaszi, Fürdetőről származó nád biofilm mintájából

is kimutattuk. Szintén három, zselatin- és tween 80 bontó törzs képviselte az Acinetobacter

lwoffii fajt. Ezek a Voges-Proskauer tesztben negatív izolátumok nem termeltek kénhidrogént

ciszteinből, sem indolt triptofánból. A nemzetség tagjai talajokban, vizekben, szennyvizekben

is gyakoriak. Anyagcseréjüket tekintve szigorúan aerob légző szervezetek. Főként

szénhidrátokat és szerves savakat hasznosítanak (Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology, 1994). Jelenlétüket Kovács és mtsai (1999) gyékény, Micsinai és mtsai (2003)

nád rizoplánban is kimutatták. A γ-proteobaktériumok további két nemzetségének jelenlétét

mintánkban egy-egy izolátum azonosítása igazolta. Egy Caulobacter táptalajról izolált, oxidáz

és kataláz pozitív törzs a nitrát redukciós tesztek kivételével a legtöbb vizsgált tulajdonságra

nézve pozitív volt, és a Xanthomonas nemzetség tagjaként határoztuk meg. Faji szinten nem

sikerült ezt a törzset identifikálnunk, parciális szekvenciája csak 96%-ban hasonlított egy, az

adatbázisban található X. campestris szekvenciához. A nemzetség számos faja ismert

különféle növényi megbetegedésekben játszott szerepéről. A Xanthomonas nemzetség

taxonómiája az utóbbi időben sok változáson ment keresztül, számos, korábban különálló fajt

ma már mint patovart tartanak számon (Trebaol és mtsai, 2000). A nemzetségnek nád

növénnyel való kapcsolatáról eddig még nem állnak rendelkezésre adatok. A Halomonas

nemzetséget szintén egy törzs képviselte, amelyet a Xanthomonas törzshöz hasonlóan

alacsony (97%) szekvencia-hasonlósággal azonosítottunk a H. alkantarctica faj

képviselőjeként. A nemzetségbe tartozó baktériumok a sókoncentráció széles tartományát

képesek tolerálni. Halotoleráns szervezetekként gyakori előfordulásúak szikes tavakban

(Ventosa és mtsai, 1998). Számos szerves vegyület bontására képesek és egyes képviselőik

93

toxikus fémionok akkumulációjára is képesek (Duckworth és mtsai, 1996, 2000; Vreeland és

mtsai, 1999).

A kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok közé 15 Kelemen-székről származó

törzs került, amelyek többsége magas pH- és nagy sókoncentrációt is tolerált. Az ARDRA

reprezentánsok azonosítása révén többségük az alkalitoleráns, illetve alkalofil Bacillus

licheniformis, B. firmus és B. horikoshii fajokat képviselte. A nemzetség jelenlétét mind a

tavaszi, mind a nyári velencei-tavi mintákból kimutattuk. Annak ellenére, hogy a Bacillusok

széleskörű dekomponáló aktivitásuk révén a természetes környezetek bakteriális

közösségeinek fontos tagjaiként ismeretesek, az általunk Bacillusként azonosított törzsek

relatíve inaktívnak bizonyultak a vizsgált fenotípusos tesztekben.

A kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok körébe tartozó kelemen-széki törzsek

közül 3 izolátumot a zselatin, a tween 80 és a DNS hidrolízisének képessége jellemezett.

Mindegyikük növekedést mutatott 10%-os sókoncentráció mellett. Ezeket a törzseket a

szekvencia analízis eredményei alapján a Planococcus maritimus faj tagjaként azonosítottuk.

A faj képviselői gyakran izolálhatók tengervízből (Claus és mtsai, 1999), de képviselőiket

kimutatták már tengeri algákhoz és cianobaktériumokhoz asszociált baktériumközösségek

tagjaként is (Reddy és mtsai, 2002; Ivanova és mtsai, 2006). A Nagy-Vadas 9, kis G+C

tartalmú Gram-pozitív baktériumokhoz sorolt kataláz pozitív törzse egy kivétellel tengervizes

táptalajról került izolálásra. Az ARDRA reprezentánsok azonosítása révén többségük (5 törzs)

a Kelemen-szék nád biofilmjében is detektált P. maritimus fajt képviselte. 10%

sókoncentráció mellett mindegyikük mutatott növekedést és a zselatin, a keményítő és a

tween 80 hidrolízisének képessége jellemezte őket. Egy izolátumot (Caulobacter táptalajról) a

P. southpolaris faj tagjaként sikerült identifikálni. Ez a törzs a másik Planococcus fajba sorolt

törzsekhez képest több tesztben (pl. ammonifikáció, kénhidrogén termelése ciszteinből,

kazein és keményítő hidrolízis) eltérő eredményt adott. További egy, nem mozgó,

ammonifikációra és ciszteinből kénhidrogén termelésére képes, számos hidrolízis tesztben

pozitív törzs Staphylococcus lentusnak bizonyult. 1-1 törzs a B. firmus fajt, valamint a

Jeotgalibacillus nemzetséget képviselte. Mindkét törzs nőtt 5 és 10%-os sókoncentrációk

mellett, valamint a vizsgált legmagasabb (pH 11) értéken.

Mind a Kelemen-szék, mind a Nagy-Vadas nád biofilm baktériumainak kitenyésztett

törzsei legnagyobb számban (27, illetve 36) a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív

baktériumokat képviselték. Többségük 5 és 10%-os sótartalom és pH 8-9 értékek mellett

mutatott növekedést, a Nagy-Vadas ebbe a csoportba sorolt törzseinek egy része azonban

94

ennél magasabb értékeknél is képes volt növekedésre. Említésre méltó, hogy a 27 Kelemen-

székről izolált törzs a reprezentánsok identifikációja révén összesen 8 különféle nemzetségbe

(Nesterenkonia, Cellulomonas, Arthrobacter, Sanguibacter, Kocuria, Dietzia, Streptomyces

és Plantibacter) nyert besorolást, míg a 36 Nagy-Vadasról származó törzset ehhez képest

összesen négy, a Nesterenkonia, a Cellulomonas, a Microbacterium és a Nocardiopsis

nemzetségek képviselőiként azonosítottuk.

A Kelemen-szék esetében a Pseudomonason és a Bacilluson kívül kívül a

Nesterenkonia nemzetséget képviselte a legtöbb (9) törzset számláló csoport. A kelemen-széki

törzsek az eszkulin és a tween 80 hidrolízisén kívül alapvetően inaktívak voltak a vizsgált

tesztekben. A kemoorganotróf, mérsékelten halofil nemzetség tagjai közül a N. sandarakina

és N. luteus fajokat azonosítottuk. A nemzetség tagjai közül a Nagy-Vadas esetében a legtöbb

törzset (22) ugyancsak a N. sandarakina faj tagjaként azonosítottuk, valamint egy törzs

esetében a szekvencia-hasonlóság mindössze 96%-nak adódott egy N. halobia szekvenciával.

Ezeknek a kataláz pozitív törzseknek a jellegzetessége a D-glükóz egy héten belüli oxidatív

hasznosítása, valamint a pozitív metilvörös teszt volt. A különféle hidrolízis tesztekben

alapvetően inaktívnak bizonyultak. A nemzetség alkalofil és mérsékelten halofil fajait (N.

aethiopica, N. halobia) korábban szintén szikes tavakból izolálták (Martins és mtsai, 2001;

Delgado és mtsai, 2004). A N. halobiat eredetileg Micrococcus halobilusként írták le

Japánban sólepárlóból (Onishi és Kamekura, 1972). A Fertőből származó nádrizómák

felületéről Borsodi és mtsai (2005b) az izolált törzsek között szintén kimutatták a N. halobiat.

A Cellulomonas nemzetség jelenlétét szintén mindkét mintavételi terület nád

biofilmjéből sikerült igazolnunk (összesen 6 törzs a Kelemen-székről, valamint egyetlen

Nagy-Vadasról származó izolátum). A C. flavigena és C. terrae fajokkal mutatott alacsony

(≤97%) parciális szekvencia-hasonlóság alapján feltételezhető, hogy a nemzetség új

faját/fajait képviselő izolátumokról lehet szó. A Cellulomonas nemzetség tagjainak

legjellegzetesebb tulajdonsága a cellulóz bontásának képessége volt. Aerob és anaerob

körülmények között egyaránt tudnak növekedni (anoxikus környezetben nitrátot használnak

elektron akceptorként).

A természetben a cellulózbontás általában sokféle szervezet közreműködésével

történhet. Szárazföldi körülmények között a gombák jóval nagyobb szerepet kapnak a

komplex szénhidrátok lebontásában. Itt az általában alacsony nedvességtartalom, a szerves

nitrogénformák alacsony hozzáférhetősége előnyt biztosít számukra a baktériumokkal

szemben, és extracelluláris cellulázaik, lignolitikus, aktív oxigénformákat termelő enzimeik

révén hatékonyan bontják a talajban felhalmozódó növényi anyagokat, a lignint is beleértve

95

(Lynd és mtsai, 2002). Ez azonban nem zárja ki a cellulózbontó baktériumok (Cytophaga,

Bacillus és Cellulomonas) talajokban való előfordulását. Mindenesetre abból, hogy a

talajmélységgel a cellulózbontás intenzitása csökken, arra lehet következtetni, hogy

szárazföldi ökoszisztémákban a cellulóz-degradáció elsősorban aerob folyamat (Vardavakis,

1989). A cellulóz bontásában szerepet játszó baktériumok általában vagy obligát anaerob

fermentatív szervezetek, mint például a Clostridium, Ruminococcus, Caldicellulosiruptor,

Fibrobacter, Acetivibrio; vagy aerob szervezetek, amelyek a csúszó mozgásra képes

Cytophaga, Sporocytophaga, vagy a Gram-pozitív Cellulomonas és Thermobifida

nemzetségekbe tartoznak. A cellulózbontók között számos termofil mikróba található, de ezek

a tavakban uralkodó természetes körülmények között aligha járulnak hozzá a cellulóz

degradációjához. Víz által befolyásolt, elárasztott környezetekben azonban a szerves anyagok

lebontása során az anaerob folyamatok dominálnak, így itt a baktériumok előnyhöz juthatnak

a gombákhoz képest. Rizsföldek talajában obligát anaerob fermentatív anyagcseréjű

cellulózbontó Clostridum fajok jelenlétét mutatták ki Chin és mtsai (1998), de emellett nagy

tömegben izoláltak fermentációra is képes Bacillus fajokat, Verrucomicrobia, Bacteroides

divízóba és Actinobacteria osztályba tartozó szervezeteket. Chin és mtsai (1998) rizsföldek

baktériumközösségeit vizsgálva a cellulóz bontására képes izolátumok között egy új

leszármazási vonalat képviselő, α-proteobaktérium rokonsági körbe tartozó, fakultatív

fermentatív – acetátot és etanolt termelő - törzset (KCB90) is találtak, amelyről vizsgálataik

eredményeképpen feltételezték, hogy nincs jelen nagy számban a környezetben. Vélhetően

gyökér-asszociált és szeneszcens növényi anyagokat értékesíthet.

Az Arthrobacter nemzetség jelenlétét a Kelemen-szék nád biofilm baktériumai között

siekrült igazolnunk, négy eszkulin-bontó törzs révén. Az ARDRA csoport reprezentáns

parciális 16S rDNS szekvenciája mindössze 96%-os hasonlóságot mutatott egy A. agilis faj

szekvenciájával. A korábban Micrococcus agilisként leírt faj közönséges előfordulású

talajokban és vízi környezetekben (Koch és mtsai, 1995). A nemzetség két másik faját a

Velencei-tó nád biofilmjéből származó törzsek képviselték. Az Arthrobacterek jellemzően a

talajból, bomló szerves anyagokból izolálható aerob, oxidatív anyagcseréjű baktériumok.

Komplex poliszacharid-bontó képességüknél fogva a növényi szerves anyag lebontásában

játszhatnak szerepet (Gardener és de Brujin, 1998). A Gram-pozitív, oxidatív anyagcserét

folytató nemzetség képviselői talajokban általános előfordulásúak, de megtalálhatók

édesvízben, tengervízben és szennyvízben egyaránt.

A Sanguibacter nemzetség két faját sikerült kimutatnunk a Kelemen-szék nád

biofilmjének baktériumközösségeiben. Az ide sorolt törzsek közös jellemzője az eszkulin- és

96

zselatinbontás, valamint a mozgásképesség volt. Ennek a nemzetségnek az első képviselőit

szarvasmarhák véréből és tejéből mutatták ki Fernández-Garayzábal és mtsai (1995), a

későbbiekben az általunk is detektált S. antarcticust és a S. marinust antarktikus talajból és

tengeri üledékből izolálták először (Pascual és mtsai, 1996; Huang és mtsai, 2005). Ennek

fényében nem meglepő, hogy az általunk ebbe a csoportba sorolt törzset tengervizes

táptalajról sikerült izolálni. A nemzetségnek eddig összesen 6 faja ismert, ebből egyedül a S.

soli származik rizoszféra környezetből, egy ginzeng-ültetvény talajából (Kim és mtsai, 2008).

A S. marinusként azonosított törzsünk parciális szekvenciája alapján a nemzetség esetleges új

faját képviseli.

A nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok közé tartozó Kocuria rosea fajként

két Kelemen-székről származó, kataláz pozitív, eszkulin bontó, alkalofil táptalajról izolált

törzset azonosítottunk. Ezt az aerob respiratórikus anyagcserével bíró fajt a Velencei-tó

nádasállományainak bifilmjéből is sikerült kimutatnunk, mind a tavaszi, mind a nyári

mintavétel során.

A tenyésztés során egy alkalofil táptalajon izolált, eszkulin, tween 80 és DNS

bontásában pozitív eredményt mutató törzset azonosítottunk a Dietzia natronolimnea faj

tagjaként. Ezt a nemzetséget szintén csak a Kelemen-szék mintájából azonosítottuk. A Dietzia

fajok széleskörűen elterjedtek vízi környezetekben, pl. mélytengeri üledékek és kelet-afrikai

szóda tavak baktériumközösségeinek tagjaiként (Duckworth és mtsai, 1996; Takami és mtsai,

1997; Colquhoun és mtsai, 1998). Képviselőik megtalálhatók voltak a Fertő nádrizomáinak és

a velencei-tavi pusztuló nádasállományok rizómáinak belső és külső felületéről kora nyáron

izolált törzsek között is (Micsinai és mtsai, 2003; Borsodi és mtsai, 2005b).

Szintén egyetlen, Kelemen-székről izolált törzs képviselte a Streptomyces

nemzetséget. A különféle bontási képességeket tesztelő vizsgálatok többségében a törzs

pozitív eredményt adott, valamint képes volt ciszteinből kénhidrogén termelésére. A

szekvencia analízis alapján ezt a törzset S. flavofunginiként identifikáltuk. A különféle

antibiotikum- és antifungális anyagok termelésére képes aktinobaktériumok, köztük

Streptomycesek ipari, illetve egészségügyi célú felkutatása több évtizedes múltra tekint vissza.

A különböző természetes környezetek mikrobiális diverzitásának feltárása révén számos,

ebből a szempontból értékes mikroorganizmust izoláltak és detektálnak. A számos növényi

vonatkozású munka közül példaként említhetjük az erdőtalajból származó Streptomycesek

hatásának vizsgálatát a közönséges luc (Picea abies) fitpatogénekkel szembeni védekezésére

(Lehr és mtsai, 2008), vagy egy sivatagi zsályafaj (Artemisia tridentata) gyökérkörnyezetének

97

vizsgálatát antifungális anyagokat termelő aktinomicéták felkutatása érdekében (Basil és

mtsai, 2004).

A nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok körébe tartozó kelemen-széki törzsek

közül egy eszkulin- és tween 80-bontó törzs képviselte a Plantibacter flavus fajt, melynek

típustörzsét a Microbacteriaceae családba tartozó, a filloszféra abundáns tagjainak számító

korineform baktériumok vizsgálata és taxonómiai helyzetének tisztázása során fűminták

vizsgálatakor írták le (Behrendt és mtsai, 2002).

A nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok további két nemzetségét csak a

Nagy-Vadas nád biofilm mintájában detektáltuk. A reprezentatív törzsek a Microbacterium

nemzetség három fajának képviselői voltak. A M. ginsengisoli és M. oxydans fajba sorolt

törzsek többé-kevésbé egységes fenotípusos sajátságokkal bírtak, míg a M. testaceum fajhoz

sorolt 3 törzs a fenti törzsektől eltérő metabolikus aktivitásokkal bírt. Tengervizes táptalajról

származott az a 4 izolátum, amelynek ARDRA reprezentánsát Nocardiopsis exhalansként

azonosítottuk. Ezeket a törzseket nagy sókoncentráció- és magas pH értékek tűrése és a nitrát

redukció hiánya jellemezte, valamint mindegyikük bontotta a zselatint és a tween 80-at.

7.2.4 Klónkönyvtárak vizsgálata

A velencei-tavi kutatásokhoz hasonlóan a tenyésztés mellett a két alföldi szikes tó nád

biofilm baktériumközösségeinek faji összetételét is vizsgáltuk DNS alapú molekuláris

biológiai módszerrel. Az egyes DNS szakaszok klónozását követően 129 (Kelemen-szék),

illetve 158 (Nagy-Vadas) klónt számláló klónkönyvtárat hoztunk létre. A klónokat az izolált

törzsekhez hasonló módon ARDRA segítségével csoportosítottuk. Ennek eredményeképpen a

Kelemen-szék klónjaiból 36, a Nagy-Vadasról származó klónokból 33 csoportot alakítottunk

ki (Függelék 6-7. táblázat).

A Kelemen-szék klónkönyvtárában a kovaalga-kloroplasztisz, illetve cianobaktérium

DNS-ként azonosított klónok (17, illetve 12 szekvencia) összesen 3 csoportba kerültek, míg

további 3, összesen 7 klónt tartalmazó ARDRA csoport reprezentánsa kimérának bizonyult. A

Nagy-Vadas esetében kovaalga-kloroplasztiszként 16, cianobaktérium DNS-ként 10 (2

csoport) szekvenciát azonosítottunk, és 3, összesen 9 klónt tartalmazó ARDRA csoport

reprezentáns klónszekvenciái bizonyultak kimérának.

A baktérium klónok, valamint a 2004 tavaszán a nád biofilm mintákból izolált törzsek

filogenetikai csoportonkénti megoszlásának összehasonlítását a 27. és a 28. ábra szemlélteti.

98

Klónozás révén a tenyésztéses vizsgálatok eredményeihez képest a nád biofilmben jelenlévő

baktériumközösségek filogenetikai csoportjainak jelentős arányeltolódását tapasztaltuk.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

törzsek klónok

α-Proteobaktériumok

β-Proteobaktériumok

γ-Proteobaktériumok

Firmicutes (kis G+C)

Aktinobaktériumok (nagy G+C)

Bacteriodetes

Fibrobacter/Acidobacteria

27. ábra A kiskunsági Kelemen-szék nádasállományának biofilmjéből származó klónok és baktériumtörzsek filogenetikai csoportok közötti megoszlásának összehasonlítása

0%

20%

40%

60%

80%

100%

törzsek klónok

α-Proteobaktériumok

β-Proteobaktériumok

γ-Proteobaktériumok

Firmicutes (kis G+C)

Aktinobaktériumok (nagy G+C)

Bacteriodetes

Chloroflexi

28. ábra A tiszántúli Nagy-Vadas nádasállományának biofilmjéből származó klónok és baktériumtörzsek filogenetikai csoportok közötti megoszlásának összehasonlítása

99

A szekvenciák közül a Kelemen-szék klónjainak 30, a Nagy-Vadas szekvenciáinak

összesen 22%-a eddig tenyésztésbe nem vont szervezetek szekvenciával mutatott

hasonlóságot, ami a vizsgált nád biofilm baktériumközösségeinek még fel nem tárt, rejtett

diverzitására utal. A reprezentatív klónok taxonómiai helyzetét a 16S rDNS parciális

szekvencia adatok alapján neighbor-joining módszerrel készült filogenetikai dendrogramokon

mutatjuk be (29-30. ábra). A klónok vizsgálata alapján a két alföldi szikes tó nád biofilmjének

baktériumközösségei Gram-negatív dominanciával voltak jellemezhetők.

