BAB IIIMETODE KERJA

3.1. Alat dan Bahan

3.1.1. Alat

a. Autoklaf

b. Batang pengaduk

c. Cawan petri

d. Drigalsky

e. Freezer

f. Hot plate

g. Inkubator

h. Jarum ose bulat

i. Jarum ose lurus

j. Labu Erlenmeyer

k. Laminar Air Flow (LAF)

l. Object glass

m. Pembakar spiritus

n. Pipet tetes

o. Pipet volume

p. Pro pipet

q. Rak tabung

r. Sendok tanduk

s. Spatula

t. Spoid

u. Tabung durham

v. Tabung reaksi

w. Timbangan digital

3.1.2.Bahan

a. Alumunium foil

b. Aquades

c. Bakteri

a) Bacillus subtilis

b) Eschericia coli

c) Salmonella thyposa

d) Staphylococcus aureus

e) Streptococcus mutans

d. H2O2 3%

e. Kapas

f. Medium

a) Gelatin

b) Kliger Iron Agar (KIA)

c) Lysine Iron Agar (LIA)

d) Manitol

e) Methyl Red

f) Milk Agar

g) Nutrient Agar (Agar, pepton, ekstrak daging)

h) Simmons Citrate Agar (SCA)

i) Urea agar

f. Sampel

a) Air got

b) Air sumur

c) Air sungai karang mumus

d) Air sungai Mahakam

e) Tanah sampah

3.2. Cara Kerja

3.2.1.Pembuatan Medium

a. Nutrient Agar (NA)

a) Ditimbang ekstrak daging 0,3 gram, pepton 0,5 gram, dan agar 1,5 gram

b) Dimasukkan bahan ke dalam labu Erlenmeyer

c) Ditambahkan aquades hingga 100 mL dan dihomogenkan

d) Dipanaskan dengan hot plate hingga mendidih

e) Didinginkan dan labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium

foil

f) Disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 121 oC selama 15 menit pada

tekanan 2 atm

b. Milk Agar

a) Ditimbang Milk Agar instan sebanyak 1,2 gram

b) Dimasukkan bahan ke dalam labu Erlenmeyer

c) Ditambahkan aquades hingga 50 mL dan dihomogenkan

d) Dipanaskan dengan hot plate hingga mendidih

e) Didinginkan dan labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil

f) Disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 121 oC selama 15 menit pada

tekanan 2 atm

c. Manitol

a) Ditimbang Manitol instan sebanyak 10,8 gram

b) Dimasukkan bahan ke dalam labu Erlenmeyer

c) Ditambahkan aquades hingga 100 mL dan dihomogenkan

d) Dipanaskan dengan hot plate hingga mendidih

e) Didinginkan dan labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil

f) Disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 121 oC selama 15 menit pada

tekanan 2 atm

d. Kliger Iron Agar (KIA)

a) Ditimbang Kliger Iron Agar instan sebanyak 2,25 gram

b) Dimasukkan bahan ke dalam labu Erlenmeyer

c) Ditambahkan aquades hingga 50 mL dan dihomogenkan

d) Dipanaskan dengan hot plate hingga mendidih

e) Didinginkan dan labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil

f) Disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 121 oC selama 15 menit pada

tekanan 2 atm

e. Gelatin

a) Ditimbang Gelatin sebanyak 7,5 gram

b) Dimasukkan bahan ke dalam labu Erlenmeyer

c) Ditambahkan aquades hingga 50 mL dan dihomogenkan

d) Dipanaskan dengan hot plate hingga mendidih

e) Didinginkan dan labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil

f) Disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 121 oC selama 15 menit pada

tekanan 2 atm

f. Methyl Red

a) Ditimbang Methyl Red instan sebanyak 1,7 gram

b) Dimasukkan bahan ke dalam labu Erlenmeyer

c) Ditambahkan aquades hingga 100 mL dan dihomogenkan

d) Dipanaskan dengan hot plate hingga mendidih

e) Didinginkan dan labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil

f) Disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 121 oC selama 15 menit pada

