LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

GRETA KALVAITYTĖ

BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ DIDŽIOSIOS UGNIAŽOLĖS

(CHELIDONIUM MAJUS L.) ŽOLĖS, KOKYBINĖ –

KIEKYBINĖ ANALIZĖ, ANTIOKSIDANTINIO

AKTYVUMO TYRIMAS BEI KIETŲJŲ KAPSULIŲ

GAMYBA

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

prof. dr. Nijolė Savickienė

Konsultantas:

prof. habil. dr. Arūnas

Savickas

KAUNAS, 2015

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis

Data

BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ DIDŽIOSIOS UGNIAŽOLĖS (CHELIDONIUM

MAJUS L.) ŽOLĖS, KOKYBINĖ – KIEKYBINĖ ANALIZĖ,

ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS BEI KIETŲJŲ

KAPSULIŲ GAMYBA

Magistro baigiamasis darbas

Konsultantas: Darbo vadovas:

prof.habil. dr. Arūnas Savickas prof. dr. Nijolė Savickienė

Data Data

Recenzentas Darbą atliko

................................... Magistrantė

................................... Greta Kalvaitytė

Data Data

KAUNAS, 2015

3

TURINYS

SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 5

SUMMARY ............................................................................................................................................. 7

SANTRUMPOS .................................................................................................................................... 10

SĄVOKOS ............................................................................................................................................ 11

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ................................................................................................ 12

1. LITERATŪROS APŽVALGA ....................................................................................................... 13

1.1. Chelidonium majus L. žolės cheminė sudėtis ir farmakologinės savybės ...................................... 13

1.2. Baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, biologinės ir farmakologinės savybės .............. 13

1.3. Chelidonium majus L. žolės cheminėje sudėtyje esančių biologiškai aktyvių junginių

antioksidantinio aktyvumo tyrimai ......................................................................................................... 14

1.4. Baltymų frakcionavimas ir kokybinė analizė .................................................................................. 15

1.4.1. Baltymų frakcionavimo metodas – gelchromatografija ............................................................... 15

1.4.2. Kokybinis baltymų nustatymas – plonasluoksnė chromatografija ............................................... 16

1.4.3. Kokybinis baltymų nustatymas – baltymų NaDS – PAGE elektroforezė .................................... 17

1.5. Kiekybinis baltymų nustatymas ...................................................................................................... 18

1.5.1. Vario jonų surišimu pagrįstas kiekybinis baltymų nustatymas .................................................... 18

1.5.2. Kumasi (Coomasie) briliantinio mėlio dažiklio surišimu pagrįstas kiekybinis baltymų

nustatymas .............................................................................................................................................. 19

1.6. Technologinės baltymų formos ....................................................................................................... 20

1.7. Kietųjų kapsulių gamyba ................................................................................................................. 21

1.8. Veikliosios medžiagos atsipalaidavimo ypatumai ir nustatymo metodai ....................................... 21

2. TYRIMO METODIKA ................................................................................................................... 23

2.1. Tyrimo objektas ............................................................................................................................... 23

2.2. Reagentai ......................................................................................................................................... 23

2.2.1. Reagentų paruošimas .................................................................................................................... 24

2.2.1.1. Gelchromatografijoje naudotas fosfatinis buferis……………………………………………..24

2.2.1.2. Tirpalai, naudoti baltymų elektroforezėje…………………………………………………….24

2.2.1.3. Geliai, naudoti baltymų elektroforezėje……………………………………………………….25

2.2.1.4. Jaučio serumo albumino standarto, naudoto Bradford metodo kalibracinei kreivei sudaryti,

tirpalų gamyba………………………………………………………………………………………….25

2.2.1.5. ABTS radikalo – katijono tirpalo gamyba…………………………………………………….26

2.3. Įranga ............................................................................................................................................... 26

2.4. Analitiniai metodai .......................................................................................................................... 27

2.4.1. Baltymų frakcijų skirstymas gelchromatografijos metodu .......................................................... 27

2.4.2. Baltymų kiekybinis nustatymas ................................................................................................... 27

2.4.3. NaDS poliakrilamidinio gelio elektroforezė ................................................................................ 28

2.4.4. Kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš Chelidonium majus L. žolės, gamyba ...................... 29

2.4.5. Miltelių technologinių savybių vertinimas ................................................................................... 30

2.4.5.1. Birumo greičio nustatymas ........................................................................................................ 30

4

2.4.5.2. Subėrimo kampo nustatymas .................................................................................................... 30

2.4.6. Pagamintų kietųjų kapsulių kokybės vertinimas .......................................................................... 31

2.4.6.1. Pagamintų kietųjų kapsulių masės vienodumo testas…………………………………………31

2.4.6.2. Pagamintų kietųjų kapsulių tirpimo testas…………………………………………………….31

2.4.7. Baltymų, išsiskyrusių iš pagamintų kietųjų kapsulių, kiekio nustatymas ................................... 32

2.4.8. Baltymų antioksidantinio aktyvumo nustatymas, naudojant (ABTS•+) modelinį radikalą ..... 33

2.4.9. Statistinis duomenų vertinimas .................................................................................................... 33

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ............................................................................................. 34

3.1. Baltymų skirstymo gelchromatografijos metodu rezultatai ............................................................ 34

3.2. Baltymų kiekio nustatymas ............................................................................................................. 35

3.3. Baltymų molekulinės masės tyrimas ............................................................................................... 35

3.4. Miltelių su baltymais, išskirtais iš Chelidonium majus L. žolės, birumo nustatymas..................... 37

3.5. Kietųjų kapsulių su ugniažolių žolės baltymais gamyba ir kapsulių masės vienodumo

nustatymas ............................................................................................................................................. 37

3.6. Baltymų kiekybinis nustatymas po išsiskyrimo iš kietųjų kapsulių ................................................ 38

3.7. Baltymų antioksidantinio aktyvumo tyrimas, naudojant (ABTS•+) modelinį radikalą ................. 38

4. IŠVADOS .......................................................................................................................................... 41

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ............................................................................................. 42

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS............................................................................................................ 43

7. PRIEDAI ........................................................................................................................................... 48

5

SANTRAUKA

BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ DIDŽIOSIOS UGNIAŽOLĖS (CHELIDONIUM

MAJUS L.) ŽOLĖS, KOKYBINĖ – KIEKYBINĖ ANALIZĖ,

ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS BEI KIETŲJŲ

KAPSULIŲ GAMYBA

G. Kalvaitytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė prof. dr. N. Savickienė1;

Konsultantas: prof. habil. dr. Arūnas Savickas2.

1Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

2Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra, –

Kaunas.

Darbo tikslas: Atlikti kokybinę – kiekybinę baltymų, išskirtų iš didžiosios ugniažolės (Chelidonium

majus L.) žolės, analizę, įvertinti baltymų tirpalo antioksidantinį aktyvumą ir pagaminti su šiais

baltymais kietąsias kapsules.

Darbo uždaviniai:

1. Atskirti Chelidonium majus L. žolės baltymų frakcijas pagal dalelių dydį;

2. Kiekybiškai nustatyti baltymų kiekį gautose frakcijose;

3. Baltymų frakcijose nustatyti baltymų molekulinę masę;

4. Pagaminti kietąsias kapsules su baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, tirpalu;

5. Nustatyti, kiek baltymų (%) atsipalaiduoja, tirpstant kietajai kapsulei;

6. Įvertinti iš Chelidonium majus L. žolės išskirtų baltymų ir baltymų, atsipalaidavusių iš kietųjų

kapsulių, antioksidantinį aktyvumą, panaudojant modelinį ABTS (2,2-azino-bis-(3-

etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties)) radikalą – katijoną.

Metodai:

1. Baltymų frakcijos pagal dalelių dydį atskirtos gelchromatografijos metodu;

2. Bradford metodu kiekybiškai nustatyta baltymų sudėtis išskirtose frakcijose;

3. NaDS – PAGE elektroforezės metodu frakcijose nustatyta baltymų molekulinė masė;

4. Kietosios kapsulės pagamintos, baltymų tirpalus džiovinant 20 ± 2°C temperatūroje kartu su

adsorbentais;

5. Baltymų, išsiskyrusių iš kietųjų kapsulių, kiekis nustatytas Bradford metodu;

6. Iš didžiųjų ugniažolių žolės išskirtų baltymų ir baltymų, atsipalaidavusių iš kietųjų kapsulių,

antioksidantinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriškai, matuojant mėginių gebą surišti

ABTS radikalą – katijoną.

6

Rezultatai:

1. Baltymai pagal molekulių dydį suskirstyti į 44 frakcijas;

2. Nustatyta didžiausia baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, koncentracija frakcijose

– 19,654 ± 0,04 µg/ml;

3. Nustatytos baltymų molekulinės masės atskirose frakcijose: 15, 20, 35 ir 38 kDa;

4. Pagamintos kietosios kapsulės su didžiųjų ugniažolių žolės baltymais. Pagalbinės medžiagos –

mikrokristalinė celiuliozė Prosolv® SMCC HD 90 ir bevandenis koloidinis silicio dioksidas

(aerosilas);

5. Atlikus baltymų išsiskyrimo iš kapsulių testą, po 60 minučių kapsulių tirpimo išsiskyrė 91 ±

0,58 % baltymų;

6. Maksimalus antioksidantinis aktyvumas (71,29 ± 0,9%) nustatytas, kai baltymų koncentracija

tirpale buvo 7 μg/ml. Mažiausias antioksidantinis aktyvumas (8,15 ± 1,2 %) pasiektas, kai

baltymų koncentracija tirpale buvo 3 μg/ml. Didžiausias baltymų, išsiskyrusių iš kietųjų

kapsulių, antioksidantinis aktyvumas (35 ± 0,7%) stebėtas, kai iš kietųjų kapsulių išsiskyrė

3,85 ± 0,05 μg baltymų.

Išvados:

1. Atlikus didžiųjų ugniažolių žolės baltymų gelchromatografiją, baltymai atsiskyrė tik dalinai.

2. Frakcijose nustatyta nuo 0,312 ± 0,09 µg/ml iki 19,654 ± 0,04 µg/ml baltymų koncentracija.

3. Nustatyta frakcijose esančių baltymų molekulinė masė atitiko fermentinės kilmės baltymų ir su

chitinu besijungančių glikoproteinų – lektinų molekulinę masę. Reikalingi tolimesni tyrimai,

norint nustatyti šių baltymų tapatybę.

4. Pagamintoje kiekvienoje kietojoje kapsulėje yra 4,86 ± 0,03 µg baltymų. Baltymų ir pagalbinių

medžiagų mišinys yra tinkamas kapsuliavimui, nes pasižymi geru birumu ir atitinka Europos

Farmakopėjos reikalavimus (pagal miltelių birumo greitį ir subėrimo kūgio kampą).

5. Kietųjų kapsulių gamybai pasirinktas tinkamas būdas, nes baltymų atsipalaidavimas iš jų yra

efektyvus, atitinka Europos Farmakopėjos reikalavimus (iš kietosios kapsulės atsipalaidavo

daugiau nei 75% baltymų per 45 min).

6. Baltymai, išskirti iš didžiųjų ugniažolių žolės, geba surišti laisvuosius radikalus. Stebėtas

sumažėjęs baltymų antiradikalinis aktyvumas, pagaminus kapsules. Baltymų aktyvumo

sumažėjimą galėjo lemti jų denatūracija dėl netinkamai parinktų eksperimentinių sąlygų,

gaminant kapsules (temperatūros, ilgo džiovinimo ar kapsulių laikymo laiko).

Reikšminiai žodžiai: Chelidonium majus, baltymai, gelchromatografija, NaDS – PAGE,

antioksidantinis aktyvumas.

7

SUMMARY

QUALITATIVE – QUANTITATIVE ANALYSIS OF PROTEINS

ISOLATED FROM CHELIDONIUM MAJUS L. HERB. EVALUATION OF

ANTIOXIDANT ACTIVITY AND PRODUCTION OF HARD CAPSULES

WITH THESE PROTEINS

Greta Kalvaitytė master thesis/ Supervisor of the research paper: prof. dr. Nijolė Savickienė1

Consultant: prof. habil. dr. Arūnas Savickas2.

1Department of Pharmacognosy, Faculty of pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences,

Kaunas, Lithuania;

2Department of Drug Technology and Social Pharmacy, Faculty of pharmacy, Lithuanian University

of Health Sciences, Kaunas, Lithuania;

Objective of work: to perform the qualitative – quantitative analysis, antioxidant activity of proteins

from Chelidonium majus L. herb, to produce hard capsules with these proteins.

Main tasks:

1. To fractionate proteins from Chelidonium majus L. herb by their particle size;

2. To evaluate the amount of protein in prepared fractions;

3. To assess the molecular mass of protein from Chelidonium majus L. herb in fractions;

4. To produce hard capsules with solution of proteins;

5. To evaluate the amount of protein (%) released from capsule after dissolution;

6. To evaluate antioxidant activity of protein solution and proteins released from hard capsules

against ABTS free radical – cation.

Methods:

1. Protein fractions, depending on their particle size, were separated by gel chromatography;

2. The amount of protein in prepared fractions was evaluated by Bradford assay;

3. The molecular mass of protein from Chelidonium majus L. herb was assesed by SDS – PAGE

assay;

4. Hard capsules were produced by drying solution of proteins in 20 ± 2°C temperature with

adsorbents;

5. The amount of protein (%), released from hard capsules, was evaluated by Bradford assay;

6. The antioxidant activity was evaluated by ABTS free radical – cation scavenging activity test

using spectrophotometry.