A Kelemen-szék baktérium klónjai közül a legkevesebb (9%) az α-

proteobaktériumokat képviselte, közülük három tenyésztésbe nem vont klónok szekvenciáival

mutatott hasonlóságot. Faji szinten az Agrobacterium sanguineumot sikerült kimutatnunk. A

nemzetséget tenyésztés segítségével is azonosítottuk. Az eredetileg a Balti-tengerből leírt

fajjal kapcsolatban több filogenetikai-taxonómiai vonatkozású kutatást végeztek. Több

Atlanti-óceánból származó Agrobacterium izolátum bizonyult új fajnak, amelyek

genotipizálásuk alapján a nemzetség egy elkülönülő leszármazási vonalát képviselik, egyes

bifenil-és dibenzofurán bontó A. sanguineum törzseket pedig Porphyrybacter sanguineusként

írtak le (Rüger és Höfle, 1992; Hiraishi és mtsai, 2002). A Nagy-Vadas bakteriális klónjainak

19%-a nyert besorolást az α-proteobaktériumok közé. A szigorúan aerob, kemoheterotróf

Sphingomonasok több biotechnológiai szempontból hasznosítható tulajdonságuk

(xenobiotikumok bontása, különféle exopoliszaharidok és karotinoidok szintézise) miatt

számos vizsgálat tárgyát képezik (Ederer és mtsai, 1997; Zablotowicz és mtsai, 1999; White

és mtsai, 1996; Silva és mtsai, 2004). Az általunk identifikált S. jaspsi fajt 2007-ben írták le

Asker és munkatársai édesvízből. Az Agrobacterium nemzetség tagjait a tenyésztés

eredményei alapján nem, csak klónozás segítségével sikerült kimutatnunk. Ezzel ellentétben a

Paracoccus nemzetség képviselőinek jelenléte a Nagy-Vadas nád biofilmjében mind a két

módszer segítségével igazolást nyert.

100

(AM940072)P28 sp. (AY826532)Agrobacterium

(AF316615)Agrobacterium albertimagni (AM940073)P126 (AB062106)Agrobacterium sanguineum (AM940074)P117 uncultured bacterium clone (EF029254) (AB166881)Phenylobacterium koreense

(AM940075)P138 uncultured bacterium clone (DQ066963)

(X72724)Ideonella dechloratans (AM940076)P91 (AB021407)Pelomonas saccharophila

(AM940077)P57 (AY771764)Hydrogenophaga taeniospiralis (AM940078)P23 (AJ585992)Hydrogenophaga atypica

(AM940079)P134 Comamonadaceae baktérium klón (EF370588) (DQ094183)Polaromonas hydrogenivorans

(AM940080)P26 (AJ318917)Dechloromonas denitrif icans (AM940081)P129 (AY277621)Dechloromonas hortensis

(AM940082)P140 (AY544768)Aquimonas voraii

(EF076758)Rheinheimera aquimaris (AM940083)P128 (AM940084)P45 (AM940085))P35 (DQ298025)Rheinheimera chironomi

(AM940086)P116 sp. (EF575565)Rheinheimera

(AM940087)P85 (AJ289162)Cellvibrio gandavensis

(AM940088)P38 Gamma-proteobaktérium klón (AF141439) (EU164778)Marinobacter taiwanensis

(AM940089)P7 (AF137029)Dyadobacter fermentans

(AM940090)P8 (AB078842)Paludibacter propionicigenes

(AM940091)P47 CFB baktérium klón (AY043735) (AB267718)Sphingoterrabacterium pochensis

(AM940092)P94 (EF100697)Pedobacter insulae sp. (AY571816)Sphingobacterium (AM940093)P69

baktérium klón (AB297423) (AM940094)P17 Bacteriodetes sp. baktérium klón (AJ534686)

(M62422)Marinilabila salmonicolor (AM940095)P103 (AM940096)P131 sp. (AJ876670)Flavobacterium (U85887)Flavobacterium tegetincola (AM940097)P19 (AJ251068)Flavobacterium hibernum (AM940098)P123 Flavobacteria baktérium klón (AM279209)

(AM940099)P32 sp. (AY259512)Gelidibacter

(AF001369)Gelidibacter gilvus (AM940100)P11 baktérium klón (AJ232823) (M62689)Fibrobacter succinogenes

(AM940101)P106 (EF010549)Arhtrobacter agilis

(AF334601)Thermodesulfobacterium thermophilum

100

100

99100

100

100

64

59

78100

100

100

100

100

100

100

99

99

99

6899

99

73

99

84

7060

98

61

93

69

55

99

99

9298

98

98

97

97

61

64

74

74

68

85

74

43

76

84

8210059

0,05

Fibrobacter/Aciobacteri a csoport

α- proteobaktériumok

β-proteobaktériumok

Bacteriodetes

Aktinobaktériumok (nagy G+C tartalmúGram pozitív baktériumok)

γ-proteobaktériumok

29. ábra A kiskunsági Kelemen-szék nádasállományának biofilmjéből származó klónok, valamint a velük közvetlen rokonságban álló baktériumok neighbor-joining módszerrel

készült dendrogramja (A méretarány 5% nukleotid különbséget jelöl.)

101

(AM940 103)V83 (AM940104)V23

(DQ363142)Agrobacterium albertimagni

(U86344)R hizobium giardini

(AM940105)V88

Alfa-proteobaktérium klón (AJ888555)

(AM940102)V72 sp. (AJ309981)Paracoccus

(AB006899)Paracoccus carot inifaciens

(AM940106)V2

(AB264131)Sphingomonas ja spsi

(AM940107)V55

(DQ363139)Agrobacterium sanguineum

(AM940111)V51 (DQ489306)Aquabacterium honkongens is

(AM940108)V93

(AM940109)V57

(AF078768)Hydrogenophaga taeniospiralis

(AJ585992)Hydrogenophaga atypica

(AM940110)V3 (AM940112)V53

(AM940113)V66

(X72724)Ideonella dech loratans

sp. (AB211233)Ideonel la

(AM940114)V114

(AM940115)V11 (AB02 1387)Malikia spinosa

(AM94 0116)V46

(AM039830)Polaromonas aquatica (AM940117)V9

baktérium klón (AY546509)

(AM940118)V90

Béta-proteobaktérium klón (AY678517) (DQ287787)Methillobaci llus f lagellatus

(AM940122)V7

Gamma-proteobaktérium k lón (AJ810621)

(AF288157)Marinobacter lutaoensis

(AM940121)V16

(AF448513)Cellvibr io vulgaris (AM940120)V118

sp. (EF575565)Rheinheimera

(DQ298025)Rheinheimera chironomi

(AM940 119)V54

(AY 544768)Aquim onas voraii

(AM940128)V133

(DQ372981)Flavobacter ium filum (AB275999)Flavobacter ium kamogawaensis

(AM940127)V131

(AM940106)V4

(AJ491824)Flavobacterium columna re

(AM940125)V127

(AF493694)Fluviicola taffens is (AM940124)V50

sp. klon (DQ463716)Bacteriodetes

(AM940123)V35

(AY264839)Algor iphagus halophi lus

(AM940129)V70

Chloroflexi baktérium klón (AY921893 )

(AF334601)Thermodesu lfobacterium thermophilum

92100

100

100

100

90

100

100

100

100

7084

92

99

99

99

98

98

98

96

9494

89

87

66

61

63

97

93

73

67

97

86

77

100

100

99

98

93

100

57

89

92

64

50

α- proteobaktériumok

β-proteob aktérium ok

Bacteriodetes

γ-proteobaktériumok

Chloro flexi

30. ábra A tiszántúli Nagy-Vadas nádasállományának biofilmjéből származó klónok, valamint

a velük közvetlen rokonságban álló baktériumok neighbor-joining módszerrel készült dendrogramja (A méretarány 5% nukleotid különbséget jelöl.)

102

A kelemen-széki klónok 14%-adódott β-proteobaktériumok rokonsági körébe

tartozónak. E csoport nagyobb diverzitását tártuk fel a tenyésztéshez képest, a

Hydrogenophaga nemzetség tagjain kívül a Dechloromonas és a Pelomonas nemzetségek

képviselőit is sikerült identifikáltunk. A Dechloromonas nemzetség több faját, köztük a D.

hortensist is perkloráttal szennyezett talajból írták le. Bioremediációs célú felhasználásuk

lehetősége a humán eredetű, kémiailag rendkívül stabil szennyező vegyület, a perklorát

disszimilatív redukciójára való képességükben rejlik (Wolterink és mtsai, 2005). Az általunk

identifikált fakultatív aerob D. denitrificans típustörzsét talajlakó Aporrectodea caliginosa

földigiliszta faj bélflórájából izolálták. A nitrát nitrogénig történő redukcióján kívül szintén

képes a klorát és perklorát redukciójára, valamint számos szerves sav hasznosítására (Horn és

mtsai, 2005). Az aerob, nitrogén fixációra képes Pelomonas saccharophila faj korábban a

Pseudomonas nemzetséghez tartozott, reklasszifikációja révén ma a Pelomonas nemzetség

típusfaja (Xie és Yokota, 2005). Összesen két klón alkotta azt az ARDRA csoportot, amely

reprezentatív szekvenciájának analízise alapján a Comamonadaceae családhoz tartozónak

bizonyult. Szintén két klón bizonyult hasonlónak egy másik olyan Comamonadaceae klónhoz,

amelyet RNS-alapú vizsgálatok során találtak a metilotróf, szénkörforgalomban szerepet

játszó bakteriális közösség aktív tagjának édesvízi üledékminták feltérképezésekor

(Nercessian és mtsai, 2005). A Nagy-Vadas klónszekvenciáinak 21%-a képviselte a β-

proteobaktériumokat. Ezek a szekvenciák a Hydrogenophaga, Malikia, Aquabacterium és

Ideonella nemzetségek képviselőinek bizonyultak, valamint kis számban környezeti klónok

szekvenciáival mutattak hasonlóságot. Többségük vízi környezetek, gyakran szennyezett

vizek, vagy kifejezetten szennyvizek mikrobiótájának közönséges előfordulású tagjai. A

Kelemen-szék nád biofilmjéből tenyésztés révén is kimutatott Hydrogenophaga nemzetségbe

tartozó H. taenospiralis fajt korábban a Pseudomonasok körébe sorolták, a H. defluviit és a H.

atypicat eleveniszapos szennyvízből izolálták először (Willems és mtsai, 1989; Kämpfer és

mtsai, 2005). Ezek a Comamonadaceae családba tartozó baktériumok kemoorganotróf és

fakultatív kemolitoautróf növekedésre is képesek. A szintén ebbe a családba tartozó Malikia

spinosa (korábban Pseudomonas) egy szennyvíziszapból származó másik faj, a M. granosa

leírását követően került ebbe a nemzetségbe (Spring és mtsai, 2005). Az Aquabacterium

honkongensis fajhoz tartozó szekvencia, amellyel az egyik reprezentatív klón hasonlóságot

mutatott, ivóvízből izolált törzstől származott. Egyes klónok az adatbázisban található,

édesvízi illetve szennyezett talajvíz eredetű Ideonella szekvenciák alapján kerültek

azonosításra. A Polaromonas nemzetség tagjai víz-, üledék- és talajmintákban fordulnak elő

(Jeon és mtsai, 2004; Kämpfer és mtsai, 2006; Sizova és Panikov, 2007).

103

A Kelemen-székről származó klónszekvenciák közel egyötöde (17%) a γ-

proteobaktériumokat képviselte. A Rheinheimera, Aquimonas és Cellvibrio nemzetségek

rokonsági körébe a Nagy-Vadas klónszekvenciái (10%) nyertek besorolást. Ezek az aerob

heterotróf, respiratórikus anyagcseréjű szervezetek édesvízi (Aquimonas voraii), tengeri

(Rheinheimera sp.) környezetekben közönséges előfordulásúak. Nagy szerves anyag

terhelésnek kitett vízi környezetben a γ-proteobaktériumok, köztük a Rheinheimera

nemzetség képviselőinek számbeli növekedését tapasztalták, ami a megváltozott

körülményekhez való alkalmazkodási képességükre utal (Pinhassi és Berman, 2003). A γ-

proteobaktériumok egyes képviselőit (Cellvibrio gandavensis) korábban talajmintákban is

detektálták (Mergaert és mtsai, 2003; Romanenko és mtsai, 2003; Saha és mtsai, 2005). A

Cellvibrio nemzetség egyes tagjai képesek a pektin és a cellulóz bontására, ezen sajátságaik

növény-asszociált környezetben a mikrobióta fontos tagjává teszi őket. A nemzetség tagjai

más környezeti mintákban is közönséges előfordulásúak (Humphry és mtsai, 2003).

A Kelemen-szék klónjainak közel 30%-a, a Nagy-Vadas klónszekvenciáinak

egynegyede nyert besorolást a Bacteriodetes csoportba, amelynek tagjai a tengervíz domináns

baktériumcsoportjainak egyikét képezik (Bowman és mtsai 1997; Pinhassi és mtsai, 1997;

Glöckner mtsai, 1999) és fontos szerepet játszanak a vízi ökoszisztémák remineralizációs

folyamataiban (Kirchman, 2002). A kelemen-széki nád biofilm mintából a vízi

környezetekben gyakori előfordulású Flavobacterium és Sphingobacterium nemzetségeken

kívül (Jooste és Hugo, 1999), amelyeket izolátumok is képviseltek, a klónozás segítségével

további nemzetségek (Dyadobacter, Paludibacter, Gelidibacter) tagjait is identifikáltuk. A

Nagy-Vadas esetében szintén detektáltuk (három ARDRA-csoport összesen 16 klónja) a

Flavobacterium nemzetséget, közülük egy reprezentánst rendkívül alacsony hasonlósági

szinten sikerült azonosítani. Tavi vízmintákból származó izolátumok aktivitását vizsgálva

Geller (1986) megfigyelte, hogy Flavobacterium törzsek a komplex, nehezen bontható

szubsztrátokat nagyobb hatékonysággal voltak képesek hasznosítani a többi izolátumhoz

képest. A biofilmek exopoliszaharid mátrixa a komplex makromolekulák „csapdázása” révén

ideális környezetet biztosít, és hozzájárul a baktériumok aktivitásának kifejtéséhez (Battin és

mtsai, 2001). Az aerob, kemoorganotróf Dyadobacterek számos szénforrás hasznosítására

képesek. A nemzetség több képviselőjét növényi környezetből mutatták ki, a D. fermentanst

például kukorica növényről (Chelius és Triplett, 2000), amelynek típustörzse nitrogénlimitált

környezetben mutatott optimális növekedést. A Gelidibacter nemzetséget faji szinten nem

sikerült identifikálnunk: az adott klón szekvenciája egy sós mocsárból származó izolátummal

mutatott 97%-os hasonlóságot. A Flavobacteriaceae családba tartozó nemzetség tagjainak

104

számos faja származik tengeri környezetből, ahol fontos szerepük van az elsődleges

produkció révén keletkező szerves anyagok mineralizációjában (Bowman és Nichols, 2005).

A Nagy-Vadas klónkönyvtárának vizsgálata révén sikerült igazolnunk az Algoriphagus

nemzetség jelenlétét is. Képviselőiket számos alkalommal mutatták ki tengervízből, illetve

algák környezetéből (Bowman és mtsai, 2003; Nedashkovskaya és mtsai, 2004). Az egyik

Nagy-Vadasról származó reprezentatív klón szekvencia analízise a Fluviicola taffensis

típustörzsének szekvenciájával való 97%-os hasonlóságot eredményezett. Ezt a szigorúan

aerob, pigment termelő fajt a nemzetséggel együtt folyóvízből írták le (O’Sullivan és mtsai,

2005). A fenti két nemzetségen kívül Bacteriodetes csoport esetében is találtunk olyan klónt,

amelyet faji szinten nem sikerült azonosítani, és csak környezeti mintákból származó más

klónokkal mutatott rokonságot (Brümmer és mtsai, 2000; Battin és mtsai, 2001).

A Nagy-Vadas nád biofilm baktériumközösségeinek klónozással történő

feltérképezése révén nem sikerült Gram-pozitív szervezeteket kimutatnunk. A Kelemen-szék

esetében egy mindössze 3 klónt (a klónkönyvtár 2%-a) számláló csoport reprezentáns

szekvenciája pedig a nagy G+C tartalmú Gram-pozitívok csoportjának, azon belül egyedül az

Arthrobacter nemzetséget képviselőinek jelenlétét igazolta. A kétféle módszerrel nyert

eredmények szembetűnő kontrasztja mögött feltehetően az alkalmazott technikák a Lángi-

tisztás nád biofilm mintájának klónozása kapcsán már említett szelektivitása áll.

A két területről származó biofilm minták vizsgálata során egyes csoportokat kizárólag

klónozás révén sikerült kimutatnunk. A Kelemen-szék egy ARDRA csoportjának (4 klón,

3%) reprezentatív klónja a szekvencia analízis alapján a Fibrobacter/Acidobacteria törzsbe

nyert besorolást. A csoport képviselőit szennyvíztisztításban alkalmazott membrán biofilmek

polifázikus taxonómiai vizsgálata során szintén detektálták (Chen és mtsai, 2004). Az általunk

azonosított szekvencia az angol perje (Lolium perenne), illetve a fehér lóhere (Trifolium

repens) gyökérkörnyezetének mikrobiális vizsgálatából származó klónkönyvtár (Marilley és

Agarno, 1999) egy tagjával mutatott 98%-os hasonlóságot. A Nagy-Vadas klónjainak

mindössze 1%-a, egy két klónt tartalmazó ARDRA csoport révén sikerült igazolnunk a

Chloroflexi törzs jelenlétét. Annak ellenére, hogy pl. talajban a mikrobióta viszonylag kis

hányadát képezik, számos természetes környezetet mikrobiális szempontból vizsgáló

tanulmány igazolta a törzs tagjainak jelenlétét tenyésztéstől független, nukleinsav-alapú

módszerekkel (Costello és Schmidt, 2006).

105

8. Összefoglalás

Munkánk célja hazánk három (morfometriai, hidrológiai, vízminőségi, stb.

tulajdonságait tekintve jelentősen különböző) szikes tavának, a Velencei-tónak, a kiskunsági

Kelemen-széknek és a tiszántúli Nagy-Vadas tónak a területén található eltérő kiterjedésű

nádasállományok víz alatti szárfelületein képződött biofilmek alkotásában résztvevő

baktériumközösségek megismerése volt. Mivel a mikrobiális ökológiai kutatásokban

alkalmazott módszerek mindegyike önmagában csak korlátozott mértékben alkalmas a teljes

mikrobiális diverzitás feltárására, ezért munkánk során a rendelkezésünkre álló tenyésztésen

alapuló és tenyésztéstől független módszerek kombinálásán alapuló ún. polifázikus

megközelítést alkalmaztunk. Kutatásunk során a nád biofilmet felépítő mikrobaközösségek

egészének anyagcsere és filogenetikai diverzitását, és annak szezonális és térbeli változását

ujjlenyomat módszerek (BIOLOG közösségi szénforrás értékesítés és DGGE) segítségével

tanulmányoztuk. Az egyes tavak nád biofilm közösségeit alkotó baktériumközösségek faji

struktúráját tenyésztésen alapuló technika, illetve molekuláris klónozás révén a baktérium

törzsek és klónok 16S rDNS szekvencia analízisére alapozva tártuk fel. A három tóra

kiterjedő nád biofilm vizsgálatok 2000 és 2006 között folytak.

A közösségi szintű mikrobiális anyagcsere mintázatokat BIOLOG GN2 és ECO

lemezek felhasználásával követtük nyomon. A minták többségénél a 96 órás inkubációs idő

után már nem volt számottevő változás az összaktivitásban, vagyis az indikátor

színfejlődésének mértékében, ezért minden esetben a 96 órás inkubációnál leolvasott

abszorbancia értékeket használtuk fel a mikróbaközösségek anyagcsere ujjlenyomatának

elemzéséhez. Az eredményeket főkomponens analízis során, valamint az értékesített

szubsztrátok típusa alapján hasonlítottuk össze.

A Velencei-tó esetében kétféle mintatípust vizsgáltunk annak érdekében, hogy a

nagyméretű nádasállományok esetleges elhelyezkedésbeli (nádasállományok belső és

nyíltvizes kapcsolattal rendelkező külső részéből származó minták), illetve kor (egy- és

többéves nádszár minták) szerinti különbségeit feltárjuk a biofilm mikróbaközösségek

vonatkozásában. A főkomponens analízis eredményei alapján az egyes mintatípusok

mikróbaközösségei nem mutattak egyértelmű elkülönülést szénforrás értékesítésük alapján,

ezért a későbbi szezonális vizsgálatokhoz mindhárom tó esetében a nyíltvízzel érintkező külső

nádasállományból gyűjtöttünk fiatal és többéves nádszárakat vegyesen. A Velencei-tó

106

esetében mindkét típusú (GN2 és ECO) BIOLOG lemez adatainak elemzése az egyes minták

szezonális csoportosulását eredményezte. Az ordinációs diagramokon a vizsgált években a

tavaszi minták helyezkedtek el a legközelebb egymáshoz, míg a nyáriak jelentős területi

elkülönülése volt megfigyelhető. Az alföldi szikes tavak vizsgálati eredményei alapján az

egyes évek tavaszi és nyári mintái egymáshoz nagyfokú hasonlóságot mutattak, azonban a két

évet összehasonlítva különböztek egymástól. Az őszi minták mindkét tó esetében az első

főkomponens mentén hasonlónak, a második főkomponens alapján pedig eltérőnek

mutatkoztak. Valamennyi időpontban és területen vett minta mikróbaközösségeit a különféle

szubsztrát csoportok közül a polimerek és a szénhidrátok preferált hasznosítása jellemezte.

