ANKARA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

PATLICAN (Solanum melongena) TOHUMLARINDA BAKIR (Cu) STRESİ İLE

OLUŞAN DNA DEĞİŞİKLİKLERİNİN BELİRLENMESİ

Didem AKSOY

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ANKARA

2009

Her hakkı saklıdır

TEZ ONAYI

Didem AKSOY tarafından hazırlanan ‘Patlıcan (Solanum melongena) Tohumlarında

Bakır (Cu) Stresi ile Oluşan DNA Değişikliklerinin Belirlenmesi’ adlı tez çalışması

20.02.2006 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen

Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul

edilmiştir.

Danışman : Doç. Dr. Sümer ARAS

Jüri Üyeleri :

Başkan : Doç. Dr. Özlem YILDIRIM

Ankara Üniversitesi, Biyoloji Anabilim Dalı

Üye : Doç. Dr. E. Sümer ARAS

Ankara Üniversitesi, Biyoloji Anabilim Dalı

Üye : Doç. Dr. Emel EMREGÜL

Ankara Üniversitesi, Kimya Anabilim Dalı

Yukarıdaki sonucu onaylarım.

Prof. Dr. Orhan ATAKOL

Enstitü Müdürü

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

PATLICAN (Solanum melongena) TOHUMLARINDA BAKIR (Cu) STRESİ İLE

OLUŞAN DNA DEĞİŞİKLİKLERİNİN BELİRLENMESİ

Didem AKSOY

Ankara Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü

Biyoloji Anabilim Dalı

Danışman: Doç. Dr. E. Sümer ARAS

Ağır metal kontaminasyonu dünyada önemli bir çevresel problemdir. Yüksek konsantrasyonlardaki ağır metaller hücrelerde ve dokularda toksik hasarlara neden olur. Bu çalışmada, bakır (Cu) kontaminasyonuna maruz kalan patlıcan (Solanum melongena L.) tohumlarında meydana gelen etkilerin moleküler ve populasyon seviyelerinde belirlenmesi amaçlanmıştır. Artan Cu konsantrasyonuyla patlıcan tohumlarının kökünde büyümenin engellendiği ayrıca kuru ağırlık ve toplam çözünür protein içeriğinde azalma belirlenmiştir. Ekotoksikolojide, RAPD analizi bitkiler için uygun bir biobelirteç olarak kabul edilmektedir. RAPD analizi için, 9 RAPD primerinin özgün polimorfik bant paterni gösterdiği bulunmuştur ve bunu takiben patlıcan tohumlarının kontrollerinin köklerinde belirlenen toplam 80 bant kullanılmıştır. Cu kontaminasyonundan sonra kontrol tohumlarına göre RAPD profilindeki değişiklikler çeşitli bant kazancı ve/veya kaybı içermiştir. Bu sonuçlar belirtmiştir çeşitli bakır konsantrasyonlarında RAPD profiline göre genomik kalıp stabilitesi değişmiştir ve bu sonuç, kuru ağırlık, toplam çözünür protein ile karşılaştırılmıştır. Moleküler ve populasyon seviyelerindeki parametrelerin ölçümü ağır metallerin etkilerinin araştırılması için önemlidir.

Şubat 2009, 44 sayfa

Anahtar Kelimeler: Patlıcan, ağır metal, RAPD, toplam çözünür protein

i

ABSTRACT

Master Thesis

IDENTIFICATION OF DNA CHANGES IN EGGPLANT (AUBERGINE) (Solanum melongena)

SEEDLINGS INDUCED BY COPPER STRESS

Didem AKSOY

Ankara University

Graduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Biology

Supervisor: Assoc. Prof. Dr. E. Sümer ARAS

Heavy-metal contamination is an important environmental problem in the world. High concentrations of heavy metals cause toxic damages to cells and tissues. In this study the effects occuring at molecular and population levels in eggplant (Solanum melongena L.) seedlings exposed to copper (Cu) contamination was aimed to be determined. Inhibition of root growth, reduction in dry weight and total soluble protein content in root of aubergine seedlings were observed with the ascending Cu concentrations. In ecotoxicology, RAPD analysis was applied as a suitable biomarker for plants. For the RAPD analyses, 9 RAPD primers were found to produce unique polymorphic band patterns and subsequently were used to produce a total of 80 bands in the control root of eggplant seedlings. The changes in RAPD profiles of root after Cu contamination was included variations as gain and/or loss of bands compared with the control seedlings. These results were suggested that genomic template stability changed in RAPD profiles and this result was compared with the growth, dry weight and total soluble protein at various Cu concentrations. The measurements of parameters at molecular and population levels are valuable for investigating the effects of heavy metals.

February 2009, 44 pages

Key Words: Eggplant, heavy metal, RAPD, total soluble protein

ii

TEŞEKKÜR

Bu tezin hazırlanmasında her konuda yardımcı olan Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi

Biyoloji Bölümü ve değerli hocam Doç. Dr. E. Sümer ARAS’a içtenlikle teşekkür ederim.

Hiçbir zaman yardım ve desteklerini esirgemeyen aileme, Dr. Mehlika BENLİ, Dr. Ayşegül

ERSAYIN YAŞINOK, D.Sinan KÖRPE, Dr. Demet CANSARAN DUMAN, Zeynep

KILIÇ ve arkadaşlarıma teşekkür ederim.

Didem AKSOY

Ankara, Şubat 2009

iii

İÇİNDEKİLER

ÖZET…………………………………………………………………………………….......i

ABSTRACT…………………………………………………………………………….......ii

TEŞEKKÜR……………………………………………………………………………….iii

SİMGELER DİZİNİ………………………………………………………………………vi

ŞEKİLLER LİSTESİ…………………………………………………………………......vii

ÇİZEGELER LİSTESİ………………………………………………………………….viii

1. GİRİŞ…………………………………………………………………………………….1

1.1 Çevre Kirliliği ve Etkileri……………………………………………………………...1

2. KURAMSAL TEMELLER……………………………………………………………..8

2.1 Moleküler Belirteçler………………………………………………………………......8

2.1.1 Hibridizasyona dayalı DNA belirteçleri…………………………………………….9

2.1.1.1 RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism – Restriksiyon

Parça Uzunluk Farklılığı)………………………………………………………….9

2.1.2 PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)’a Dayalı DNA Belirteçleri…………….......10

2.1.2.1 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Çoğaltılmış

Parça Uzunluk Farklılığı)……………………………………………...................10

2.1.2.2 SSR (Simple Sequence Repeat – Basit Dizi Tekrarları)……………………......11

2.1.2.3 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region – Dizin

Karakterli Çoğaltılmış Bölge)……………………………………………………12

2.1.2.4 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – Rastgele Çoğaltılmış

DNA Farklılığı)…………………………………………………………………...12

3. MATERYAL VE YÖNTEM………………………………………………………......14

3.1 Materyal……………………………………………………………………………….14

3.2 Yöntem………………………………………………………………………………...14

3.2.1 Tohum yüzey sterilizasyonu……………………………………………………......14

3.2.2 Çimlendirme yöntemi………………………………………………………………14

iv

3.2.3 Ölçüm ve analizler…………………………………………………………………..15

3.2.3.1 Bitki kök boyu ve kuru ağırlık tayini……………………………………………15

3.2.3.2 Toplam çözünür protein içeriğinin belirlenmesi……………………………......15

3.2.3.3 DNA izolasyonu………………………………………….......................................16

3.2.3.4 RAPD uygulamaları………………………………………………………………17

3.2.3.4.1 RAPD bileşenleri ve koşulları………………………………………………….18

3.2.3.4.2 Agaroz jel elektroforezi………………………………………………………...19

3.2.3.5 Veri analizleri…………………………………………………………………......19

3.2.3.5.1 İstatistiksel analizler……………………………………………………………19

3.2.3.5.2 Genomik Kalıp Stabilitesi (GKS)……………………………………………...19

4. BULGULAR……………………………………………………………………………20

4.1 Erken Fide Gelişim Evresinde Patlıcan Bitkisinin Kök Büyümesi Üzerine

Bakır Stresinin Etkisi…………………………………………………………………20

4.2 Erken Fide Gelişim Evresinde Patlıcan Bitkisinin Kök Kuru Ağırlığı Üzerine

Bakır Stresinin Etkisi…………………………………………………………………21

4.3 Bakır Stresinin Patlıcan Bitkisinin Protein Miktarına Etkisi………………….......23

4.4 Bakır Stresinin Patlıcan Bitkisinde RAPD-PCR Sonuçlarına Etkisi……………...23

4.5 Bakır stresine maruz kalmış örneklerin populasyon Parametrelerinin

istatistiksel analizi…………………………………………………………………….30

4.6 RAPD profili ve kök uzunluğu, kuru ağırlığı, toplam çözünür protein

miktarının karşılaştırılması…………………………………………………………..32

5. TARTIŞMA VE SONUÇ………………………………………………………………33

KAYNAKLAR…………………………………………………………………………….38

EK Toplam Çözünür Protein Standardı…………………………………………….......43

ÖZGEÇMİŞ……………………………………………………………………………….44

v

SİMGELER DİZİNİ

AFLP Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi (Amplified Fragment Lenght

Polymorphism)

BSA Bovine Serum Albumin

CTAB Setil Trimetil Amonyum Bromür

dNTP Deoksinukleotid trifosfat

EDTA Etilen Daimin Tetraasetik Asit

GKS Genomik Kalıp Stabilitesi

PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction)

PVPP Polivinil Polipirolidon

RAPD Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (Random

Amplified Polymorphic DNA)

RFLP Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment

Lenght Polymorphism)

SCAR Dizin Karakterli Çoğaltılmış Bölge (Sequence Characterized

Amplified Region)

SSR Basit Dizi Tekrarları (Simple Sequence Repeats)