8

Results:

1. Proteins depending on particle size were separated into 44 fractions;

2. The biggest amount of proteins in prepared fractions was 19,654 ± 0,04 µg/mL;

3. The particle size in different fractions was 15, 20, 35 and 38 kDa;

4. Hard capsules with proteins from Chelidonium majus L. herb were produced. Support

materials: silicified microcrystalline cellulose Prosolv® SMCC HD 90 and colloidal silicon

dioxide (aerosil);

5. The amount of protein (%), released from hard capsules after 60 min, was 91 ± 0,58 %;

6. Antioxidant activity reached 71,29 ± 0,9 % at 7 μg/ml of protein solution. Least antioxidant

activity (8,15 ± 1,2 %) was achieved at 3 μg/ml of protein solution. The highest antioxidant

activity of proteins, released from hard capsules, was 35 ± 0,7 %, when hard capsules released

3,85 ± 0,05 μg of proteins.

Conclusions:

1. After the gel chromatography of proteins, isolated from Chelidonium majus L. herb, proteins

were separated only partially.

2. The amount of protein in prepared fractions was from 0,312 ± 0,09 µg/mL to 19,654 ± 0,04

µg/mL.

3. The determined protein particle size matched up enzymatic proteins and chitin – binding

glycoproteins (lectins) particle size. Further investigation is necessary to determine the

sameness of protein.

4. Every produced hard capsule contains 4,86 ± 0,03 µg of proteins. Compound of proteins and

support materials is suitable for encapsulation because of a good powder flow. It meets the

requirements of European Pharmacopoeia (by powder flow rate and angle of repose).

5. Method of production of hard capsules was selected properly. Release of proteins from hard

capsules is effective and meets the requirements of European Pharmacopoeia (hard capsule

released more than 75% of proteins in 45 min).

6. Protein fractions are able to bind free radicals. This activity decreased after encapsulation of

proteins. Decreased activity of proteins could be determined by their denaturation, which was

caused by inappropriate conditions of producing capsules (temperature, long time of drying or

storage).

Key words: Chelidonium majus, proteins, gel chromatography, SDS – PAGE, antioxidant activity.

9

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju magistrinio darbo vadovei prof. dr. Nijolei Savickienei už atsakingą

požiūrį, kantrybę ir nepaprastai vertingas konsultacijas, rengiant mokslinį – tiriamąjį darbą.

Taip pat prof. habil. dr. Arūnui Savickui už skirtą laiką ir pagalbą priimant technologinius sprendimus.

Vilniaus Universiteto Biotechnologijos instituto darbuotojams dėkoju už suteiktą materialinę bazę ir

kokybiško darbo sąlygas, vykdant numatytuosius tyrimus.

Mylimai šeimai dėkoju už neblėstantį tikėjimą ir palaikymą.

10

SANTRUMPOS

CmGRP1 – glicinu praturtintas, su RNR besijungiantis baltymas (Chelidonium majus L. Glycine Rich

RNA – binding protein);

CMP – fermentinės kilmės baltymas – peroksidazė;

CMN1, CMN2 – fermentinės kilmės baltymai – nukleazės;

CBL-1 – didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) glikoproteinas lektinas;

PC – plonasluoksnė chromatografija;

JSA – jaučio serumo albuminas (anglų k. BSA – bovine serum albumin);

BCR – bicinchoninė rūgštis (anglų k. BCA – bicinchoninic acid);

PBS – fosfatinio buferio tirpalas;

ABTS – 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis);

IP – išaktyvinimo procentas;

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas;

NaDS – natrio dodecilsulfatas (anglų k. SDS – sodium dodecyl sulfate);

NaDS – PAGE – natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė;

TRIS – 2-amino-2-hidroksimetil-propano-1,3-diolis;

TEMED – N, N, N´, N´- tetrametiletilendiaminas;

APS – amonio persulfatas.

11

SĄVOKOS

Adsorbcija – medžiagos sugėrimas iš dujų ar skysčių adsorbento paviršiumi.

Apoptozė – savaiminė ląstelių žūtis.

Chelacija – susijungimas su metalų jonais ir netirpių junginių sudarymas.

Chitinas – angliavandenis, sudarytas iš N-acetilgliukozamino monomerų.

Glicinas – pakeičiamoji amino rūgštis.

Lektinai – neimuninės ir nefermentinės kilmės baltyminės medžiagos, gebančios atpažinti ir jungtis

prie įvairių angliavandenių bei sukelti ląstelių agliutinaciją.

Supernatantas – virš nuosėdų esantis skystis po centrifugavimo.

ĮVADAS

Šio tyrimo objektas – iš didžiųjų ugniažolių žolės išskirti baltymai. Didžioji ugniažolė

(Chelidonium majus L.) – vaistinis augalas, pasižymintis antiuždegiminiu, choleretiniu, spazmolitiniu,

analgetiniu, antimikrobiniu, antivirusiniu, antioksidantiniu, antinavikiniu, imunomoduliuojančiu

veikimu [2]. Vaistinėje augalinėje žaliavoje – žolėje – kaupiami alkaloidai, organinės rūgštys,

flavonoidai, karotinoidai ir kiti biologiškai aktyvūs junginiai [4].

Vaistinių augalų farmakologiniai poveikiai priklauso ne tik nuo biologiškai aktyvių antrinių

metabolitų, bet ir nuo pirminių metabolitų, pvz., baltymų. Atlikta daug tyrimų in vivo ir in vitro su

Chelidonium majus L. žolėje esančiomis biologiškai aktyviomis medžiagomis, tačiau vis dar mažai

žinoma apie šioje vaistinėje augalinėje žaliavoje esančius baltymus, jų savybes ir biologinį aktyvumą.

Todėl ši tiriamojo darbo tema yra aktuali.

Siekiant įvertinti biologinį ir farmakologinį baltymų aktyvumą, baltymams turi būti suteikta

technologinė forma. Kietosios kapsulės – preliminariems baltymų in vivo tyrimams tinkama

technologinė forma. Kapsulių gamybos metodas yra paprastas ir nereikalaujantis itin daug gamybos

etapų bei įrengimų. Ši farmacinė forma užtikrina tikslų dozavimą bei priimtiną ir paprastą vartojimą

[39].

Literatūros duomenimis, didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) žolės ekstraktuose

esantys alkaloidai, fenoliniai junginiai, β – karotenas pasižymi antioksidantiniu aktyvumu, tačiau

antioksidantinis baltymų, išskirtų iš žolės, aktyvumas iki šiol tirtas nebuvo. Šiems baltymams nebuvo

pritaikyta ir technologinė forma, todėl antioksidantinio baltymų nustatymo ir kietųjų kapsulių gamyba

yra šio darbo naujumas.

12

Darbo tikslas: atlikti kokybinę – kiekybinę baltymų, išskirtų iš didžiosios ugniažolės

(Chelidonium majus L.) žolės, analizę, įvertinti baltymų tirpalo antioksidantinį aktyvumą ir pagaminti

su šiais baltymais kietąsias kapsules.

Magistro baigiamojo darbo tikslas įgyvendintas bendradarbiaujant kartu su Baltarusijos

Valstybinės mokslų akademijos, V. F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institutu (vykdant

bendrą projektą: „Naujų augalinės kilmės polipeptidų lektinų tyrimas ir panaudojimo būdų paieška,

kuriant potencialius immunomoduliatorius ir citostatikus“ (Paraiškos registracijos Nr. TAP-LB-12-

006)). Šiame institute iš Chelidonium majus L. žolės išskirti baltymai. Sutikus bendradarbiauti ir

Vilniaus Universiteto Biotechnologijos instituto mokslo darbuotojams, didžiųjų ugniažolių žolės

baltymai įvertinti kokybiškai (natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezės metodu) ir

kiekybiškai (spektrofotometriniu Bradford metodu). Su tiriamųjų baltymų tirpalu, džiovinant jį 20 ±

2°C temperatūroje kartu su adsorbentais, pagamintos kietosios kapsulės, kurių atsipalaidavimas ištirtas

krepšelio metodu. ABTS radikalo – katijono surišimo metodu nustatytas iš didžiųjų ugniažolių žolės

išskirtų baltymų ir baltymų, atsipalaidavusių iš kietųjų kapsulių, antioksidantinis aktyvumas.

Atlikus tyrimus, paruoštas pranešimas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Studentų

mokslinės draugijos (SMD) organizuojamoje Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencijose 2014

metais. Taip pat pristatytas stendinis pranešimas tarptautinėje konferencijoje „5th International

Conference on Pharmaceutical Sciences and Pharmacy Practise, dedicated to 145th Anniversary of

prof. Petras Raudonikis 2014“.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Atlikti kokybinę – kiekybinę baltymų, išskirtų iš didžiosios ugniažolės

(Chelidonium majus L.) žolės, analizę, įvertinti baltymų tirpalo antioksidantinį aktyvumą ir pagaminti

su šiais baltymais kietąsias kapsules.

Darbo uždaviniai:

1. Atskirti Chelidonium majus L. žolės baltymų frakcijas pagal dalelių dydį;

2. Kiekybiškai nustatyti baltymų kiekį gautose frakcijose;

3. Baltymų frakcijose nustatyti baltymų molekulinę masę;

4. Pagaminti kietąsias kapsules su baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, tirpalu;

5. Nustatyti, kiek baltymų (%) atsipalaiduoja, tirpstant kietajai kapsulei;

6. Įvertinti iš Chelidonium majus L. žolės išskirtų baltymų ir baltymų, atsipalaidavusių iš kietųjų

kapsulių, antioksidantinį aktyvumą, panaudojant modelinį ABTS radikalą – katijoną.

13

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Chelidonium majus L. žolės cheminė sudėtis ir farmakologinės savybės

Didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) vaistinė augalinė žaliava – žolė, yra aprašyta

Europos Farmakopėjos monografijoje (01/2008:1861) [1]. Augalas priklauso aguoninių

(Papaveraceae) šeimai ir pasižymi antiuždegiminiu, choleretiniu, spazmolitiniu, analgetiniu,

antimikrobiniu, antivirusiniu, antioksidantiniu, antinavikiniu, imunomoduliuojančiu veikimu [2].

Chelidonium majus L. žolė kaupia antrinius metabolitus – alkaloidus [3]. Žolėje

identifikuojama per 20 skirtingų alkaloidų (iki 1 %), kurie yra skirstomi į

kelias grupes: benzofenantridino darinius (chelidoninas, cheleritrinas, sangvinarinas, izochelidoninas),

protoberberino darinius (berberinas, koptizinas) bei protopiną. Randama ir organinių

rūgščių – chelidoninės, p-hidroksibenzoinės, obuolių, citrinų, kofeino (0,4%), p-kumarino

(0,06%). Taip pat žolėje nustatyti saponinai, flavonoidai, karotenoidai, chelidocistatinas [4].

2013 metais Rumunijoje spektrometriškai nustatytos įvairios mineralinės medžiagos Chelidonium

majus L. žolėje – daugiausia aptikta kalio (4420mg/kg) ir kalcio (4402mg/kg) [5].

Pastaruoju metu didesnis dėmesys skiriamas Chelidonium majus L. žolėje esantiems

baltymams išskirti ir analizuoti. 2007 metais iš Chelidonium majus L. sulčių išskirtas 21 baltymas [6].

Tais pačiais metais identifikuoti kiti du fermentinės kilmės baltymai – peroksidazė (CMP) ir

nukleazės: CMN1 (20 kDa) ir CMN2 (36kDa) [7]. 2014 metais atlikta proteominė Chelidonium majus

L. žolės ektrakto analizė. Ekstrakte nustatytas 1240 skirtingų baltymų rinkinys. Daugiausia rasta

baltymo 14-3-3 (17%), šiluminio šoko baltymo (anglų k. heat shock protein) (16%), peroksidazės

(13%), peroksiredoksino (9%) ir glioksalazės (9%) [8]. Augalo žolėje esančiose geltonos spalvos

sultyse aptinkama glikoproteinų, tokių kaip lektinai [9]. Šių glikoproteinų sudėtyje dominuojančios

amino rūgštys yra serinas (13,04%), asparto rūgštis (11,61%), glicinas (9,51%), leucinas (9,06%),

treoninas (7,82%) [10].

1.2. Baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, biologinės ir farmakologinės

savybės

Nustatyta, kad Chelidonium majus L. žolės sultyse rastas glicinu praturtintas baltymas

(CmGRP1) priklauso su RNR besijungiančių baltymų klasei. Tai baltymai, padedantys augalams

greitai reaguoti į aplinkos pasikeitimus, sužeidimus ir patogenų (bakterijų, virusų) invazijas. Atsiradus

patogeno sukeltai infekcijai, šie baltymai per signalinius kelius aktyvuoja už gynybą atsakingus genus

14

ir inicijuoja augalo atsparumą, t.y., infekcija nuslopinama. Atsiradus virusinei infekcijai, šie baltymai

atpažįsta ir tiesiogiai susijungia su viruso RNR, paveikdami jos replikaciją [11].

2008 metais Lenkijoje vykdytas tyrimas atskleidė, kad iš Chelidonium majus L. žolės išskirti

fermentinės kilmės baltymai nukleazės (CMN1 ir CMN2) paskatina moters gimdos kaklelio vėžinių

ląstelių apoptozę. Šie baltymai geba hidrolizuoti nukleino rūgščių fosfodiesterines jungtis. Po 48

valandų inkubacinio periodo su 13,3 ng/ml koncentracijos nukleaze CMN2, 62 ± 3% vėžinių ląstelių

sukelta apoptozė [12].