Összességében megállapítható, hogy a GN2 és az ECO lemezekkel végzett vizsgálataink

egyaránt a közösségi szintű szénforrás hasznosítási mintázatok a Velencei-tó mintavételi

területei szerinti eltérő szezonális dinamikájára engedtek következtetni. Az ECO lemezek

ugyanakkor az egyes mikróbaközösségek aktivitásának összehasonlítására alkalmasabbnak

bizonyultak, mint a GN2 lemezek. A GN2 és ECO lemezek szénforrásainak összetételében a

szénhidrátok és a szerves savak számában van a legnagyobb különbség. A GN2 lemezek

számos olyan az ECO lemezeken nem található, de a baktériumok által könnyen hasznosítható

szénhidrátot tartalmaznak, amelyek többségét a vizsgált minták mikróbaközösségeinek

mindegyike jól értékesítette. A GN2 lemezeken mért abszorbancia adatok főkomponens

analízise ezért a minták anyagcsere-ujjlenyomatában sokkal kisebb összvarianciát

eredményezett.

A BIOLOG GN2 lemezekkel végzett két éves szénforrás értékesítési vizsgálatok

főkomponens értékei a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas nád biofilm mikróbaközösségek

esetében a velencei-tavi mintákhoz képest az összvariancia közel kétszeresét magyarázták. A

jelenség magyarázata feltehetően az lehet, hogy a Velencei-tóhoz képest a szélsőségesen

változó vízforgalommal és fiziko-kémiai paraméterekkel jellemezhető alföldi szikes vízterek

nádasállományán fejlődő biofilm közösségek anyagcsere aktivitásuk nagyfokú változásában is

tükrözik mikrokörnyezetük változását. A partszegélyén található nádasok ezen vízterek

esetében ugyanis a velencei-tavinál sokkal kevésbé összefüggőek és kisebb kiterjedésűek, így

a víztestben kialakuló változások kifejezettebben és közvetlenebbül befolyásolhatják a nád

biofilm mikróbaközösségeinek szerkezetét és aktivitását.

A mindhárom szikes tóról származó nád biofilm baktériumközösségek szerkezetében

bekövetkező szezonális változásokat és az egyes fajok relatív abundanciáját DGGE-vel

vizsgáltuk. A Velencei-tó esetében az eltérő helyekről és különböző időpontokban gyűjtött

minták baktériumközösségeit reprezentáló csíkok mintázata és a sávok intenzitása alapján a

107

legnagyobb hasonlóságot mindkét évben az ugyanarról a mintavételi területről eltérő

időpontokban gyűjtött minták baktériumközösségeinek sávmintázatai mutatták. A

korábbiakban ismertetett közösségi szintű mikrobiális anyagcsere nyomon követését célzó

BIOLOG vizsgálatok eredményei elsősorban a szezonális dinamikára, míg a DGGE

vizsgálatok eredményei inkább a mintavételi területek közti különbségekre utalnak. A

látszólagos ellentmondás hátterében feltehetően a Velencei-tó egyes területein előforduló

eltérő fajösszetételű, de hasonló anyagcsere potenciállal rendelkező, szezonálisan változó

baktériumközösségek állhatnak. A kelemen-széki nád biofilm minták DGGE sávmintázatuk

alapján elsődlegesen a mintavétel éve szerint váltak szét, és a baktériumközösségek egyes

tagjainak abundancia-változásaiban a BIOLOG eredmények főkomponens analízisével

megegyező csoportosulást figyelhettünk meg. A Nagy-Vadasról származó minták

baktériumközösségei DGGE sávmintázatuk alapján kevésbé egyértelmű csoportosulást

mutattak.

Megállapíthatjuk tehát, hogy a kétféle közösségi szintű vizsgáló módszer alkalmasnak

bizonyult a vizsgált nád biofilm minták közösségeinek vizsgálatára, azonban az egyes

területek, illetve a szezonális dinamika jellemzéséhez további részletesebb, több mintavételi

pontra kiterjedő, és gyakoribb mintavétellel egybekötött vizsgálatsorozatra volna szükség.

A mintákban a baktériumok mennyiségi viszonyait csíraszámbecsléssel, a biofilm

baktériumközösségek diverzitását részben tenyésztésen alapuló, részben molekuláris klónozás

segítségével térképeztük fel. A nád biofilm minták tenyészthető baktériumközösségeinek

fenotípusos sajátságairól az izolátumok hosszú távú laboratóriumi vizsgálatok során nyert

eredményei alapján szereztünk információt. A tenyésztésbe vont törzsek, valamint a

reprezentatív klónok identifikáláshoz 16S rDNS szekvencia analízist végeztünk.

A Velencei-tó mindhárom mintavételi területéről vett nád biofilm mintákban tavasszal

a csíraszám értékek a nyáriakhoz képest több nagyságrenddel magasabbak voltak. A velencei-

tavi területek közül tavasszal a Fürdető csíraszám értékei több esetben is egy nagyságrenddel

magasabbak voltak a másik két területről származó mintákénál, valamint a kétféle minta típus

értékei is nagyságrendi eltérést mutattak a szerves anyagban gazdag táptalajokon. A

különböző területekről származó nyári minták csíraszám értékei között nem volt nagyságrendi

különbség, ugyanakkor volt olyan táptalaj, amelyen a vizsgált két mintatípus becsült

csíraszámai mindhárom területen egy nagyságrendnyi különbséget mutattak. A négyféle

táptalajon megfigyelt értékeket összehasonlítva mindhárom tó mintáinak esetében többnyire a

Caulobacter táptalajon figyeltük meg a legmagasabb becsült csíraszámokat. A Kelemen-szék

és a Nagy-Vadas nád biofilm baktériumainak vizsgálataihoz a mesterséges tengervizes

108

táptalaj bizonyult a legalkalmasabbnak a bakteriális diverzitásának tenyésztéses módszerekkel

történő feltárására.

A három tó nád biofilm mintáiból kitenyésztett törzsállományok közül a velencei-tavi

törzsek alapvetően fakultatív fermentatív metabolizmussal bírtak. Ezen belül a Gram-negatív

dominanciájú tavaszi minták törzseit inkább a gyors (glükóz 24 órán belül történő

hasznosítása, mely gyakran gázképzéssel is együtt járt, illetve a Voges-Proskauer teszt

butilén-glikolos fermentációja), míg a döntően Gram-pozitív festődésű nyári minták törzseit a

lassú (a glükóz egy hét alatt megfigyelhető fermentációja, valamint pozitív metilvörös teszt)

fermentatív aktivitás jellemezte. A vizsgált szubsztrátok közül a tavaszi törzsekre a keményítő

és a tween 80 hasznosítása, a nyári minták izolátumaira az eszkulin és a kazein hidrolízise

volt jellemző. A kiskunsági Kelemen-szék és a tiszántúli Nagy-Vadas tó kitenyésztett

baktériumainak többsége Gram-pozitív festődésű volt, a kitenyésztett baktériumok a vizsgált

tesztekben a velencei-taviakhoz képest alacsony aktivitást mutattak. A velencei-tavi

törzsállományokkal ellentétben az alföldi törzsek teszteredményei alapvetően aerob légző

anyagcserére utaltak. Említésre méltó, hogy a Velencei-tóból egyáltalán nem, a Kelemen-szék

és a Nagy-Vadas esetében is csak néhány cellulóz bontó szervezetet sikerült kimutatnunk. Az

általunk vizsgált biofilm minták minden esetben egészséges nádnövények száráról

származtak, ezért nem meglepő a cellulózbontó szervezetek hiánya/kis száma a vizsgált

biofilmek baktériumközösségeiben.

Az ARDRA-csoportosítást követően a reprezentatív törzsek azonosításának

eredményei alapján mindhárom tó nád biofilm baktériumközösségeinek széles diverzitását

sikerült feltárnunk. Az egyes területekről származó mintákból azonosított taxonok számában

és egymáshoz viszonyított arányában jellegzetes eltéréseket tapasztaltunk, valamint az egyes

filogenetikai törzsekhez tartozó nemzetségek és fajok összetételében is csak részleges

átfedéseket lehetett megfigyelni.

A velencei-tavi nád biofilm minták közül tavasszal és nyáron is a tó nyugati

természetvédelmi területén található Lángi-tisztásról származó mintákból azonosítottuk a

legtöbb baktérium taxont, a legkevesebbet pedig a nyíltvizes területen található Fürdető

mintáiból. A Nagy-Vadas mintájából a Lángi tisztás mintáival közel egyező számú taxont

identifikáltunk. A legtöbb baktérium taxont ugyanakkor a Kelemen-szék nád biofilmjéből

határoztuk meg. Az utóbbi két szikes tóból származó törzsek közül több alacsony (≤97%)

szekvencia-hasonlóságot mutatott már leírt fajokkal, ennek alapján lehetséges, hogy ezek a

törzsek új fajok képviselői.

109

A tavaszi és nyári velencei-tavi minták törzseinek azonosítását összehasonlítva

részben átfedő faji szerkezetet állapíthatunk meg. Az α-proteobaktériumok más-más

nemzetségeit azonosítottuk tavasszal és nyáron, a β-proteobaktériumokat csak a tavaszi

minta törzsei képviselték. A γ-proteobaktériumok körébe tartozó Aeromonas nemzetség

mind a tavaszi, mind a nyári nád biofilm minták tenyészthető közösségalkotójának

bizonyult, azonban a tavaszi minta törzsállományában a nyáriénál nagyobb számú törzs

képviselte ezt a nemzetséget. A fenotípusos tesztek alapján a tavaszi velencei-tavi minta

gyors fakultatív fermentatív aktivitással rendelkező tenyészthető baktériumközösségként

volt jellemezhető, feltételezhető, hogy a jelenség mögött többek között az azonosítás révén

feltárt faji összetétel, ezen belül az Aeromonasok említett nagy száma állhat. A kis G+C

tartalmú Gram-pozitív baktériumok közé relatíve kevés törzs került a Velencei-tó tavaszi

mintáiban, míg nyáron a második legnagyobb számú törzscsoport képviselte ezt a törzset.

A feltárt sokféleség tekintetében azonban a tavaszi minták bizonyultak diverzebbnek. A

nyáron izolált és ebbe a csoportba sorolt, többségükben vegyessavas fermentációt mutató

törzsek túlnyomó részét Bacillus pumilusként azonosítottuk. A nyári mintavétel alkalmával

kitenyésztett közösségekre inkább a lassú, egy héten belül megfigyelhető fermentatív

aktivitás volt jellemző, ennek egyik feltételezhető oka többek között a Bacillus és rokon

nemzetségekbe tartozó törzsek nagy száma lehet.

A velencei-tavi tavaszi minták törzsállományán kívül a többi esetben a nagy G+C

tartalmú Gram-pozitív baktériumokat képviselte a legtöbb törzs, és összességében ennek a

filogenetikai csoportnak tártuk fel tenyésztéssel a legszélesebb (Arthrobacter,

Aureobacterium, Cellulomonas Dietzia, Kocuria, Micrococcus, Microbacterium,

Nesterenkonia, Nocardiopsis, Plantibacter, Rhodococcus, Sanguibacter, Streptomyces)

diverzitását.

A két alföldi szikes tó közül a Kelemen-szék nád biofilm mintájából kitenyésztett

baktériumok azonosításának eredményei a Nagy-Vadasénál nagyobb átfedést mutattak a

velencei-tavi minták általunk tenyésztéssel detektált faji összetételével. A nagy G+C tartalmú

Gram-pozitív baktériumok számos, a β-proteobaktériumok Acidovorax és Hydrogenophaga

nemzetségeinek, az Agrobacterium, valamint az Enterobacteriaceae család egyes tagjainak

jelenlétét a Nagy-Vadas nád biofilm mintájában nem, csak a kiskunsági Kelemen-szék

esetében sikerült igazolnunk. Az alföldi szikes tavak esetében több olyan nemzetséget

(Paracoccus, Halomonas, Planococcus, Nesterenkonia) sikerült kimutatnunk, amelyek

képviselőinek jelenléte a vizsgált szikes vizek nádon kialakuló biofilm

baktériumközösségeinek szikes környezethez való alkalmazkodására utal.

110

A tenyésztéses vizsgálatok révén a Pseudomonas és a Bacillus nemzetségek

képviselőinek jelenlétét az összes vizsgált nád biofilm minta baktériumközösségében

igazoltuk. A három tó biofilm mintáiból a Pseudomonas, a Bacillus és a vele közelrokon

nemzetségek fajainak csak részben átfedő, de összességében nagy fajgazdaságát (P.

anguilliseptica, P. fluorescens, P. fragi, P. gessardi, P. marginalis, P. putida, P. stutzeri; B.

cereus, B. firmus, B. fusiformis, B. horikoshii, B. licheniformis, B. pumilus, Brevibacillus agri,

Marinibacillus campisalis, Marinibacillus marinus, Paenibacillus sp., Jeotgallibacillus sp.)

tártuk fel. Ezek a metabolikus sokféleségükről ismert fajok növény-asszociált

mikróbaközösségek tagjaként széles körben elterjedtek a különféle vízi környezetekben.

Az egyes tavak nád biofilm baktériumközösségeinek diverzitását molekuláris

klónozással is feltérképeztük. A velencei-tavi Lángi-tisztást a korábbi eredmények alapján

választottuk a tenyésztéstől független vizsgálatra. Az alföldi szikes területek esetében a

tenyésztéssel is feldolgozott nád biofilm mintákból izolált közösségi DNS-ből hoztunk létre

klónkönyvtárat. Mindhárom klónkönyvtár esetében a vizsgált szekvenciák bizonyos hányada

kovaalga-kloroplasztisz, illetve cianobaktérium-szekvenciának, valamint kimérának

bizonyult. Ez egyrészt a növényi környezetből származó biofilm minták bakteriális

diverzitásának feltérképezésekor a DNS-alapú, eubakteriális primerek felhasználásával

történő klónozásos technika módszertani hátrányára utal, másrészt azonban ráirányítja a

figyelmet a nád perifitonban a baktériumközösségek mellett a kovaalga, valamint a

cianobaktérium közösségek jelenlétére és szerepére.

A klónozás révén mindhárom minta esetében a nád biofilm alkotásában résztvevő

baktériumközösségek széles diverzitását tártuk fel. A könyvtárak közös sajátsága volt, hogy

klónjaik jelentős hányada eddig tenyésztésbe nem vont szervezetek szekvenciáival mutatott

nagyfokú hasonlóságot. A klónok vizsgálata mindhárom tó esetében a nád biofilm

baktériumközösségek Gram-negatív dominanciájára engedett következtetni. Egyedül a

Kelemen-szék klónjai között találtunk a Gram-pozitív Arthrobacter nemzetséghez tartozó

képviselőt, melyet tenyésztéssel is sikerült igazolnunk a minta baktériumközösségében. A

tenyésztéssel feltárt mikróbaközösségek összetételében gyakran megfigyelhető jelenség a

Gram-pozitív, illetve endospóra képző szervezetek túlsúlya. A molekuláris klónozást

megelőző DNS izolálás során előfordulhat egyes baktériumok (pl. a sejtfal-szerkezeti

eltérések miatti) preferenciális feltáródása és ennek következtében nagyobb arányú

detektálása az adott mintában. A három klónkönyvtár klónjai a reprezentánsok identifikációja

révén az α-, β- és γ-proteobaktériumokat és a Bacteriodetes csoportot képviselték. Ezek közül

111

β-proteobaktériumokat csak a Velencei-tó egyes területeiről és a Kelemen-székről sikerült kis

számban kitenyésztenünk. A Bacteriodetes csoportba tartozó szervezeteket kizárólag a

Kelemen-szék biofilm baktériumai között azonosítottuk tenyésztéses eljárással is. A fenti két

csoport képviselői klónozásos vizsgálatok alapján gyakran bizonyulnak különféle környezeti

minták, köztük növény-asszociált mikrobióta abundáns tagjainak, ahol sokrétű szerepet

tölthetnek be a növény és szűkebb környezete életében. Az adatbázisokban fellelhető

viszonylag kevés tenyésztésbe vont Bacteriodetes baktériumot képviselő szekvencia szintén

azt jelzi, hogy a tenyésztésen alapuló vizsgálatok továbbfejlesztése nagymértékben

hozzájárulhat a csoport sokféleségének és aktivitásának megismeréséhez.

A fenti csoportokon kívül mindhárom minta esetében azonosítottunk olyan

csoportokat klónozás segítségével, amelyeket az általunk választott és alkalmazott tenyésztési

feltételek mellett nem detektálhattunk a nád biofilm baktériumközösségek tagjaként. Ilyenek

voltak a Lángi-tisztás esetében a Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes, Spirochaetes,

Chlorobi és Chloroflexi csoportok, a Kelemen-szék biofilm mintájában a

Fibrobacter/Acidobacteria, valamint a Nagy-Vadas nád biofilmjében a Chloroflexi csoport.

A Lángi-tisztás reprezentatív klónjainak azonosítása révén a faj/nemzetség szintjén

identifikált taxonok egyikét sem mutattuk ki tenyésztéssel az adott minta biofilm baktériumai

között. A két alföldi szikes nád biofilm minta esetében is rendkívül csekély átfedést

tapasztaltunk ebben a tekintetben (Agrobacterium, Hydrogenophaga és Arthrobacter

nemzetségek a Kelemen-szék, Paracoccus nemzetség a Nagy-Vadas mintájában). Az

Agrobacterium és a Hydrogenophaga nemzetségek tagjainak mindhárom tó nád biofilmjében

való jelenlétét csak a két diverzitás elemző módszer ötvözésével sikerült igazolnunk.

Munkánk során az alkalmazott módszerek lehetővé tették, hogy betekintést nyerjünk a

vizsgált növény-asszociált biofilmek baktériumainak potenciális metabolikus aktivitásába,

valamint filogenetikai és taxonómiai diverzitásába. A közösségi szintű anyagcserét

feltérképezni hivatott BIOLOG szénforrás értékesítési tesztek és a baktériumközösségek

szerkezetének megismerésére használt DGGE módszerrel kapott eddigi eredményeink alapján

arra következtethetünk, hogy az egyes mintavételi területek, illetve a szezonális dinamika

megbízható feltérképezéséhez további hosszú távú, gyakori mintavételezéssel kivitelezett

vizsgálatok szükségesek. A tenyésztéses és a klónozásos vizsgálatok eredményeinek részleges

átfedése a két mikrobiális ökológiai diverzitás vizsgáló módszer eltérő szelektivitására utal. A

tenyésztéses vizsgálatok kibővítésével (pl. további táptalajok bevonásával, a tenyésztési

technikák módosításával) a szikes tavak nádasain kialakuló biofilmek

baktériumközösségeinek eddig még feltáratlan, rejtőzködő diverzitására is fényt derülhet.

112

9. Kivonat

Munkánk során a Velencei-tó, a kiskunsági Kelemen-szék és a tiszántúli Nagy-Vadas

nádasainak biofilmjét felépítő mikrobaközösségek egészének szezonális és térbeli változását

anyagcsere és genetikai ujjlenyomat módszerek (BIOLOG közösségi szénforrás értékesítés és

DGGE) segítségével tanulmányoztuk. A baktériumok mennyiségi viszonyainak csíraszám

becsléssel történő felmérését követően, a közösségek taxonómiai és filogenetikai

diverzitásának feltárását tenyésztésen alapuló és molekuláris biológiai módszer (klónozás)

segítségével végeztük. A tenyésztésbe vont törzsek, valamint a reprezentatív klónok

identifikáláshoz a 16S rDNS gén szekvencia analízisét alkalmaztuk. Vizsgálataink 2000 és

2006 között folytak.

A Velencei-tó esetében a különböző nádszár típusok biofilm mikróbaközösségei a

szénforrás értékesítési profilokat összehasonlító főkomponens analízis eredményei alapján

nem különültek el egymástól. Az ECO lemezek a GN2 lemezeknél alkalmasabbak voltak a

közösségi szintű szénforrás hasznosítási mintázatok mintavételi területek szerint eltérő

szezonális dinamikájának összehasonlítására. A DGGE vizsgálatok eredményei alapján a

Velencei-tó esetében a legnagyobb hasonlóságot mindkét évben az ugyanarról a mintavételi

területről eltérő időpontokban gyűjtött minták baktériumközösségeinek sávmintázatai

mutatták. A Kelemen-szék nád biofilm mintái DGGE sávmintázatuk alapján elsődlegesen a

mintavétel éve szerint váltak szét, és a baktériumközösségek egyes tagjainak abundancia-

változásaiban a BIOLOG eredmények főkomponens analízisével megegyező csoportosulást

figyeltünk meg. A Nagy-Vadasról származó minták baktériumközösségei DGGE

sávmintázatuk alapján kevésbé egyértelmű csoportosulást mutattak.

A Velencei-tó mindhárom mintavételi területén vett nád biofilm mintákban tavasszal a

csíraszám értékek a nyáriakhoz képest több nagyságrenddel magasabbak voltak. A négyféle

táptalajon megfigyelt értékeket összehasonlítva mindhárom tó mintáinak esetében többnyire a

Caulobacter táptalajon figyeltük meg a legmagasabb becsült csíraszámokat.