TBE Tris Borat EDTA

TE Tris EDTA

vi

ŞEKİLLER LİSTESİ

Şekil 1.1 Hidroksil radikalinin oluşumu ve etkileri…………………………………………3

Şekil 1.2 Hidroksil radikalinin hücreye etkileri…………………………………………......4

Şekil 4.1 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere

ait kök uzunlukları………………………..………………………………………20

Şekil 4.2 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere

bakır metalinin kök uzunluğuna etki oranları……………………………………21

Şekil 4.3 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere

ait kök kuru ağırlıkları……………………………………………………………21

Şekil 4.4 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere

bakır metalinin kök kuru ağırlığına etki oranları………………………………...22

Şekil 4.5 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere

ait kök toplam çözünür protein miktarı…………………………………………..22

Şekil 4.6 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen

örneklere bakır metalinin kök toplam çözünür protein miktarına etki oranları….23

Şekil 4.7 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere

ait polimorfizm oranları………………………………………………………….24

Şekil 4.8 Tube A 07 primeri……………………………………………………………….26

Şekil 4.9 Tube A 09 primeri……………………………………………………………….26

Şekil 4.10 Tube A 11 primeri……………………………………………………………...27

Şekil 4.11 Tube A 12 primeri……………………………………………………………...27

Şekil 4.12 Tube A 16 primeri……………………………………………………………...28

Şekil 4.13 Tube A 17 primeri……………………………………………………………...28

Şekil 4.14 Tube A 18 primeri……………………………………………………………...29

Şekil 4.15 Tube A 20 primeri……………………………………………………………...29

Şekil 4.16 Tube C 01 primeri……………………………………………………………...30

Şekil 4.17 Örneklere RAPD profili ve kök uzunluğu, kuru ağırlığı, toplam çözünür

protein miktarının karşılaştırılması……………………………………………..32

vii

ÇİZGELER LİSTESİ

Çizelge 1.1 Ağır metallerin çevreye yayınımında en etkin olan endüstriyel faaliyetler…….1

Çizelge 3.1 Nanodrop sonuçları……………………………………………………………16

Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan primerler ve dizi bilgileri………………………………18

Çizelge 4.1 Örneklere ait bant farklılıkları………………………………………………...25

Çizelge 4.2 Populasyon parametrelerinin istatistiksel analizi……………………………...31

viii

1

1. GİRİŞ

1.1 Çevre Kirliliği ve Etkileri

Günümüzde sanayileşme, hızlı nüfus artışı ile oluşan su ve toprak kirliliği ciddi boyutlarda

tehlike oluşturmaktadır. ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA)’nın hazırladığı 129 tane

öncelikli çevre kirleticileri arasında yer alan ağır metaller, en önemli çevre kirletici

gruplardan birini oluşturmaktadır.

Volkanik faaliyetler, maden eritme ve işleme tesislerinin katı atıkları, fabrika ve termik

santrallerin bacasından çıkan uçucu küller, atık su arıtma çamurları, otoyollarda araçlardan

salınan benzin, balata ve lastik kökenli atıklar, tarım ilaçları ve gübreler, pil vb. endüstri

ürünlerinin gelişi güzel atılması ağır metal kirliliğinin nedenleri arasında yer alır.

Çizelge 1.1 Ağır metallerin çevreye yayınımında en etkin olan endüstriyel faaliyetler (Kalamak 2006)

Endüstriyel atık sularla sulanan tarım alanlarında yetişen bitkilerde ürün kayıpları, hasarlar

görülmektedir; bu tarım ekonomisine ve besin zinciri yoluyla insan sağlığına zarar

vermektedir.

Yoğunluğu 5 g/cm3’ten büyük olan veya atom ağırlığı 50 ve daha büyük olan elementlere

ağır metal denir. Ağır metallerden demir, bakır, çinko, mangan, molibden, kobalt bitkiler

için gerekli elementlerdir ve esansiyel elementler denir. Esansiyel elementler kofaktör

olarak birçok enzim sistemi için gereklidir, biyomoleküllerin yapısal stabilizasyonuna

katkıda bulunurlar (Yu 2005).

2

Bakır bitkilerin büyümesi ve gelişimi için önemli bir mikro elementtir. Fotosentez ve

besinlerin metabolizmada kullanılabilir enerji kaynakları haline dönüştürülmesi için

gereklidir, katalizör olarak işlev görür.

Bakır fazlalığı bitkilerde kök hücrelerine zarar verdiğinden kök uzamasını engellemektdir,

lipid peroksidasyonuna ve dolayısıyla membranların parçalanmasına yol açtığından

klorozise ve (Keller and Hammer 2004), demir eksikliğine neden olmaktadır (Ouzounidou

et al. 1998).

Bakır, hem esansiyel hem de toksik bir elementtir. Yüksek dozlarda iz element olmayan

kadmiyuma göre daha toksiktir (Ralph and Burchett 1998, Mediouni et al. 2006). Bu

durum, bakırın iz element olmasından dolayı reaktif oksijen türlerine (süperoksit radikali

(O2.-), hidrojen peroksit (H2O2), hidroksil radikali (OH·) direk etki etmesiyle

açıklanmaktadır. Bakır ve demir geçiş metalleri oksidoredüksiyon reaksiyonlarında görev

aldığından reaktif oksijen türlerinin oluşumlarını hızlandıran katalizör vazifesi

görmektedirler. Reaktif oksijen türlerinden en zarar verici olan hidroksil radikalinin (OH·)

en önemli sentez kaynağı metaller tarafından katalizlenen Haber-Weiss döngüsüdür

(Nikookar et al. 2005).

Haber-Weiss reaksiyonu iki kimyasal reaksiyona ayrılabilir:

İlk reaksiyonda süperoksit molekülü Cu+2 veya Fe+3 ile reaksiyona girerek Cu+ veya Fe+2 ve

O2 oluşturur.

I. Cu+2 veya Fe+3 + O2.- Cu+ veya Fe+2 + O2

İkinci reaksiyon ise Fenton reaksiyonu olarak bilinir.

II. Cu+ veya Fe+2 + H2O2 Cu+2 veya Fe+3 + OH· + OH-

Net reaksiyon: O2.- + H2O2 O2 + OH· + OH

-

3

Bakır membran proteinlerinin sülfidril gruplarına bağlanarak (Olson et al. 1978, Doncheva

et al.1996) ve reaktif oksijen radikaleri ile reaksiyona girerek lipid peroksidayonunu

artırmakta ve membran permeabilitesini bozmaktadır.

Şekil 1.1 Hidroksil radikalinin oluşumu ve etkileri (www.biozentrum.uni- frankfurt.de/Pharmakologie/index.html, 2008)

Pozitif yüklü metal iyonlarının, DNA’nın her iki zincirinde bulanan fosfat gruplarındaki

negatif yüklü oksijen atomları ve bazların azot ve oksijen gibi elektron donörü olan

atomları ile reaksiyona girebileceği bildirilmiştir (Anastassopoulou 2003). Buna göre

metaller DNA’daki olası bölgelere direk veya dolaylı olarak sıkıca bağlanabilmektedirler

(Anastassopoulou 2003). Metallerin DNA’ya bağlanması genellikle baz eşleşmesini

sağlayan hidrojen bağlarının kırılmasına ve çift zincirli yapının kararlılığının bozulmasına

4

sebep olmaktadır, nükleik aistlerin konformasyonunda oluşan değişimler metal iyonunun

çeşidine bağlıdır (Theophanides 1981, Yang and Wang 1996).

Şekil 1.2 Hidroksil radikalinin hücreye etkileri (www.mustafaaltinisik.org.uk/21-adsem-01s.pdf, 2008)

Bitkiler, ortamın kirliliğinin giderilmesinde ve kirlilik seviyesi hakkında bilgi sağlamak

amacıyla da kullanılmaktadır. Dolayısıyla organizmadaki değişimlerin gözlenmesi ve

ölçülmesi ile kirletici, kirliliği oluşturan kaynaklar ve kirliliğin yoğunluğu arasında bir

bağlantı kurulabilmektedir.

Kirleticilere duyarlı organizmalar vasıtasıyla çevresel kirlilik seviyelerininin belirlenmesi

var olan ve gittikçe gelişen bir çalışma alanıdır. 1950lerden beri yüksek yapılı bitkilerin

yaprakları biyolojik monitör olarak kullanılmaktadır (Al-Shayeb et al. 1995). Bütün

araştırmaların temelinde organizmaların çevrelerinde bulunan farklı tipteki uyarıcılara karşı

duyarlı olmaları ve çeşitli biçimlerde reaksiyon vermeleri vardır. Organizmaların bu

5

özellikleri onların içinde bulundukları ortamın kirlilik seviyesi hakkında kalitatif bilgi

sağlamak amacıyla kullanılmaktadır.

Ülkemizde çevre kirliliğinin biyolojik monitörler aracılığıyla tespit edilmesi amacıyla

endüstri bölgelerinden, otoyol kenarlarından ve şehir merkezlerinden bitki ve toprak

materyalleri toplanarak ağır metal içerikleri belirlenmiştir (Aksoy vd. 1998, Çelik vd.

2005).

Mengoni et al. (2000) araştırmasında, ağır metal kirliliğinin olduğu farklı bölgelerden

toplanan Silene paradoxa L. populasyonlarına ait bitki örneklerinin RAPD analizi yapılarak

toleranslı populasyon belirlenmiştir.

Kirlilik tespitinde ve kirliliğin giderilmesinde bitkilerin kullanılmasının pek çok avantajı

vardır:

� Hızlı gelişirler.

� Kolay kontamine olmazlar.

� Çalışma materyali doğadan alındığı ve geniş alanlara uygulanabildiği için

maliyeti düşüktür.