tekanan 2 atm

g) Urea Agar

a) Ditimbang Urea Agar instan sebanyak 2,5 gram

b) Dimasukkan bahan ke dalam labu Erlenmeyer

c) Ditambahkan aquades hingga 100 mL dan dihomogenkan

d) Dipanaskan dengan hot plate hingga mendidih

e) Didinginkan dan labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil

f) Disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 121 oC selama 15 menit pada

tekanan 2 atm

h. Simmons Citrate Agar (SCA)

a) Ditimbang Simmons Citrate Agar instan sebanyak 2,3 gram

b) Dimasukkan bahan ke dalam labu Erlenmeyer

c) Ditambahkan aquades hingga 100 mL dan dihomogenkan

d) Dipanaskan dengan hot plate hingga mendidih

e) Didinginkan dan labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil

f) Disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 121 oC selama 15 menit pada

tekanan 2 atm

i. Pembuatan larutan H2O2 3 %

a) Diambil larutan H2O2 50 % sebanyak 0,6 mL

b) Dimasukkan dalam labu takar 10 mL

c) Ditambahkan aquades hingga tanda batas

d) Dihomogenkan larutan

j. Lysine Iron Agar (LIA)

a) Ditimbang Lysin Iron Agar instan sebanyak 3,4 gram

b) Dimasukkan bahan ke dalam labu Erlenmeyer

c) Ditambahkan aquades hingga 100 mL dan dihomogenkan

d) Dipanaskan dengan hot plate hingga mendidih

e) Didinginkan dan labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil

f) Disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 121 oC selama 15 menit pada

tekanan 2 atm

3.2.2.Pembuatan Kultur Sampel

a. Tanah sampah (Metode sebar)

a) Disiapkan sampel tanah sampah

b) Disiapkan cawan petri yang telah disterilisasi

c) Dimasukkan medium NA sebanyak 10 mL dengan menggunakan spoid

d) Ditunggu hingga medium NA memadat

e) Disebarkan sampel tanah sampah dengan menggunakan spatula

f) Ditutup cawan petri dan dibungkus

g) Diinkubasi dalam inkubator selama 1x24 jam pada suhu 37 oC

b. Air Sungai Mahakam (Metode tuang)

a) Disiapkan sampel air sungaiMahakam

b) Disiapkan cawan petri yang telah disterilisasi

c) Dimasukkan sampel dengan menggunakan spoid sebanyak 2 mL

d) Dimasukkan medium NA sebanyak 10 mL dengan menggunakan spoid

e) Dihomogenkan sampel dan medium

f) Ditunggu hingga medium NA memadat

g) Ditutup cawan petri dan dibungkus

h) Diinkubasi dalam inkubator selama 1x24 jam pada suhu 37 oC

c. Air Sungai Karang Mumus (Metode tuang)

a) Disiapkan sampel air sungai karang mumus

b) Disiapkan cawan petri yang telah disterilisasi sebelumnya

c) Dimasukkan sampel dengan menggunakan spoid sebanyak 2 mL

d) Dimasukkan medium NA sebanyak 10 mL dengan menggunakan spoid

e) Dihomogenkan sampel dan medium

f) Ditunggu hingga medium NA memadat

g) Ditutup cawan petri dan dibungkus

h) Diinkubasi dalam inkubator selama 1x24 jam pada suhu 37 oC

d. Air Sumur (Metode tuang)

a) Disiapkan sampel air sumur

b) Disiapkan cawan petri yang telah disterilisasi sebelumnya

c) Dimasukkan sampel dengan menggunakan spoid sebanyak 2 mL

d) Dimasukkan medium NA sebanyak 10 mL dengan menggunakan spoid

e) Dihomogenkan sampel dan medium

f) Ditunggu hingga medium NA memadat

g) Ditutup cawan petri dan dibungkus

h) Diinkubasi dalam inkubator selama 1x24 jam pada suhu 37 oC

e. Air Got (Metode tuang)