A velencei-tavi tavaszi mintákból származó Gram-negatív dominanciájú törzseket a

gyors fermentatív aktivitás jellemezte, míg a főként Gram-pozitív festődésű nyári minták

törzsei lassú fermentatív aktivitást mutattak. Az alföldi szikes tavakból kitenyésztett

baktériumok többsége Gram-pozitív festődésű volt, és alacsony metabolikus aktivitással

rendelkezett.

113

A reprezentatív törzsek azonosításának eredményei alapján az egyes területekről

származó mintákból azonosított taxonok számában és egymáshoz viszonyított arányában

jellegzetes eltéréseket tapasztaltunk, és az egyes filogenetikai törzsekhez tartozó nemzetségek

és fajok összetételében is csak részleges átfedéseket lehetett megfigyelni. A velencei-tavi

tavaszi minták törzsállományán kívül a többi esetben a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív

baktériumokat képviselte a legtöbb törzs, és összességében ennek a filogenetikai csoportnak

tártuk fel tenyésztéssel a legszélesebb diverzitását. Az alföldi szikes tavak esetében több olyan

nemzetséget is kimutattunk, amelynek jelenléte a nádon kialakuló biofilm

baktériumközösségek szikes környezethez való alkalmazkodására utal. A tenyésztéses

vizsgálatok révén a Pseudomonas és a Bacillus nemzetségek képviselőinek jelenlétét az

összes vizsgált nád biofilm minta baktériumközösségében igazoltuk, ugyanakkor a

nemzetségek fajainak csak részben átfedő, de összességében nagy fajgazdaságát tártuk fel.

A velencei-tavi Lángi-tisztásról származó nádminta klónkönyvtárának jelentős

hányada eddig tenyésztésbe nem vont szervezetek szekvenciáival mutatott hasonlóságot. A

klónok vizsgálata mindhárom szikes tó nád biofilm baktériumközösségeinek Gram-negatív

dominanciájára utalt, és a klón reprezentánsok az α-, β- és γ-proteobaktériumokat és a

Bacteriodetes csoportot képviselték. Mindhárom szikes tó esetében azonosítottunk olyan

csoportokat klónozás segítségével, amelyeket az alkalmazott tenyésztési feltételek mellett

nem detektáltunk a nád biofilm baktériumközösségek tagjaként (Lángi-tisztás:

Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes, Spirochaetes, Chlorobi és Chloroflexi; Kelemen-szék:

Fibrobacter/Acidobacteria; Nagy-Vadas: Chloroflexi csoportok).

114

10. Abstract

The objective of the present work was to uncover the seasonal and spatial changes of

reed biofilm microbial communities in three Hungarian soda lakes (Lake Velencei, Kelemen-

szék and Nagy-Vadas) using metabolic as well as genetic fingerprinting methods (BIOLOG

community-level physiological profiling and DGGE). Following the germ count estimation of

bacteria within the studied samples, taxonomic and phylogenetic diversity of biofilm bacterial

communities was revealed by cultivation based and molecular biological cloning techniques.

Representative strains and clones were indentified according to their partial 16S rDNA

sequence analysis. The investigations were carried out between 2000 and 2006.

Based on the results of principal component analysis, Lake Velencei biofilm microbial

communities originating from different types of reed samples did not differ from each other

by their carbon source utilization patterns. Contrary to GN2, ECO plates proved to be more

adequate to follow the seasonal dynamics of community-level physiological profiles by

comparing the BIOLOG plates. Based on the results of genetic fingerprinting, the DGGE

patterns of biofilm bacterial communities originating from different sampling times of a given

sampling site of Lake Velencei showed the highest similarity. The band patterns of Kelemen-

szék biofilm bacterial communities showed primary separation according to the years of

sampling, and the changes in the abundance of community members correlated with the

results of principal component analysis of BIOLOG data. Bacterial communities of Nagy-

Vadas biofilm samples did not grouped clearly by their DGGE patterns.

The CFU values of bacteria within the biofilm taken in spring were at least one order

of magnitude higher than in summer at all sampling sites of Lake Velencei. Comparing the

media applied during the study, the CFU values were mostly the highest on Caulobacter

medium.

In the case of Lake Velencei, dominantly Gram-negative strains isolated from the

spring biofilm samples were characterized by their fast, while the mostly Gram-positive

strains of the summer samples by their slow fermentative activities. The majority of isolates

originating from the Kelemen-szék and Nagy-Vadas biofilm samples stained Gram-positively

and showed low activities in the studied phenotypic tests.

Results of the identification of representative strains revealed differences within the

numbers and ratios of the identified taxa of the studied bacterial communities in the three

115

lakes. Only partial overlaps can be observed among the genera and species of different

phylogenetic phyla identified within the biofilm bacterial communities, as well.

Except of the strains of the spring samples taken in Lake Velencei, the high G+C

Gram-positives were represented by the greatest number of isolates. The overall species

diversity revealed by cultivation in our samples was the greatest in the case of this

phylogenetic phylum, as well. A number of genera identified from the biofilms of Kelemen-

szék and Nagy-Vadas referred to the adaptation of reed biofilm bacteria to the special (saline,

alkaline) characteristics of the studied lakes. Representatives of the genera Pseudomonas and

Bacillus were found to be present in the bacterial communities of each studied reed bioiflm

sample. A partly overlapping but a great overall species diversity of the members of these

genera was revealed from the biofilm bacterial communities of the studied lakes.

The results of molecular cloning revealed a Gram-negative dominated diversitiy

within the reed biofilm bacterial communities of the studied sites (Lángi-tisztás in Velencei-

tó, Kelemen-szék and Nagy-Vadas). The clones represented the α-, β- és γ-proteobacteria and

the Bacteriodetes group. A great number of sequences obtained from the clone library of

Lángi-tisztás were affiliated with uncultured environmental clones. The presence of certain

bacterial groups within the reed biofilm bacterial communities of the three studied lakes was

verified by cloning but not by cultivation (Lángi-tisztás: Verrucomicrobia,

Gemmatimonadetes, Spirochaetes, Chlorobi and Chloroflexi; Kelemen-szék:

Fibrobacter/Acidobacteria; Nagy-Vadas: Chloroflexi).

116

11. Felhasznált irodalom Ács É., Buczkó K., Lakatos Gy. (1991) A Velencei-tó és a Fertő nádbevonatának

összehasonlító algológiai elővizsgálata. (Comparative algological study of the reed-periphyton in Lake Velencei and Lake Fertő). Bot. Közlem. 78: 95-111.

Ács É, Buczkó K., Lakatos Gy. (1994) Changes in the mosaic-like water surfaces of Lake Velencei as reflected by reed periphyton studies. Studia Botan. Hung. 25: 5-19.

Ács É., Buczkó K. (1994) Daily changes of reed periphyton composition in a Hungarian shallow lake (Lake Velencei). In: Marino, D., Montresor M. (eds.): Proc. 13th Internat. Diatom Symp. Biopress Limited, Bristol. pp. 1-10.

Ács É., Borsodi A.K., Makk J., Molnár P., Mózes A., Rusznyák A., Reskóné M.N., Kiss K.T. (2003) Algological and bacteriological investigations on reed periphyton in Lake Velencei, Hungary. Hydrobiologia 506-509: 549-557.

Ács É., Lakatos Gy., Reskóné N.M. (2001) A Velencei-tó nádbevonatában bekövetkezett változások. Hosszú távú algológiai vizsgálatok. Hidrol. Közl. 81: 308-310.

Ács É., Borsodi A.K., Kiss É., Kiss K.T., Kröpfl K., Szabó K., Vladár P.,Várbíró G., Záray Gy. (2007) Comparative examinations of biofilms on different substrata in a shallow sodic lake: combining analytical chemistry, community-level physiological profiling and microscopy. Aquat. Ecol. in press DOI 10.1007/s10452-007-9132-0.

Altschul S.F., Madden T.L., Schaeffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.

Amann R., Lemmer H., Wagner M. (1998) Monitoring the community structure of wastewater treatment plants: a comparison of old and new techniques. FEMS Microbiol. Ecol. 25: 205-215.

Andrews F.H., Harris R.F. (2000) The ecology and biogeography of mikroogranisms on plant surafaces. Annu. Rev. Phytopathol. 38: 145-180.

Andrikovics S., Murányi D. (2003) Zoobentosz együttesekről a Szabadszállás-Fülöpszállás környéki fehér szikes vizekben. Természetvédelmi Közlemények 10: 251-271.

Applegate D.H., Bryers J.D. (1991) Effects of carbon and oxygen limitations and calcium concentrations on biofilm removal processes. Biotechnol. Bioeng. 37: 17-25.

Bach H., Hartmann A., Schloter M., Munch J.C. (2001) PCR primers and functional probes for amplification and detection of bacterial genes for extracellular peptidases in single strains and in soil. J. Microbiol. Methods. 44: 173-182.

Bacilio-Jiménez M., Aguilar-Flores S., del Valle M.V., Pérez A., Zepeda A., Zenteno E. (2001) Endophytic bacteria in rice seeds inhibit early colonozation of roots by Azospiriilum brasilense. Soil Biol. Biochem. 33: 167-172.

Baker B.H., Williams L.A. J., Miller J.A., Fitch F.J. (1971) Sequence and geochronology of the Kenya rift volcanics. Tectonophysics 11: 191-215.

Basil A.J., Strap J.L., Knotek-Smith H.M., Crawford D.L. (2004) Studies on the microbial populations of the rhizosphere of big sagebrush (Artemisia tridentata). J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31: 278-88.

Battin T.J., Wille A., Sattler B., Psenner R. (2001) Phylogenetic and functional heterogeneity of sediment biofilms along environmental gradients in a glacial stream. Appl. Environ. Microbiol. 67: 799-807.

Beatty P.H., Jensen S.E. (2002) Paenibacillus polymyxa produces fusaricidin-type antifungal antibiotics active against Leptosphaeria maculans, the causative agent of blackleg disease of canola. Can. J. Microbiol. 48: 159-69.

Behrendt U., Ulrich A., Schumann P., Naumann D., Suzuki K. (2002) Diversity of grass-associated Microbacteriaceae isolated from the phyllosphere and litter layer after

117

mulching the sward; polyphasic characterization of Subtercola pratensis sp. nov., Curtobacterium herbarum sp. nov. and Plantibacter flavus gen. nov., sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 1441-1454.

Benhamou N., Kloepper J.W., Quadt-Hallman A., Tuzun S. (1996) lnduction of defense-related ultrastructural modifications in pea root tissues inoculated with endophytic bacteria. Plant Physiol. 112: 919-929.

Bercovier H., Steigerwalt A.G., Guiyoule A., Huntley-Carter G., Brenner D.J. (1984) Yersinia aldovae (formerly Yersinia enterocolitica-like group X2): a new species of Enterobacteriaceae isolated from aquatic ecosystems. Int. J. Syst. Bacteriol. 34: 166-172.

Berg G., Rokot N., Steidle A., Eberl L., Zock A., Smalla K. (2002) Plant-dependent genotypic and phenotypic diversity of antagonistic rhizobacteria isolated from different Verticillium host plants. Appl. Environ. Microbiol. 68: 3328–3338.

Berge O., Guinebretiere M.H., Achouak W., Normand P., Heulin T. (2002) Paenibacillus graminis sp. nov. and Paenibacillus odorifer sp. nov., isolated from plant roots, soil and food. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 607-16.

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (1994) Holt J.G. (ed.) Williams & Wilkins, Baltimore/London.

Bohus I., Rékasi T., Szikora Sz., Barkács K., Záray Gy, Ács É. (2005) Interaction of acetochlor and atrazine with natural freshwater biofilms grown on polycarbonate substrate in lake Velence (Hungary). Microchem. J. 79: 201-205.

Boon N., De Windt W., Verstraete W., Top E.M. (2002) Evaluation of nested PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) with group-specific 16S rRNA primers for the analysis of bacterial communities from different wastewater treatment plants. FEMS Microbiol. Ecol. 39: 101-112.

Boros E. (1999) A magyarországi szikes tavak és vizek ökológiai értékelése. Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 9: 13-80.

Boros E. (2003) Vízimadár populációváltozások és környezeti okai a Kiskunsági Nemzeti Park szikes tavain és mocsarain (KNP II. sz. területének térségében). Természetvédelmi Közlemények 10: 289–312.

Boros E., Andrikovics S., Kiss B., Forró L. (2006) Feeding ecology of migrating waders (Charadrii) at sodic-alkaline pans in the Carpathian Basin. Bird Study 53: 86–91.

Borsodi A., Sallai K. (1997) A Fertő fenéküledékének alkalofil baktériumközösségei. Hidrol. Közl. 77: 259-263.

Borsodi A., Farkas I., Kurdi P. (1998) Numerical analysis of planctonic and reed biofilm bacterial communities of Lake Fertő. Wat. Res. 32: 1831-1840.

Borsodi A., Sallai K. (1998) Alkalofil Bacillusok szerepe a Fertő szervesanyag lebontási folyamataiban. Hidrol. Közl. 78: 306-308.

Borsodi A., Beszteri B., Reskóné N.M., Micsinai A., Márialigeti K. (2001) A Velencei-tó üledékéből kitenyésztett alkalofil baktériumtörzsek fenotípusos jellemzése. Hidrol. Közl. 81: 334-336.

Borsodi A.K, Vladár P., Cech G., Gedeon G., Beszteri B., Micsinai A., Reskóné, N.M., Márialigeti K. (2003a) Bacterial activities in the sediment of Lake Velencei, Hungary. Hydrobiologia 506-509: 721-728.

Borsodi A., Reskóné N.M., Gedeon G., Vladár P., Boros E., Márialigeti K. (2003b) Szikes tavak baktériumközösségeinek szénforrás értékesítési vizsgálata BIOLOG rendszerrel. Hidrol. Közl. 83. 25-28.

Borsodi A., Vladár P., Rusznyák A., Szabó G., Sipos R., Márialigeti K. (2005a) Tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független molekuláris biológiai vizsgálatok a Kiskunsági NP szikes tavainak baktériumközösségein. Hidrol. Közl. 85: 23-25.

118

Borsodi A.K., Micsinai A., Rusznyák A., Vladár P., Kovács G., Tóth E.M., Márialigeti K. (2005b) Diversity of alkaliphilic and alkalitolerant bacteria cultivated from decomposing reed rhizomes in a Hungarian soda lake. Microb. Ecol. 50: 9-18.

Borsodi A.K, Rusznyák A., Molnár P., Vladár P., Reskóné M.N., Tóth E.M., Sipos R., Gedeon G., Márialigeti K. (2007) Metabolic activity and phylogenetic diversity of reed (Phragmites australis) periphyton bacterial communities in a Hungarian shallow soda lake. Microb. Ecol. 53: 612-620.

Boschker H.T.S., Cappenberg T.E. (1997) Patterns of extracellular enzyme activities in littoral sediments of lake Gooimeer, The Netherlands. Microbiol. Ecol. 25: 79-86.

Bowman J.P., McCammon S.A., Brown M.V., Nichols D.S., McMeekin T.A. (1997) Diversity and association of psychrophilic bacteria in Antarctic sea ice. Appl. Environ. Microbiol. 63: 3068–3078.

Bowman J.P., Nichols C.M., Gibson, J.A.E. (2003) Algoriphagus ratkowskyi gen. nov., sp. nov., Brumimicrobium glaciale gen. nov., sp. nov., Cryomorpha ignava gen. nov., sp. nov. and Crocinitomix catalasitica gen. nov., sp. nov., novel flavobacteria isolated from various polar habitats. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 1343–1355.

Bowman J.P., Nichols D.S. (2005) Novel members of the family Flavobacteriaceae from antarctic maritime habitats including Subsaximicrobium wynnwilliamsii gen. nov., sp. nov., Subsaximicrobium saxinquilinus sp. nov., Subsaxibacter broadyi gen. nov., sp. nov., Lacinutrix copepodicola gen. nov., sp. nov., and novel species of the genera Bizionia, Gelidibacter and Gillisia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1471-1486.

Brenner D.J., Bercovier H., Ursing J., Alonso J.M., Steigerwalt A.G., Fanning G.R., Carter G.P., Mollaret H.H. (1980) Yersinia intermedia: a new species of Enterobacteriaceae composed of rhamnose-positive, melibiose-positive, raffinose-positive strains (formerly called Yersinia enterocolitica or Yersinia enterocolitica-like). Curr. Microbiol. 4: 207-212.

Brenner M., Keenan L.W., Miller S.J., Schelske C.L. (1999) Spatial and temporal patterns of sediment and nutrient accumulation in shallow lakes of the Upper St. Johns River Basin, Florida. Wetlands Ecology and Management 6: 221-240.

Brix H. (1987) Treatment of watewater in the rhizopshere of wetland plants: the root-zone method. Water Sci. Technol. 19: 107-118.

Brubaker R.R. (1991) Factors promoting acute and chronic diseases caused by Yersiniae. Clin. Microbiol. Rev. 4: 309-324.

Brümmer I.H.M., Fehr W., Wagner-Döbler I. (2000) Biofilm community structure in polluted rivers: abundance of dominant phylogenetic groups over a complete annual cycle. Appl. Environ. Microbiol. 66: 3078-3082.

Brümmer I.H.M., Felske A., Wagner-Döbler I. (2003) Diversity and seasonal variability of β-Proteobacteria in biofilms of polluted rivers: analysis by temperature gradient gel electrophoresis and cloning. Appl. Environ. Microbiol. 69: 4463-4473.

Buczkó K., Ács É. (1997) Zonation of periphytic algae in two Hungarian shallow lakes (Lake Velence and Fertő) Acta Bot. Hung. 40: 21-34.

Buczkó K., Ács É. (1998) Comparison of succession of reed periphyton in a degraded and in an undisturbed part of a shallow lake (Lake Velencei, Hungary, Central Europe). Verh. Internat. Verein. Limnol. 26: 1674-1676.

Buckó K., Schmidt A. (1995) Szikes tavak. In: Járainé Komlódi M. (ed.) Pannon Enciklopédia Magyarország Növényvilága, Dunakanyar 2000 Kiadó, Budapest, pp. 74-76.

Chelius M.K., Triplett E.W. (2000) Dyadobacter fermentans gen. nov., sp. nov., a novel gram-negative bacterium isolated from surface-sterilized Zea mays stems. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50 : 751-758.

119

Chen C.L., Liu W.T., Chong M.L., Wong M.T., Ong S.L., Seah H., Ng W.J. (2004) Community structure of microbial biofilms associated with membrane-based water purification processes as revealed using a polyphasic approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 466-473.

Chin K.J., Rainey F.A., Janssen P.H., Conrad R. (1998) Methanogenic degradation of polysaccharides and characterization of polysaccharolytic clostridia from anoxic rice field soil. Syst. Appl. Microbiol. 21: 185–200.

Choi K.H., Dobbs F.C. (1999) Comparison of two kinds of Biolog microplates (GN and ECO) in their ability to distinguish among aquatic microbial communities. J. Microbiol. Meth.36: 203-13.

Christensen B.E. (1989) The role of extracellular polysaccharids in biofilms. J. Bacteriol. 10: 181-202.

Christensen B.E., Characklis W.G. (1990) Physical and chemical properties of biofilms. In: Characklis, W.G. and Marshall K.C (eds) Biofilms. John Wiley and sons, New York, pp. 93-130.

Chung Y.R., Kim C.H., Hwang I., Chun J. (2000) Paenibacillus koreensis sp. nov., a new species that produces an iturin-like antifungal compound. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 1495-1500.

Claus D., Fritze D., Kocur M. (1999) The genus Planococcus. In: The Prokaryotes 3rd Edition. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. (eds.), Springer, New York, pp. 1781-1791.

Collins M.D., Lund B.M., Farrow J.A.E., Schleifer K.H. (1983) Chemotaxonomic study of an alkalophilic bacterium, Exiguobacterium aurantiacum gen nov., sp. nov. J. Gen. Microbiol. 129: 2037-2042.

Colquhoun J.A, Heald S.C., Li L., Tamaoka J., Kato C., Horikoshi K., Bull A.T. (1998) Taxonomy and biotransformation activities of some deep-sea actinomycetes. Extremophiles 2: 269-277.

Cooper P.F. (1993) The use of reed bed systems to treat domestic sewage: The European design and operational guidelines for reed bed systems. In: Moshiri G.A. (ed.), Constructed Wetlands for Water Quality Improvement. Lewis Publishers, Boca raton, FL pp.: 203-217.

Costello E.K., Schmidt S.K. (2006) Microbial diversity in alpine tundra wet meadow soil: novel Chloroflexi from a cold, water-saturated environment. Environ. Microbiol. 8: 1471-1486.

Costerton, J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., Lapin-Scott H.M. (1995) Microbial biofilms. Annu. Rev. Microbiol. 49: 711-745.