2014 metais Gruzijoje įrodyta, kad su chitinu besijungiantis baltymas lektinas (CBL-1),

išskirtas iš Chelidonium majus L. augalo, pasižymi agliutinaciniu aktyvumu. Tyrimo metu agliutinavo

triušio eritrocitai, bet nebuvo paveikti žmogaus eritrocitai. Yra žinoma, kad lektinai geba agliutinuoti

ne vien eritrocitus, bet ir kitas ląsteles, bakterijas, grybelius bei virusus. Tai, kad tyrimo metu buvo

atmestas šių baltymų toksiškumas žmogui, didesnį potencialą įgijo tolimesni lektinų biologinių

savybių tyrimai ir pritaikymas medicinos praktikoje [13].

1.3. Chelidonium majus L. žolės cheminėje sudėtyje esančių biologiškai aktyvių

junginių antioksidantinio aktyvumo tyrimai

Antioksidantinis Chelidonium majus L. vaistinėje žaliavoje – žolėje – kaupiamų junginių

aktyvumas nustatytas in vitro metodais. Pirmą kartą antioksidantinis žolės ekstraktų aktyvumas

geležies redukcijos antioksidantinės galios (FRAP) metodu buvo nustatytas 2003 metais Vengrijoje

[14]. Pakartotinai antioksidantinis žolės ekstraktų aktyvumas įrodytas, panaudojus kitą – 2,2-difenil-1-

pikrilhidrazilo (DPPH•) radikalų surišimo metodą [15]. 2008 metais Rumunijoje ištirtas β-karoteno

antioksidantinis aktyvumas žolėje [16]. Vėliau ištirtas nuo fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio

priklausantis antioksidantinis Chelidonium majus L. žolės aktyvumas [17]. Aprašyta ir stipri alkaloido

berberino geba slopinti superoksido radikalus [18]. Korėjos mokslininkai išaiškino Chelidonium majus

L. žolės ekstraktų antioksidantinio aktyvumo mechanizmą: ekstraktuose esantys junginiai aktyvuoja

transkripcijos faktorių FOXO3a, kuris dalyvauja įvairiuose ląstelės procesuose – ciklo kontrolėje,

apoptozėje, DNR atkūrime ir laisvųjų deguonies radikalų surišime. FOXO3a sumažina aktyvių

deguonies (O2•-) formų gamybą, aktyvindamas antioksidantiniu poveikiu pasižymintį fermentą –

superoksido dismutazę [19]. Atlikus proteominę Chelidonium majus L. žolės ekstrakto analizę, jame

rasta daugelis fermentinės kilmės baltymų (gliutationo peroksidazė, superoksido dismutazė,

peroksiredoksinas), gebančių surišti laisvuosius radikalus, taigi, pasižyminčių antioksidantiniu

aktyvumu [8].

15

1.4. Baltymų frakcionavimas ir kokybinė analizė

Baltymai identifikuojami ir charakterizuojami kokybiniais analizės metodais. Tyrimo metodai

turi būti greitai ir paprastai atliekami, nesunkiai pritaikomi, atrankūs, tikslūs ir ekonomiški. Šiuos

kriterijus atitinkantys kokybinio nustatymo metodai yra plonasluoksnė chromatografija (PC) ir natrio

dodecil sulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (NaDS – PAGE). Plonasluoksnė chromatografija

pagrįsta baltymuose esančių aminorūgščių adsorbcija ant sorbento paviršiaus, o NaDS – PAGE –

įkrautų baltymų molekulių judėjimu elektriniame lauke [20, 21]. Prieš vykdant kokybinę baltymų

analizę, rekomenduojama baltymus išskirstyti į atskiras frakcijas. Taip užtikrinamas geresnis

kokybinių tyrimų rezultatų tikslumas ir patikimumas [22].

1.4.1. Baltymų frakcionavimo metodas – gelchromatografija

Gelchromatografija – tai kolonėlinės skysčių chromatografijos būdas molekulių atskyrimui

pagal jų dydį ir formą, panaudojant polimerines medžiagas – gelius. Šis metodas yra pagrįstas sieto

principu: tiriamajame bandinyje esančios molekulės viena nuo kitos atskiriamos minėtą bandinį

perleidžiant per tam tikro skersmens poras turinčius sorbentus, esančius kolonėlėje [23]. Tai

stacionarioji kolonėlės fazė. Baltymų atskyrimui, siekiant išvengti jų denatūracijos, dažniausiai

naudojami hidrofiliniai sorbentai, tokie kaip dekstranas ir agarozė. Iš pradžių kolonėlė pripildoma

sorbento funkciją atliekančiu išbrinkusios struktūros dariniu – geliu. Kad būtų užtikrinta gera

eliuojamų medžiagų kartu su judančiąja faze tėkmė, gelis turi būti chemiškai inertiškas, o jo

grūdeliai mechaniškai stiprūs. Prieš leidžiant mėginį, į sistemos kilpą prileidžiama buferių, kurių

sudėtyje nėra ištirpusių dujų (kad neliktų oro burbuliukų). Ant kolonėlės užnešamas tiriamasis

skirtingą molekulių dydį turintis bandinys, o kai jis įsigeria į gelį, pradedama leisti ir

judančioji fazė – eliuentas. Kaip eliuentai dažnai panaudojami buferiai ar tirpikliai. Gelfiltracijos

metodu tiriant krūvio neturinčias daleles, eliuentu gali būti distiliuotas vanduo. Tiriant krūvį turinčias

daleles, pvz., baltymus, naudojami buferiai (natrio chloridas, katijoninis fosfatinis, anijoninis TRIS-

HCl ir kt.), kontroliuojantys pH ir joninę jėgą. Molekulės, didesnės už gelio poras, tekėdamos į jas

nepatenka, todėl iš kolonėlės išteka greičiausiai. Mažesnio skersmens molekulės išskiriamos lėčiau,

nes iš pradžių pasiskirsto tarp gelio porų ir tik vėliau išteka iš kolonėlės (1 pav.).

16

1 pav. Gelchromatografijos principas

(https://drgpinstitute.wordpress.com/2014/12/26/gel-permeation-chromatography/)

Iš kolonėlės pradėjęs tekėti buferis su atsiskyrusiomis dalelėmis (eliuatas), prateka pro

detekcijos kiuvetę, kurioje matuojama individuali medžiagos savybė – ultravioletinės spinduliuotės

absorbcija. Registratorius nenutrūkstamai žymi pratekančio tirpalo absorbciją ir užfiksuoja medžiagų

absorbcijos pikus. Pratekėjęs detekcijos kiuvetę, eliuatas mažais tūriais surenkamas automatiniu

frakcijų kolektoriumi. Siekiant gelfiltracijos metodu nustatyti molekulines tiriamųjų bandinių mases,

kaip standartas panaudojami žinomų molekulinių masių baltymai (aprotininas, ribonukleazė,

ovalbuminas, feritinas, tiroglobulinas ir kt.) [24, 25]. Gelchromatografija yra greitas, paprastas, lengvai

pakartojamas, ekonomiškas ir plačiai pritaikomas metodas. Tačiau išskiriami ir keli jo trūkumai.

Būtina kruopščiai parinkti gelchromatografijos vykdymo sąlygas (sorbentus, eliuentus, tiriamųjų

mėginių koncentraciją ir tūrį), kad būtų išvengta nepageidaujamų reakcijų kolonėlėje ir jos užteršimo.

Taip pat nėra lengva interpretuoti gautus rezultatus, o tai gali iškreipti tyrimų išvadas [26, 27].

1.4.2. Kokybinis baltymų nustatymas – plonasluoksnė chromatografija

Plonasluoksnė chromatografija – tai kokybinis tyrimo metodas, paremtas tiriamųjų medžiagų

adsorbcija and sorbento paviršiaus. Šiuo metodu galima identifikuoti po gelchromatografijos surinktų

baltymų frakcijų sudėtį. Remiantis Europos Farmakopėjos monografija (01/2008:1861), šis metodas

taikomas didžiųjų ugniažolių žolėje esantiems alkaloidams identifikuoti [1]. Literatūros duomenimis,

17

plonasluoksnė chromatografija panaudojama ir aminorūgščių nustatymui, kuris yra svarbus, vertinant

baltymų struktūrą [28]. Metodo principas: kaip stacionarioji fazė yra naudojama chromatografinė

stiklo, plastiko ar aliuminio folijos plokštelė, padengta plonu sorbento sluoksniu. Sorbentu dažniausiai

parenkami aliuminio oksidas arba silicio dioksidas (silikagelis). Ant sorbento pieštuku neryškiai

pažymima linija, ant kurios kapiliaru užlašinami maži tiriamojo baltymų tirpalo ir standartinių

aminorūgščių tirpalų kiekiai. Tuomet plokštelė dedama į uždaromą stiklinį indą, prisotintą

judančiosios fazės – eliuento – garų. Judančiąja faze būna organinių polinių ir nepolinių tirpiklių

mišinys. Dažniausiai naudojami acetonas, chloroformas, etanolis, butanolis, etilacetatas ir kiti

tirpikliai. Eliuentas dėl adsorbcijos jėgų pradeda kilti plokštele aukštyn ir kartu neša jame ištirpusias

tiriamąsias baltymų mėginio daleles. Jos plokštele kyla skirtingu greičiu ir pasiekia skirtingą aukštį.

Tai priklauso nuo baltymų mėginio sąveikos (cheminių jungčių susidarymo) su sorbentu stiprumo: kuo

aminorūgščių funkcinės grupės labiau sąveikauja su sorbentu, tuo į mažesnį chromatografinės

plokštelės aukštį jos pakyla. Kai eliuentas pakyla maždaug 10 cm atstumu nuo pradžios linijos, tyrimas

baigiamas. Plokštelė išimama iš indo, išdžiovinama 20 ± 2oC temperatūroje ir ryškinama cheminiais

reagentais (dragendorfo, ninhidrinu, platinos chlorido tirpalu). Plonasluoksnė chromatografija yra

kokybinis metodas, kuriuo galima identifikuoti baltymų sudėtį pagal sulaikymo rodiklio Rf reikšmes.

Šis rodiklis yra tiriamosios medžiagos ir tirpiklio, nueito plokštele, kelio santykis. Baltymų sudėtyje

esančios aminorūgšys nustatomos, palyginus gautas Rf reikšmes su standartinių aminorūgščių Rf

reikšmėmis [29]. Plonasluoksnės chromatografijos privalumai: nesunkiai atliekama; sunaudojami maži

tiriamųjų medžiagų kiekiai; nereikalauja brangios įrangos; platus sorbentų ir tirpiklių pasirinkimas;

chromatografuojant šiuo metodu netaikomas šildymas, todėl išvengiama baltymų denatūracijos;

metodas gali būti pritaikomas ir kiekybiniam nustatymui (analičių dėmės gali būti nugramdomos nuo

plokštelės, ištirpinamos ir tiriamos kitais metodais). Tačiau šis metodas mažiau jautrus už kitus

metodus, pvz., NaDS – PAGE elektroforezę [20].

1.4.3. Kokybinis baltymų nustatymas – baltymų NaDS – PAGE elektroforezė

Elektroforetinis baltyminių kompleksų frakcionavimas poliakrilamidiniame gelyje yra

kokybinės analizės metodas, padedantis skirstyti baltymus, įvertinti tokias jų charakteristikas,

kaip krūvis ar molekulinė masė. Dažniausiai baltymų analizei yra naudojama natrio dodecil – sulfato

poliakrilamido gelio elektroforezė (NaDS – PAGE), kai dėl anijoninio detergento – natrio dodecil

sulfato (NaDS) – įtakos denatūravę ir bendrą neigiamą krūvį įgiję baltymai poliakrilamido gelyje

migruoja link teigiamą krūvį turinčio anodo. Kadangi baltymų komplekse esančios baltymų molekulės

turi skirtingą molekulinę masę, skiriasi ir jų krūvio kiekis, tenkantis masės vienetui. Dėl šios

18

priežasties galutinis baltymų frakcionavimas priklauso vien tik nuo molekulinės masės.

Priklausomai nuo poliakrilamido gelio koncentracijos, galima frakcionuoti skirtingos molekulinės

masės makromolekules. Didinant poliakrilamido gelio koncentraciją, jo poros mažėja, todėl 5 % gelis

rekomenduojamas atskirti denatūruotus baltymus, kurių molekulinė masė yra 57–212 kDa, 10% gelis:

16 – 68 kDa, o 15 %: 12 – 13 kDa [30]. Atlikus elektroforezę, baltymai ant gelio fiksuojami ir

ryškinami dažais. Jautrus, pigus ir mažiems baltymų kiekiams nustatyti tinkamas dažymas yra sidabro

nitrato tirpalu. Dažymo sidabru principas pagrįstas sidabro jonų ir tam tikrų baltymo molekulėje

esančių cheminių grupių (COO-) susijungimu, kuris tampa vizualiai matomas gelyje [31]. NaDS –

PAGE elektroforezės privalumai: universalumas (galima tirti baltymus ir nukleino rūgštis),

selektyvumas, patikimumas, rezultatų tikslumas. Trūkumai: šiam metodui atlikti būtini geri technologo

įgūdžiai, kad būtų išvengta gelio deformacijos ir rezultatų netikslumo; ilgai trunkantis analizės

metodas, sunaudojantis daug cheminių reagentų [21].

1.5. Kiekybinis baltymų nustatymas

Baltymų kiekiui frakcijose nustatyti dažniausiai naudojami spektrofotometriniai metodai, kurie

yra skirstomi į dvi grupes:

I) metodai, paremti baltymo – vario jonų chelatų sudarymu su netiesiogine redukuoto vario jono

detekcija;

II) metodai, paremti baltymo – dažiklio susijungimo reakcija su tiesiogine gauto junginio spalvos

pokyčio detekcija [32].