a) Disiapkan sampel air got

b) Disiapkan cawan petri yang telah disterilisasi sebelumnya

c) Dimasukkan sampel dengan menggunakan spoid sebanyak 2 mL

d) Dimasukkan medium NA sebanyak 10 mL dengan menggunakan spoid

e) Dihomogenkan sampel dan medium

f) Ditunggu hingga medium NA memadat

g) Ditutup cawan petri dan dibungkus

h) Diinkubasi dalam inkubator selama 1x24 jam pada suhu 37 oC

3.1.1.Pembuatan Biakan Sampel

a. Disiapkan sampel yang sudah diisolasi di dalam cawan petri

b. Dimasukkan medium NA ke dalam tabung reaksi, dibuat agar miring dan

ditunggu hingga medium memadat

c. Diambil sampel pada cawan petri dengan jarum ose bulat lalu digoreskan

secara zig-zag pada medium di dalam tabung reaksi

d. Ditutup tabung reaksi dengan kapas dan diinkubasi didalam inkubator

selama 1x24 jam pada suhu 37 oC

3.2.3.Pembuatan Biakan Bakteri

a. Esherichia coli

a) Disiapkan biakkan murni Esherichia coli

b) Disiapkan tabung reaksi yang telah berisi medium agar miring

c) Digoreskan secara zig-zag dengan ose bulat steril pada biakkan murni,

kemudian digoreskan pada tabung reaksi yang berisi medium agar miring

d) Ditutup tabung reaksi dengan kapas dan alumunium foil

e) Dilakukan seluruh pengerjaan pada Laminar Air Flow (LAF)

f) Diletakkan tabung reaksi pada inkubator selama 1x24 jam pada suhu 37 oC.

b. Bacillus subtillis

a) Disiapkan biakkan murni Bacillus subtillis

b) Disiapkan tabung reaksi yang telah berisi medium agar miring

c) Digoreskan secara zig-zag dengan ose bulat steril pada biakkan murni,

kemudian digoreskan pada tabung reaksi yang berisi medium agar miring

d) Ditutup tabung reaksi dengan kapas dan alumunium foil

e) Dilakukan seluruh pengerjaan pada Laminar Air Flow (LAF)

f) Diletakkan tabung reaksi pada inkubator selama 1x24 jam pada suhu 37 oC

c. Staphylococcus aureus

a) Disiapkan biakkan murni Staphylococcus aureus

b) Disiapkan tabung reaksi yang telah berisi medium agar miring

c) Digoreskan secara zig-zag dengan ose bulat steril pada biakkan murni

kemudian digoreskan pada tabung reaksi yang berisi medium agar miring

d) Ditutup tabung reaksi dengan kapas dan alumunium foil

e) Dilakukan seluruh pengerjaan pada Laminar Air Flow (LAF)

f) Diletakkan tabung reaksi pada inkubator selama 1x24 jam pada suhu 37 oC

d. Salmonella thyposa

a) Disiapkan biakkan murni Salmonella thyposa

b) Disiapkan tabung reaksi yang telah berisi medium agar miring

c) Digoreskan secara zig-zag dengan ose bulat steril pada biakkan murni,

kemudian digoreskan pada tabung reaksi yang berisi medium agar miring

d) Ditutup tabung reaksi dengan kapas dan alumunium foil

e) Dilakukan seluruh pengerjaan pada Laminar Air Flow (LAF)

f) Diletakkan tabung reaksi pada inkubator selama 1x24 jam pada suhu 37 oC

e. Streptococcus mutans

a) Disiapkan biakkan murni Streptococcus mutans

b) Disiapkan tabung reaksi yang telah berisi medium agar miring

c) Digoreskan secara zig-zag dengan ose bulat steril pada biakkan murni

kemudian digoreskan pada tabung reaksi yang berisi medium agar miring

d) Ditutup tabung reaksi dengan kapas dan alumunium foil

e) Dilakukan seluruh pengerjaan pada Laminar Air Flow (LAF)