Cowan S.T., Steel K.J. (1974) Manual for the identification of medical bacteria. University Press, Cambridge.

Daane L.L., Harjono I., Barns S.M., Launen L.A., Palleron N.J., Haggblom M.M. (2002) PAH-degradation by Paenibacillus spp. and description of Paenibacillus naphthalenovorans sp. nov., a naphthalene-degrading bacterium from the rhizosphere of salt marsh plants. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 131-139.

Davey M.E., O’Toole G.A. (2000) Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 847-867.

Delgado O., Quillaguamán J., Bakhtiar S., Mattiasson B., Gessesse A., Hatti-Kaul R. (2004) Nesterenkonia aethiopica sp. nov., an alkaliphilic, moderate halophile isolated from an Ethiopian soda lake. Extremophiles 8: 63-71.

Dinka M., Szeglet P. (1999) Carbohydrate and nutrient content in rhizomes of Phragmites australis from different habitats of Lake Fertő/Neusiedlersee. Limnologica 29: 47-59.

120

Duckworth A.W., Grant W.D., Jones B.E., van Steenberg R. (1996) Phylogenetic diversity of soda lake alkaliphiles. FEMS Microbiol. Ecol. 19: 181-19.

Duckworth A.W., Grant W.D., Jones B.E., Meijer D., Márquez M.C., Ventosa, A. (2000) Halomonas magadi sp. nov., a new member of the genus Halomonas, isolated from a soda lake of the East African Rift Walley. Extremophiles 4: 53-60.

Dunbar J., Sahnnon T., Barns S.M., Davis J.A., Kuske C.R. (1999) Levels of bacterial community diversity in four arid soils compared by cultivation and 16S rRNA gene cloning. Appl. Environ. Microbiol. 65: 1662-1669.

Eady R.R. (2001) The nitrogen-fixing bacteria chap. 22 In: The Prokaryotes 3rd Edition. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. (eds.), Springer, New York, pp. 942-951.

Ederer M.M., Crawford R.L., Herwig R.P., Orser C.S. (1997) PCP degradation is mediated by closely related strains of the genus Sphingomonas. Mol. Ecol. 6: 39–49.

Elo S., Maunuksela L., Salkinoja-Salonen M., Smolander A., Haahtela K. (2000) Humus bacteria of Norway spruce stands: plant growth promotingproperties and birch, red fescue and alder colonizing capacity. FEMS Microbiol. Ecol. 31: 143-152.

Érsek T., Gáborjányi R. (1998) Növénykórokozó mikroorganizmusok. ELTE Eötvös Kiadó, Budapest.

Fehr D., Burr S.E., Gibert M., d’Alayer J., Frey J., Popoff M.R. (2007) Aeromonas exoenzyme T of Aeromonas salmonicida is a bifunctional protein that targets the host cytoskeleton. J. Biol. Chem. 282: 28843–28852.

Felske A., Wolterink A., van Lis R. Akkermans A.D.L. (1997) Screening for dominant bacterial 16S rDNA sequences in soil. Antonie van Leeuwenhoek

Fernández-Garayzábal J.F., Dominguez L., Pascual C., Jones D., Collins M.D. (1995) Phenotypic and phylogenetic characterization of some unknown coryneform bacteria isolated from bovine blood and milk: description of Sanguibacter gen.nov. Lett. Appl. Microbiol. 20: 69-75.

Ferris M.J., Muyzer G., Ward D.M. (1996) Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA-defined populations inhabiting a hot spring microbial mat community. Appl. Environ. Microbiol. 62: 340-346.

Forró L., Boros E. (1997) Microcrustacean zooplankton as potential food of Recurvirostra avosetta in sodic waters of the Hungarian Plain. Wetlands Int. Pub. 43: 239–250.

Fritsche K., Auling G., Andreesen J.R., Lechner U. (1999) Defluvibacter lusatiae gen. nov., sp. nov., a new chlorophenol-degrading member of the alpha-2 subgroup of proteobacteria. Syst. Appl. Microbiol. 22: 197-204.

Frostegård Å., Courtois S., Ramisse V., Clerc S., Bernillon D., Le Gall F., Jeannin P., Nesme X., Simonet P. (1999) Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils. Appl. Environ. Microbiol. 65: 5409-5420.

Gardener B.B.M., de Bruijn F.J. (1998) Detection and isolation of novel rhizopine-catabolizing bacteria from the environment. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4944-4949.

Garland J.L., Mills A.L. (1991) Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community level sole-carbon-source utlization. Appl. Environ. Microbiol. 57: 2351-2359.

Garland J.L. (1997) Analysis and interpretation of community-level physiological profiles in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 24: 289-300.

Geller, A. (1986) Comparison of mechanisms enhancing biodegradability of refractory lake water constituents. Limnol. Oceanogr. 31: 755-764.

Glöckner F.O., Fuchs B.M., Amann R. (1999) Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 65: 3721-3726.

121

Gomez E., Garland J., Conti M. (2004) Reproducibility in the response of soil bacterial community-level physiological profiles from a land use intensification gradient. Appl. Soil Ecol. 26: 21-30.

Grant W.D. (1992) Alkaline Environments. In: Lederberg J. (ed.) Encyclopedia of Microbiology. Academic Press, New York. pp. 73-80.

Greenway M., Wooley A. (1999) Constructed wetlands in Queensland: performance, efficiency and nutrient bioaccumulation. Ecol. Eng. 12: 39-55.

Grey J.P., Herwig R.P. (1996) Phylogenetic analysis of the bacterial communities in marine sediments. Appl. Environ. Microbiol. 62: 4049-4059.

Haack S.K., Garchow H., Klug M.J., Forney L.J. (1995) Analysis of factors affecting the accuracy, reproductibility, and interpreation of microbial community carbon source utilization patterns. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1458-1468.

Hamamoto T., Horikoshi K. (1992) Alkaliphiles. Encyclopedia of Microbiology. Vol. 1. pp. 81-87.

Hinnebusch B.J. (1997) Bubonic plague: a molecular genetic case history of the emergence of an infectious disease. J. Mol. Med. 75:645–652.

Hiraishi A., Yonemitsu Y., Matsushita M., Shin Y.K., Kuraishi H., Kawahara K. (2002) Characterization of Porphyrobacter sanguineus sp. nov., an aerobic bacteriochlorophyll-containing bacterium capable of degrading biphenyl and dibenzofuran. Arch. Microbiol. 178: 45-52.

Holben W.E., Harris D. (1995) DNA-based monitoring of total community structure in environmental samples. Mol. Ecol. 4: 627-631.

Hoower R.B., Pikuta E.V., Bej A.K., Marsic D., Whitman W.B., Tang J., Krader P. (2003) Spirochaeta americana sp. nov., a new haloalkaliphilic, obligately anaerobic spirochaete isolated from soda Mono Lake in California. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 815-821.

Horikoshi K. (1991) Microorganisms in Alkaline Environments. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim.

Horikoshi K. (1995) Discovering novel bacteria, with an eye to biotechnological applications. Curr. Opin. Biotechnol. 6: 292-297.

Horn M.A., Ihssen J., Matthies C., Schramm A., Acker G., Drake H.L. (2005) Dechloromonas denitrificans sp. nov., Flavobacterium denitrificans sp. nov., Paenibacillus anaericanus sp. nov. and Paenibacillus terrae strain MH72, N2O-producing bacteria isolated from the gut of the earthworm Aporrectodea caliginosa. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1255-1265.

Huang Y., Dai X., He L., Wang Y., Wang B., Liu Z., Liu S. (2005) Sanguibacter marinus sp. nov., isolated from coastal sediment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1755–1758.

Humayoun S.B., Bano N., Hollibaugh J.T. (2003) Depth distribution of microbial diversity in Mono Lake, a meromictic soda Lake in California. Appl. Environ. Micobiol. 69: 1030–1042.

Humphry D.R., Black G.W., Cummings S.P. (2003) Reclassification of 'Pseudomonas fluorescens subsp. cellulosa' NCIMB 10462 (Ueda et al. 1952) as Cellvibrio japonicus sp. nov. and revival of Cellvibrio vulgaris sp. nov., nom. rev. and Cellvibrio fulvus sp. nov., nom. rev. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 393-400.

Idris R., Trifonova R., Puschenreiter M., Wenzel W.W., Sessitsch A. (2004) Bacterial communities associated with flowering plants of the Ni hyperaccumulator Thlaspi goesingense Appl. Environ. Microbiol. 70: 2667–2677.

Ivanova E.P., Wright J.P., Lysenko A.M., Zhukova N.V., Alexeeva Y.V., Buljan V., Kalinovskaya N.I., Nicolau D.V., Christen R., Mikhailov V.V. (2006) Characterization

122

of unusual alkaliphilic gram-positive bacteria isolated from degraded brown alga thalluses. Mikrobiol. Z. 68: 10-20.

Jeon C.O., Park W., Ghiorse W.C., Madsen E.L. (2004) Polaromonas naphthalenivorans sp. nov., a naphthalene-degrading bacterium from naphthalene-contaminated sediment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 93–97.

Jones B.E., Grant W.D., Duckworth A.W., Owenson G.G. (1998) Microbial diversity of soda lakes. Extremophiles. 2: 191-200.

Jones D., Keddie R.M. (2000) The Genus Artrobacter, chapter. 55 In: The Prokaryotes 3rd Edition. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. (eds.), Springer, New York, pp. 945-960.

Joo G.J., Kim Y.M., Lee I.J., Song K.S., Rhee I.K. (2004) Growth promotion of red pepper plug seedlings and the production of gibberellins by Bacillus cereus, Bacillus macroides and Bacillus pumilus. Biotechnol. Lett. 26: 487-491.

Jooste P.J, Hugo C.J (1999) The taxonomy, ecology and cultivation of bacterial genera belonging to the family Flavobacteriaceae. Int. J. Food Microbiol. 53: 81-94.

Juhnke M.E., Mathre D.E., Sands D.C. (1987) Identification and characterization of rhizosphere-competent bacteria of wheat. Appl. Environ. Microbiol. 53: 2793-2799.

Juretschko S., Loy A., Lehner A., Wagner M. (2002) The microbila community composition of a nitrifying-denitrifying activated sludge from an industrial sewage treatment plant analyzed by the full-cycle rRNA approach. Syst. Appl. Microbiol. 25: 84-99.

Kalmbach S., Manz W., Wecke J., Szewzyk U. (1999) Aquabacterium gen. nov., with description of Aquabacterium citratiphilum sp. nov., Aquabacterium parvum sp. nov. and Aquabacterium commune sp. nov., three in situ dominant bacterial species from the Berlin drinking water system. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 769-777.

Kamekura M., Dyall-Smith M.L., Upasani V., Ventosa A., Kates M. (1997) Diversity of alkaliphilic halobacteria: proposals for transfer of Natronobacterium vacuolatum, Natronobacterium magadii, and Natronobacterium pharaonis to Halorubrum, Natrialba, and Natronomonas gen. nov., respectively, as Halorubrum vacuolatum comb. nov., Natrialba magadii comb. nov., and Natronomonas pharaonis comb. nov., respectively. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 853-857.

Kämpfer P., Busse H.J., Falsen E. (2006) Polaromonas aquatica sp. nov., isolated from tap water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 605-608.

Kämpfer P., Schulze R., Jäckel U., Malik K.A., Amann R., Spring S. (2005) Hydrogenophaga defluvii sp. nov. and Hydrogenophaga atypica sp. nov., isolated from activated sludge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 341–344.

Kang S.H., Cho H.S., Cheong H., Ryu C.M., Kim J.F., Park S.H. (2007) Two bacterial endophytes eliciting both plant growth promotion and plant defense on pepper (Capsicum annuum L.). J. Microbiol. Biotechnol. 17: 96-103.

Kaper J.B., Lockman H., Colwell R.R. (1981) Aeromonas hydrophila: ecology and toxigenicity of isolates from an estuary. J. Appl. Bacteriol. 50: 359-377.

Kevbrin V.V., Zhilina T.N., Rainey F.A., Zavarzin G.A. (1998) Tindallia magadii gen. nov., sp. nov.: an alkaliphilic anaerobic ammonifier from soda lake deposits Curr. Microbiol. 37: 94-100.

Khmelenina N.V., Kalyuzhnaya M.G., Starostina N.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A. (1997) Isolation and characterisation of halotolerant alcaliphilic metanotrophic bacteria from Tuva Soda Lakes. Curr. Microbiol. 35: 257-261.

Kim M.K., Pulla R.K., Kim S.Y., Yi T.H., Soung N.K., Yang D.C. (2008) Sanguibacter soli sp. nov., isolated from soil of a ginseng field. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 538-541.

Kimura M. (1980) A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 16: 111–120.

123

Kirchman D.L. (2002) The ecology of Cytophaga-Flavobacteria in aquatic environments. FEMS Microbiol. Ecol. 39: 91–100.

Kiviat E., Hamilton E. (2001) Phragmites use by Native North Americans. Aquat. Bot. 69: 341-357.

Kloepper J.W., Leong J., Teintze M., Schroth N.M. (1980) Enhanced plant growth by siderophores produced by plant growth-promoting rhizobacteria. Nature 286: 885-886.

Koch C., Schumann P., Stackebrandt E. (1995) Reclassification of Micrococcus agilis (Ali-Cohen 1889) to the genus Arthrobacter as Arthrobacter agilis comb. nov. and emendation of the genus Arthrobacter. Int. J. Syst. Bacteriol. 45: 837-839.

Konopka A., Oliver L., Turco R. F. (1998) The use of carbon substrate utilization patterns in environmental microbiology. Microbil. Ecol. 35: 103-115.

Kotsis I., Fehér E., Cziráki R. (1982) A Balaton nyílt vize baktériumnépességének összetételéről. MTA Biol. Oszt. Közl. 25: 245-260.

Kovács M., Engloner A., Turcsányi G. (1998) A Balaton sekélyvízi zónája növényzetének (hínárosok, nádasok) vizsgálata, szerepük a tápanyageliminációban (összefoglalás). In: Salánki J., Padisák J. (eds.): A Balaton kutatásának 1997-es eredményei. Veszprém.

Kovács G., Burghardt J., Pradella S., Shumann P., Stackebrandt E., Márialigeti K. (1999) Kocuria palustris spec. nov. and Kocuria rhizophila spec. nov. isolated from the rhizoplane of narrow-leaved cattail (Typha angustifolia). Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 167-173.

Kovács G. (2001) Klasszikus és molekuláris biodiverzitási vizsgálatok úszólápon növő keskenylevelű gyékény (Typha angustifolia, L.) rizoplán baktérium-közösségén. ELTE Mikrobiológiai Tanszék, PhD disszertáció.

Kröpfl K., Záray Gy., Ács É. (2003a) Investigation of lead and nickel contaminated natural biofilms. Spectrochimica Acta B 58: 2177-2181.

Kröpfl K., Záray Gy., Vladár P., Mages M., Ács É. (2003b) Study of biofilm formation by total-reflection X-ray fluorescence spectrometry. Microchem. J. 75: 133-137.

Kumar S., Tamura K., Nei M. (2004) MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Brief Bioinform. 5: 150-163.

Kurdi P., Borsodi A. (1995) A Fertő-tó nádasok övezte belső tavai planktonikus baktérium közösségeinek numerikus analízise. Hidrol. Közl. 75: 238-244.

Lakatos Gy., Bartha Zs. (1989) Plankton - und Biotekton- untersuchungen im Velencei-see (Ungarn). Acta Biol. Debrecina 21: 37-66.

Lakatos Gy., Ács É. (1990) Nád élőbevonat vizsgálatok aVelencei-tavon (1978-88). [Investigations on the reedperiphyton in Lake Velence (1978-88).] IV. Fejér megyei Környezetvédelmi Szeminárium 1990. okt. 15-17. pp. 291-302.

Lakatos Gy., Ács É., Buchtijarova L.N. (1991) Study on reed-periphyton in Lake Velence. Ann. Hist. Mus. Nat. Hung. 83: 187-197.

Lakatos Gy., Grigorszky I., Bíró P. (1998) Reed-periphyton complex in the littoral of shallow lakes. Verh. Internat. Verein. Limnol. 26: 1852-1856.

Lakatos Gy., Kiss M., Mészáros I. (1999) Heavy metal content of common reed (Phragmites australis /Cav./ Trin ex Steudel) and its periphyton in Hungarian shallow standing waters. Hydrobiologia 415: 47-53.

Lane D.J. (1991) 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E, Goodfellow M (eds.) Nucleic acid techniques in bacterial systematics, John Wiley and Sons, Chichester, pp. 115-147.

Langó Zs., Borsodi A.K., Micsinai A. (2002) Comparative studies on Aeromonas strains isolated from lakes Balaton (Hungary) and Fertő/Neusiedlersee (Hungary). Acta Microbiol. Immunol. Hung. 49: 37-45.

124

Larkin M.J., Kulakov L.A., Allen C.R., (2005) Biodegradation and Rhodococcus-masters of catabolic versatility. Curr. Opin. Biotechnol. 16: 282-290.

Lee J.V., Gibson D.M., Shewan J.M. (1977) A numerical taxonomic study of some Pseudomonas-like marine bacteria. J. Gen. Microbiol. 98: 439-451.

Lee S., Furham J.A. (1990) DNA hybridization to compare species composition of natural bacterioplankton assemblages. Appl. Environ. Microbiol. 56: 739-746.

Lee Y.K., Jung H.J., Lee H.K. (2006) Marine bacteria associated with the Korean brown alga, Undaria pinnatifida. J. Microbiol. 44: 694-698.

Lehr N.A., Schrey S.D., Hampp R., Tarkka M.T. (2008) Root inoculation with a forest soil streptomycete leads to locally and systemically increased resistance against phytopathogens in Norway spruce. New Phytol. 177: 965-976.

Lilley, A. K., Fry, J. C., Bailey, M. J., Day, M. J. (1996) Comparison of aerobic heterotrophic taxa isolated from four root domains of mature sugar beet (Beta vulgaris). FEMS Micobiol. Ecol. 21: 231-242.

Lovley D.R., Phillips E.J.P., Lonergan D.J. (1989) Hydrogen and formate oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese by Alteromonas putrefaciens. Appl. Environ. Microbiol. 55: 700-706.

Lugtenberg B.J.J., Chin-A-Woeng T.F.C., Bloemberg G.V. (2002) Microbe-plant interactions: principles and mechanisms. Antonie van Leeuwenhoek 81: 373-383.

Lynd L.R., Weimer P.J., van Zyl W.H., Pretorius I.S. (2002) Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66: 506-577.

Ma Y., Zhang W., Xue Y., Zhou P., Ventosa A., Grant W.D. (2004) Bacterial diversity of the Inner Mongolian Baer Soda Lake as revealed by 16S rRNA gene sequence analyses. Extremophiles 8: 45–51.

MacDonell M.T., Colwell R.R. (1985) Phylogeny of the Vibrionaceae, and recommendation for two new genera, Listonella and Shewanella. System. Appl. Microbiol. 6: 171-182.

Madsen J.D., Chambers P.A., James W.F., Koch E.W., Westlake D.F. (2001) The interaction between water movement, sediment dynamics and submersed macrophytes. Hydrobiologia 44: 71-81.

Makk J. (2002) Kovaalgákohoz asszociált baktériumközösségek vizsgálata dunai biofilmekben. ELTE Mikrobiológiai Tanszék, PhD disszertáció.

Makk J., Ács É., Márialigeti K., Kovács G. (2003) Investigations on the Danube gravel-biofilm diatom associated bacterial communities. Biologia 58: 729-742.

Marilley, L., Aragno M. (1999) Phylogenetic diversity of bacterial communities from different proximity to Lolium perenne and Trifolium repens roots Agric. Ecosyst. Environ. Appl. Soil Ecol. 13: 127-136.

Martin-Laurent F., Phillipot L., Hallet S., Chaussod R., Germon J.C., Soulas G., Catroux G. (2001) DNA extraction from soils: old bias for new microbial diversity analysis methods. Appl. Environ. Microbiol. 67: 2354-2359.

Martins R.M., Davids W., Al-Soud W.A. (2001) Starch-hydrolyzing bacteria from Ethiopian soda lakes. Extremophiles 5: 135-144.

Mauchamp A., Blanch S., Grillas P. (2001) Effects of submergence ont he growth of Phragmites australis. Aquat. Bot. 69: 147-164.

Megyeri J. (1999) A szikes tavak és élőviláguk: vizsgálatok a Kiskunsági Nemzeti Park szikes tavain. Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 9: 161-169.

Melnikova M., Karpunina L.V., Ostakhina N.V., Ignatov V.V. (2000) Enzyme activity of lectins from the nitrogen-fixing soil bacterium Bacillus polymyxa. Current Microbiol. 41: 246-249.

Mergaert J., Lednicka D., Goris J., Cnockaert M.C., De Vosand P., Swings J. (2003) Taxonomic study of Cellvibrio strains and description of Cellvibrio ostraviensis sp.

125

nov., Cellvibrio fibrivorans sp. nov. and Cellvibrio gandavensis sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 465-471.