� Farklı biyolojik çalışma disiplinleri ile kombine edilebilir.

Tez kapsamında model bitki olarak seçilen patlıcan (Solanum melongena L.) Solanacea

familyasına ait olup ülkemizde en fazla yetiştiriciliği yapılan yazlık sebze türlerinden birini

oluşturmaktadır. Türkiye’de yıllık patlıcan üretimi 800-850 bin ton arasında değişmektedir.

Üretim özellikle Ege, Akdeniz, Güneydoğu Anadolu ve Marmara bölgelerine dağılmış olup

bu bölgelerin Türkiye toplam üretimindeki payları sırasıyla %30, %25, %15, %10’dur.

Yetiştirilen ürünün büyük bir bölümü iç pazarda taze olarak tüketilmekte, az bir kısmı ihraç

edilmektedir. Sera yetiştiriciliğinde patlıcan, domates, hıyar ve biberden sonra yaklaşık

%10’luk bir oranla dördüncü sırada yer almaktadır (Abak 1993). 2000 yılına ait FAO

istatistikleri incelendiğinde Türkiye’nin geçtiğimiz yıl 850.000 ton’luk üretim değeri ve

6

32.600 ha’lık üretim alanıyla dünyadaki patlıcan üreticisi ülkeler arasında önemli bir

yerinin olduğu görülmektedir.

Ağır metallerin patlıcan (Solanum melongena L.) bitkisi üzerine etkileri :

Khan and Khan (1983), gerçekleştirdikleri çalışmada kurşun ve kadmiyumun farklı

konsantrasyonlarının domates ve patlıcan tohumları üzerine etkilerini incelemişlerdir.

Patlıcan bitkisinde toksik etki yaratmak için 150 ppm kurşunun, 3 ppm kadmiyumun yeterli

olduğunu tespit etmişlerdir.

Al-Nakshabandi et al. (1997), atık su ile sulamanın patlıcan bitkisi üzerine etkisini

araştırmış ve ürün miktarında iki kat artış olduğunu gözlemiştir. Bu durum, azot, fosfor,

potasyum gibi besin maddelerinin bol olması ile açıklanmış fakat patojenik

mikroorganizmalarca da zengin bu suların kullanımının sağlık açısından riskli olduğu

belirtilmiştir.

Bletsos et al. (1999), çalışmalarında atık su ile sulanan patlıcan bitkisinin meyvelerinde ağır

metal seviyesini sınırın altında tespit etmiş ve atık suyun kullanılabilirliği belirtilmişlerdir.

Neelima and Reddy (2003), civa (5-50 ppm) ve kadmiyumun (50-9000 ppm) patlıcan

tohumları üzerine etkisini incelemiş ve yüksek konsantrasyonların toksisiteye neden

olduğunu belirtmişlerdir.

Sierra et al. (2008), madencilik endüstrisi sonucu cıva birikiminin (14.16 mg/kg (ppm))

olduğu bir bölgede (Almaden) toprağın patlıcan bitkisinin fidelenme, çiçeklenme ve

olgunlaşma dönemleri üzerine etkisini kök ve gövde uzunluğu, yaş ve kuru ağırlık

ölçümleri, organlardaki metal seviyesi belirlenerek incelenmiştir. Bitkide herhangi bir

toksik etki belirlenmemiştir, bitkinin normal gelişimini sürdürdüğü kaydedilmiştir.

7

Ağır metallerin patlcan bitkisi üzerine etkileri ile ilgili literatürde sınırlı sayıda araştırma

vardır.

Ağır metallerin DNA üzerindeki etkilerini belirlemek için birçok araştırmacı RAPD

tekniğini uygulamıştır (Conte et al. 1998, Mengoni et al. 2000, Atienzar et al. 2000, 2001,

Lui et al. 2005, 2007, 2009). Yapılan çalışmalara göre ağır metallerin konsantrasyon

artışına paralel olarak PCR ürünlerindeki polimorfizm oranın arttığı tespit edilmiştir.

Bu tez çalışmasında, günümüzde önemli bir çevresel problem olan ağır metal stresine karşı

patlıcan (Solanum melongena L.) tohumlarında meydana gelen etkilerin populasyon

parametrelerinden kök uzunluğu, kuru ağırlığı ve toplam çözünür protein seviyeleri ile ve

moleküler parametrelerden RAPD analizi ile incelenmesi amaçlanmıştır. Böylelikle bu

biyobelirteçlerin (populasyon ve moleküler parametreler) kullanılabilirliği, biyoindikatör

olarak kullanılan organizma ile kirliliğin biyolojik etkisi ve ortamın kirlilik seviyesi

hakkında bilgi edinilebilir.

8

2. KURAMSAL TEMELLER

2.1 Moleküler Belirteçler

Protein ya da DNA’da bulunan polimorfizimlere dayanan ‘moleküler belirteçler’in

geliştirilmesi; taksonomi, filogeni, genetik, bitki ıslahı ve ekoloji gibi bilim dallarına

büyük oranda katkı sağlamıştır.

Protein belirteçler arasında en yaygın kullanılanı izoenzimdir. İzoenzim; yapısal

karakterleri farklı fakat aynı reaksiyonu katalizleyen, farklı genlerce kodlanmış enzim

formlarıdır. İzoenzim analizleri, farklı dokularda ve gelişimin farklı evrelerinde

regülasyonunun izlenebilmesi için kullanılabilir. Kodominant belirteç olarak genetik bilgi

sağlayabilir. Ancak, izozim lokuslarının azlığı ve translasyon sonrası değişimlere açık

olmaları kullanım olanaklarını sınırlamaktadır (Staub et al. 1982, Bernatzky and Tanksley

1989).

DNA belirteçleri stabildir, tüm dokulardan elde edilebilir, ekolojik koşullardan etkilenmez

(Williams et al. 1990).

Bitki dokularında moleküler belirteçler ile yapılan çalışmalarda DNA profillerinin

çıkarılması ve spesifik DNA parmakizlerinin elde edilmesi şu şekilde sıralanabilir;

• Bitkisel materyalin temin edilmesi

• Bitkisel materyalden DNA izole edilmesi

• Uygulanacak yönteme göre genetik materyalin polimeraz zincir reaksiyonu

(PCR) ile çoğaltılması

• Bireyler arasındaki polimorfizmin farklı moleküler belirteç teknikleri ile tespit

edilmesi (RAPD, RFLP, AFLP, SCAR, SSCP vs.)

• DNA bant profillerinin analizi

9

DNA belirteçleri, hibridizasyona dayalı ve PCR’a dayalı belirteçler olmak üzere ikiye ayrılabilir.

2.1.1 Hibridizasyona dayalı DNA belirteçleri 2.1.1.1 RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism – Restriksiyon Parça

Uzunluk Farklılığı)

RFLP tekniğinde genomik DNA’nın restriksiyon enzimleri kullanılarak spesifik

bölgelerden kesilmesi sağlanır ve çok sayıda DNA fragmentleri elde edilebilir. DNA

fragmentleri agaroz jel elektroforezi ile ayrıldıktan sonra Southern Blot tekniği ile

nitroselüloz veya naylon membrana transfer edilir. Radyoaktif işaretlenmiş bir prob ile

hibridizasyon yapılır. Radyoaktif DNA hibritleri otoradyografi ile gözlenebilir (Botstein et

al.1980).

RFLP tekniğinin avantajları:

• Güvenilirdir. Farklı laboratuarlarda, farklı araştırıcılar tarafından aynı sonuçlara

ulaşılabilmektedir.

• Kodominant özellikte olduklarından heterozigotların belirlenmesinde ve

karakterizasyonunda kullanılmaktadır.

RFLP tekniğinin dezavantajları:

• Analizleri pahalı, fazla zaman ve iş gücü gerektirmektedir.

• Yaygın olarak radyoaktif etiketleme yöntemi kullanılmaktadır.

• Yüksek kalitede ve fazla miktarda DNA’ya ihtiyaç vardır (10-20 µg).

10

2.1.2 PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)’a dayalı DNA belirteçleri

Polimeraz zincir reaksiyonu belirli bir DNA bölgesinin in vitro şartlarda primerler

tarafından yönlendirilerek, enzimatik olarak çoğaltılması işlemidir. PCR, Kary Mullis (K.B.

Mullis, U.S. patent 4 683 195, Temmuz, 1987) tarafından geliştirilmiş olup, moleküler

biyolojinin hızlı bir şekilde gelişmesinde katalizör olmuştur (Steffan and Atlas, 1991). PCR

tekniği, genetik yapısı değiştirilen bitki veya mikroorganizmaların tespiti, moleküler

klonlama, DNA baz dizilişlerinin belirlenmesi, genetik akrabalık ve adli tıp vakalarının

tespitinde kullanılmaktadır.

PCR’ın çalışma prensibi ard arda tekrarlanan üç basamaktan oluşmaktadır:

1. DNA’nın çift iplikçiğinin sıcaklıkla ayrılması

2. Oligonükleotid primerlerin oluşturulan tek zincirli DNA molekülünde hedef

bölgelere bağlanması

3. dNTPlerin varlığında DNA polimerazın primerlerle uzatılması

PCR tekniğinin uygulanması thermocycler içinde in vitro koşullarda gerçekleştirilmekte

olup, gerekli reaksiyon karışımı kalıp DNA’yı, nükleotid karışımını (dNTPs), bir ya da bir

çift oligonükleotid primeri, DNA polimeraz enzimini, tampon çözeltisini ve MgCl2’ü içerir.