1.5.1. Vario jonų surišimu pagrįstas kiekybinis baltymų nustatymas

Baltymų ir vario jonų chelacija yra paremti Louri bei bicinchoninės rūgšties kiekybinio

baltymų nustatymo metodai. Louri (Lowry) metodas vykdomas dviem etapais. Pirmojo etapo metu

baltymai per peptidinėse jungtyse esančius azoto atomus ir aromatinių aminorūgščių tirozino bei

triptofano liekanas jungiasi su dvivalenčiais vario jonais (Cu2+

) ir redukuoja juos iki vienvalenčių

(Cu+). Susiformavęs tarpinis junginys toliau reaguoja su Folin Ciocalteu reagentu (fosfomolibdeno –

fosfovolframo rūgščių tirpalu). Antrojo etapo metu vyksta redokso reakcija ir šis reagentas yra

redukuojamas, kai pirmajame etape susidaręs polipeptidų ir vario kompleksas atiduoda jam savo

elektronus. Reakcijos eigoje susidaro mėlynos spalvos kompleksas, kurio sugertis matuojama, esant

750 nm bangos ilgiui. Louri metodu galima nustatyti baltymus, kurių koncentracija svyruoja nuo 0,01

19

iki 1,0 mg/ml. Šis metodas apibūdinamas kaip jautrus, tačiau rezultatams įtakos gali turėti pernelyg

daug skirtingų priemaišų, tokių kaip: paviršiui aktyvios medžiagos, tioliai, disulfidai, glicerolis, K+

jonai ir kt. [33].

Bicinchoninės rūgšties (BCR) metodas turi panašumų su Louri metodu, kadangi taip pat

vykdoma dvivalenčių vario jonų redukcija iki vienvalenčių. Susidaręs tarpinis kompleksas per

vienvalenčius vario jonus (Cu+) jungiasi su bicinchonine rūgštimi ir suformuoja violetinės spalvos

kompleksą, sugeriantį šviesą prie 562 nm bangos ilgio. BCR metodo privalumai – didesnis jautrumas

(juo galima nustatyti 0,5 μg/ml baltymų koncentracijas) ir galimybė nustatyti baltymų koncentraciją

mėginiuose, kuriuose yra iki 5% įvairių priemaišų. Šio metodo trūkumas: norint išgauti labiau matomą

susidariusio komplekso spalvą, reikalingas šildymas, o tai gali denatūruoti baltymus [34].

Abiem metodais baltymų kiekis nustatomas, palyginus gautus šviesos sugerties rezultatus su

kalibracine kreive, kuriai sudaryti, kaip standartas, dažniausiai panaudojamas jaučio ar žmogaus

serumo albuminas [35].

1.5.2. Kumasi (Coomasie) briliantinio mėlio dažiklio surišimu pagrįstas kiekybinis

baltymų nustatymas

Šis metodas (dar kitaip vadinamas Bradford metodu) po 2007 metais Turkijoje

vykdyto palyginamojo tyrimo, skirto baltymų koncentracijai plazmoje, nustatyti, pripažintas

kaip greitesnis, paprastesnis, lengviau atliekamas ir jautresnis už kitus metodus [36].

Pagrindinis metodo principas: baltymų frakcija paveikiama specifiniu reagentu – Kumasi

(Coomasie) briliantinio mėlio dažikliu, su kuriuo sudaro mėlynos spalvos junginį

(spalvos intensyvumas tiesiogiai priklauso nuo baltymų koncentracijos). Susidariusio junginio

absorbcija pamatuojama, esant 595 nm UV bangos ilgio. Baltymo koncentracija nustatoma

pagal kalibracinę kreivę. Metodo privalumai: Kumasi reagentas yra stabilus ir suderinamas su

druskomis, tirpikliais, buferiniais tirpalais, o susidariusio komplekso spalvos pokytis matomas iškart,

nekeičiant temperatūros sąlygų. Pagrindinis šio metodo trūkumas – nesuderinamumas su paviršiui

aktyviomis medžiagomis. Net ir mažiausias šių medžiagų kiekis mėginyje nusodina reagentą.

Bradfordo metodu galima nustatyti 10 – 100 µg baltymų koncentracijas, o pritaikius metodą

mikroanalizei, galima nustatyti ir baltymus, kurių koncentracija yra 1 – 10µg [37].

20

1.6. Technologinės baltymų formos

Norint atlikti baltymų tyrimus in vivo, baltymams turi būti suteikta technologinė forma. Jos

parinkimas gali lemti baltymų biologinį ir farmakologinį aktyvumą. Šiuo metu rinkoje yra apie 160

baltyminės kilmės vaistų, kuriems suteiktos parenteralinės, inhaliuojamos, rektalinės ar

geriamosios formos. Visas šias technologines formas sieja bendri reikalavimai: baltymai jose turi būti

labai išgryninti ir koncentruoti, turėti trumpą pusinės eliminacijos laiką ir mažiausiai dviejų

metų tinkamumo vartoti laiką.

Yra du baltyminės kilmės vaistų vartojimo keliai: parenteralinis ir neparenteralinis

(inhaliuojamas, rektalinis, peroralinis). Parenteralinis kelias (į veną, raumenis, po oda) laikomas

pačiu efektyviausiu terapiniam aktyvumui užtikrinti, nes baltymams nereikia įveikti fermentinio

ir žarnų epitelio barjerų. Tačiau dažniausiai vartojami injekciniai preparatai turi būti sterilūs,

o tai lemia ypatingus jų gamybos, tyrimų, laikymo ir vartojimo reikalavimus.

Inhaliacinis baltyminės kilmės vaistų vartojimas yra patogus, saugus ir praktiškas. Didelis

kapiliarinis tinklas aplink plaučius užtikrina greitą baltymų absorbciją, bet ji yra sąlyginai

maža, nes inhaliuotas vaistas dažniausiai pasiskirsto tik viršutinėje plaučių dalyje.

Rektalinės baltyminės kilmės vaistų formos yra gerai pasisavinamos dėl geros kraujotakos.

Apeinamas virškinamasis traktas. Šis vartojimo būdas tinkamas vaistams, kurie sukelia pykinimą ir

virškinamojo trakto gleivinės trikdymą. Žvakutėje gali būti patalpinta didesnė baltymų dozė.

Peroralinės formos (tabletės, kapsulės) užtikrina paprastą vartojimo būdą, todėl yra

populiariausios tarp vartotojų. Tačiau gaminant jas, būtina atsižvelgti į virškinamojo trakto įtaką

baltymams. Baltymai turi įveikti fermentinį ir žarnyno epitelinį barjerą, kad būtų užtikrintas jų

terapinis efektas. Siekiant, kad virškinamajame trakte baltymai nebūtų paveikti fermentų proteazių,

kuriamos technologinės formuluotės su pagalbinėmis medžiagomis (buferiais, paviršiui aktyviomis

medžiagomis, proteazių inhibitoriais). Žarnyno epitelis sudarytas iš tvirtai susijungusių ląstelių, kurios

sunkiai praleidžia vandenyje tirpias medžiagas. Norint pagerinti baltymų absorbciją per žarnų epitelį, į

technologines formuluotes dedama riebiųjų rūgščių, paviršiui aktyvių medžiagų, gliceridų ir tulžies

druskų, kurios laikinai atidaro jungtis tarp ląstelių ir leidžia vandenyje tirpiems baltymams pereiti per

epitelį [38]. Atlikta nedaug tyrimų su kapsuliuotomis baltymų formomis, bet yra žinoma, kad tai –

preliminariems baltymų in vivo tyrimams tinkama technologinė forma. Kapsulių gamybos metodas yra

paprastas ir nereikalaujantis itin daug gamybos etapų bei įrengimų. Kapsulių vidus veikliosiomis ir

pagalbinėmis medžiagomis užpildomas, nevykdant presavimo, kuris gali pažeisti vaistinę medžiagą.

Kapsulės apvalkalas apsaugo viduje esančias medžiagas, nepraleisdamas lakių skysčių, dujų ar oro

deguonies. Ši farmacinė forma užtikrina tikslų dozavimą bei priimtiną ir paprastą vartojimą [39].

21

1.7. Kietųjų kapsulių gamyba

Kietosios kapsulės – kietą apvalkalą turintys, įvairios formos ir talpos preparatai,

dažniausiai talpinantys vienkartinę vaistinės medžiagos dozę [40]. Kietųjų kapsulių gamybą

palengvina pramonės paruošti kapsulių apvalkalai. Populiariausi kapsulių apvalkalai yra

gaminami iš želatinos – gyvūninės kilmės polimero, kuris yra stabilus sausoje aplinkoje,

bet tirpsta šiltuose skysčiuose. Dėl šių savybių želatininės kapsulės išlieka stabilios jas laikant,

o pavartojus peroraliai, greitai tirpsta ir atpalaiduoja veikliąsias medžiagas [41].

Kadangi kapsulių apvalkalai jau būna pagaminti pramoniniu būdu, pagrindiniu technologo

darbu tampa kietosios kapsulės užpildymas veikliąja ir pagalbinėmis medžiagomis. Pagalbinės

medžiagos naudojamos, siekiant padidinti kapsuliuojamo užpildo masę (skiedikliai: manitolis,

mikrokristalinė celiuliozė, laktozė, krakmolas), pagerinti birumą (slidinančios medžiagos:

talkas, aerosilas), pagreitinti miltelių suirimą ir tirpumą (suirimą greitinančios medžiagos:

natrio kroskarmeliozė, algino rūgštis). Kai kapsuliuojami skysti arba tiršti augaliniai ekstraktai,

nedidelius jų kiekius galima adsorbuoti poringomis, didelį paviršiaus plotą turinčiomis

pagalbinėmis medžiagomis ir gauti birias mases, tinkamas kapsulių pildymui [42].

Kapsulių pildymas gali būti atliekamas rankinėmis, pusiau automatinėmis ir visiškai

automatinėmis mašinėlėmis. Visais šiais būdais pildant kapsules, atliekami sekantys veiksmai:

kapsulių apvalkalai dedami į kapsuliavimo mašinėlę ir paskirstomi į specialius lizdus. Tuomet kapsulių

kepurėlės atskiriamos nuo korpusų. Į korpusus duozuojamas kapsulių užpildas. Kapsulės uždaromos ir

išimamos iš pildymo mašinėlės. Įvertinus kapsulių kokybę, jos yra pakuojamos ir ženklinamos [43,

44].

Prieš kapsuliavimą svarbu įvertinti technologines kapsuliuojamų veikliųjų ir pagalbinių

medžiagų savybes: birumą, homogeniškumą, dalelių morfologiją. Nuo birumo priklauso kapsulių

masės vienodumas. Gerai byrantys milteliai neprilips prie kapsulių apvalkalo, kapsulėse nesusidarys

oro tarpų. Tokiu būdu kapsulės bus užpildytos tolygiai, kartu išvengiant didelių masės nuokrypių.

Didesnės ir apvalią formą turinčios dalelės lemia geresnį birumą. Kad būtų užtikrintas geras miltelių

birumas, atliekamas laisvai beriamų miltelių greičio ir subėrimo kampo nustatymas [45].

1.8. Veikliosios medžiagos atsipalaidavimo ypatumai ir nustatymo metodai

Efektyvus veikliosios medžiagos atsipalaidavimas iš kietųjų želatinos kapsulių yra sąlygojamas

greito apvalkalo tirpimo. Kapsulės gali būti ir modifikuoto – pailginto ar uždelsto – atpalaidavimo.

Pailginto atpalaidavimo modifikacija (celiuliozės darinių naudojimas, dvigubas apvalkalas) sulėtina

22

kapsulės turinio atsipalaidavimą, todėl užtikrinamas ilgiau trunkantis veikliosios medžiagos veikimas.

Uždelstą kapsulės atpalaidavimą sąlygoja pagalbinių medžiagų įterpimas į kapsulių turinį ar apvalkalą,

dėl kurio veiklioji medžiaga nėra paveikiama skrandžio sulčių ir atsipalaiduoja tik žarnyne [46, 47,

48].

Veikliosios medžiagos atsipalaidavimas priklauso nuo daugelio veiksnių: kapsulės užpildo

dalelių dydžio, ilgalaikio kapsulės laikymo, temperatūros ir drėgmės poveikio. 2013 metais Lietuvoje

vykdyto tyrimo metu kietosios kapsulės buvo užpildytos skirtingais sausųjų augalinių ekstraktų dalelių

dydžiais (milteliais, granulėmis). Buvo atliktas tirpumo ir aktyvių junginių atpalaidavimo testas iškart

po kapsulių užpildymo ir po ilgalaikio laikymo, trukusio iki 12 mėnesių, esant skirtingoms

temperatūros bei santykinės oro drėgmės sąlygoms. Tyrimo metu nustatyta, kad mažesnės dalelės,

turėjusios didesnį paviršiaus plotą, dėl geresnio skysčių skverbimosi į jas buvo nesunkiai atpalaiduotos

tirpimo metu. Granulės didesnės, stabilesnės ir ne tokios jautrios drėgmei, todėl kapsulės, užpildytos

jomis, parodė nepakitusį aktyvių junginių atpalaidavimą net po ilgalaikio laikymo. Tai įrodė gamybos

technologijos įtaką aktyvių junginių atpalaidavimui. Pradinis aktyvių junginių atpalaidavimas buvo

geresnis, palyginus su atpalaidavimu po ilgalaikio laikymo. Dėl temperatūros ir santykinės oro

drėgmės pokyčių ilgalaikio laikymo metu kapsulėse susikaupė pernelyg daug drėgmės, kas apsunkino

kapsulės suirimą ir aktyvių junginių atpalaidavimą [49].