Micsinai A., Borsodi A., Csengeri V., Horváth A., Oravecz O., Nikolausz M., Reskóné M. N., Márialigeti K. (2003) Rhizome-associated bacterial communities of healthy and declining reed stands in Lake Velencei, Hungary. Hydrobiologia 506-509:707-713.

Monfort P., Baleux B. (1990) Dynamics of Aeromonas hydrophila, Aeromonas sobria and Aeromonas caviae in a sewage treatment pond. Appl. Environ. Microbiol. 56: 2007-2011.

Muyzer G., Brinkhoff T., Nübel U., Santegoeds C.M., Schäfer H., Wawer C. (1997) Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology. In: Akkermans A.D.L., van Elsas J.D., de Bruijn F.J. (eds) Molecular microbiology manual vol. 3.4.4. Kluwer, Dordrecht, the Netherlands. pp. 1-27.

Muyzer G., De Waal E.C., Uitterlinden A.G. (1993) Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 59: 695-700.

Nedashkovskaya O.I., Vancanneyt M., Van Trappen S., Vandemeulebroecke K., Lysenko A.M., Rohde M., Falsen E., Frolova G.M., Mikhailov V.V., Swings J. (2004) Description of Algoriphagus aquimarinus sp. nov., Algoriphagus chordae sp. nov. and Algoriphagus winogradskyi sp. nov., from sea water and algae, transfer of Hongiella halophila Yi and Chun 2004 to the genus Algoriphagus as Algoriphagus halophilus comb. nov. and emended descriptions of the genera Algoriphagus Bowman et al. 2003 and Hongiella Yi and Chun Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1757-1764.

Nercessian O., Noyes E., Kalyuzhnaya M.G., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. (2005) Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake. Appl. Environ. Microbiol. 71: 6885-6899.

Neubauer H., Aleksic S., Hensel A., Finke E.J., Meyer H. (2000) Yersinia enterocolitica 16S rRNA gene types belong to the same genospecies but form three homology groups. Int. J. Med. Microbiol. 290: 61-64.

Nielsen P.H., Jahn A., Palmgren R. (1997) Conceptual model for production and composition of exopolymers in biofilms. Water Sci. Technol. 36: 11-19.

Nikolausz M., Márialigeti K., Kovács G. (2004) Comparison of RNA- and DNA-based species diversity investigations in rhizoplane bacteriology with respect to chloroplast sequence exclusion. J. Microbiol. Meth. 56: 365-373.

Normander B., Prosser, J.I. (2000) Bacterial origin and community composition in the barley phytosphere as a function of habitat and presowing conditions. Appl. Environ. Microbiol. 66: 4372-4377.

Nübel U., Engelen B., Felske A., Snaidr J., Wieshuber A., Amann R.I., Ludwig W., H. Backhaus (1996) Sequence heterogeneities of genes encoding 16S rRNAs in Paenibacillus polymyxa detected by temperature gradient gel electrophoresis. J. Bacteriol. 178: 5636-5643.

Onishi H., Kamekura M. (1972) Micrococcus halobius sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 22: 233-236.

Ostendorp W. (1989) Die-back of reeds in Europe - a critical review of literature. Aquat. Bot. 35:5-26.

O'Sullivan L.A, Weightman A.J, Fry J.C (2002) New degenerate Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides-specific 16S ribosomal DNA-targeted oligonucleotide probes reveal high bacterial diversity in River Taff epilithon. Appl. Environ. Microbiol. 68: 201-210.

O'Sullivan L.A., Rinna J., Humphreys G., Weightman A.J., Fry J.C. (2005) Fluviicola taffensis gen. nov., sp. nov., a novel freshwater bacterium of the family

126

Cryomorphaceae in the phylum 'Bacteroidetes'. Int. J. Syst. Evol Microbiol. 55: 2189-2194.

Pascual C., Collins M.D., Grimont P.A., Dominguez L., Fernandez-Garayzabal J.F. (1996) Sanguibacter inulinus sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 811-813.

Petersen D.J., Srinivasan M., Chanway C.P. (1996) Bacillus polymyxa stimulates increased Rhizobium etli populations and nodulation when co-resident in the rhizosphere of Phaseolus vulgaris. FEMS Microbiol. Lett. 142: 271-276.

Pinhassi J., Zweifel U.L., Hagström A. (1997) Dominant marine bacterioplankton species found among colony-forming bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 63: 3359-3366.

Pinhassi J., Berman T. (2003) Differential growth response of colony-forming alpha- and gamma-proteobacteria in dilution culture and nutrient addition experiments from Lake Kinneret (Israel), the eastern Mediterranean Sea, and the Gulf of Eilat. Appl. Environ. Microbiol. 69: 199-211.

Podani J. (1997) Bevezetés a többváltozós biológiai adatfeltárás rejtelmeibe. Scientia Kiadó, Budapest. pp. 212-227.

Podschunn R., Ullmann U. (1998) Klebsiella spp. as nosocomial pathogens: epidemiology, taxonomy, typing methods, and pathogenicity factors. Clin. Microbiol. Rev. 11: 589-603.

Poindexter J.S. (1991) Dimorphic prosthecate bacteria: the genera Caulobacter, Asticcacaulis, Hyphomicrobium, Hyphomonas and Thiodendron. In: The Prokaryotes 3rd Edition. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. (eds.), Springer, New York, pp. 2176-2196.

Pollák B., Rusznyák A., Palatinszky M., Márialigeti K., Borsodi A. (2006) Tiszántúli szikes tavak baktériumközösségeinek összehasonlító vizsgálata. Hidrol. Közl. 86: 88-90.

Pourcher A.M., Sutra L., Hébé I., Moguedet G., Bollet C., Simoneau P., Gardan L. (2001) Enumeration and characterisation of cellulolytic bacteria from refuse of a landfill. FEMS Microbiol. Ecol. 34: 229-241.

Rainey F.A., Ward N., Sly L.I., Stackebrandt E. (1996) The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage: proposal of Nocardiopsaceae fam. Nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 1088-1092.

Reddy G.S., Prakash J.S., Vairamani M., Prabhakar S., Matsumoto G.I., Shivaji S. (2002) Planococcus antarcticus and Planococcus psychrophilus spp. nov. isolated from cyanobacterial mat samples collected from ponds in Antarctica. Extremophiles 6: 253-261.

Reed S.C., Middlebrooks E.J., Crites R.W. 1988. Natural systems for watewater treatment. In: Wetland systems. McGraw-Hill, New York, pp.: 164-202.

Reiter B., Pfeifer U., Schwab H., Sessitsch A. (2002) Response of endophytic bacterial communities in potato plants to infection with Erwinia carotovora subsp. atroseptica. Appl. Environ. Microbiol. 68: 2261-2268.

Reskóné N.M. (1999) A Velencei-tó mai arculata, vízminősége. Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 9. 175-182.

Reskóné N.M., Ponyi J., Szító A., Kiss G., Ács É., Borsodi, A.K. (2001) A Velencei-tó biológiai állapota. Hidrol. Közl. 81. 448-451.

Reskóné N.M., Borsodi A.K. (2003) Long-term investigations on the changes of the MPN values of bacterial communities in the sulphur cycle in Lake Velencei, Hungary. Hydrobiologia 506-509: 715-720.

Rhodes M.W., Kator H. (1994) Seasonal occurence of mesophilic Aeromonas spp. as a function of biotype and water quality in temperate freshwater lakes. Water Res. 28: 2241-2251.

127

Roberts D.P., Lohrke S.M., Meyerb S.L.F., Buyer J.S., Bowers J.H., Bakerd C.J., Lie W., de Souzaf J.T., Lewis J.A,. Chungg,S. (2005) Biocontrol agents applied individually and in combination for suppression of soilborne diseases of cucumber. Crop. Prot. 24: 141-155.

Romanenko L.A., Schumann P., Rohde M., Lysenko A.M., Mikhailov V.V., Stackebrandt E. (2002) Psychrobacter submarinus sp. nov. and Psychrobacter marincola sp. nov., psychrophilic halophiles from marine environments. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 1291–1297.

Romanenko L.A., Uchino M., Falsen E., Zhukova N.V., Mikhailov V.V., Uchimura (2003) Rheinheimera pacifica sp. nov., a novel halotolerant bacterium isolated from deep sea water of the Pacific. Int J Syst Evol Microbiol 53: 1973-1977.

Rónai A. (1985) Az Alföld negyedidőszaki földtana. Geol. Hung. 21: p. 446. Rosado A.S., Duarte G.F., Seldin L., van Elsas J. D. (1998) Genetic diversity of nifH gene

sequences in Paenibacillus azotofixans strains and soil samples analyzed by denaturing gradient gel electorophoresis of PCR-amplified gene fragments. Appl. Environ. Microbiol. 64: 2770-2779.

Rüger H.J., Höfle M.G. (1992) Marine star-shaped-aggregate-forming bacteria: Agrobacterium atlanticum sp. nov.; Agrobacterium meteori sp. nov.; Agrobacterium ferrugineum sp. nov., nom. rev.; Agrobacterium gelatinovorum sp. nov., nom. rev.; and Agrobacterium stellulatum sp. nov., nom. rev. Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 133-43.

Saha P., Krishnamurthi S., Mayilraj S., Prasad G.S., Bora T.C., Chakrabarti T. (2005) Aquimonas voraii gen. nov., sp. nov., a novel gammaproteobacterium isolated from a warm spring of Assam, India. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1491-1495.

Saitou N., Nei M. (1987) The neighbour-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4: 406–452.

Sakiyama C.C., Paula E.M., Pereira P.C., Borges A.C., Silva D.O. (2001) Characterization of pectin lyase produced by an endophytic strain isolated from coffee cherries. Lett. Appl. Microbiol. 33: 117-121.

Salmassi T.M., Venkateswaren K., Satomi M., Neolson K.H., Newman D. K., Hering J.G. (2002) Oxidation of arsenite by Agrobacterium albertimagni, AOL15, sp. nov., isolated from Hot Creek, California. Geomicrobiol. J. 19: 53–66.

Salmassi T.M., Walker J.J., Newman D.K., Leadbetter J.R., Pace N.R., Hering J.G. (2006) Community and cultivation analysis of arsenite oxidizing biofilms at Hot Creek. Environ. Microbiol. 8:50-59.

Santegoeds C.M., Ferdelman T.G., Muyzer G., de Beer D. (1998) Structural and functional dynamics of sulphate-reducing populations in bacterial biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3731-3739.

Sato K., Yiang H.Y. (1996) Gram-positive bacterial flora on the root surface of wheat (Triticum aestivum L.) growth under different soil conditions. Biol. Fert. Soils 23: 121-125.

Schlesner H. (1988) Verrucomicrobium spinosum gen. nov., sp. nov.; a fimbriated prosthecate bacterium Syst. Appl. Microbiol. 10: 54-56.

Schmidt A. (2003) Kiskunsági szikes tavak összehasonlító vízkémiai vizsgálata. Természetvédelmi Közlemények 10. pp. 153-162.

Schmitz R.A., Klopprogge K., Grabbe R. (2002) Regulation of nitrogen fixation in Klebsiella pneumoniae and Azotobacter vinelandii: NiFL, transducing two environmental signals to the nif transcriptional activator NifA. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 4: 235-242.

Schulze R., Spring S., Amann R., Huber I., Ludwig W., Schleifer K.H., Kampfer P. (1999) Genotypic diversity of Acidovorax strains isolated from activated sludge and description of Acidovorax defluvii sp nov. Syst. Appl. Microbiol. 22: 205-214.

128

Seidler R.J., Allen D.A., Lockman H., Colwell R.R., Joseph S.W., Daily O.P. (1980) Isolation, enumeration and characterization of Aeromonas from polluted waters used for diving operations. Appl. Environ. Microbiol. 39: 1010-1018.

Seldin L., Rosado A.S., da Cruz D.W., Nobrega A., van Elsas J.D., Paiva E.(1998) Comparison of Paenibacillus azotofixans strains isolated from rhizoplane, rhizosphere, and non-root-associated soil from maize planted in two different brazilian soils. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3680-3688.

Seo E.J., Yoo S.H., Oh K.W., Cha J., Lee H.G., Park C.S. (2004) Isolation o fan exopolisaacharide-producing bacterium Sphingomonas sp. CS101, which forms an unusual type of sphingan. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68: 1146-1148.

Shishido M., Loeb B.M., Chanway C.P. (1995) External and internal root colonization of lodgepool pine seedlings by two growth-promoting Bacillus strains originated from different root microsites. Can. J. Microbiol. 41: 707-713.

Silva C., Cabral J.M., van Keulen F. (2004) Isolation of a betacarotene over-producing soil bacterium, Sphingomonas sp. Biotechnol. Lett. 26: 257–262.

Sinha S.N., Banerjee R.D. (1997) Ecological role of thiosulfate and sulfide utilizing purple nonsulfur bacteria of a riverine ecosystem. FEMS Microbiol. Ecol. 24: 211-220.

Sizova M., Panikov N. (2007) Polaromonas hydrogenivorans sp. nov., a psychrotolerant hydrogen-oxidizing bacterium from Alaskan soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 616-619.

Smalla K., Wachtendorf U., Heuer H., Liu W.T., Forney L. (1998) Analysis of BIOLOG GN substrate utilization patterns by microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 64: 1220-1225.

Smit E., Leeflang P., Gommans S., van den Broek K., van Mil S., Wernars K. (2001) Diversity and seasonal fluctuations of the dominant members of the bacterial soil community in a wheat field as determined by cultivation and molecular methods. Appl. Environ. Microbiol. 67: 2284–2291.

Smith K.P., Handelsman J., Goodman R.M. (1999) Genetic basis in plants for interactions with disease-suppresive bacteria. Agricultural Sciences 96: 4786-4790.

Sorokin D.Y., Kuenen J.G. (2000a) A novel facultatively autotrophic hydrogen oxidizing bacterium from alkaline environment. Extremophiles 4: 237–245.

Sorokin D.Y., Lysenko A.M., Mityushina L.L., Tourova T.P., Jones B.E., Rainey F.A., Robertson L.A., Kuenen G.J. (2003) Thioalkalimicrobium aerophilum gen. nov., sp. nov. and Thioalkalimicrobium sibericum sp. nov., and Thioalkalivibrio versutus gen. nov., sp. nov., Thioalkalivibrio nitratis sp. nov. and Thioalkalivibrio denitrificans sp. nov., novel obligately alkaliphilic and obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria from soda lakes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 1779-1783.

Sorokin D.Y., Tourova T.P., Lysenko A.M., Mityushina L.L., Kuenen J.G. (2000b) Thioalkalivibrio thiocyanoxidans sp. nov. and Thioalkalivibrio paradoxus sp. nov., novel alkaliphilic, obligately autotrophic, sulfur-oxidizing bacteria capable of growth on thiocyanate, from soda lakes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 2157-2163.

Spring S., Wagner M., Schumann P., Kämpfer P. (2005) Malikia granosa gen. nov., sp. nov., a novel polyhydroxyalkanoate- and polyphosphate-accumulating bacterium isolated from activated sludge, and reclassification of Pseudomonas spinosa as Malikia spinosa comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 621-629.

Stackebrandt E., Liesack W., Goebel B.M. (1993) Bacterial diversity in a soil sample from a subtropical Australian environment as determined by 16S rDNA analysis. FASEB J. 7: 232-236.

129

Stackebrandt E., Liesack W. (1993) Nucleic acids and classification. In: Goodfellow M., O’Donnel A. (eds.), Handbook of New Bacterial Systematics. Academic Press, New York, pp. 151-194.

Strunk, O., Gross, O., Reichel, B., May, M., Hermann, S., Stuckmann, N., Nonhoff, B., Lenke, M., Ginhart, T., Vilbig, A., Ludwig, T., Bode, A., Schleifer, K. H., Ludwig, W. (1998) ARB: A software environment for sequence data. Department of Microbiology, Technical University Munich, Munich (Germany).

Sümegi P., Molnár A., Szilágyi G. (2000) Szikesedés a Hortobágyon. Természet Világa 131: 5.

Szabó A. (2001) A Kiskunsági Nemzeti Park (KNP) szikes kisvizeinek Protozoológiai (Ciliata) vizsgálata. Hidrol. Közl. 81: 462–464.

Szabó A. (2003) Protozoológiai (Protozoa, Ciliata) vizsgálatok a Fülöpszállás-Szabadszállás környéki szikes kisvizekben (1998–1999). Természetvédelmi Közlemények 10: 229-239.

Szabó G., Borsodi A., Vladár P., Cech G., Tóth E., Boros E., Márialigeti K. (2004) A Kiskunsági Nemzeti Park szikes tavainak bakteriológiai vizsgálata. Hidrol. Közl. 84: 147-150.

Szabó I., Szeglet P., Tóth I. (1993) Preliminary case study of sludge deposition around the Keszthely bay of the Lake Balaton. First International Conference On Environmental Engineering, Leicester, Great Britain, 21-23 September 1993, Book of Abstracts.

Takami H., Inoue A., Fuji F., Horikoshi K. (1997) Microbial flora in the deepest sea mud of the Mariana Trench. FEMS Microbiol. Lett. 152: 279-285.

Takeuchi M., Hatano. K. (1998) Union of the genera Microbacterium Orla-Jensen and Aureobacterium Collins et al. in a redifined genus Microbacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 48: 739-747.

Tamásné D.Zs. (1999) Hazai szikes vizeink kémiai jellege. Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 9: 281-292.

Tanner C.C. (1996) Plants for constructed wetland treatment systems – a comparisonof the growth and nutrient uptake of eight emergent species. Ecol. Eng. 7: 59-83.

Teske A., Ramsing N.B., Habicht K., Fukui M., Küver J., Jørgensen B.B., Cohen Y. (1998) Sulphate-reducing bacteria and their activities in cyanobacterial mats of solar lake (Sinai, Egypt). Appl. Environ. Microbiol. 62: 2943-2951.

Tindall B.J. (1988) Procaryotic life in alkaline, saline, athalassic environment. In: Rodriguez-Valera (ed.): Halofilic bacteria Alicante, Spain: CRC Press Inc., Boca Raton, Florida pp. 31-67.

Tixier C., Sancelme M., Aït-Aïssa S., Widehem P., Bonnemoy F., Cuer A., Truffaut N., Veschambre H. (2002) Biotransformation of phenylurea herbicides by a soil bacterial strain, Arthrobacter sp. N2: structure, exotoxicity and fate of diuron metabolite with soil fungi. Chemosphere 46: 519-526.

Trebaol G., Gardan L., Manceau C., Tanguy J.L., Tirilly Y., Boury S. (2000) Genomic and phenotypic characterization of Xanthomonas cynarae sp. nov., a new species that causes bacterial bract spot of artichoke (Cynara scolymus L.) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 1471-1478.

Tsavkelova E.A., Cherdyntseva T.A., Botina S.G., Netrusov A.I. (2007) Bacteria associated with orchid roots and microbial production of auxin. Microbiol. Res. 162: 69-76.

Ude S., Arnold D.L., Moon C.D., Timms-Wilson T., Spiers A.J. (2006) Biofilm formation and cellulose expression among diverse environmental Pseudomonas isolates. Environ. Microbiol. 8: 1997-2011.

130

Vallaeys T., Topp E., Muyzer G. (1997) Evaluation of denaturing gradient gel electrophoresis int he detection of 16S rDNA sequence variation in rhizobia and methanotrophs. FEMS Microbiol. Ecol. 24: 279-285.

Vardavakis E. (1989) Seasonal fluctuations of aerobic cellulolytic bacteria, and cellulase and respiratory activities in a soil profile under a forest. Plant Soil 115: 145–150.

Ventosa A., Nieto J.J., Oren A. (1998) The biology of aerobic moderately halophilic bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 504-544.

Verhille S., Baida N., Dabboussi F., Hamze M., Izard D., Leclerc H. 1999. Pseudomonas gessardii sp. nov. and Pseudomonas migulae sp. nov., two new species isolated from natural mineral waters. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 1559-1572.

Victorio L., Gilbride K.A., Allen D.G., Liss S.N. (1996) Phenotypic fingerprinting of microbial communities in wastewater treatment systems. Wat. Res. 30: 1077-1086.

Vladár P, Rusznyák A, Márialigeti K, Borsodi AK. (2008) Diversity of sulfate-reducing bacteria inhabiting the rhizosphere of Phragmites australis in Lake Velencei (Hungary) revealed by a combined cultivation-based and molecular approach. Microb. Ecol. In press DOI 10.1007/s00248-007-9324-0.

von der Weid I., Paiva E., Nobrega A., van Elsas J.D., Seldin L. (2000) Diversity of Paenibacillus polymyxa strains isolated from the rhizosphere of maize planted in Cerrado. Soil Res. 151: 369-81.

von Wintzingerode F., Göbel U.B., Stackebrandt E. (1997) Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-based rRNA analysis. FEMS Microbiol. Rev. 21: 213-229.

Vörös L., Boros E., Sschmidt A., V. Balogh K., Németh B., Somogyi B., Mózes, A. (2006) A fitoplankton fizikai és kémiai környezete fehér vizű szikes tavainkban. Hidrol. Közl. 86: 139–141.