2.1.2.1 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Çoğaltılmış Parça Uzunluk Farklılığı)

AFLP tekniğinde genomik DNA, restriksiyon enzimleri (EcoRI / MseI) ile kesilir, biyotin

ve radyoaktivite ile işaretlenmiş iki adaptör yardımıyla restriksiyon fragmentleri uygun bir

DNA ligaz ile birleştirilir. Birleştirilen bu adaptörlere uygun primerler ile restriksiyon

fragmentlerin pre-amplifikasyonu yapılır. Oluşturulan fragmentlerin radyoaktif işaretli özel

primerlerle selektif amplifikasyonları sağlanır. Elde edilen ürünler poliakrilamid jel

üzerinde yürütülür ve gümüş boyama ya da radyoaktivite ile görüntülenir (Ergül 2000).

11

AFLP’nin avantajları

• Laboratuarlar arası cihaz farklılığı sonucu etkilemez.

AFLP’nin dezavantajları

• Radyoaktif işaretleme yapılır.

• Dominant belirteçlerdir.

2.1.2.2 SSR (Simple Sequence Repeat – Basit Dizi Tekrarları)

Ardışık tekrarlanan 2-6 nükleotitli gruplara mikrosatellit denir. Mikrosatellitlerin varlığı

birçok organizmada gösterildikten sonra DNA zincirindeki değişiklikleri belirleyen bir

metot kullanılmaya başlanmıştır. Bu metot, SSR lokusuna bağlanan primerlerin PCR

yardımıyla farklı uzunlukta parça çoğaltması esasına dayanmaktadır ve ard arda tekrarlanan

zincir elemanlarının sayısındaki değişiklikler sonucunda oluşan SSRler bireyler arasındaki

farklılıkları belirler. SSRleri çevreleyen korunmuş DNA dizileri primer olarak kullanılarak

PCR tekniği sayesinde bir lokustaki farklı alleller tespit edilebilir.

SSR tekniğinin avantajları

• Oldukça polimorfiktir; bundan dolayı yüksek oranda bilgi vermektedir.

• Bitki genomunda fazla bulunup düzenli bir dağılım gösterirler. Örneğin; buğday

genomu her 704 kb da bir (GT)n grubu ve her 440 kb da bir (GA)n grubu içerir.

• Kodominant belirteçlerdir.

SSR tekniğinin dezavantajları

• Fazla iş gücü gerektirir.

• Maliyeti yüksektir.

12

2.1.2.3 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region – Dizin Karakterli Çoğaltılmış Bölge)

Bir gen bölgesine ait belirli büyüklükteki RAPD bandının klonlanıp, uç bölgelerinden

dizileri belirlendikten sonra, bu fragmana yönelik RAPD primerlerini içeren primer çiftleri

ile geliştirilen bir tekniktir (Paran and Michelmore 1993).

SCAR tekniğin avantajları

• Kodominant belirteçlerdir.

• RAPD belirteçlerde istenmeyen amplifikasyon ürünleri elde edilirken SCAR

belirteçler spesifiklik gösterir.

SCAR tekniğinin dezavantajları

• Uzun zaman alır ve işçiliği fazladır.

2.1.2.4 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – Rastgele Çoğaltılmış DNA Farklılığı)

Diğer PCR uygulamalarının aksine iki yerine bir primer kullanılır. Bu primerler 9-10 baz

çiftlik rastgele primerlerdir. Primer kalıp DNA üzerinde komplementeri olan, birbirine

yakın iki bölgeye bağlanarak arada kalan DNA bölgesinin amplifikasyonunu sağlar. Bu

şekilde çoğaltılan DNA dizileri için agaroz jel üzerinde elektroforez uygulanır ve bazı

dizilerin çoğaldığı, bazılarının ise çoğalmadığı gözlenir. Bu gözlem polimorfizmin

göstergesidir (Welsh and Mcclelland 1990).

RAPD tekniğinin avantajları

• Evrensel primer seti kullanılır.

• Hızlı sonuç alınır, ucuzdur ve az iş gücü gerektirir.

• Az miktarda DNA yeterlidir.

13

RAPD tekniğinin dezavantajları

• Güvenilirliği sınırlıdır, farklı laboratuarlarda farklı sonuçlar hatta bir ısı döngü

cihazından diğerine farklı sonuç verebilir

• Dominant belirteçlerdir.

14

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1 Materyal

Bu çalışmada, İzmir Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı İdari ve Mali İşler Dairesi Başkanlığı,

Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsünden alınan topan çeşidi patlıcan (Solanum melongena

L.) tohumları kullanılmıştır.

3.2 Yöntem 3.2.1 Tohum yüzey sterilizasyonu

Tohumlar, yüzey sterilizasyonunu sağlamak amacıyla %30’luk teknik sodyum hipoklorit

(NaOCl) çözeltisis ile 20 dakika muamele edilmiş ve daha sonra distile su ile 3 kere

yıkanmıştır.

3.2.2 Çimlendirme yöntemi

Deney iki aşamadan oluşmaktadır. Birinci kısımda, distile suda 2 mm uzunluğa gelen

tohumlar oda sıcaklığında, farklı konsantrasyonlarda ağır metal çözeltilerine üç hafta maruz

bırakılmışlardır, bu kısımdaki örnekler ds-30, ds-60, ds-120, ds-240 olarak adlandırılmıştır.

İkinci kısımda, tohumlar oda sıcaklığında, direk ağır metal çözeltilerine üç hafta maruz

bırakılmıştır, buradakiler de 30, 60, 120, 240 olarak adlandırılmıştır. Kontrol olarak distile

suda, oda sıcaklığında, üç hafta gelişen tohumlar kullanılmıştır, K ile ifade edilmiştir.

Her petriye 20 tohum yerleştirilerek deney üç tekrarlı olarak yapılmıştır. Tohumlara

CuCl2·2H20 çözeltisi 30, 60, 120, 240 mg/l konsantrasyonlarında uygulanmıştır.

15

3.2.3 Ölçüm ve analizler 3.2.3.1 Bitki kök boyu ve kuru ağırlık tayini

Ağır metal stresinin bitkiler üzerine etkilerini belirlemek amacıyla üç haftanın sonunda bazı

büyüme parametrelerinden kök uzunluğu (mm/tohum) ve kuru ağırlık ölçümleri (g/tohum)

70ºC’ye ayarlanmış etüvde 48 saat kurutularak belirlenmiştir.

3.2.3.2 Toplam çözünür protein içeriğinin belirlenmesi

0.08g tartılan kontrol ve muamele kök örnekleri sıvı azotla havanda ezilerek 700 µl fosfat

tamponu (0.2 M, pH 7.0) ile homojenize edilmiş, 27000 g’de 20 dk. santrifüj edilerek

süpernatantlar yeni tüplere alınmıştır (Omran 1980). Örneklerin toplam çözünür protein

konsantrasyonları, Bradford metoduna (Bradford 1976) göre belirlenmiştir. Bu yönteme

göre; 100 µl örnek çözeltisi ile 400 µl deiyonize su karıştırıldıktan sonra 5 ml 1XBradford

çözeltisine eklenmiştir. Blank olarak 500 µl deiyonize ve 5 ml 1X Bradford karışımı

kullanılmıştır. Bu karışımlar ~10 saniye vortekslenerek karıştırıldıktan sonra 10 dakika oda

sıcaklığında bekletilmiş ve absorbans değerleri 595 nm dalga boyunda spektrofotometrede

(Hitachi U-1800) paralelli olarak blanke karşı okunmuştur. Standart BSA (Bovin Serum

Albumin) ile hazırlanmıştır (Ek 1).

Örneklerin Toplam Çözünür Protein Konsantrasyonunun Hesaplanması:

Spektrofotometrede okunan değer X Dilüsyon faktörü

Standart eğrinin eğimi

Bradford çözeltisi; 0.5 g Coomassie Blue G’nin 50 ml suda çözülmesi, 250 ml %95’lik

etanol ve 500 ml %85’lik fosforik asit eklenip karıştırılarak 1 L’ye tamamlanması ile

5X’lik solusyon elde edilmiştir. Çözelti +4ºC’de karanlıkta tutulmuştur.

16

3.2.3.3 DNA izolasyonu

RAPD analizlerini gerçekleştirmek üzere patlıcan tohumu örneklerinden DNA izolasyonu,

Aras ve Cansaran (2006) tarafından optimize edilmiş protokole göre yapılmıştır. İzolasyon

sonucunda 760 - 2194 ng/µl aralığında değişen miktarlarda ve 1.9 – 2.03 aralığında saflık

gösteren DNA elde edilmiş (A260/280 absorpsiyon oranı) (NanoDrop ND-1000

Spectrophotometer) (Çizelge 3.1), ayrıca DNA kalitesi etidyum bromür varlığında agaroz

jelde de gösterilmiştir.

Çizelge 3.1 Nanodrop sonuçları

örnek ng/ul A260 A280 260/280 260/230

K 1823.25 36.465 18.771 1.94 1.4

ds-30 2389.68 47.794 24.256 1.97 1.62

ds-60 1699.47 33.989 17.898 1.90 1.21

ds-120 717.74 14.355 7.534 1.91 0.41

ds-240 1124.93 22.499 11.078 2.03 0.29

30 859.77 17.195 8.848 1.94 0.32

60 968.09 19.362 10.152 1.91 1.12

120 1500.07 30.001 15.65 1.92 1.24

240 1301.38 26.028 13.261 1.96 1.34

DNA izolasyonu aşağıdaki protokolle gerçekleştirilmiştir;

• Bitki materyali (0.1 g) toz haline gelinceye kadar sıvı azotta ezilir.

• Önceden ısıtılmış DNA ekstraksiyon tamponundan [50 mM Tris-HCl (pH 8), 50

mM EDTA, 10 ml LiCl (4 M), %1 CTAB, %2 PVPP] her örneğe 1 ml eklenerek

örnekler kısa bir süre tamponda ezilir.