Kapsulėse esanti veiklioji medžiaga veikia tik kapsulei ištirpus, todėl svarbu nustatyti

vaistinės medžiagos tirpimo greitį. Tai įvykdyti padeda farmakopėjiniai – krepšelio ir mentinis –

metodai. Krepšelio prietaisą sudaro stiklinis ar kitos inertiškos medžiagos permatomas

indas, motoras, velenas ir poras turintis cilindrinis krepšelis (maišymo elementas). Indas

pusiau įmerktas į pritaikytą vandens vonelę, kurioje kaitiklio dėka tirpimo testo metu palaikoma

37 ± 0,5 °C temperatūra. Kietoji kapsulė įdedama į sausą krepšelį, kuris yra pamerkiamas į indą

su vandeniu ar kita tyrimui parinkta terpe. Krepšelis sukamas 50 – 200 apsisukimų per minutę

greičiu, kol kapsulė ištirpsta. Mentinis prietaisas sudarytas tuo pačiu principu kaip ir krepšelio,

išskyrus tai, kad, kaip maišymo elementai, yra naudojama mentė su velenu. Atsitiktinai parinkta

kapsulė dedama į indą su vandeniu ir maišoma su prie veleno pritvirtinta mente, kol ištirpsta.

Abiem metodais tiriant kapsulių tirpumą, vaistinių medžiagų koncentracijos nustatomos tam

tikrais laiko tarpais, paėmus mėginius iš indo, ir pripildant jį atitinkamu tūriu vandens ar kito tyrimui

parinkto tirpalo, kad būtų kompensuojamas ir palaikomas pastovus terpės tūris. Siekiant atkartoti in

vivo vykstantį veikliųjų medžiagų atsipalaidavimą, tyrimo metu gali būti parenkamos kitos terpės,

pvz., dirbtinės skrandžio sultys (0,1 mol/l HCl tirpalas) ar fosfatinis buferis (pH 6,8), kartu su kasos

fermentais, pvz, pankreatinu, kurie imituoja veikliųjų medžiagų atpalaidavimą žarnyne [50].

Reikalaujama, kad per 45 minutes ištirptų ne mažiau kaip 75% medžiagos [51].

23

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Baltymų frakcijos, išskirtos iš didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) žolės, paruoštos

Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos V. F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institute.

2.2. Reagentai

1. Ultra švarus vanduo, ruošiamas Millipore vandens valymo sistema (VU Biotechnologijos

institutas, Lietuva);

2. 0,01 M buferinis tirpalas – PBS, pH 7,4 (sudėtis: NaCl – 8,0 g/l; KCl – 0,2 g/l; Na2HPO4 – 1,44

g/l; KH2PO4 – 0,24 g/l) (anglų k. phosphate buffered saline) (Sigma-Aldrich®, JAV);

3. 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) diamonio druska (ABTS) (anglų k. 2,2'-

azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) (Sigma-Aldrich®, JAV);

4. Kalio persulfatas (K2S2O8 ) (Sigma-Aldrich®, JAV);

5. Jaučio serumo albuminas (JSA) (Sigma-Aldrich®, JAV);

6. Bradford reagentas (sudėtis: 100mg mėlynos spalvos briliantinio mėlynojo dažiklio G-250; 50

ml 95% etanolio, 100 ml 85% fosforo rūgšties. Skiedžiama ultra švariu vandeniu iki 1 litro

tūrio) (Sigma-Aldrich, JAV);

7. Etanolis (reaktifikuotas spiritas 96,3%) (C2H5OH) (Stumbras, Lietuva);

8. 99,8 % acto rūgštis (CH3COOH) (tirpalas) (Standart, Lenkija);

9. Natrio hidroksidas (NaOH) (milteliai) (Sigma-Aldrich®, JAV);

10. Prosolv® SMCC HD 90 (JRS Pharma, Vokietija);

11. Bevandenis koloidinis silicio dioksidas – aerosilas (Degussa AG, Vokietija)

12. Dinatrio hidrofosfatas (Na2HPO4 • 12H2O) (Sigma-Aldrich®, JAV);

13. Natrio chloridas (NaCl) (milteliai) (Carl-Roth, Vokietija);

14. Praskiesta vandenilio chlorido rūgštis (HCl) (tirpalas) (Merck, JAV);

15. Akrilamidas – BIS (30% tirpalas) (Sigma-Aldrich®, JAV);

16. TRIS (2-amino-2-hidroksimetil-propano-1,3-diolis)(NH2C(CH2OH)3) (Sigma-Aldrich®, JAV);

17. Natrio dodecilsulfatas (CH3(CH2)11OSO3Na)(tirpalas) (Sigma-Aldrich®, JAV);

18. Amonio persulfatas ((NH4)2S2O8)(APS)(milteliai) (Sigma-Aldrich®, JAV);

19. N, N, N´,N´ – tetrametiletilendiaminas (TEMED)(C6H16N2) (Sigma-Aldrich®, JAV);

20. TRIS – glicino buferis – NaDS tirpalas, pH 8,3 (sudėtis: 1,51 g TRIS (2-amino-2-hidroksimetil-

24

propano-1,3-diolio) bazės, 9,4 g glicino (C2H5NO2), 5 ml 10 % NaDS) (Sigma-Aldrich®, JAV);

21. Neredukuotas pavyzdžio buferinis tirpalas (Lane Marker Non-reducing Sample Buffer) (penkis

kartus koncentruotas), pH 6,8 (sudėtis: 0,3 M TRIS • HCl, 5% NaDS, 50% glicerolio,

patentuotas rožinės spalvos dažiklis)(Thermo Fisher Scientific, Didžioji Britanija);

22. Baltymų standartas (rinkinys PageRuler™ #26616, naudojamas elektroforezei; dalelių dydis

10 – 170 kDa) (Fermentas Life Science, Lietuva);

23. Thermo Scientific Pierce Silver dažymo rinkinys (Thermo Fisher Scientific, JAV);

24. „0“ dydžio želatininės kapsulės (Capsuline, JAV)

2.2.1. Reagentų paruošimas

Gelchromatografijai atlikti paruoštas fosfatinis buferis (pH 7,0); natrio dodecilsulfato

poliakrilamido gelio elektroforezei vykdyti pagamintas gelis ir paruošti naudoti tirpalai; kalibracinei

kiekybinio baltymų nustatymo kreivei sudaryti paruošti skirtingų koncentracijų jaučio serumo

albumino tirpalai; baltymų antioksidantinio aktyvumo nustatymui aktyvuotas ABTS radikalas –

katijonas.

2.2.1.1. Gelchromatografijoje naudotas fosfatinis buferis

Buferis paruoštas tokiu būdu: 17,91 g Na2HPO4·12H2O ir 8,77 g NaCl tirpinta

995 ml ultra švaraus vandens. Į tirpalą įpilta 4 M HCl tiek, kad pH būtų 7,0. Gautas tirpalas

skiestas ultra švariu vandeniu iki 1000 ml. Pagamintas buferis saugomas +4ºC temperatūroje.

2.2.1.2. Tirpalai, naudoti baltymų elektroforezėje

1. 1,5 M TRIS-HCl buferinis tirpalas, pH 8,8. 18,15 g TRIS tirpintas 70 ml ultra švaraus vandens. Į

tirpalą įpilta 4 M HCl tiek, kad pH būtų 8,8. Gautas tirpalas skiestas ultra švariu vandeniu iki 100 ml.

Saugomas +4ºC temperatūroje;

2. 0,5 M TRIS-HCl buferinis tirpalas, pH 6,8. 6,0 g TRIS tirpintas 70 ml ultra švaraus vandens. Į

tirpalą įpilta 4 M HCl tiek, kad pH būtų 6,8. Gautas tirpalas skiestas ultra švariu vandeniu iki 100 ml.

Saugomas +4ºC temperatūroje;

25

3. 10 % Natrio dodecilsulfato (NaDS) tirpalas. 5,0 g NaDS tirpinta nedideliame tūryje ultra švaraus

vandens. Gautas tirpalas praskiestas iki 50 ml, laikomas 20 ± 2°C temperatūroje;

4. 10 % amonio persulfato (APS) tirpalas. 100 mg APS ištirpinta 1 ml ultra švaraus vandens.

Tirpalas tinkamas naudoti tik pagaminimo dieną;

5. Vienkartinis (1x) elektroforezės buferinis tirpalas. 100 ml TRIS – glicino – NaDS

elektroforezės buferinis tirpalas (10x) skiedžiamas ultra švariu vandeniu iki 1 litro.

2.2.1.3. Geliai, naudoti baltymų elektroforezėje

Atskirai ruošiami 15% frakcionuojantis ir 4 % koncentruojantis poliakrilamido geliai.

Frakcionuojantis gelis gaminamas sumaišant 5 ml 30 % akrilamido-BIS tirpalo, 2,5 ml 1,5 M TRIS-

HCl buferinio tirpalo (pH 8,8), 2,3 ml ultra švaraus vandens ir 0,1 ml 10 % NaDS tirpalo. Gelio

polimerizacijai sukelti, į pagamintą tirpalą pripilama 0,1 ml APS ir 0,01 ml TEMED. Koncentruojantis

gelis gaminamas atitinkamai sumaišant 1,3 ml 30 % akrilamido-BIS tirpalo, 2,5 ml 0,5 M TRIS-HCl

buferinio tirpalo (pH 6,8), 6,1 ml ultra švaraus vandens ir 0,1 ml 10 % NaDS tirpalo. Gelio

polimerizacijai sukelti, į pagamintą tirpalą pripilama 0,05 ml APS ir 0,01 ml TEMED.

Paruoštas frakcionuojančio gelio tirpalas pilamas į sukonstruotą formą iki tam tikros pažymėtos

vietos (4 cm nuo stiklo viršaus) ir atsargiai užpilamas ultra švariu vandeniu. Polimerizacija trunka apie

40 min. Ant sustingusio skiriamojo gelio pilamas koncentruojančio gelio tirpalas ir įstatomos

specialios gelio takelius formuojančios šukos. Polimerizacija trunka apie 40 min. Vėliau šukos

ištraukiamos, o takeliai praplaunami ultra švariu vandeniu.

2.2.1.4. Jaučio serumo albumino standarto, naudoto Bradford metodo kalibracinei

kreivei sudaryti, tirpalų gamyba

Prieš nustatant baltymų koncentracijas tirpaluose Bradford metodu, yra sudaroma kalibracinė

kreivė, naudojant jaučio serumo albumino (JSA) standartinius tirpalus. Standartiniai pramoniniu būdu

paruošti jaučio serumo albumino tirpalai skiedžiami ultra švariu vandeniu 1 ml mėgintuvėliuose. 1

lentelėje pateikta informacija apie pirminio jaučio serumo albumino standarto tirpalo koncentraciją bei

tūrį ir naudojamo praskiedimui ultra švaraus vandens tūrį, ruošiant tam tikros koncentracijos galutinį

jaučio serumo albumino standartą.

26

1 lentelė. Jaučio serumo albumino standarto tirpalų koncentracijos, tūriai bei ultra švaraus vandens tūriai

Mėgintuvėlio

numeris

Pirminis jaučio serumo albumino

standartas Ultra švaraus

vandens tūris,

µl

Galutinė jaučio

serumo

albumino

standarto

koncentracija,

µg/ml

Tirpalo

koncentracija,

mg/ml

Tirpalo tūris,

µl

1 2 10 790 25

2 2 10 990 20

3 1,5 10 990 15

4 1 10 990 10

5 0,5 10 990 5

6 0,25 10 990 2,5

7 0,125 10 990 1,25

8 (tuščias

mėginys) - - 1000 0

2.2.1.5. ABTS radikalo – katijono tirpalo gamyba

Antioksidantiniam aktyvumui nustatyti ruošiamas ABTS radikalo – katijono tirpalas:

atsveriama 0,0548 g ABTS miltelių ir ištirpinama 50 ml ultra švaraus vandens. Po to į

gautą tirpalą pridedama 0,0095 g kalio persulfato ir gerai išmaišoma. Aktyvacijai būtinas tam tikras

laiko tarpas, tad šis radikalas kartu su aktyvatoriumi kalio persulfatu laikomas tamsioje, 9 – 15°C

temperatūroje ne trumpiau nei 16 valandų.