Vörös L., V. Balogh K. (2003) Fotoautotróf pikoplankton a Duna-Tisza közi szikes tavakban. Természetvédelmi Közlemények 10: 185–189.

Vörös L., V. Balogh K., Boros E. (2005) Pikoplankton dominancia szikes tavakban. Hidrol. Közl. 85: 166–168.

Vreeland R.H. (1999) The genus Halomonas. In: The Prokaryotes 3rd Edition. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. (eds.), Springer, New York, pp. 1098-1109.

Wagner M., Loy A., Nogueira R., Purkhold U., Lee N., Daims H. (2002) Microbial community composition and function in wastewater treatment plants. Antonie van Leeuwenhoek 81: 665-680.

Watnick P., Kolter R. (2000) Biofilm, city of microbes. J. Bacteriol. 182: 2675-2679. Wenzel M., Schonig I., Berchtold M., Kampfer P., Konig H. (2002) Aerobic and facultatively

anaerobic cellulolytic bacteria from the gut of the termite Zootermopsis angusticollis. J. Appl. Microbiol. 92: 32-40.

Weon H.Y., Kim B.Y., Kim M.K., Yoo S.H., Kwon S.W., Go S.J., Stackebrandt E. (2007) Lysobacter niabensis sp. nov. and Lysobacter niastensis sp. nov., isolated from greenhouse soils in Korea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 548-51.

White D.C., Sutton S.D., Ringelberg D.B. (1996) The genus Sphingomonas: physiology and ecology. Curr. Opin. Biotechnol. 7: 301–306.

Widdel F., Pfenning N. (1992) The genus Desulfuromonas and other Gram-negative sulfur-reducing eubacteria. In: The Prokaryotes 3rd Edition. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. (eds.), Springer, New York, pp. 3379-3389.

131

Wilkinson B.J, Sment K.A, Mayberry W.R (1982) Occurrence, localization and possible significance of an ornithine-containing lipid in Paracoccus denitrificans. Arch. Microbiol. 131: 338-343.

Willems A., Busse J., Goor M. (1989) Hydrogenophaga, a new genus of hydrogen-oxidizing bacteria that includes Hydrogenophaga flava comb. nov. (formerly Pseudomonas flava), Hydrogenophaga palleronii comb. nov. (formerly Pseudomonas palleronii), Hydrogenophaga pseudoflava comb. nov. (formerly Pseudomonas pseudoflava and "Pseudomonas carboxydoflava"), and Hydrogenophaga taeniospiralis comb. nov. (formerly Pseudomonas taeniospiralis). Int. J. Syst. Bacteriol. 39: 319-333.

Wolde-meskel E., Terefework Z., Frostegard A., Lindström K. (2005) Genetic diversity and phylogeny of rhizobia isolated from agroforestry legume species in southern Ethiopia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1439–1452.

Wolterink A., Kim S., Muusse M., Kim I.S., Roholl P.J., van Ginkel C.G., Stams A.J., Kengen S.W. (2005) Dechloromonas hortensis sp. nov. and strain ASK-1, two novel (per)chlorate-reducing bacteria, and taxonomic description of strain GR-1. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 2063-2068.

Xie C.H., Yokota A. (2005) Reclassification of Alcaligenes latus strains IAM 12599T and IAM 12664 and Pseudomonas saccharophila as Azohydromonas lata gen. nov., comb. nov., Azohydromonas australica sp. nov. and Pelomonas saccharophila gen. nov., comb. nov., respectively. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 2419-2425.

Yang C.H., Crowley D.E. (2000) Rhizosphere microbial community structure in relation to root location and plant iron nutritional status. Appl. Environ. Microbiol. 66: 345-351.

Yoon J.H., Lee C. H., Kang S. J., Oh T. K. (2005) Psychrobacter celer sp. nov., isolated from sea water of the South Sea in Korea. 55: 1885–1890.

Zablotowicz R.M., Leung K.T., Alber T., Cassidy M.B., Trevors J.T., Lee H., Veldhuis L., Hall J.C. (1999) Degradation of 2,4-dinitrophenol and selected nitroaromatic compounds by Sphingomonas sp. UG30. Can. J. Microbiol. 45: 840–848.

Záray Gy., Kröpfl K., Szabó K., Taba Gy., Ács É., Berlinger B., Salih B., Akbulut A. (2005) Comparison of freshwater biofilms grown on polycarbonate substrata in the Lake Velence (Hungary) and Lake Mogan (Turkey). Microchem. J. 79: 145-148.

Zhang H., Sekiguchi Y., Hanada S., Hugenholtz P., Kim H., Kamagata Y., Nakamura K. (2003) Gemmatimonas aurantiaca gen. nov., sp. nov., a Gram-negative, aerobic, polyphosphate-accumulating micro-organism, the first cultured representative of the new bacterial phylum Gemmatimonadetes phyl. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 1155-1163.

Zhilina,T.N., Zavarzin G.A. (1994) Alcalophilic anaerobic community at pH 10. Curr. Microbiol. 29: 109-112.

132

12. Köszönetnyilvánítás Szeretném mindenkinek megköszönni a segítségét, akinek része volt abban, hogy ez a

dolgozat elkészülhetett.

Kiemelten köszönettel tartozom:

Dr. Borsodi Andreának, témavezetőmnek, a szakmai vezetésen, bátorításon és ösztökélésen

túl a kitartásáért és türelméért,

Dr. Márialigeti Károly tanszékvezetı úrnak, hogy a Mikrobiológiai Tanszéken lehetővé tette

számomra a munkám elvégzését és mindvégig támogatott,

és Micsinai Adriennek és Vladár Péternek, akiknek a segítségére mindig számíthattam,

Reskóné Nagy Máriának és Kiss Gábornak, a mintavételezésekben nyújtott segítségéért,

a Mikrobiológiai Tanszék mindenkori dolgozóinak, szakdolgozóinak és doktoranduszainak,

akik számtalanszor nyújtottak segítı kezet,

és végül, de nem utolsósorban köszönöm családomnak a nélkülözhetetlen támogatást és

hátteret, és hogy végig rendületlenül hittek a munkámban és bennem.

133

134

GN2 MicroPlateTM

A1 water

A2 α-cyclodextrin

A3 dextrin

A4 glycogen

A5 tween 40

A6 tween 80

A7 N-acetyl-D-galactos amine

A8 N-acetyl-D-glucosamine

A9 adonitol

A10 L-arabinose

A11 D-arabitol

A12 cellobiose

H1 α-D

G1 D-Cel

F1 Gly

E1 α-C

13. Függelék

B1

i-erythritol

B2 D-fructose

B3 L-fucose

B4 D-galactose

B5 gentiobiose

B6 α-D-glucose

B7 m-inositol

B8 α-D-lactose

B9 lactulose

B10 maltose

B11 D-mannitol

B12 D-mannose

C1

D-melibiose

C2 ß-methyl-D-glucoside

C3 D-psicose

C4 D-raffinose

C5 L-rhamnose

C6 D-sorbitol

C7 sucrose

C8 D-trehalose

C9 turanose

C10 xylitol

C11 methyl pyruvate

C12 mono-methyl succinate

D1 acetic acid

D2 cis-aconitic acid

D3 citric acid

D4 formic acid

D5 D-galactonic acid lactone

D6 D-galacturonic acid

D7 D-gluconic acid

D8 D-glucosaminic acid

D9 D-glucuronic acid

D10 α-hydroxy butyric acid

D11 ß-hydroxy butyric acid

D12 γ-hydroxy butyric acid

E1 p-hydroxy phenilacetic acid

E2 itaconic acid

E3 α-keto butyric acid

E4 α-keto glutaric acid

E5 α-keto valeric acid

E6 D,L-lactic acid

E7 malonic acid

E8 propionic acid

E9 quinic acid

E10 D-saccharic acid

E11 sebacic acid

E12 succinic acid

F1 bromo su

F2 succinamic

F3 glucuron.

F4 alaninamide

F5 D-alanine

F6 L-alanine

F7 L-alanyl-

F8 L-asparagine

F9 L-aspartic

F10 L-glutamic

F11 glycyl-L-

F12 glycyl-L-

ccinic acid acid amide glycine acid acid aspartic acid glutamic acid

G1L-

histidine

G2 hydroxy L-proline

G3 L-leucine

G4 L-ornithine

G5 L-phenylalanine

G6 L-proline

G7 L-pyroglutamic acid

G8 D-serine

G9 L-serine

G10 L-threonine

G11 D,L-carnitine

G12 γ-amino butyric acid

H1urac

ocanic id

H2 inosine

H3 uridine

H4 thymidine

H5 phenyl ethylamine

H6 putrescine

H7 2-amino ethanol

H8 2,3-butanediol

H9 glycerol

H11 D,L-a-glycerol phosphate

H11 glucose-1-phosphate

H12 glucose-6-phosphate

ECO MicroPlateTM

A1 water

A2 ß-Methyl-D-Glucoside

A3 D-Galactonic acid γ-Lactone

A4 L-Arginine

A1 water

A2 ß-Methyl-D-Glucoside

A3 D-Galactonic acid γ-Lactone

A4 L-Arginine

A1 water

A2 ß-Methyl-D-Glucoside

A3 D-Galactonic acid γ-Lactone

A4 L-Arginine

B1 Pyruvic acid methyl ester

B2 D-Xylose

B3 D-Galacturonic acid

B4 L-Asparagine

B1 Pyruvic acid methyl ester

B2 D-Xylose

B3 D-Galacturonic acid

B4 L-Asparagine

B1 Pyruvic acid methyl ester

B2 D-Xylose

B3 D-Galacturonic acid

B4 L-Asparagine

C1 Tween 40

C2 i-Erythritol

C3 2-Hydroxy Benzoic Acid

C4 L-Phenylalanine

C1 Tween 40

C2 i-Erythritol

C3 2-Hydroxy Benzoic Acid

C4 L-Phenylalanine

C1 Tween 40

C2 i-Erythritol

C3 2-Hydroxy Benzoic Acid

C4 L-Phenylalanine

D1 Tween 80

D2 D-Mannitol

D3 4-Hydroxy Benzoic acid

D4 L-serine

D1 Tween 80

D2 D-Mannitol

D3 4-Hydroxy Benzoic acid

D4 L-serine

D1 Tween 80

D2 D-Mannitol

D3 4-Hydroxy Benzoic acid

D4 L-serine

yclo- Dextrine

E2 N-Acetyl-D-Glucosamine

E3 Hydroxybutyric acid

E4 L-Threonine

E1 α-Cyclo- Dextrine

E2 N-Acetyl-D-Glucosamine

E3 Hydroxybutyric acid

E4 L-Threonine

E1 α-Cyclo- Dextrine

E2 N-Acetyl-D-Glucosamine

E3 Hydroxybutyric acid

E4 L-Threonine

cogen F2 D- Glucos-aminic acid

F3 Itaconic acid

F4 Glycyl-L-Glutamic acid

F1 Glycogen

F2 D- Glucos-aminic acid

F3 Itaconic acid

F4 Glycyl-L-Glutamic acid

F1 Glycogen

F2 D- Glucos-aminic acid

F3 Itaconic acid

F4 Glycyl-L-Glutamic acid

lobiose

G2 Glucose-1-Phosphate

G3 α-Ketobutyric acid

G4 Phenylezhyl-amine

G1 D-Cellobiose

G2 Glucose-1-Phosphate

G3 α-Ketobutyric acid

G4 Phenylethyl-amine

G1 D-Cellobiose

G2 Glucose-1-Phosphate

G3 α-Ketobutyric acid

G4 Phenylethyl-amine

-Lactose H2 D,L-α-Glycerol Phosphate

H3 D-Malic acid

H4 Putrescinee

H1 α-D-Lactose

H2 D,L-α-Glycerol Phosphate

H3 D-Malic acid

H4 Putrescinee

H1 α-D-Lactose

H2 D,L-α-Glycerol Phosphate

H3 D-Malic acid

H4 Putrescinee

1. ábra

legközelebbi rokon faj/nemzetség(parciális 16S rDNS szekvencia hasonlóság) minta táptalaj 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Agrobacterium vitis (AB118158; 97-98%) 24 L, G, F A, B, O, T - 25 50 - - - 4 4 - 42 - - 13 - 33 4 - 96 - 4 4 8 -

Acidovorax delafieldii (AF332187; 99%) 3 L B - - + - - - - - - - - - + - - - - - + - - + -

Delftia sp. (AF509481; 99%) 3 L, G A, B, T - + 33 33 - - + + - 33 - - - - - + + + + + - - -

Hydrogenophaga sp. (AM051269; 99%) 5 G, F O, T - - 14 - - - - - 29 29 - - 57 - - 14 14 - - 57 - - -

Rhodoferax fermentans (D16212; 99%) 1 L B - - - + - - + - - - - - + - - - - - - - - - -

Pseudomonas anguilliseptica (AF439803; 98-100%) 21 L, F B, O, T - 29 38 - 5 - - - 90 86 10 - 33 - 76 - - 5 10 24 10 67 -

Pseudomonas fragi (D84014; 98%) 4 L, G A, B, T - 50 75 - - - - - - 25 50 - - - - - - - - - 25 + -

Pseudomonas marginalis (AF311387; 99%) 8 L, F B, O - 75 88 - - - 25 - - 50 - - - - 63 - - + + + - - -

Pseudomonas putida (AY972175; 98%) 8 G, F B, O - + 88 - - - 88 - - 50 13 - 25 63 88 - - 13 25 25 - 25 -

Aeromonas sobria (X74683; 99-100%) 43 L, G, F B, O, T - 91 70 + + 95 + + - 98 - 98 + - 47 21 93 93 + 98 91 95 -

Aeromonas veronii (X74684; 99%) 4 L, G, F O, T - + 75 + + + + + - + + + + - 25 50 + + 75 + 75 75 -

Shewanella putrefaciens (X81623; 97%) 2 F O - + 50 - - - 50 - - + - - + - 50 - - - - - - 50 -

Psychrobacter sp. (DQ337539; 95%) 2 L, G T - + + + + - + + - - - - 50 - - - - - - - - + -

Bacillus cereus (AY842872; 99-100%) 8 L, G, F B, O, T + + 25 63 50 25 63 50 - - - 25 25 - - 50 25 25 25 + 50 25 -

Bacillus sp. (AF414443; 99%) 5 G O, T + + - 20 20 - 60 60 - 20 - - 40 - 20 60 - 60 + 80 60 20 -

Marinibacillus marinus (AJ237708; 98%) 2 G A, O + 50 - - - - - - - - - - + - - + - + + 50 50 50 -

Brevibacillus agri (AB039334; 96%) 3 G B, T + + - + + - + + - - - - 67 - - + + + + 67 67 - -

Paenibacillus sp. (AB043868; 95%) 2 G T + + - 50 50 - + + - - - - + - - + - + - + + 50 -

Exiguobacterium aurantiacum (DQ019166; 98%) 1 G T + + - + + - + + - - - - - - - + - + + + + - -

Kocuria palustris (AJ536438; 99%) 6 L, G, F T + + - 17 17 - + + - - - - 67 - - 67 17 - 50 17 - 17 -

Kocuria rosea (AY211171; 99%) 3 L, G T + + - - - - - - - - - - + - - - - - - + + + -

Micrococcus sp. (AY357893; 95%) 7 L, G A, B, T + 86 14 - - - - - - - - - - - - - - 14 71 + - 29 -

Arthrobacter crystallopoietes (X80738; 99%) 4 L A, B, T + + - - - - - - - - - - + - - - - - 25 75 75 + -

Aureobacterium kitaminense (AB013919; 99%) 2 G B + 50 - + 50 - + + - - - - - - - - - - 50 + + - -

Microbacterium arborescens (AY649756; 97%) 2 L B, O + - - - - - - - + - - - - - - - - - + + - + -

1. táblázat

rövidítések: T, Lángi-tisztás; G, Gárdony; F, Fürdető; A, Horikoshi-féle alkalikus táptalaj; B, King B táptalaj; O, Caulobacter táptalaj; T, TSY táptalaj; +, 100 % pozitív; -, 100% negatív

fenotípusos tesztek: 1 Gram reakcó; 2 oxidáz; 3 kataláz; 4 D-glükóz oxidatív (24h); 5 D-glükóz fermentatív (24h) ; 6 gáztermelés D-glükóz fermentáció közben ; 7 D-glükóz oxidatív (1 hét) ; 8 D-glükóz fermentatív (1 hét); 9ammonifikáció; 10 mozgás; 11 H2S ciszteinből; 12 indol triptofánból; 13 NO3

- redukciója NO2--té; 14 NO3

- redukciója N2-né ; 15 NO3- redukciója NH3-vá; 16 metilvörös reakció; 17 Voges-Proskauer reakció; 18 eszkulin hidrolízis; 19

kazein hidrolízis; 20 zselatin hidrolízis; 21 keményítő hidrolízis; 22 tween 80 hidrolízis; 23 cellulózbontás

A Velencei-tó három mintavételi területéről származó nád biofilm mintákból 2000. áprilisában kitenyésztett baktériumtörzsek fenotípusos jellemzése az ARDRA vizsgálatukat követően kialakított törzscsoportok szerint, teszteredményeik százalékos formában való feltüntetésével, valamint az egyes ARDRA csoportok reprezentánsainak 16S rDNS parciális szekvencia-analízise alapján történt identifikáció.

törzsek származásatörzsek száma

fenotípusos sajátságok

135

legközelebbi rokon faj/nemzetség

(parciális 16S rDNS szekvencia hasonlóság) minta táptalaj 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Bacillus pumilus ( AJ458441; 99%) 59 F, G, L A, B, O, T 53 36 39 61 46 - 98 95 3 31 5 - 2 - 10 73 25 + 78 80 12 25 -

Bacillus cereus (AB257305; 100%) 2 L A, B + - + + - - + + - - - - + - - 50 50 + - + + - -

Bacillus licheniformis (AB039328; 99%) 1 L T + - - - - - + + - + - - + - - - - + - + - - -

Bacillus firmus (AF526919; 99%) 6 F, G, L A, O, T 50 83 + 33 17 - 83 33 - 83 17 - 17 - 50 17 17 67 83 + 83 - -

Bacillus fusiformis (AY548954; 97-100%) 5 F, G, L B, T + - + - - - 40 - 40 20 20 - 20 - 20 - - 60 20 20 40 40 -

Marinibacillus marinus (AJ237708; 99%) 2 G A + + + - - - - - 50 50 + - - - - - - 50 + + + - -

Marinibacillus campisalis (AY190535; 98%) 8 F, G, L B, O, T 75 - + - - - 13 - - 25 - - 25 13 - - - 63 + + 75 - -

Rhodococcus erythropolis (AF420422; 99%) 22 F, G, L A, B, O, T 77 23 77 - - - 4 - 95 - 32 - 9 - - - - 23 - 32 - 4 -

Micrococcus sp. (AJ313024; 99%) 24 F, G, L A, O, T + 21 + - - - 17 - 13 4 - - - - - 4 - 17 + 96 - 46 -

Microbacterium flavescens (AB004716; 98%) 1 L B + - - + - - + + - - - - - - - + - + + + - - -

Microbacterium sp. (AJ876685; 99%) 27 F, G, L A, B, O, T 67 48 96 33 4 - + 89 - 15 - - 7 - 44 74 41 + 96 96 4 56 -

Aureobacterium kitaminense (AB013920; 99%) 3 F, L B, O + - 33 33 - - + 67 - - - - - - - + - + 33 + 67 - -

Arthrobacter ramosus (X80742; 97%) 9 G, L A, B, O, T 78 11 11 - - - - - - - 22 - 11 - - 44 11 89 + 89 - - -

Kocuria rosea (DQ060382; 99%) 2 L A, O + - + - - - + + - - - - 50 - - - 50 - - - - - -

Kocuria palustris (AJ536438; 100%) 9 F, G, L A, O, T 89 22 + - - 11 78 56 22 - - - 89 - - - - 11 - 11 56 22 -

Rhodobacter sp. (U63934; 98%) 28 F, G, L A, B, O, T - 21 93 - - - 32 7 - 7 7 - 4 - - 11 - 79 4 - - 18 -

Defluvibacter lusatiae (AJ132378; 98%) 2 L A - + + - - - + - - - + - - - - + 50 + - - - - -

Klebsiella pneumoniae (AY043391; 99%) 3 F, G, L B - - 67 + + 33 + + - 67 - - 67 - - 67 - + - - - 33 -

Serratia marcescens (AY043387; 98%) 5 G, L A, B, T - 60 80 80 80 - + + - - 20 - 80 - - 40 40 + 60 40 - 20 -

Pseudomonas putida (AF095892; 97%) 8 G, L B, O, T - 38 38 - - - 75 - 38 88 13 - 25 - - - - - 50 13 13 + -

Pseudomonas gessardii (AF074384; 100%) 9 F, L B, O, T - 44 78 78 - - 78 22 22 44 - - 89 - 11 - - 33 + 44 - 89 -