• Örnekler 1.5 ml Eppendorf tüplerine alınır ve üzerlerine %0.2 β-merkapto etanol

eklenir.

• Tüplerdeki solüsyonlar 65°C’da 15 dakika inkübe edilir.

17

• İnkübasyon süresinin sonunda örneklerin oda sıcaklığına soğuması beklenir, tüplere

0.5 ml kloroform/izoamil alkol (24:1 [v/v]) eklenir ve vorteks kullanılmadan iyice

karıştırılır.

• Daha sonra örnekler 17,000 x g’de (14,000 rpm) 2 dakika santrifüj edilir ve

süpernatant (~0.8 ml) yeni tüplere aktarılır.

• Süpernatanta eşit hacimde izopropanol eklenir ve karışım birkaç defa hafifçe ters

düz edilerek karıştırılır. DNA eldesinin etkinliğini arttırmak için örnekler buz

üzerinde 15 dakika inkübe edilebilir.

• Daha sonra örnekler 17,000 x g’de (14,000 rpm) 2 dakika santrifüj edilir.

• Süpernatant atılır ve üzerine 1 ml %70’lik etanol eklenir.

• Örnekler tekrar 17,000 x g’de (14,000 rpm) 1 dakika santrifüj edilir.

• Elde edilen pellet etanol tamamen uçana kadar oda sıcaklığında kurutulur.

• Daha sonra pellet üzerine uygun miktarda (30-60 µl) TE tamponu [10 mM Tris-HCl

(pH: 8), 1 mM EDTA] eklenerek çözdürülür.

• Çözeltinin üzerine 1 µl ribonükleaz (RNaz, 10 mg/ml) eklenir, örnekler kullanılana

kadar –20 °C’da saklanır.

3.2.3.4 RAPD uygulamaları

Dokuz farklı primer kullanılarak gerçekleştirilen (primerlerin isimleri ve dizileri çizelge 3.2

de belirtilmiştir) RAPD uygulamalarında, tüm işlemler (PCR döngü şartları, ısı döngü

cihazı, kullanılan Taq polimeraz ve diğer PCR bileşenlerinin markası ve konsantrasyonları,

elektroforez şartları ve jel konsantrasyonları, tampon ve diğer çözeltiler için kullanılan

kimyasalların tür ve markası vb.) Williams et al. (1990)’ a göre optimize edilmiş şartlar

altında gerçekleştirilmiş, kontaminasyondan korunmak için steril ekipmanlar kullanılmış ve

her RAPD işlemi için DNA örneği içermeyen negatif kontrol kullanılmıştır.

18

Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan primerler ve dizi bilgileri

Primer Nukleotid Dizisi (5´ → 3´)

TUBE A 07

G A A A C G G G T G

TUBE A 09

G G G T A A C G C C

TUBE A 12

T C G G C G A T A G

TUBE A 13

A A T C G G G C T G

TUBE A 16

A G C C A G C G A A

TUBE A 17

G A C C G C T T G T

TUBE A 18

A G G T G A C C G T

TUBE A 20

G T T G C G A T C C

TUBE C 01

T T C G A G C C A G

3.2.3.4.1 RAPD bileşenleri ve koşulları

RAPD tekniğinde her örnek için toplam 25µl’lik reaksiyon gerçekleştirilmiş, aşağıdaki

bileşenlere standart hacime ulaşacak şekilde ultra distile su eklenmiştir.

o 200 ng genomik DNA,

o 2.5 µl 10x reaksiyon tamponu,

o 2.5 mM MgCl2,

o 20 µM dNTPs,

o 0.2 µM primer,

o 0.5 ünite Taq polimeraz (Bioron).

19

PCR döngü şartları;

� 94°C de 2 dakika ön denatürasyon

� 94°C de 30 saniye (denatürasyon)

� 36ºC de 1 dakika (bağlanma)

� 72°C de 1,45 dakika (uzama)

� 72°C de 8 dakika (son uzama)

şeklinde Techne ısı döngü cihazında gerçekleştirilmiştir.

3.2.3.4.2 Agaroz jel elektroforezi

PCR ürünleri ve DNA belirteçleri (marker) (DNA Ladder Plus, Promega, 100 bp) % 1.6

agaroz konsantrasyonu ve 0,5 µl/ml etidyum bromür içeren jellerde, 1xTBE (Tris Borat

EDTA) tamponu içerisinde 5 V/cm olacak şekilde yaklaşık 4 saat ayrıma tabii tutulmuştur.

Jel görüntüleme sisteminde görüntülenmiş (Gene Genius, Syngene) ve fotoğrafları

çekilmiştir (GyneSnap Software, Synoptics Ltd.).

3.2.3.5 Veri Analizleri

3.2.3.5.1 İstatistiksel analizler

Populasyon parametrelerinden elde edilen verilere SPSS (Statistic Program for Social

Sciences 15.0) paket programı kullanılarak varyans analizi (ANOVA) yapılmıştır.

3.2.3.5.2 Genomik Kalıp Stabilitesi (GKS)

RAPD profilindeki polimorfizm ortalamalarından belirlenir.

GKS = (1- a/n) x 100

a : her örnekteki ortalama polimorfik bant sayısı

n : kontroldeki toplam bant sayısı

35 döngü

20

4. BULGULAR 4.1 Erken Fide Gelişim Evresinde Patlıcan Bitkisinin Kök Büyümesi Üzerine Bakır Stresinin Etkisi

Farklı konsantrasyonlarda uygulanan Cu stresinin 21 günlük patlıcan bitkisinin kök

uzunluğuna etkisi incelendiğinde; Cu konsantrasyonunun artışına bağlı olarak kök

uzunluğu önemli derecede azalmıştır (Şekil 4.1). Şekil 4.2’ de bu azalışın etki oranları

belirtilmektedir. ds-240 ile 120 aynı oranda etkilenmiştir.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

K ds-30 ds-60 ds-120 ds-240 30 60 120 240

Örnekler

Kök uzunluğu (mm/tohum)

Şekil 4.1 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere ait kök uzunlukları

21

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

K ds-30 ds-60 ds-120 ds-240 30 60 120 240

Örnekler

Cu Etki Oranı %

Şekil 4.2 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere bakır metalinin kök uzunluğuna etki oranları

4.2 Erken Fide Gelişim Evresinde Patlıcan Bitkisinin Kök Kuru Ağırlığı Üzerine Bakır Stresinin Etkisi

Farklı konsantrasyonlarda uygulanan Cu çözeltisinin kök kuru ağırlığı üzerinde etkisi

incelendiğinde artan bakır konsantrasyonuna bağlı olarak kök kuru ağırlığında azalış

gözlenmektedir (Şekil 4.3). Etki oranları şekil 4.4’de gösterilmiştir. İkinci grubun bakır

stresinden daha fazla etkilendiği gözlenmektedir.

0

0,0001

0,0002

0,0003

0,0004

0,0005

0,0006

K ds-30 ds-60 ds-120 ds-240 30 60 120 240

Örnekler

Kök kuru ağırlık (g/tohum)

Şekil 4.3 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere ait kök kuru ağırlıkları

22

Şekil 4.4 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere bakır metalinin kök kuru ağırlığına etki oranları

4.3 Bakır Stresinin Patlıcan Bitkisinde Toplam Çözünür Protein Miktarına Etkisi

Farklı konsantrasyonlarda uygulanan Cu çözeltisinin kök toplam çözünür protein miktarı

üzerine etkisi incelendiğinde artan bakır konsantrasyonuna bağlı olarak kök toplam çözünür

protein miktarı azalış göstermektedir (Şekil 4.5). Etki oranları şekil 4.6’de gösterilmiştir.

Bakır stresinin ikinci grubu daha fazla etkilediği tespit edilmiştir.

0

2

4

6

8

10

12

14

K ds-30 ds-60 ds-120 ds-240 30 60 120 240

Örnekler

Toplam çözünür protein

miktarları (mg/g)

Şekil 4.5 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere ait kök toplam çözünür protein miktarı

0

10

20

30

40

50

60

70

80

K ds-30 ds-60 ds-120 ds-240 30 60 120 240

Örnekler

Cu Etki Oranı %

23

0

10

20

30

40

50

60

70

K ds-30 ds-60 ds-120 ds-240 30 60 120 240

Örnekler

Cu Etki Oranı %

Şekil 4.6 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere bakır metalinin kök toplam çözünür protein miktarına etki oranları

4.4 Bakır Stresinin Patlıcan Bitkisinde RAPD Sonuçlarına Etkisi

Deneyde kullanılan onbir primerden dokuz primer net ve tekrar edilebilir sonuç vermiştir

(Şekil 4.8-4.16). Her primer için polimorfizm hesaplamaları örneklerin bant paternleri

kontrolün bant paternleriyle karşılaştırılarak yapılmıştır. Kontrolde bulunup örneklerde

bulunmayan ve kontrole göre yeni oluşan bantlar polimorfik olarak değerlendirilmiştir.

Polimorfizm yüzdeleri polimorfik bant sayısına toplam bant sayıları oranlanarak

hesaplanmıştır (Şekil 4.7). Çizelge 4.1 de a; kontrole göre yeni ortaya çıkan bantları

belirtmek için, b; kaybolan kontrol bantlarını belirtmek için kullanılmıştır. Artan metal

konsantrasyonuna bağlı olarak polimorfizm oranının artığı görülmüştür.