2.3. Įranga

1. Analitinės svarstyklės CPA225D-0CE (Sartorius, Vokietija);

2. Spektrofotometras TECAN infinite M200 (Tecan, Vokietija);

3. Automatiniai dozatoriai (pipetmanai) (Eppendorf Research, JAV);

4. Centrifuga Eppendorf Centrifuge 5415R (Eppendorf Research, JAV);

5. Gelfiltracijos kolonėlė GE Healthcare Superdex 200 10/300 GL (dydis – 1x30cm;

tūris – 24ml) (GE Healthcare, Švedija),

6. Gelfiltracijos chromatografijos sistema AKTA purifier 100 (GE Healthcare, Švedija);

7. Krepšelio aparatas Erweka DZT (Erweka GmbH, Vokietija);

8. Laikmatis (Thermo Fisher Scientific, JAV);

9. Termostatas Dri – Block® DB – 2D (Techne, Didžioji Britanija);

10. Elektroforezės aparatas MP – 300V CS (Cleaver Scientific Ltd, Didžioji Britanija);

27

11. Vandens gryninimo sistema Synergy millipore (Merck, JAV);

12. 2 mm skersmens sietas (Fisher Scientific, JAV);

13. Kapsuliavimo mašinėlė Capsuline – 15 (Capsuline, JAV);

14. Aparatas birumo nustatymui ERWEKA AG (ERWEKA GmbH, Vokietija);

2.4. Analitiniai metodai

2.4.1. Baltymų frakcijų skirstymas gelchromatografijos metodu

Siekiant atskirti Chelidonium majus L. žolės baltymus pagal dalelių

dydį, atlikta gelchromatografija. Ji vykdyta, naudojant AKTA gryninimo sistemą ir cilindro formos

Superdex 200 10/300 GL gelchromatografijos kolonėlę. Kolonėlė užpildyta sorbentu – agarozės ir

dekstrano mišiniu. Prieš gelchromatografiją 1,5 ml baltymų tirpalo centrifuguota +4 ± 1oC

temperatūroje 15 minučių, 10000 apsisukimų per minutę greičiu, naudojant Eppendorf Centrifuge

5415R centrifugą, surinktas baltymų mėginio supernatantas. Gelchromatografija atlikta, esant +4 –

+16oC temperatūrai. Kolonėlė pusiausvyrinama, leidžiant 50 ml distiliuoto vandens, po to – 50 ml

eliuento – fosfatinio buferio (pH 7,0). Gelchromatografijos sąlygos: tėkmės greitis 0,5 ml per minutę;

maksimali slėgio riba – 14 barų. Prieš leidžiant mėginį, sistemos kilpa užpildyta judančiąja faze –

fosfatiniu buferiu (pH 7,0), kad neliktų oro burbuliukų. Švirkštu sušvirkštas 1 ml mėginio

supernatanto. Registruoti frakcijų pikai, esant 215 nm ir 280 nm UV bangos ilgiui. Baltymų frakcijos

surinktos po 0,5 ml į 44 ependorfus.

2.4.2. Baltymų kiekybinis nustatymas

Baltymų kiekis tiriamosiose baltymų frakcijose nustatytas spektrofotometriniu Bradford

metodu. Baltymų tirpalą paveikus Bradford reagentu, susidaro mėlynos spalvos junginys,

kurio šviesos absorbcija nustatoma spektrofotometriškai. Baltymo kiekis yra tiesiogiai

proporcingas spalvos intensyvumui ir yra nustatomas pagal kalibracinę kreivę, sudarytą

naudojant standartinius jaučio serumo albumino (JSA) tirpalus.

Automatiniu dozatoriumi paimama po 120 µl pagamintų standartinių jaučio serumo albumino

tirpalų ir mikrolėkštelėse sumaišoma su tokiu pat kiekiu Bradford reagento. Po 5 minutes trunkančio

inkubacinio laikotarpio 20 ± 2°C temperatūroje, spektrofotometru pamatuojama absorbcija, esant 595

nm bangos ilgiui. Remiantis optinio tankio reikšmėmis, brėžiamas grafikas – šviesos sugerties

28

priklausomybė nuo baltymo koncentracijos. Gauta kalibracinė baltymų kiekio nustatymo tiesė,

pavaizduota 2 paveiksle.

2 pav. Kalibracinė Bradford metodo baltymų kiekio nustatymo kreivė

Tyrimo eiga pakartota, sumaišant po 120µl tiriamųjų baltymų frakcijų, surinktų po

gelfiltracijos, su tokiu pat kiekiu Bradford reagento. Po 5 minučių vėl matuota absorbcija, esant 595

nm bangos ilgiui. Absorbcijos priklausomybė nuo baltymo koncentracijos yra tiesinė. Gautos

kalibracinės kreivės funkcija yra y = 0,0205x + 0,0105, o koreliacijos koeficientas R2 = 0,9956.

Kadangi jis yra artimas 1, tokia kalibracinė kreivė yra laikoma patikima ir gali būti naudojama

baltymų koncentracijų nustatymui tiriamosiose frakcijose. Pagal funkciją apskaičiuotas tiriamosiose

frakcijose esančių baltymų kiekis. Bradford tyrimas atliktas du kartus: prieš baltymų, išskirtų iš

Chelidonium majus (L.) žolės, kapsuliavimą ir tiriant baltymų, išsiskyrusių iš kietųjų kapsulių, kiekį.

2.4.3. NaDS poliakrilamidinio gelio elektroforezė

Siekiant nustatyti baltymų molekulines mases, buvo atlikta natrio dodecilsulfato poliakrilamido

gelio elektroforezė (NaDS – PAGE).

Mėginių paruošimas. Po gelchromatografijos atrinktos baltymų tirpalų frakcijos, turinčios

didžiausią baltymų koncentraciją. Imama po 32 µl baltymų frakcijos, sumaišoma su 8 µl neredukuoto

pavyzdžio buferinio tirpalo (Lane Marker Non – reducing Sample Buffer). Toliau mėginiai kaitinami

termostate 5 minutes, esant 95oC temperatūrai.

29

Elektroforezės eiga. Elektroforezė atliekama vertikaliame elektroforezės aparate, naudojant

poliakrilamidinį gelį, kuris yra sudarytas iš 15 % koncentracijos frakcionuojančio (apatinio) gelio ir 4

% koncentruojančio (viršutinio) gelio. Prieš įleidžiant į gelio takelius mėginius, iš gelio ištraukiamos

šukos, o viršutinis ir apatinis aparato rezervuarai užpildomi vienkartiniu elektroforezės tirpalu: TRIS –

glicino – NaDS buferiu. Ant gelio užnešama po 30 µl paruoštų mėginių ir 0,5 µl standarto. Kaip

standartas naudojami žinomų molekulinių masių baltymai (PageRuler™ #26616, dalelių dydis 10 –

170 kDa). Elektroforezė atliekama, esant 200 V elektrinei įtampai, per gelį tekant 25 mA stiprio

elektros srovei. Tyrimas vykdomas 90 minučių, kol dažo frontas pasiekia skiriamojo gelio apačią. Po

to srovės šaltinis išjungiamas, gelio plokštelė išimama iš buferio sistemos. Iš plokštelės išimtas

skiriamasis gelis dažomas sidabro nitrato tirpalu.

Gelio dažymas. Po elektroforezės poliakrilamido gelis dedamas į plastikinę vonelę ir dukart

plaunamas ultra švariu vandeniu. Tuomet fiksuojamas 30 % etanolio ir 10 % acto rūgšties tirpalu.

Perplovus 10% etanoliu ir ultra švariu vandeniu, gelis aktyvinamas jautrumą didinančiu darbiniu

tirpalu (0,2 % „Silver Stain Sensitizer“ tirpalas ultra švariame vandenyje). Dar kartą perplovus ultra

švariu vandeniu, į vonelę ant gelio plokštelės pilama 2 % „Silver Stain Enhancer“ ir „Silver Stain“

mišinio. Gelis dažomas pusvalandį ir perplaunamas vandeniu. Ant perplauto gelio užpilama

ryškinamojo tirpalo (2 % „Silver Stain Enhancer“ su „Silver Stain Developer“), kuris išryškina gelyje

atsiradusias baltymų juosteles. Stabilizuojant nudažytą gelį, jis apdorojamas 5 % acto rūgštimi.

2.4.4. Kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš Chelidonium majus L. žolės,

gamyba

Baltymų tirpalai išdžiovinti, naudojant adsorbentus – poringas kietas medžiagas su

dideliu paviršiaus plotu: silicifikuotą mikrokristalinę celiuliozę Prosolv® SMCC HD 90 ir bevandenį

koloidinį silicio dioksidą – aerosilą. Baltymų, išskirtų iš didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.)

žolės, tirpalas porcelianinėje lėkštelėje sumaišytas su pagalbinėmis medžiagomis: 3 dalys baltymų

tirpalo sumaišyta su 10 dalių Prosolv® SMCC HD 90 ir 3 dalimis aerosilo. Gauta masė paskleista

ant pergamentinio popieriaus ir palikta džiūti 20 ± 2°C temperatūroje 24 valandas iki 10 % sausojo

likučio. Tuomet masė pertrinta per 2 mm dydžio angelių sietą. Kapsulėms gaminti naudota

kapsuliavimo mašinėlė. Susidarę birūs milteliai kapsuliuoti į „0“ dydžio kapsules,

pripildant didesnįjį cilindrą (korpusą) milteliais ir užvelkant ant jo mažesnįjį cilindrą (kepurėlę).

Pagamintos kietosios želatinos kapsulės jautrios drėgmės ir temperatūros pokyčiams,

todėl buvo laikomos 4 ± 1°C temperatūros sąlygomis, esant 30 – 60% santykinei oro drėgmei.

30

2.4.5. Miltelių technologinių savybių vertinimas

Miltelių technologinėms savybėms vertinti nustatytas laisvai beriamų miltelių greitis ir miltelių

kūgio kampas.

2.4.5.1. Birumo greičio nustatymas

Pasverta 50 ± 0,01 g tiriamųjų miltelių mišinio (0,01 g tikslumu) ir suberta į prietaiso Erweka

AG (Vokietija) piltuvėlį. Taikyta 20-ties sekundžių vibracija. Po purtymo atidarius piltuvėlį,

išmatuotas laikas t (sek), per kurį tiriamieji milteliai m (g) išbėgo į surinkimo indą.

Birumo greitis B (g/sek) apskaičiuotas pagal 1 formulę:

20

t

mB

(1 formulė)

Birumas turi būti ne mažesnis kaip 4 – 5 g/s [52].

2.4.5.2. Subėrimo kampo nustatymas

Subėrimo kampas matuotas, naudojant prietaisą Erweka AG (Vokietija). Miltelių mišinio

dalelės, laisvai byrėdamos per fiksuotą piltuvą į surinkimo indą, suformuodavo kūgį, kurio aukštis

buvo išmatuotas į prietaisą integruotu matlankiu.

2 lentelėje pavaizduotas miltelių birumo įvertinimas pagal kūgio kampą, remiantis Eur. Ph. 2.9.36

[52].

2 lentelė. Miltelių birumo įvertinimas pagal kūgio kampą

Birumas Kūgio kampas (o)

Puikus 25 – 30

Geras 31 – 35

Vidutiškas 36 – 40

Priimtinas 41 – 45

Prastas 46 – 55

Labai prastas 56 – 65

Itin prastas > 66

31

Kuo mažesnis kūgio kampas (o), tuo geresnės miltelių birumo savybės, taigi ir kapsuliavimo

galimybės.

2.4.6. Pagamintų kietųjų kapsulių kokybės vertinimas

Pagamintų kietųjų želatininių kapsulių kokybės rodiklių vertinimui atliktas masės vienodumo ir

kapsulių tirpimo testas.

2.4.6.1. Pagamintų kietųjų kapsulių masės vienodumo testas

Tyrimas atliktas pagal Eur. Ph. 01/2008:20905 – „Vienadozių preparatų masės vienodumo

nustatymas“[53].

Testui atlikti paimama 20 atsitiktinai parinktų, nepažeistų kapsulių, kurios yra pasveriamos

ir apskaičiuojama vidutinė vienos kapsulės masė. Kietoji kapsulė yra atidaroma ir visas jos

turinys išberiamas. Atskirai pasveriamas ir želatininis kapsulės apvalkalas. Kapsulės turinio

masė yra skirtumas tarp nepažeistos kapsulės masės ir jos apvalkalo masės.

3 lentelėje parodytas leistinas svėrinių nuokrypis. Leidžiamas tik ne daugiau kaip 2 svėrinių

nuokrypis procentais nuo masės vidurkio, didesnis nei nurodytas šioje lentelėje. Be to, nė

vienas iš svėrinių neturi leistinų nuokrypio ribų viršyti daugiau kaip 2 kartus.

3 lentelė. Leistinas svėrinių nuokrypis

2.4.6.2. Pagamintų kietųjų kapsulių tirpimo testas

Šio tyrimo tikslas – įvertinti baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių greitį. Kapsulių tirpimo

tyrimui naudotas krepšelinis prietaisas.

Tyrimas atliktas, naudojant aparatą Erweka DZT. Prietaisą sudaro vandens vonia, kurioje yra

įstatytas indas su tyrimui reikalinga terpe (50 ml fosfatinio druskos buferinio tirpalo (PBS) ir natrio

Vaistinė forma Vidutinė masė Procentinis nuokrypis

Kapsulės Mažiau nei 300 mg 10 %

300 mg ir daugiau 7,5 %

32

šarmo (NaOH) mišiniu (pH=8)). Į indą įmerktas nustatytu greičiu (100 apsisukimų per minutę)

besisukantis krepšelis. Terpės temperatūra (37 ± 0,5 oC) palaikoma termostatinio vandens šildytuvo

pagalba. Krepšelio nuotolis nuo indo dugno – 20 ± 2 mm. Į krepšelį dedama atsitiktinai parinkta

kapsulė. Kapsulei su baltymų frakcija pradėjus tirpti, kas 15 minučių imami baltymų tirpalų mėginiai

po 10 ml (paimti viso 4 mėginiai – po 15, 30, 45, 60 minučių). Mėginiai imami iš vietos, esančios

viduryje tarp tirpimo terpės paviršiaus ir krepšelio apatinės dalies, ne mažesniu kaip 10 mm atstumu

nuo indo sienelių. Kiekvieną kartą iš indo paėmus 10 ml baltymų tirpalo mėginio, atgal į indą įpilta 10

ml terpės, kad būtų kompensuojamas ir palaikomas pastovus terpės tūris.

2.4.7. Baltymų, išsiskyrusių iš pagamintų kietųjų kapsulių, kiekio nustatymas

Siekiant nustatyti, kiek baltymų, tirpstant kapsulei, atsipalaidavo, buvo atliktas Bradford

tyrimas. Atlikta surinktų mėginių po 15, 30, 45 ir 60 minučių analizė.