Aeromonas salmonicida (AF541929; 99%) 15 F, G, L A, B, O, T - 93 27 + + 60 + + - + 13 47 87 - 40 13 47 60 + 80 93 + -

Aeromonas popoffii (AJ223180; 99%) 1 F T - + + + + - + + - + - + - - + + - - + + + + -

2.táblázat

A Velencei-tó hátom mintavételi területéről származó nád biofilm mintákból 2001. júliusában kitenyésztett baktériumtörzsek fenotípusos jellemzése az ARDRA vizsgálatukat követően kialakított törzscsoportok szerint, teszteredményeik százalékos formában való feltüntetésével, valamint az egyes ARDRA csoportok reprezentánsainak 16S rDNS parciális szekvencia-analízise alapján történt identifikáció.

törzsek származása

fenotípusostesztek: 1 Gram reakcó; 2 oxidáz; 3 kataláz; 4 D-glükóz oxidatív (24h); 5 D-glükóz fermentatív (24h) ; 6 gáztermelés D-glükóz fermentáció közben ; 7 D-glükóz oxidatív (1 hét) ; 8 D-glükóz fermentatív (1 hét); 9ammonifikáció; 10 mozgás; 11 H2S ciszteinből; 12 indol triptofánból; 13 NO3

- redukciója NO2--té; 14 NO3

- redukciója N2-né ; 15 NO3- redukciója NH3-vá; 16 metilvörös reakció; 17 Voges-Proskauer reakció; 18 eszkulin hidrolízis;

19 kazein hidrolízis; 20 zselatin hidrolízis; 21 keményítő hidrolízis; 22 tween 80 hidrolízis; 23 cellulózbontásrövidítések: L, Lángi-tisztás; G, Gárdony; F, Fürdető; A, Horikoshi-féle alkalikus táptalaj; B, King B táptalaj; O, Caulobacter táptalaj; T, TSY táptalaj; +, 100 % pozitív; -, 100% negatív

törzsek számafenotípusos sajátságok

136

legközelebbi rokon faj/nemzetség (parciális 16S rDNS szekvencia hasonlóság) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Paracoccus carotinifaciens (AB006899) 7 A - 50 + 17 17 - 17 17 33 50 - - - - 17 - - + - 50 - 67 -Agrobacterim albertimagni (DQ363142) 1 A - - + - + - + + + + - - - - + - - + - - - + -Hydrogenophaga taeniospiralis (AF078768; 97%) 2 B, O - 50 50 - - - - - 50 + - - - - - - - - - - - - -Acidovorax delafieldii (AF332187; 99%) 4 B, O - 25 50 25 - - 25 - + + - - - - 25 - - 25 25 25 25 + -Acidovorax temperans (AY880181; 99%) 2 O - 50 - - - - - - + + - - - - - - - - - 50 - + -Yersinia aldovae (AJ871363; 99%) 2 B - - + + + + + + - + - 50 + - 50 + + + - - - + -Pseudomonas anguilliseptica (AF439803; 99%) 1 B - + + - - - - - + + - + + - + - - - + - - - -Yersinia intermedia (AF366380; 99%) 1 O - - + + + - + + - + - + + - - + + + - - - + -Pseudomonas anguilliseptica (AM263519; 99%) 4 O - 50 75 25 - - 75 25 50 75 50 - 50 - 50 - - 25 + 75 25 + -Pseudomonas stutzeri (U65012; 99%) 2 T - + 50 - - - - 50 + + 50 - 50 50 + - - - 50 50 50 + -Pseudomonas fluorescens (DQ439976; 99%) 3 O, T - 67 67 - - - 33 - 33 33 67 - - - - 33 - - 67 67 - + -Sphingobacterium sp. (AY571816; 98%) 3 O 33 33 + - - - - - 33 33 - - 33 - 33 - - 67 - 33 - 33 -Flavobacterium pectinovorum (AM230490; 96%) 6 O, T 67 67 + 50 - - 67 17 - 67 33 - - 83 + 17 - 33 17 50 67 + -Nesterenkonia luteus (AY588278; 99%) 5 B, T + 20 + - - - - - - 20 - - - - - 20 - - 20 - - - -Nesterenkonia sandarakina (AY588277; 98%) 4 A + - + - - - - - - - - - - - - - - + - - - + -Plantibacter flavus (AY275509; 98%) 1 B + - + - - - - - - - - - - - - - - + - - - + -Cellulomonas flavigena (AF140036; 96%) 4 B + 25 75 - - - - - - 75 - - - - - - - 50 - 25 - - +Cellulomonas flavigena (AF140036; 96%) 1 B + - + - - - - - - + - - - - - - - + - + - + +Cellulomonas terrae (AY884570; 97%) 1 A + - + - - - - - - - + - - - + - - + + + + + +Streptomyces flavofungini (EF571003; 98%) 1 T + - + - - - - - - - - - - - - - - 50 - 25 50 - -Arthrobacter agilis (AF440440; 96%) 4 T + 25 75 - - - - - - 75 - - - - - - - 50 - 25 - - -Sanguibacter antarcticus (EF211071; 98%) 2 T + - + - - - - - - 50 - - - - - 50 - + - + - - -Sanguibacter marinus (AJ783958; 97%) 1 T + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - + -Dietzia natronolimnea (AJ717374; 99%) 1 A + - - - - - - - - - - - - - - + - + - - - + -Kocuria rosea (AM397645; 98%) 2 A + - + - - - - - - - - - - - - - - + - 50 - 50 -Bacillus licheniformis (EF423608; 99%) 2 B + - + 50 50 - 50 + - + - - + 50 + + + + - + - + -Bacillus firmus (DQ089748; 98%) 1 O + - + - - - + - + + - - - - + - - + + + - + -Bacillus firmus (DQ089748; 98%) 4 T 75 25 75 - - - - - 25 25 - - - - 50 - - 50 50 + - 50 -Bacillus horikoshii (DQ363137; 98%) 1 T + - + - - - + - + + - - - - - - - + + + - + -Bacillus horikoshii (DQ363137; 98%) 1 T + + + - - - - - - + - - - - - - - - - + - - -Bacillus horikoshii (DQ363137; 98%) 3 A + 33 + 33 33 - 33 33 - 33 - - + - - - - - 33 + 33 + -Planococcus maritimus ( DQ333301; 98%) 1 T + - + - - - - - - + - - - - - - - 50 - + - 50 -Planococcus maritimus ( DQ333301; 98%) 2 A, T + - + - - - - - - + - - - - - - - 50 - + - 50 -

3.táblázat

A Kelemen-székről származó nád biofilm mintából 2004. áprilisában kitenyésztett baktériumtörzsek fenotípusos jellemzése az ARDRA vizsgálatukat követően kialakított törzscsoportok szerint, teszteredményeik százalékos formában való feltüntetésével, valamint az egyes ARDRA csoportok reprezentánsainak 16S rDNS parciális szekvencia-analízise alapján történt identifikáció.

fenotípusos tesztek: 1 Gram reakcó; 2 oxidáz; 3 kataláz; 4 D-glükóz oxidatív (24h); 5 D-glükóz fermentatív (24h) ; 6 gáztermelés D-glükóz fermentáció közben ; 7 D-glükóz oxidatív (1 hét) ; 8 D-glükóz fermentatív (1 hét); 9 ammonifikáció; 10 mozgás; 11 H2S ciszteinből; 12 indol triptofánból; 13 NO3

- redukciója NO2--té; 14 NO3

- redukciója N2-né ; 15 NO3- redukciója NH3-vá; 16 metilvörös reakció; 17 Voges-Proskauer reakció; 18

eszkulin hidrolízis; 19 kazein hidrolízis; 20 zselatin hidrolízis; 21 keményítő hidrolízis; 22 tween 80 hidrolízis; 23 cellulózbontásrövidítések: A, Horikoshi-féle alkalikus táptalaj; B, King B táptalaj; O, Caulobacter táptalaj; T, mesterséges tengervizes táptalaj; +, 100 % pozitív; -, 100% negatív

törzsek száma táptalajfenotípusos sajátságok

137

legközelebbi rokon faj/nemzetség (parciális 16S rDNS szekvencia hasonlóság) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Paracoccus carotinifaciens (AB006899; 99%) 14 A, O - 57 + - - - 50 - 21 43 14 - 7 - 14 7 - 43 - 86 7 93 -

Afipia sp. (AJ864853; 99%) 3 O - 33 + - 33 - + - 33 33 67 - - - - - - 67 33 67 - 67 -

Xanthomonas campestris (AF123092; 96%) 1 O - + + - - - + - + + + - - - - - - + + + - + -

Halomonas alkantarctica (AJ564880; 97%) 1 T - + + + - - + + - + - - + - - - - - - + - + -

Shewanella putrefaciens (X81623; 98%) 3 T - + + - - - - 33 67 67 33 - 33 - 33 - - - 33 + - + -

Pseudomonas marginalis (AM263525; 99%) 2 B, O - 50 + 50 - - 50 50 - 50 50 - 50 - 50 50 - 50 + + - 50 -

Acinetobacter lwoffii (AM284986; 98%) 3 B, O - 67 67 33 33 - 33 33 33 33 - - 33 - 33 33 - 33 67 + 67 + -

Nesterenkonia sandarakina (AY588277; 99%) 9 A, T + - + - 11 - 67 11 22 - - - - - - 56 - - 11 33 - 33 -

Nesterenkonia sandarakina (AY588277; 99%) 13 A, B, O, T + - + - 8 - 92 8 - - - - 8 - 8 15 - 31 - 15 - - -

Nesterenkonia halophila (AY820953; 96%) 1 A + - + - - - - - - - - - - - - + - - - - - - -

Microbacterium ginsengisoli (AB271048; 98%) 3 B, O + - + - - - + - - 50 - - - - - - - + - - - - -

Microbacterium oxydans (AM237353; 99%) 2 B + - + - - - + - - 50 - - - - - - - + - - - - -

Microbacterium testaceum (DQ122218; 99%) 3 B, O + - + - - - - - - + - - + - - - - - - + - - -

Cellulomonas flavigena (AF140036; 97%) 1 B + - + - - - - - - + - - + - - - - - - + - - +

Nocardiopsis exhalans (AB368714; 99%) 4 T 75 25 + - - - 75 - 25 25 75 - - - - - - - 25 + - + -

Jeotgallibacillus (AF281158; 96%) 1 T + - + - - - + - - + - - - - - - - - - + - + -

Bacillus firmus (EF032672; 97%) 1 T + - + + + - + + - + - - - - - - - - - - - - -

Planococcus maritimus (DQ333301; 98%) 5 T 50 50 + - 25 - 25 25 50 + - - - - 50 - - 50 - 75 50 75 -

Planococcus southpolaris (AJ314745; 97%) 1 O + - + - - - - + - + + - - - + - - + + + - + -

Staphylococcus lentus (D83370; 99%) 1 T + - + - - - - + + - + - + - + - - - + + - + -

4.táblázat

törzsek száma táptalajfenotípusos sajátságok

fenotípusos tesztek: 1 Gram reakcó; 2 oxidáz; 3 kataláz; 4 D-glükóz oxidatív (24h); 5 D-glükóz fermentatív (24h) ; 6 gáztermelés D-glükóz fermentáció közben ; 7 D-glükóz oxidatív (1 hét) ; 8 D-glükóz fermentatív (1 hét); 9 ammonifikáció; 10 mozgás; 11 H2S ciszteinből; 12 indol triptofánból; 13 NO3

- redukciója NO2--té; 14 NO3

- redukciója N2-né ; 15 NO3- redukciója NH3-vá; 16 metilvörös reakció; 17 Voges-Proskauer reakció; 18

eszkulin hidrolízis; 19 kazein hidrolízis; 20 zselatin hidrolízis; 21 keményítő hidrolízis; 22 tween 80 hidrolízis; 23 cellulózbontásrövidítések: A, Horikoshi-féle alkalikus táptalaj; B, King's B táptalaj; O, Caulobacter táptalaj; T, tengervizes táptalaj; +, 100 % pozitív; -, 100% negatív

A Nagy-Vadasról származó nád biofilm mintából 2004. áprilisában kitenyésztett baktériumtörzsek fenotípusos jellemzése az ARDRA vizsgálatukat követően kialakított törzscsoportok szerint, teszteredményeik százalékos formában való feltüntetésével, valamint az egyes ARDRA csoportok reprezentánsainak 16S rDNS parciális szekvencia-analízise alapján történt identifikáció.

138

ARDRA csoport klónjainak száma legközelebbi rokon nemzetség/faj szekvencia

hasonlóság

4 környezeti klón (EF220748) 99% (414/418)1 környezeti klón (DQ432405) 98% (400/408)

5 környezeti klón (AF418951) 99% (413/415), 97% (390/401)

3 környezeti klón (EF540429) 98% (410/416)3 Sphingomonas kaistensis ( AY785128) 98% (422/428)

2 tenyésztésbe nem vont Rickettsiales batérium klón (DQ223223) 99% (436/439)

3 Aquabacterium sp. (EF179861) 98% (470/485)3 környezeti klón (DQ501338) 98% (465/473)3 környezeti klón (EF417647) 97% (467/477)

3 tenyésztésbe nem vont Mehylophilaceae baktérium klón (AY338037) 96% (451/466)

1 Lysobacter niastensis ( DQ462462) 98% (469/478)7 környezeti klón (DQ351758) 97% (500/514)

1 tenyésztésbe nem vont Xanthomonadaceae baktérium klón (EF019778) 97% (481/494)

3 tenyésztésbe nem vont Sphingobacteria baktérium klón (EF520603) 98% (464/473)

2 Flavobacterium sp. (DQ530100) 97% (462/475)

2 tenyésztésbe nem vont Bacteriodetes baktérium klón (AM157589) 96% (474/489)

3 Flexibacter ruber (M58788) 97% (451/461)2 Haliscomenobacter hydrossis ( AJ784892) 98% (458/467)

4 tenyésztésbe nem vont Bacteriodetes baktérium klón (AJ318142) 95% (451/470)

3 tenyésztésbe nem vont Sphingobacteria baktérium klón (DQ003154) 98% (465/470)

4 tenyésztésbe nem vont Sphingobacteria baktérium klón (EF520596) 96% (470/485)

5 tenyésztésbe nem vont Bacteriodetes baktérium klón (DQ917823) 97% (438/450)

Chlorobi (zöld kén baktériumok) 2 környezeti klón (EF203206) 98% (464/470)

Chloroflexi (zöld nem kén baktériumok) 1 tenyésztésbe nem vont Chloroflexi baktérium klón

(EF220771) 96% (444/458)

Spirochaetes 3 környezeti klón (AY940555) 98% (425/433)

Verrucomicrobia 1 tenyésztésbe nem vont Verrucomicrobia baktérium klón (EF220751) 99% (476/478)

2 tenyésztésbe nem vont Gemmatimonadetes baktérium klón (EF220497) 98% (439/444)

3 tenyésztésbe nem vont Gemmatimonadetes baktérium klón (DQ828292) 98% (470/477)

14 97% (392/402)9 99% (386/387)8 cianobacterium klón (AY580403) 98% (412/418)7 cianobacterium klón (DQ289925) 97% (434/447)4 kiméra1 kiméra3 kiméra1 kiméra

A velencei-tavi Lángi-tisztás nád biofilmjéből száramzó klónok ARDRA-csoportosításának, valamint a reprezentáns klónok parciális 16S rDNS szekvencia analízisén alapuló identifkációjának eredményei

5.táblázat

kloroplaszt

cianobaktérium klónok

Bacteriodetes

α-proteobaktériumok

β-proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

Gemmatimonadetes

139

ARDRA csoport klónjainak száma legközelebbi rokon nemzetség/faj szekvencia

hasonlóság

3 Agrobacterium sp. (AY826532) 98% (406/403)

6 Agrobacterium sanguineum (AB062106) 99% (410/414)

3 környezeti klón (EF029254) 98% (407/415)

környezeti klón (AF236002) 97% (404/415)

2 Hydrogenophaga atypica (AJ585992) 97% (446/459)

2 Hydrogenophaga taeniospiralis (AY771764) 98% (427/434)

3 Dechloromonas denitrificans (AJ318917) 98% (448/454)

3 Dechloromonas hortensis (AY277621) 98% (459/466)

4 Pelomonas saccharophila (AB021407) 98% (424/432)

2 tenyésztésbe nem vont Comamonadaceae baktérium klón (EF370588) 97% (428/440)

2 környezeti klón (DQ066963) 97% (428/441)

5 Rheinheimera sp. (EF575565) 98% (441/449)

Rheinheimera aquimaris (EF076758) 97% (347/357)

1 Rheinheimera chironomi (DQ298025) 98% (419/425)

4 Rheinheimera chironomi (DQ298025) 98% (398/404)

1 Rheinheimera sp. (EF575565) 98% (406/414)

4 környezeti klón (AF141439) 97% (394/404)

4 Cellvibrio gandavensis (AJ289162) 99% (413/414)

3 Aquimonas voraii (AY544768) 98% (429/435)

4 Dyadobacter fermentans (AF137029) 97% (370/379)

4 Palucidibacter propionicigenes (AB078842) 98% (423/429)

6 tenyésztésbe nem vont Bacteriodetes sp. klón (AJ534686) 94% (403/425)

2 Flavobacterium hibernum (AJ251068) 98% (299/305)

2 Gelidibacter sp. (AY259512) 97% (427/437)

3 környezeti klón (AY043735) 98% (406/414)

1 környezeti klón (AB297423) 97% (429/442)

4 Sphingobacterium sp. (AY571816) 98% (439/447)

Pedobacter insulae (EF100697) 97% (433/446)

3 Flavobacterium sp. (AJ876670) 97% (447/457)

4 tenyésztésbe nem vont Flavobacteria baktérium klón (AM279209) 97% (450/462)

1 Flavobacterium sp. (AJ876670) 97% (446/458)

Aktinobaktériumok (nagy G+C tartalmú Gram-pozitív 3 Arthrobacter agilis (EF010549) 97% (367/375)

Fibrobacter/Acidobacteria csoport 4 környezeti klón (AJ232823) 98% (442/448)

β-proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

Bacteriodetes

α-proteobaktériumok

6.táblázat

A Kelemen-szék nád biofilmjéből száramzó klónok ARDRA-csoportosításának, valamint a reprezentáns klónok parciális 16S rDNS szekvencia analízisén alapuló identifkációjának eredményei

140

ARDRA csoport klónjainak száma legközelebbi rokon nemzetség/faj szekvencia

hasonlóság

6 Sphingomonas jaspsi (AB264131) 98% (382/389)

6 Agrobacterium albertimagni (DQ363142) 98% (428/436)

4 Agrobacterium sanguineum (DQ363139) 99% (401/402)

4 Agrobacterium albertimagni (DQ363142) 97% (405/417)

7 Paracoccus sp. (AJ309981) 97% (422/434)

Paracoccus carotinifaciens (AB006899) 96% (419/432)

4 környezeti klón (AJ888555) 97% (389/400)

4 Hydrogenophaga teinospiralis (AF078768) 98% (396/402)

2 Hydrogenophaga defluvii (AJ585993) 98% (470/476)

3 környezeti klón (AY546509) 97% (401/410)

4 Malikia spinosa (AB021387) 96% (391/404)

6 Polaromonas aquatica (AM039830) 98% (384/390)

3 Aquabacterium honkongensis (DQ489306) 98% (411/418)

3 Ideonella sp. (DQ664241) 97% (457/471)

1 tenyésztésbe nem vont Ideonella sp. baktérium klón (AY435508) 98% (463/472)

4 Ideonella sp. (AB211233) 94% (402/425)

3 Hydrogenophaga atypica (AJ585992) 99% (467/471)

1 környezeti klón (AY678517) 97% (468/479)

5 környezeti klón (AJ810621) 98% (392/399)

3 Cellvibrio vulgaris (AF448513) 96% (406/419)

5 Aquimonas voraii (AY544768) 99% (440/443)

3 Rheinheimera sp. (EF575565) 100% (434/434)

Rheinheimera chironomi (DQ298025) 97% (421/430)

11 Flavobacterium columnare (AJ491824) 99% (419/421)

3 Flavobacterium filum (DQ372981) 98% (410/417)

2 Flavobacterium kamogawaensis (AB275999) 92% (427/463)

3 Fluviicola taffensis (AF493694) 97% (407/418)

5 tenyésztésbe nem vont Bacteriodetes sp. Baktérium klón (DQ463716) 97% (433/443)

16 Algoriphagus halophilus (AY264839) 96% (337/350)

Chloroflexi csoport 2 tenyésztésbe nem vont Chloroflexi baktérium klón (AY921893) 97% (420/432)

α-proteobaktériumok

α-proteobaktériumok

α-proteobaktériumok

Bacteriodetes

7.táblázat

A Nagy-Vadas nád biofilmjéből száramzó klónok ARDRA-csoportosításának, valamint a reprezentáns klónok parciális 16S rDNS szekvencia analízisén alapuló identifkációjának eredményei

141