24

0

10

20

30

40

50

60

ds30

ds60

ds120

ds240

30 60 120

240

Örnekler

Polimorfizm oranı %

Şekil 4.7 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere ait polimorfizm oranları

25

Çizelge 4.1 Örneklere ait bant farklılıkları

K ds-30 a/b

ds-60 a/b

ds-120 a/b

ds-240 a/b

30 a/b

60 a/b

120 a/b

240 a/b

Tube A 07

8 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 2 0 / 0 0 / 0 1 / 1 0 / 2

Tube A 09

10 0 / 0 0 / 0 0 / 0 1 / 2 0 / 0 0 / 0 2 / 3 3 / 2

Tube A 11

10 0 / 2 0 / 2 0 / 2 0 / 4 0 / 2 0 / 2 5 / 2 1 / 8

Tube A 12

12 0 / 0 0 / 1 2 / 2 3 / 7 0 / 0 0 / 4 4 / 4 1 / 7

Tube A 16

9 1 / 0 1 / 0 1 / 0 0 / 3 1 / 0 1 / 0 1 / 2 0 / 4

Tube A 17

7 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 2 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 2

Tube A 18

4 0 / 0 0 / 0 0 / 0 1 / 2 0 / 0 0 / 1 2 / 1 0 / 2

Tube A 20

8 0 / 0 0 / 1 0 / 1 0 / 1 0 / 1 0 / 4 0 / 1 0 / 2

Tube C 01

12 0 / 2 1 / 5 2 / 3 2 / 3 2 / 2 1 / 5 3 / 5 1 / 8

Total 80 5 11 13 33 8 18 37 43

K: kontrol (a/b) a : kontrole göre yeni oluşan bant b : kontrole göre kaybolan bant

26

Şekil 4.8 Tube A 07 primeri M: Marker K: Kontrol

Şekil 4.9 Tube A 09 primeri N: Negatif M: Marker K: Kontrol

27

Şekil 4.10 Tube A 11 primeri M: Marker K: Kontrol N: Negatif

Şekil 4.11 Tube A12 primeri M: Marker K: Kontrol

28

Şekil 4.12 Tube A 16 primeri M: Marker K: Kontrol N: Negatif

Şekil 4.13 Tube A 17 primeri N: Negatif M: Marker K: Kontrol

29

Şekil 4.14 Tube A 18 primeri N: Negatif K: Kontrol M: Marker

Şekil 4.15 Tube A 20 primeri N: Negatif M: Marker K: Kontrol

30

Şekil 4.16 Tube C 01 primeri M: Marker K: Kontrol N: Negatif

4.5 Bakır Stresine Maruz Kalmış Örneklerin Populasyon Parametrelerinin İstatistiksel Analizi

İstatiksel analizler için SPSS paket programı uygulanmıştır. Her bir populasyon parametresi

(kök uzunluğu, kuru ağırlığı, toplam çözünür protein miktarı) için farklı konsantrasyonlarda

ve şartlarda metale maruz bırakılan örnekler arasındaki farklılıkları değerlendirmek için

Duncan’s testi yapılmıştır.

Çizelge 4.2’e göre kök uzunlukları incelendiğinde, ds-120, ds-240, 120, 240 örnekleri

benzer, ds, ds-30, ds-60, 30 ve 60 örnekleri farklı bulunmuştur. Kök kuru ağırlıkları

bakımından ds-60 ile 30 ve 120 ile 240 örneklerinin benzer, ds, ds-30, ds-120 ve 60

örneklerinin farklı oldukları tespit edilmiştir. Kök toplam çözünür protein miktarları

incelendiğinde ds-60 ile 30 ve ds-120 ile ds-240 ayrıca 120 ve 240 örneklerinin benzer, ds,

ds-30 ve 60 örneklerinin farklı oldukları görülmüştür.

31

Çizelge 4.2 Populasyon parametrelerinin istatistiksel analizi Kök uzunluğu

Mean ± SE Kök kuru ağırlığı Mean ± SE

Kök toplam çözünür protein

Mean ± SE

K 43.20 ± 0.8082904 (a)

0.000520 ± 0.0000115 (a)

12.270 ± 0.1558846 (a)

ds-30 16.00 ± 0.4618802 (b)

0.000468 ± 0.0000081 (b)

10.560 ± 0.1847521 (b)

ds-60 11.40 ± 0.2886751 (c)

0.000427 ± 0.0000075 (c)

6.660 ± 0.1212436 (c)

ds-120 5.00 ± 0.2886751 (d)

0.000330 ± 0.0000115 (d)

5.730 ± 0.981495 (d)

ds-240 4.00 ± 0.1154701 (d)

0.000280 ± 0.0000173 (e)

5.580 ± 0.1212436 (d)

30 13.60 ± 0. 9237604 (e)

0.000431 ± 0.0000058 (c)

6.860 ± 0.0750555 (c)

60 8.40 ± 0.3464102 (f)

0.000370 ± 0.0000115 (f)

6.100 ± 0.0577350 (e)

120 4.00 ± 0.4618802 (d)

0.000170 ± 0.0000127 (g)

5.180 ± 0.1039230 (f)

240 3.60 ± 0.2309401 (d)

0.000160 ± 0.0000046 (g)

4.860 ± 0.0577350 (f)

*Aynı sütunda farklı harfi alan değerler arasındaki farklılıklar önemlidir. (P < 0.05)

32

4.6 RAPD Profili ve Kök Uzunluğu, Kuru Ağırlığı, Toplam Çözünür Protein Miktarının Karşılaştırılması RAPD profili ve kantitatif ölçümlerle belirlenen değişimler artan metal konsantrasyonuna

bağlı olarak kalıbın stabilitesinin azaldığını göstermektedir (Şekil 4.17). Bakır stresinden

ikinci grup daha fazla olumsuz etkilenmiştir.

0

15

30

45

60

75

90

105

120

kök uzunluğu

kök kuru ağırlığı

kök toplam çözünür protein

RAPD profili

RAPD profili ve kök uzunluğu, kuru ağırlığı,

toplam çözünür protein miktarının

karşılaştırması (%)

K ds30 ds60 ds120 ds240 30 60 120 240

Şekil 4.17 Örneklerde RAPD profili ve kök uzunluğu, kuru ağırlığı, toplam çözünür protein miktarının karşılaştırılması

33

5. TARTIŞMA VE SONUÇ

Ağır metaller, yabancı otlar ve tarım zararlarına karşı geliştirilen tarım ilaçlarında

kullanılmaktadır. Örneğin bakır, mangan ve çinko fungisit, kurşun ve arsenik ise

meyvelerdeki böcek zararlılarına karşı geliştirilen ilaçlarda kullanılmaktadır.

Toprak ve doğal su kaynaklarının toksik metallerle kirlenmesi sonucunda bu bölgelerde

yaşayan organizmalarda ciddi zararlar oluşmaktadır. Bitkilerde ağır metal toksisitesi

fotosentez (Baron et al. 1995), lipid metabolizması (Ouariti et al. 1997), nükleik asit

biyosentezi (Doncheva et al. 1996) gibi çeşitli büyüme ve gelişme işlevlerinde hasarlara

neden olmaktadır.

Bakır ve demir gibi geçiş metalleri serbest radikaller ile yürütülen lipid peroksidasyonu

reaksiyonlarının çoğunun başlatılmasında rol alırlar. Lipid peroksidasyonu hücre

membranındaki doymamış yağ asitlerinin serbest radikallerle birleşerek bir seri reaksiyon

sonucu bozulmaları ve lipid hidroperoksitlerin oluşmasıdır. Peroksidasyon sonucu oluşan

malondialdehit ve 4-hidroksi-nonenal gibi aldehitlerin biyolojik aktiviteleri DNA ve

proteinlerle çapraz bağlanarak moleküllerin faaliyetini değiştirmeleri şeklindedir (Griffiths

et al. 2002). Lipid peroksidayonunun etkileri membran akışkanlığının azalması, membranın

normal koşullarda geçirimsiz olduğu maddelere karşı (Ca+2 gibi) zayıflığının artması ve

membrana bağlı enzimlerin inaktivasyonudur (Doğan 2005).

Ağır metallerin toksik etkilerini populasyon ve moleküler parametrelerle tespit etmek

mümkündür. Populasyon seviyesinde bitki boyu, biomass, toplam çözünür protein, prolin

ve anti-oksidatif enzimlerin miktar değişimleri ile; moleküler seviyede ise SSR, AFLP,

RFLP ve RAPD analizleri ile belirlemek mümkündür.

Tez kapsamında farklı konsantrasyonlar ve farklı şartlar uygulanan patlıcan tohumları

üzerine bakır metalinin etkileri populasyon parametrelerinden kök uzunluğu, kuru ağırlığı

ve toplam çözünür protein; moleküler parametrelerden RAPD-PCR ile incelenmiştir.

34

RAPD profili birçok canlıda genotoksisitenin belirlenmesinde kullanılmaktadır (Liu et al.

2005, 2009). DNA hasarının tespitinde RAPD tekniğinin kullanılmasının pek çok avantajı

vardır; radyoaktif değildir, az miktarda DNA yeterlidir, aynı anda birçok örnekle çalışmak

mümkündür, hızlı bir tekniktir.

Bitkilerin ağır metal stresine karşı çeşitli direnç mekanizmaları geliştirdiği, bunlardan bir

tanesinin de metalin köklerde tutulması ve gövdeye dağılımının engellenmesi olduğu

belirtilmiştir (Fernandes and Henriques 1991). Metallerin köklerde tutulup biriktirilmesi

köklerin yapısını ve büyümesini diğer organlara göre çok daha fazla etkilemesine neden

olmaktadır.