Naudojant 0,125, 0,25, 0,5, 1,0, 1,5 ir 2 mg/ml koncentracijų jaučio serumo albuminą, kaip standartą,

sudaryta nauja kalibracinė kreivė, pavaizduota 3 paveiksle.

3 pav. Kalibracinė Bradfordo metodo kiekybinio baltymų nustatymo kreivė

Pamatavus tiriamųjų mėginių tirpalų absorbciją, baltymų koncentracija apskaičiuota pagal lygtį

y = 0,0604x – 0,0154. Koreliacijos koeficientas R² = 0,9899. Kalibracinė kreivė yra patikima, kadangi

koreliacijos koeficientas artimas 1. Didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) atsipalaidavusių iš

kapsulių baltymų kiekis palygintas su baltymų kiekiu kapsulėje.

33

2.4.8. Baltymų antioksidantinio aktyvumo nustatymas, naudojant (ABTS•+)

modelinį radikalą

Baltymų tirpalui prieš kietųjų kapsulių gamybą ir baltymams, išsiskyrusiems po pagamintų

kapsulių tirpinimo, buvo taikytas antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodas, pagrįstas ABTS

radikalo – katijono (ABTS•+) surišimo mechanizmu [54, 55]. ABTS•+, dar kitaip – prooksidantas – tai

stabilus, tamsiai žalios spalvos, ilgai gyvuojantis radikalas, turintis keturis absorbcijos maksimumus

regimosios šviesos absorbcijos spektre, esant 415, 650, 734 ir 815 nm bangos ilgiui. Aktyvus ABTS•+

radikalas buvo gautas, reaguojant ABTS su kalio persulfatu. Radikalas gaunamas, laikant ABTS ir

kalio persulfato mišinį santykiu 5:1 tamsoje 16 valandų. Katijoninė radikalo forma išlieka stabili dvi

paras. Elektronų perdavimo reakcijoms yra svarbus terpės pH, nes esant didesnei pH reikšmei,

antioksidantas savo elektronus prooksidantui atiduoda greičiau. Todėl atliktame tyrime buvo naudotas

fosfatinis buferio (PBS) tirpalas, kuris užtikrino pH 7,4 reikšmę. Tyrimas vykdytas tiriamajame

mėgintuvėlyje su vandeniniu PBS tirpalu, įpilant skirtingą tūrį baltymų frakcijos ir aktyvuoto kalio

persulfatu ABTS tirpalo. Vykdyta spektrofotometrinė analizė, esant absorbcijos maksimumui ties 734

nm bangos ilgiu. Antioksidantinis aktyvumas apskaičiuotas pagal 2 formulę [55, 56]:

(𝐴𝑘−𝐴𝑡

𝐴𝑘) × 100% = 𝐼𝑃 (%) (2 formulė)

kur:

Ak – kontrolinio tirpalo absorbcijų vidurkis;

At – tiriamojo tirpalo absorbcijų vidurkis.

Atliktas baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus (L.) žolės, tirpalo antioksidantinio aktyvumo

nustatymas prieš kapsulių gamybą bei atsipalaidavusių baltymų iš kietųjų kapsulių antiradikalinio

aktyvumo tyrimas. Standartiniu tirpalu laikytas ABTS radikalas – katijonas (ABTS•+) PBS tirpale.

2.4.9. Statistinis duomenų vertinimas

Duomenys pateikti išraiška vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). Visi tyrimai pakartoti tris

kartus.

Statistinė duomenų analizė atlikta, naudojant programinį paketą MS Office Excel 2010

(Microsoft Corporation, JAV).

34

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Baltymų skirstymo gelchromatografijos metodu rezultatai

Tyrime baltymų frakcionavimas vykdytas pagal 2.4.1. skyriuje aprašytą metodiką.

Gelchromatografijos metodu buvo surinktos 44 baltymų frakcijos po 0,5 ml. Baltymų frakcijų

chromatograma vaizduojama 4 paveiksle.

4 pav. Baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, frakcijų chromatograma. Gautos smailės prie 280nm

(mėlyna spalva) ir 215nm (rožinė spalva) UV bangos ilgių

Chromatogramoje pavaizduotos mėlynos spalvos smailės gautos, esant 280 nm bangos

ilgio absorbcijai, o rausvos spalvos smailės – prie 215 nm bangos ilgio. Remiantis literatūros

duomenimis, prie 215 nm UV bangos ilgio yra stebima peptidines jungtis turinčių medžiagų

absorbcija, o esant 280 nm bangos ilgiui, užfiksuojama aromatinių aminorūgščių (triptofano, tirozino,

fenilalanino) bei disulfidiniais tilteliais tarpusavyje susijungiančio cisteino absorbcija [57].

Ties 14 – 15, 24 – 25, 30 – 31, 36 – 37, 40, 43, 46 – 47, 50 – 52 bei 54 – 55 frakcijomis gautos prie

skirtingų UV bangos ilgių smailės nurodo jose esančias skirtingas struktūras. Visos frakcijos turi

peptidinių jungčių. Aromatinių aminorūgščių bei cisteino kiekis frakcijose yra mažesnis. Ties 36 – 42

35

frakcijomis smailės yra persidengusios. Tai rodo nepilną dalelių atsiskyrimą pagal dydį, o kartu ir

baltymų dydžio bei formos panašumą tarpusavyje.

Tolimesniam koncentracijos ir molekulinės masės tyrimui pasirinktos 14, 36, 37, 40, 43

46, 51 bei 55 baltymų frakcijos, kurių smailės chromatogramoje buvo aukščiausios.

3.2. Baltymų kiekio nustatymas

Siekiant nustatyti baltymų koncentraciją, esančią gautose baltymų frakcijose po

gelchromatografijos, buvo taikytas Bradford metodas. Išmatuota 14, 36, 37, 40, 43, 46, 51

bei 55 frakcijose esančių baltymų šviesos absorbcija ir pagal funkciją y = 0,0205x + 0,0105

apskaičiuota baltymų koncentracija. Tyrimų rezultatai pateikti 4 lentelėje.

4 lentelė. Baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, frakcijų kiekybinis nustatymas Bradford metodu

Frakcijos Nr. Absorbcija Koncentracija, µg/ml

14 0,0169 0,312 ± 0,09

36 0,4134 19,654 ± 0,04

37 0,3276 15,468 ± 0,05

40 0,1782 8,180 ± 0,07

43 0,1111 4,907 ± 0,06

46 0,0844 3,605 ± 0,11

51 0,0750 3,146 ± 0,07

55 0,0628 2,551 ± 0,06

Iš lentelėje pateiktų duomenų matyti, kad didžiausias baltymų kiekis (19,654 ± 0,04 µg/ml)

buvo nustatytas 36 frakcijoje. Taip pat nemažai (15,468 ± 0,05 µg/ml) baltymų rasta 37 frakcijoje.

Būtent šios frakcijos atrinktos tolimesniam molekulinės masės nustatymui natrio dodecilsulfato

poliakrilamido gelio elektroforezės būdu.

3.3. Baltymų molekulinės masės tyrimas

Norint nustatyti po gelchromatografijos ir kiekybinės analizės atrinktų 36 ir 37 baltymų

frakcijų molekulines mases, buvo atlikta NaDS – PAGE elektroforezė pagal 2.4.3. skyriuje aprašytą

36

metodiką. Naudotas baltymų standartas – rinkinys PageRuler™ #26616, kurio dalelių dydis 10 – 170

kDa. Tyrimo rezultatai pateikti 5 paveiksle.

5 pav. Chelidonium majus L. žolės baltymų frakcijų NaDS – PAGE elektroforezė

Paveiksle matyti, kad 36 ir 37 baltymų frakcijose esančių baltymų molekulinės masės yra

beveik tapačios. Lyginant su standartu, nustatyta, kad šiose frakcijose baltymų molekulinės masės yra

15, 20, 35 ir 38 kDa. Jeigu elektroforezės gelyje matomos dvi juostos yra labai arti viena kitos

arba net susiliejusios į vieną, tai rodo, kad polipeptidai yra ne tik panašios

molekulinės masės, bet gali būti to paties baltymo skirtingos izoformos arba turėti panašią

aminorūgščių seką. Ši tendencija būdinga 15 kDa molekulinę masę turintiems baltymams.

Remiantis kitų autorių atliktų tyrimų su Chelidonium majus L. žolės baltymais duomenimis, 15

kDa molekulinę masę turi glicinu praturtintas su RNR besijungiantis baltymas (Glycine – Rich RNA –

Binding Protein) [58]. 20k Da masę turi fermentinės kilmės baltymai peroksiredoksinas, tioredoksinas,

glioksalazė [8]. Tokią pačią molekulinę masę turi ir su chitinu besijungiantys glikoproteinai – lektinai.

[59]. 35 kDa molekulinė masė būdinga didžiųjų ugniažolių žolėje esančiam fermentui nukleazei [12].

38 kDa molekulinę masę turi fermentinės kilmės baltymas glutationo peroksidazė [60].

37

3.4. Miltelių su baltymais, išskirtais iš Chelidonium majus L. žolės, birumo

nustatymas

Atliktų miltelių su baltymais, išskirtais iš Chelidonium majus L. žolės, birumo tyrimų rezultatai

pateikiami 5 lentelėje.

5 lentelė. Baltymų ir pagalbinių medžiagų miltelių birumo parametrai

Tiriamasis mišinys

Birumo

greitis

(g/sek)

Subėrimo

kampas

(SK), (0)

Chelidonium majus

L. baltymų ir

pagalbinių medžiagų

mišinys

4,47 ± 0,32 31,00 ± 0,43

Remiantis birumo parametrais, nurodytais Eur. Ph. monografijoje 01/2010:20936 [52], pagal

gautus rezultatus nustatyta, kad Chelidonium majus L. baltymų ir pagalbinių medžiagų mišinys yra

tinkamas kapsuliavimui, nes pasižymi geru birumu.

3.5. Kietųjų kapsulių su ugniažolių žolės baltymais gamyba ir kapsulių masės

vienodumo nustatymas

Pagaminus kietąsias kapsules, kurių sudėtyje yra Chelidonium majus L. žolės baltymų, ir

atlikus kapsulių masės vienodumo testą, gauti rezultatai pateikiami 6 lentelėje.

6 lentelė. Kietųjų kapsulių, pagamintų su Chelidonium majus L. baltymų tirpalu, masės nuokrypiai.

Tyrimo objektas

Masė, mg (X ± SD; n=20), Serijos numeris

1 2 3

Chelidonium majus L.

kietosios kapsulės 0,34 ± 0,002 0,34 ± 0,003 0,34 ± 0,0021

Gauta vidutinė kietosios kapsulės masė 0,34 ± 0,0024 g. Pagamintų kietųjų kapsulių masės

nuokrypis neviršija leistino 7,5 % masės nuokrypio, vadinasi, jos yra užpildytos tolygiai ir todėl

38

atitinka Europos Farmakopėjos reikalavimus [53]. Kiekvienos kapsulės sudėtyje buvo 4,86 ± 0,03 µg

baltymų.

3.6. Baltymų kiekybinis nustatymas po išsiskyrimo iš kietųjų kapsulių

Kapsulių tirpimo testas atliktas pagal 2.4.6.2. skyriuje aprašytą metodiką. Bradford metodu

nustatytas baltymų kiekis kapsulėje ir baltymų kiekis po atsipalaidavimo iš kietųjų kapsulių.

Apskaičiuotas baltymų atsipalaidavimas iš kapsulių (%). Rezultatai pateikti 7 lentelėje.

7 lentelė. Didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) baltymų kiekis kapsulėje ir po atsipalaidavimo iš

kapsulių

Laikas

Baltymų kiekis,

nustatytas,

išsiskiriant

baltymams iš

kapsulių (µg)

Baltymų kiekis kapsulėje

(µg) Atsipalaidavimas (%)

Po 15 min. 3,85 ± 0,05

4,86 ± 0,03

79 ± 0,64

Po 30 min. 3,97 ± 0,02 82 ± 0,79

Po 45 min. 4,26 ± 0,03 88 ± 0,82

Po 60 min. 4,41 ± 0,06 91 ± 0,58

Pagal Europos Farmakopėjos reikalavimus (Eur. Ph. 07/2010:51701), per 45 minutes iš

kapsulės turėtų atsipalaiduoti ne mažiau kaip 75% aktyvios medžiagos [51]. Pagal lentelėje esančius

duomenis matyti, kad baltymų atsipalaidavimas iš kapsulių yra efektyvus. Daugiausiai baltymų (91 ±

0,58%) atsipalaiduoja, praėjus 60 min. nuo kapsulių tirpimo pradžios.

3.7. Baltymų antioksidantinio aktyvumo tyrimas, naudojant (ABTS•+) modelinį

radikalą

Baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, ir baltymų, atsipalaidavusių iš kietųjų

kapsulių, antioksidantinio aktyvumo tyrimas vykdytas pagal 2.4.8 skyriuje aprašytą ABTS radikalo –

katijono (ABTS•+) surišimo įvertinimo metodiką. Gauti baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L.

žolės, tirpalo antioksidantinio aktyvumo rezultatai išreikšti ABTS radikalo – katijono (ABTS•+)

surišimo geba (%) ir grafiškai pavaizduoti 6 paveiksle:

39

6 pav. ABTS radikalo – katijono surišimo gebos tiesioginė priklausomybė nuo Chelidonium majus L.

baltymų koncentracijos

Stebėta ABTS radikalo – katijono surišimo gebos tiesioginė priklausomybė nuo

koncentracijos, pvz.: maksimalus antiradikalinis aktyvumas (71,29 ± 0,9 %) pasiektas, kai

baltymų koncentracija buvo 7 ± 0,4 μg/ml. Mažiausias antioksidantinis aktyvumas (8,15 ± 1,2 %)

pasiektas, kai baltymų koncentracija tirpale buvo 3 ± 0,6 μg/ml.