f) Diletakkan tabung reaksi pada inkubator selama 1x24 jam pada suhu 37 oC

3.1.2.Prosedur Uji Biokimia

a. Uji Hidrolisis Polisakarida, Protein, dan Lemak

a) Disiapkan 3 cawan petri yang berisi medium Milk Agar

b) Dibagi atau ditandai menjadi dua bagian setiap cawan petri, lalu sampel dan

biakkan bakteri digoreskan secara zig-zag dengan ose bulat steril pada

medium

c) Ditutup cawan petri dan dibungkus dengan kertas

d) Diinkubasi dalam inkubator selama 2x24 jam pada suhu 37 oC

e) Diamati reaksi positif bila terdapat daerah bening di sekeliling biakan pada

cawan petri

b. Uji Katalase

a) Ditetesi larutan H2O2 3% (2-3 tetes) pada object glass

b) Diambil biakan menggunakan ose bulat secara steril (2 bakteri, dan 3

sampel)

c) Diamati reaksi positif bila terdapat gelembung O2

c. Uji Methyl Red

a) Disiapkan 6 tabung reaksi berisi medium Methyl red dan tabung durham di

dalamnya

b) Ditanamkan biakkan pada medium (1 bakteri, 4 sampel dan 1 kontrol)

c) Diinkubasi selama 5-7 x 24 jam dengan suhu optimum 37 oC

d) Diamati reaksi positif bila warna medium menjadi warna kuning

dibandingkan dengan kontrol

c. Uji Fermentasi Karbohidrat

a) Disiapkan 8 tabung reaksi dan diisi dengan medium manitol sebanyak 5 mL

b) Dimiringkan 10o dan ditunggu hingga padat

c) Digoreskan biakkan/sampel menggunakan ose bulat pada tabung reaksi (3

bakteri, 4 sampel, dan 1 kontrol)

d) Diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37 oC

e) Diamati reaksi positif bila terjadi perubahan warna medium menjadi bening

dibandingkan kontrol

e. Uji Produksi H2S

a) Disiapkan 7 tabung reaksi, diisi dengan medium KIA, diletakkan di rak

tabung dan di tunggu hingga memadat

b) Ditusuk biakkan/sampel menggunakan ose lurus pada tabung reaksi (4

sampel, 3 bakteri dan 1 kontrol)

c) Diinkubasi selama 7x24 jam pada suhu 37 oC

d) Diamati reaksi positif bila terdapat warna hitam disepanjang tusukan pada

medium dibandingkan dengan kontrol

f. Uji Pencairan Gelatin

a) Disiapkan 7 tabung reaksi dan dimasukkan medium gelatin

b) Ditanamkan biakkan/sampel uji dengan ose bulat pada tabung yang berisi

medium cair gelatin (4 sampel, 2 biakkan dan 1 kontrol)

c) Diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37 oC

d) Dimasukkan ke dalam freezer selama 10-15 menit sampai 1x24 jam

e) Diamati reaksi positif bila medium gelatin menjadi cair dibandingkan

dengan

kontrol

g. Uji Tes Urease

a) Disiapakan 7 tabung reaksi dan dimasukkan medium urea agar

b) Ditunggu hingga medium memadat

c) Ditusuk biakkan/sampel uji dengan ose lurus pada medium di tabung reaksi

(4 sampel, 2 bakteri dan 1 kontrol)

d) Diinkubasi 24 jam pada suhu 37 oC

e) Diamati bila reaksi positif terjadi perubahan warna menjadi merah dan

dibandingkan dengan kontrol

h. Uji Tes Utilisasi Citrate

a) Disiapkan 7 tabung reaksi dan dimasukkan medium SCA, lalu dimiringkan

100, dan dibiarkan hingga memadat

b) Ditanamkan biakkan sampel/bakteri dengan ose bulat (zig-zag) pada tabung

reaksi (4 sampel, 2 bakteri, dan 1 kontrol)

c) Diinkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37 oC

d) Diamati reaksi positif bila terjadi perubahan warna medium menjadi warna

biru tua/ biru gelap dibandingankan dengan kontrol

i. Uji Tes Lysine Decarboxylase

a) Disipakan 7 tabung reaksi dan dimasukkan medium LIA, ditunggu hingga

memadat

b) Ditanamkan biakkan sampel/bakteri dengan ose lurus pada tabung reaksi (4

sampel, 2 bakteri, dan 1 kontrol)

c) Diinkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37 oC

Diamati reaksi positif bila ada tusukan violet di dalam medium