Toksinlerin kökte yaptığı etkilerden biri büyümesini engellemektir. Bu çalışmada

beklenildiği gibi metal konsantrasyonunun artışıyla parallel olarak kök boyunda azalma

tespit edilmiştir. Farklı konsantrasyonlarda bakır stresine maruz bırakılan örnekler, kontrole

göre % 62-91 oranlarında azalmaya sebep olmuştur. 120 ve 240 ppm Cu konsantrasyonları

her iki grupta da benzer etkiler yaratmıştır (P<0.05). Her iki deney düzeneğinde de 30 ve 60

ppm Cu konsantrasyonlarına maruz bırakılan bitkilerde farklı oranlarda etkiler görülmüştür

(P<0.05). Bakırın Phaseolus vulgaris L. (Zengin ve Muzuroğlu 2004), Lolium perenne

(Wong and Bradshaw 1982) bitkilerinde de kök ve gövde uzunluğunu azalttığı tespit

edilmiştir. Alüminyumun buğday kök hücrelerinde DNA replikasyonunu ve hücre

bölünmesini azalttığı ve dolayısıyla kök büyümesini engellediği belirtilmiştir (Zhengua et

al. 1993).

Ayrıca; yüksek konsantrasyonlarda (120, 240 ppm) her iki grupta da kökte

kahverengileşmelerin meydana geldiği gözlenmiştir. Kahverengileşmenin suberin

miktarının artmasıyla oluştuğu, bu durumun da su alımını sınırladığı belirtilmiştir (Barcelo

and Poschenrieder 1990).

Bakırın kök kuru ağırlığı birinci grupta (ds-30, ds-60, ds-120, ds-240) %10 – 46, ikinci

grupta (30, 60, 120, 240) %17- 69 azalmaya sebep olmuştur. Etki oranı ikinci grubun 120

35

ve 240 ppm konsantrasyonlarında daha fazla görülmüştür, sırasıyla % 67.3 – 69.2’dir. ds-

60 ile 30 ve 120 ile 240 örneklerinde benzer etkiler tespit edilmiştir (P<0.05). Mediouni et

al.(2006) ağırlıktaki azalışı ağır metalin etkisiyle hücrelerin bölünmesinin engellenmesi ile

açıklamıştır.

Kök kuru ağırlığında gözlendiği gibi toplam çözünür protein profiline baktığımızda da

artan metal konsantrasyonuyla ters yönde bir ilişki tespit edilmiştir. Birinci grupta %13 –

54, ikinci grupta % 44 – 60 azalış belirlenmiştir. ds-60 ile 30, ds-120 ile ds-240 ve 120 ile

240 örneklerinde benzer etkiler tespit edilmiştir (P<0.05). Bakırın domates bitkisi

çeşitlerinde (Mazhoudi et al. 1997), kadmiyumun Hordeum vulgare (Liu et al. 2005)

bitkisinde toplam çözünür protein üzerine olumsuz etkileri belirtilmiştir.

Kök kuru ağırlığında ve toplam çözünür protein miktarında belirtildiği gibi ikinci gruplarda

tespit edilen azalma oranlarının daha fazla olması metallerin bitkiler üzerine etkileri

araştırılırken bitkinin ne şekilde (distile suda çimlendirilerek metal çözeltisinde

geliştirilmesi ve metal çözeltisinde çimlendirilerek geliştirilmesi) metale maruz

bırakıldığının önemli olduğunun bir göstergesidir.

Genotoksik ajanların DNA üzerinde meydana getirdiği hasarları DNA üzerinden parmakizi

yöntemleri ile inceleyen çok sayıda çalışma yapılmıştır. Çoğu parmakizi ile bakterilerden

çiçekli bitkilere kadar hemen her organizma sınıfı için kullanılabilir ve eş zamanlı olarak

çok sayıda örnek incelenebilir. Bu yönüyle parmakizi yöntemleri, konsantrasyon ve maruz

kalma süresi gibi, genotoksik ajanın değişik faktörlerle olan etkileşimini birden fazla örnek

üzerinde incelemeye olanak tanır. RAPD gibi parmak izi yöntemlerinin yüksek donanımlı

biyolojik laboratuarlar gerektirmemesi de önemli bir avantaj sağlar (Sava 2000,

Theodorakis et al. 2001, Atienzar et al. 2002).

Birçok çalışmada RAPD parmak izi yöntemi kullanılarak farklı organizmalarda çeşitli

genotoksik ajanların etkileri araştırılmıştır. Bu çalışmaların bir kısmında genotoksik ajanlar

laboratuar koşullarında kontrollü olarak uygulanmış, bir kısmında genotoksik ajanlara

36

doğal yaşam alanlarında maruz kalan organizmalar incelenmiştir. Liu et al. (2007) pirinç

(Oryza sativa L.) ile gerçekleştirdiği çalışmada, pirinç tohumlarına çeşitli

konsantrasyonlarda kadmiyum çözeltisi (CdCl2.2H2O) uygulamış ve yüksek

konsantrasyonlu çözeltilere maruz kalan örneklerin kontrol örneklere göre RAPD bant

paternlerinin değiştiğini belirlemiştir. Diğer tüm koşullar sabit tutulduğunda kontrolün

sahip olduğu bant paterninin ağır metale maruz kalmış örneklerde değişmesi, bu değişimin

genotoksik ajanın (Cd) mutasyonel etkisiyle oluştuğu düşüncesini ortaya çıkarmıştır.

RAPD analizinde kontrole göre farklı bant profillerinin gözlenmesinin nedenleri kalıp DNA

üzerinde, primerlerin bağlanma bölgelerinde meydana gelmiş mutasyonlardır. Mutasyonlar

primerlerin bu bölgeler ile eşleşmesini engelleyecek ve bu fragmanlar çoğaltılamayacaktır.

Ayrıca; primer bağlanma bölgeleri arasında oluşmuş tek ya da çift zincirdeki kırıklar bu

fragmanın çoğaltılmasını engelleyecektir. Kalıp DNA üzerinde meydana gelen baz

mutasyonları primerler için yeni bağlanma bölgeleri de oluşturabilir.

Tez kapsamında patlıcan (Solanum melongena L.) örneklerinde ağır metal kirliliğinin

neden olmuş olabileceği etkiler populasyon ve moleküler parametrelerden RAPD ile

incelenmiştir. RAPD primerlerinde kullanılan rastgele primerlerin örneklere ait kalıp

DNAlar üzerinde bağlanma bölgelerinde değişimler (yeni bağlanma bölgelerinin

oluşturulması, varolan bağlanma bölgelerinin yok olması) meydana getirmesi örneklerin

bant profillerinde polimorfizme sebep olmuştur. Polimorfizm oranları birinci grupta %6 –

41, ikinci grupta %10 – 53 tespit edilmiştir. En fazla polimorfizm ikinci grubun 120 ve 240

ppm bakıra maruz kalmış örnelerinde görülmektedir, sırasıyla % 46.25, 53.75’dir. Bant

paternlerindeki farklılıklar en fazla tube C01 primerinde görülmektedir.

RAPD profili ile belirlenen GKS ve populasyon parametreleri GKS ile karşılaştırıldığında,

ikinci grupun daha fazla etkilendiği gözlenmektedir. Bu da toksik ajana maruz kalma

şeklinin önemini belirtmektedir.

37

Bu çalışmada, populasyon ve moleküler biomarkerların birlikte kullanılabilirliği

gösterilmiştir. Biyoindikatör olarak kullanılan organizma ile kirliliğin biyolojik etkisi

kantitatif olarak tespit edilmiştir.

38

KAYNAKLAR

Abak, K. 1993. Yazlık sebzeler ve örtü altı yetiştiriciliği raporu (Solanaceae,

Cucurbitaceae, Leguminaceae ve Compositae) Türkiye bahçe bitkileri alt sektörünün gözden geçirilmesi projesi, hazırlık çalışması: Bahçe bitkileri üretiminin bölgesel özellikleri. Adana, 23s.

Aksoy, A., Dixon, J.M. and Hale, W.H.G. 1998. Biological Flora of British Isles: Capsella

bursa-pastoris (L.) Medikus. Journal of Ecology, 86; 171-186.

Al-Nakshabandi, G.A., Saqqar, M.M., Shatanawi, M.R., Fayyad, M.and Al-Horani, H. 1997. Some environmental problems associated with the use of treated wastewater for irrigation in Jordan. Agricultural Water Management, 34; 81-94.

Al-Shayeb, S.M., Al-Rajhi M.A. and. Seaward, M.R.D. 1995. The date palm (Phoenix

dactyliferaL.) as a biomonitor of lead and other elements in arid environments. Science of theTotal Environment, 168; 1-10.

Anastassopoulou, J. 2003. Metal–DNA interactions. Journal of Molecular Structure, 651/653; 19–26. Anonim 2008 Web sitesi: www.mustafaaltinisik.org.uk/21-adsem-01s.pdf Erişim tarihi:

04.09.2008 Anonymous 2008 Web sitesi: www.biozentrum.uni-frankfurt.de/Pharmakologie/index.html

Erişim tarihi: 04.09.2008 Aras, S. and Cansaran, D. 2006. Isolation of DNA for sequence analysis from herbarium material of some lichen species. Turkish Journal of Botany, 30; 449- 453. Atienzar, F.A., Cheung, V.V., Jha, A.N. and Depledge, M.H. 2001. Fitness parameters and

DNA effects are sensitive indicators of copper-induced toxicity in Daphnia manga. Toxicological Sciences, 59; 241-250.

Atienzar, F.A., Cordi, B., Donkin, M.E., Evenden, A.J., Jha, A.N. and Depledge, M.H.

2000. Comparison of ultraviolet-induced genotoxicity detected by random amplified polymorphic DNA with chlorophyll flurescence and growth in a marine macroalgae, Palmaria palmata. Aquatic Toxicology, 50; 1-12.

Atienzar, F.A., Venier, P., Jha, A.N. and Depledge, M.H. 2002. Evaluation of the random

amplified polymorphic DNA (RAPD) assay for the detection of DNA damage and mutations. Mutation Research, 521; 151–163.

39

Barcelo, J. and Poschenrieder, C. 1990. Plant water relations as effected by heavy metal stres. Journal of Plant Nutrition, 13; 1-37.

Baron, M., Arellano, J.B. and Gerge, L. 1995. Copper and photosystem ll: a controversial

relationship. Physiologia Plantarum, 94; 174-180. Bernatzky, R. and Tanksley, S.D. 1989. Restriction fragments as molecular markers for

germplasm analysis and utilization. in: Brown A.D.H., Marshall, D.R., Frankel, O.H. Williams J. T (eds). The Use of Plant Genetic Resources, Cambridge University Press, pp. 353-362, Cambridge.

Bletsos, F.A., Gantidis, N.D. and Tsialtas, J.T. 1999. Heavy metal content of eggplant fruits

grown on different levels of sewage sludge. International Symposium on Composting of Organic Matter 549.

Botstein, D., White, R., Skolnick, M. and Davis, R.W. 1980. Construction of a genetic

linkage map in man using restriction fragmenth length polymorphisms, The American Journal of Human Genetics, 32; 314-331.

Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72; 254-284.

Çelik, A., Kartal, A.A., Akdoğan, A. ve Kaska, Y. 2005. Determining the heavy metal

pollution in Denizli (Turkey) by using Robinio pseudo-acacia L. Environment International, 31(1); 105-112.

Doğan, M. 2005. Ceratophyllum demersum L.’de kadmiyum klorür, sodyum klorür ve

bunların kombinasyonlarının fizyolojik ve morfolojik etkileri. Doktora tezi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı, 23-27.

Doncheva, S., Nikolov, B. and Ogneva, V. 1996. Effect of excess copper on the

morphology of the nucleus in maize root meristem cells. Physiologia Plantarum, 96 (1); 118-122.

Ergül, A. 2000. Asmalarda (Vitis vinifera L. cvs.) Genomik DNA Parmakizi Analizleri ile

Moleküler Karakterizasyon. Doktora Tezi, Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, 159-160.

Fernandes, J.C. and Henriques, F.S. 1991. Biochemical, physiological and structural effect

off excess copper in plants. The Botanical Review, 57; 246-273. Griffiths, H.R., Moller, L., Bartosz, G., Bast, A., Bentoni-Freddari, C., Collins, A., Cooke,

M., Coolen, S., Haenen, G., Hoberg, A.M., Loft, S., Lunec, J., Olinski, R., Parry, J.,

40

Pompella, A., Poulsen, H., Verhagen, H. and Astley, A.B. 2002. Biomarkers. Molecular Aspects of Medicine, 23; 101-208.

Kamalak, F.2006. Kahramanmaraş Bölgesindeki Akarsu ve Kaynak Sularındaki Kurşun,

Kadmiyum ve Bakırın Birlikte Çöktürme/Önzenginleştirme ve Alev Atomik Absorpsiyon Spektrometresiyle Tayini. Yüksek Lisans Tezi. Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, 16.

Khan, S. and Khan, N.N. 1983. Influence of lead and cadmium on the growth and nutrient

concentration of tomato (Lycopersicum esculentum) and egg-plant (Solanum

melongena). Plant and Soil, 74; 387-394. Keller, C. and Hammer, D. 2004. Metal availability and soil toxicity after repeated

croppings of Thlapsi caerulescens in metal contaminated soils. Environmental Pollution, 131; 243-254.

Liu, W., Li, P.J., Qi, X.M., Zhou, Q.X., Zheng, L., Sun, T.H. and Yang, Y.S. 2005. DNA changes in barley (Hordeum vulgare) seedlings induced by cadmium pollution using RAPD analysis. Chemosphere, 61; 158-167. Liu, W., Yang, Y.S., Zhou, Q. X., Xie, L.J., Li, P.J. and Sun, T.H. 2007. Impact assessment

of cadmium contamination on rice (Oryza sativa L.) seedlings at molecular and population levels using multiple biomarkers. Chemosphere, 67; 1155-1163.

Liu, W., Yang, Y.S., Li, P.J., Zhou, Q.X., Xie, L.J. and Han, Y.P. 2009. Risk assessment of

cadmium-contaminated soil on plant DNA damage using RAPD and physiological indices. Journal of Hazardous Material. 161; 878-883.

Mazhoudi, S., Chaoui, A., Habil Ghorbal, M. and El Ferjani, E. 1997. Response of

antioxidant enzymes to excess copper in tomato (Lycopersicon esculentum, Mill.). Plant Science, 127(2); 129-137.

Mediouni, C., Benzarti, O., Tray, B., Mohamed, H.G. and Jemal, F. 2006. Cadmium and

copper toxicity for tomato seedlings. Argonomy for Sustainable Development, 26; 227-232.

Mengoni, A., Gonnelli, C., Galardi, F., Gabbrielli, R. and Bazzicalupo, M. 2000. Genetic

diversity and heavy metal tolerance in populations of Silene paradoxa L. (Caryophyllaceae): a random amplified polymorphic DNA analysis. Molecular Ecology, 9; 1319-1324.

Nikookar, K., Moradshahi, A. and Hosseini, L. 2005. Physiological responses of Dunaliella

salina and Dunaliella tertiolecta to copper toxicity. Biomolecular Engineering, 22 (4); 141-146.

41

Neelima, P. and Reddy, K.J. 2003. Differential effect of cadmium and mercury on growth and metabolism of Solanum melongena L. seedlings. Journal of Environmental Biology, 24(14); 453-460.

Olson, K.R., Squibb, K.S. and Cousins, R.J. 1978. Tissue uptake, subcellular distribution,

and metabolism of 14CH3HgCl and CH3(203)HgCl by rainbow trout, Salmo

Gardneri. Journal of the fisheries research board of Canada, 35 (4); 381-390. Omran, R.G. (1980) Peroxide Levels and the Activities of Catalase, Peroxidase, and

Indoleacetic Acid Oxidase during and after Chilling Cucumber Seedlings. Plant Physiology,65: 407-408.

Ouariti, O., Boussama, N. and Zarrouk, M. 1997. Cadmium- and copper-induced changes

in tomato membran lipids. Photochemistry, 45(7); 1343-1350. Ouzounidou, G., Ilias, I., Tranopoulou, H. and Karataglis, S. 1998. Amelioration of copper

toxicity by iron on spinach physiology. Journal of Plant Nutrition, 21; 2089-2101. Paran, I. and Michelmore, R.W. 1993. Development of reliable PCR based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theoretical and Applied Genetics, 85; 985–993. Ralph, P.J. and Burchett, M.D. 1998. Photosynthetic response of Halophila ovalis to heavy

metal stres. Environmental Pollution, 103; 91-101. Savva, D. 2000. The use of arbitrarily primed PCR (AP-PCR) fingerprinting to detect exposure to genotoxic chemicals. Ecotoxicology, 9; 341–353. Sierra, M.J., Millán, R. and Esteban, E. 2008. Potensial use of Solanum melongena in

agricultural areas with high mercury background concentrations. Food and Chemical Toxicology, 46; 2143-2149.

Steffan, R.J. and Atlas, R. M., 1991, Polymerase Chain reaction: Applications in

Environmental Microbiology, Annual Review of Microbiology, 15; 137-161. Staub, J.E., Kuhns, L.J., May, B. and Grun, P. 1982. Stability of potato tuber isozymes

under different storage regimes. Jouranl of the American Society for Horticultural Science, 107; 428-432.

Theodorakis, C.W., Bickham, J.W. and Lamb, T. 2001. Integration of genotoxicity and population genetic analyses in kangaroo rats (Dipodomys merriami) exposed to radionuclide contamination at the Nevada test site, USA. Environmental Toxicology and Chemistry, 20; 317-326.

42

Theophanides, T. 1981. Fourier transform infrared spectra of calf thymus DNA and its reactions with the anticancer drug cisplatin. Applied Spectroscopy, 35; 461-465. Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. and Tingey, S.V. 1990. DNA

Polimorphisms Amplified by Arbitrary Primers are Useful as Genetic Markers. Nucleic Acids Research, 18, 6531-6535.

Welsh, J. and McClelland, M. 1990. Fingerprinting Menomes using PCR with Arbitrary

Primers. Nucleic Acids Research, 18; 7213-7218. Wong, M.H. and Bradshaw, A.D. 1982. A comparison of the toxicity of heavy metals,

using root elongation of ryegrass, Lolium perenne. New Phytologist, 91; 255-261. Yang, D. and Wang, A.H.-J. 1996. The structural studies of interactions between anticancer

platinum drugs and DNA. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 66; 81-111.

Yu, M.H. 2005. Environmental toxicology: biological and health effects of pollutants. CRC

press, Boca Raton. Zengin, F.K. ve Munzuroğlu, Ö. 2004. Effect of lead (Pb++) and copper (Cu++) on the

growth of root, shoot and leaf of bean (Phaseolus vulgaris L.) seedlings. G.Ü.Fen Bilimleri Dergisi, 17(3); 1-10.

Zhengua, S., Wang, J. and Guan, H. 1993. Effect of aluminum and calcium on growth of

wheat seedlings and germination of seeds. Journal of the Plant Nutrition, 16; 2135-2148.

43

EK

EK1 Toplam çözünür protein standardı

y = 3,7112x

R2 = 0,9955

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,05 0,1 0,15 0,2

mg/ml BSA

Spektrometrede okunan değerler

44

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Didem AKSOY

Doğum Yeri : Giresun

Doğum Tarihi : 03.03.1984

Medeni Hali : Bekar

Yabancı Dili : İngilizce

Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)

Lise : Hamdi Bozbağ Anadolu Lisesi (1999-2002)

Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü

(2002-2006)

Yüksek Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü

Biyoloji Anabilim Dalı (2007-2009)

Çalıştığı Kurum ve Yıl

Başkent Üniversitesi Transplantasyon ve Gen Bilimleri Enstitüsü (2008- …)