Tai, kad baltyminės kilmės biologiškai aktyvios medžiagos, esančios Chelidonium majus (L.)

žolėje, pasižymi antioksidantiniu aktyvumu, patvirtina 2014 metais Lenkijoje atlikta proteominė

Chelidonium majus (L.) žolės ektrakto analizė. Ekstrakte nustatytas 1240 skirtingų baltymų

rinkinys, kuriame rasta antioksidantiniu aktyvumu pasižyminti gliutationo peroksidazė bei daugelis

kitų fermentinių antioksidantų, tokių kaip katalazė ar peroksiredoksinas [8].

Antioksidantinio aktyvumo tyrimas pagal tą pačią metodiką pakartotas po Chelidonium majus

L. žolės baltymų atsipalaidavimo iš kietųjų kapsulių. Gauti rezultatai pavaizduoti 7 paveiksle.

40

7 pav. Chelidonium majus L. baltymų, atsipalaidavusių iš kapsulių po tam tikro laiko intervalo,

antiradikalinis aktyvumas

Didžiausias baltymų antiradikalinis aktyvumas – 35 ± 0,7 % stebėtas, praėjus 15 minučių nuo

baltymų atsipalaidavimo pradžios iš pagamintų kietųjų kapsulių, kai iš jų atsipalaidavo 3,85 ± 0,05µg

baltymų. Vėliau stebėtas antiradikalinio aktyvumo mažėjimas. Baltymų aktyvumo sumažėjimą galėjo

lemti jų denatūracija dėl netinkamai parinktų eksperimentinių sąlygų, gaminant kapsules

(temperatūros, ilgo džiovinimo ar kapsulių laikymo laiko).

41

4. IŠVADOS

1. Atlikus didžiųjų ugniažolių žolės baltymų gelchromatografiją, baltymai atsiskyrė tik dalinai.

2. Frakcijose nustatyta nuo 0,312 ± 0,09 µg/ml iki 19,654 ± 0,04 µg/ml baltymų koncentracija.

3. Nustatyta frakcijose esančių baltymų molekulinė masė atitiko fermentinės kilmės baltymų ir su

chitinu besijungančių glikoproteinų – lektinų molekulinę masę. Reikalingi tolimesni tyrimai, norint

nustatyti šių baltymų tapatybę.

4. Pagamintoje kiekvienoje kietojoje kapsulėje yra 4,86 ± 0,03 µg baltymų. Baltymų ir pagalbinių

medžiagų mišinys yra tinkamas kapsuliavimui, nes pasižymi geru birumu ir atitinka Europos

Farmakopėjos reikalavimus (pagal miltelių birumo greitį ir subėrimo kūgio kampą).

5. Kietųjų kapsulių gamybai pasirinktas tinkamas būdas, nes baltymų atsipalaidavimas iš jų yra

efektyvus, atitinka Europos Farmakopėjos reikalavimus (iš kietosios kapsulės atsipalaidavo daugiau

nei 75% baltymų per 45 min).

6. Baltymai, išskirti iš didžiųjų ugniažolių žolės, geba surišti laisvuosius radikalus. Stebėtas sumažėjęs

baltymų antiradikalinis aktyvumas, pagaminus kapsules. Baltymų aktyvumo sumažėjimą galėjo lemti

jų denatūracija dėl netinkamai parinktų eksperimentinių sąlygų, gaminant kapsules (temperatūros, ilgo

džiovinimo ar kapsulių laikymo laiko).

42

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Įdiegtos praktinės rekomendacijos: su baltymais, išskirtais iš didžiosios ugniažolės

(Chelidonium majus L.) žolės, pagamintos kietosios kapsulės, kurių technologiniai rodmenys

atitinka Europos Farmakopėjos reikalavimus. Šios kapsulės tolimesniems biologinio aktyvumo

tyrimams perduotos Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V. F. Kuprevičiaus eksperimentinės

botanikos institutui pagal susitarimą, vykdant bendrą Lietuvos – Baltarusijos projektą „Naujų

augalinės kilmės polipeptidų lektinų tyrimas ir panaudojimo būdų paieška, kuriant potencialius

imunomoduliatorius ir citostatikus“ (Paraiškos registracijos Nr. TAP-LB-12-006).

Praktinės rekomendacijos tolimesniems tyrimams:

nustatyti Chelidonium majus L. žolėje esančių baltymų tapatybę ir struktūrą;

palyginti kokybinę – kiekybinę Chelidonium majus L. sudėtį džiovintoje ir šviežioje vaistinėje

augalinėje žaliavoje;

optimizuoti kietųjų kapsulių su baltymais gamybą;

su Chelidonium majus L. žolėje esančiais baltymais atlikti tolimesnius antioksidantinio

aktyvumo tyrimus in vivo.

43

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. European Pharmacopoeia 7th Edition. Greater Celandine. Chelidonii herba. 01/2008:1861.

2. Gilca M., Gamana L., Panait E., Stoian I., Atanasiu V. Chelidonium majus – an Integrative

Review: Traditional Knowledge versus Modern Findings. Forsch Komplementmed 2010;

17:241–248.

3. Jyoti B. S. Chelidonium majus L. – a review on pharmacological activities and clinical effects.

Global J Res. Med. Plants & Indigen. Med./Volume 2, Issue 4/April 2013/ 238 – 245.

4. European Medicines Agency. Assessment report on Chelidonium majus L., herba.

EMA/HMPC/369801/2009. Prieiga per internetą:

http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-

_HMPC_assessment_report/2012/01/WC500120711.pdf

5. Dumbravă D. G, Hădărugă N. G, Moldovan C., Raba D. N., Popa M. V. Obtaining and

comparative analysis of some carotenoidic extracts from marigold (Calendula officinalis L.)

flowers and celandine (Chelidonium majus L.) flowers. Journal of Agroalimentary Processes

and Technologies 2013; 19(1): 74 – 78.

6. Nawrot R., Kalinowski A., Gozdzicka-Jozefiak A. Proteomic analysis of Chelidonium majus

milky sap using two-dimensional gel electrophoresis and tandem mass spectrometry.

Phytochemistry 2007; 68:1612–1622.

7. Nawrot R., Lesniewicz K., Pienkowska J., Gozdzicka-Jozefiak A. A novel extracellular

peroxidase and nucleases from a milky sap of Chelidonium majus. Fitoterapia 2007; 78: 496–

501.

8. Nawrot R., Zauber H., Schulze W. X. Global proteomic analysis of Chelidonium majus and

Corydalis cava (Papaveraceae) extracts revealed similar defense – related protein compositions.

Fitoterapia 2014; 94: 77–87.

9. Barnes J, Anderson L. A. and Phillipson J. D. Herbal Medicines. Third edition. UK:

Pharmaceutical Press; 2007.p. 136 – 145.

10. Fik E., Dalgalarrondo M., Haertlé T., GoŸdzicka-Józefiak A. Comparative biochemical

analysis of lectin and nuclease from Chelidonium majus L. Acta biochimica polonica. Vol. 47

No. 2/2000. p. 413–420.

11. Musidlak O., Buchwald W., Nawrot R. Plant defense responses against viral and bacterial

pathogen infections. Focus on RNA – binding proteins (RBPs). Herba polonica. 2014; Vol. 60

No. 4.

12. Nawrot R., Wouñ – Cholewa M., GoŸdzicka – Józefiak A. Nucleases isolated from

Chelidonium majus L. milky sap can induce apoptosis in human cervical carcinoma HeLa

44

cells but not in Chinese Hamster Ovary CHO cells. Folia histochemica et cytobiologica. 2008;

Vol. 46, no. 1, p. 79 – 83.

13. Khurtsidze M., Aleksidze N., Alexidze G. Partial Purification and Biochemical Characteristics

of Lectin CBL – 1 Isolated from the Greater Celandine (Chelidonium majus L.) Plant. Bulletin

of the Georgian National Academy of sciences, 2014; vol. 8, no. 3.

14. Then M., Szentmihályi K., Sárközi Á., Szöllôsi Varga I. Examination on antioxidant activity in

the greater celandine (Chelidonium majus L.) extracts by FRAP method. Acta Biologica

Szegediensis. 2003; Volume 47(1 – 4). p. 115-117.

15. Hădărugă D. I., Hădărugă N. G. Antioxidant activity of Chelidonium majus L. extracts from

the Banat county. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies 2009, 15(3), 396-

402.

16. Dumbravă D. G., Hadarugă N. G., Hadarugă D. I., Gruia A., Tatu C., Păunescu V., Lupea A.

X. Antioxidant activity of some celandine (Chelidonium majus L.) carotenoidic extracts.

Journal of Agroalimentary Processes and Technologies 2008, 14(2), 433 – 441.

17. Jakovljević Z. D., Stanković S. M., Topuzović D. M. Seasonal variability of Chelidonium

majus L. secondary metabolites content and antioxidant activity. EXCLI Journal 2013;12:

260 – 268 – ISSN 1611 – 2156.

18. Choi D. S., Kim S. J. & Jung M. Y. Inhibitory Activity of Berberine on DNA Strand Cleavage

Induced by Hydrogen Peroxide and Cytochrome c. Bioscience, Biotechnology, and

Biochemistry. 2001;Volume 65, Issue 2. p. 452 – 455.

19. Heo J. I., Kim J. H., Lee J. M., Lim S.S., Kim S. C., Park J. B., Kim J. B., Lee J. Y.

Antioxidant Activity and Its Mechanism of Chelidonium majus Extract. Korean J. Medicinal

Crop Sci 2013; 21(2): 136 − 141.

20. Kumar S., Jyotirmayee K., Sarangi M. Thin Layer Chromatography: A Tool of Biotechnology

for Isolation of Bioactive Compounds from Medicinal Plants. International Journal of

Pharmaceutical Sciences Review and Research. 2013;18(1), Jan –Feb, nᵒ 18: 126-132.

21. Schägger H. Tricine–SDS-PAGE. Nature protocols. 2006; Vol.1 No.1:16 – 22.

22. Redeker V., Hughes C., Savistchenko J., Vissers J.P.C., Melki R. Qualitative and Quantitative

Multiplexed Proteomic Analysis of Complex Yeast Protein Fractions That Modulate the

Assembly of the Yeast Prion Sup35p. [Interaktyvus] 2011. [Žiūrėta 2014-12-17]. Prieiga per

internetą:

http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0023659

23. Gupta P. K. Cell and Molecular Biology. New Delhi:Rastogi Publications, 2005. pp. 20.

24. Ahmed H. Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization.

Florida:CRC Press, 2004. p. 140 – 149.

45

25. Burgess R. R., Deutscher M. P. Methods in enzymology. Guide to Protein Purification, 2nd

Edition. San Diego:Academic Press, 2009. p. 43 – 57.

26. Berek D. Size exclusion chromatography – A blessing and a curse of science and technology of

synthetic polymers. J. Sep. Sci. 2010; 33: 315–335.

27. Trathnigg B. Size-exclusion Chromatography of Polymers. In: Meyers R.A. Encyclopedia of

Analytical Chemistry. Chichester: John Wiley & Sons Ltd, 2000. pp. 8008–8034.

28. Sen S., Sarkar S., Kundu P., Laskar S. Separation of Amino Acids Based on Thin-Layer

Chromatography by a Novel Quinazoline Based Anti-Microbial Agent. American Journal of

Analytical Chemistry, 2012; 3: 669-674.

29. Striegel M. F., Hill J. Thin-Layer Chromatography for Binding Media Analysis. Los Angeles:

The Getty Conservation Institute.1996.

30. Roy V. K., Kumar N. S. and Gurusubramanian G. Proteins – structure, properties and their

separation by SDS – polyacrylamide gel electrophoresis. Science Vision: Vol 12 Issue No 4.

2012. p. 170 – 181.

31. Chevallet M., Luche S., and Rabilloud T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.

Nat Protoc. 2006; 1(4): 1852–1858.

32. Owusu – Apenten R. K. Food protein analysis. Quantitative Effects on Processing. New York:

Marcel Dekker, Inc. 2002.

33. Waterborg J. H. The Lowry Method for Protein Quantitation. In: Walker J. M. The Protein

Protocols Handbook. Second edition. Totowa, New Jersey: Humana Press; 2002. pp. 7 – 11.

34. Walker J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. In: Walker J. M.

The Protein Protocols Handbook. Second edition. Totowa, New Jersey: Humana Press; 2002.

pp. 11 – 15.

35. Burtis C. A., Ashwood E. R., Bruns D. E. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular

Diagnostics. Fifth edition. St. Louis, Missouri: Elsevier Saunders, 2012.

36. Okutucu B., Dınçer A., Habib Ö., Zıhnıoglu F. Comparison of five methods for determination

of total plasma protein concentration. J. Biochem. Biophys. Methods 2007; 70: 709–711.

37. Kruger N. J. The Bradford Method for Protein Quantitation. In: Walker J. M. The Protein

Protocols Handbook. Second edition. Totowa, New Jersey: Humana Press; 2002. p. 15 – 21.

38. Ratnaparkhi M.P., Chaudhari S.P., Pandya V.A. Peptides and proteins in pharmaceuticals.

International Journal of Current Pharmaceutical Research. 2011. Vol 3, Issue 2, pp. 1-9.

39. Bhatt B., Agrawal S.S. Pharmaceutical Technology. Capsules. [Interaktyvus] 2007. [Žiūrėta

2015-02-24]. Prieiga per internetą:

http://nsdl.niscair.res.in/jspui/bitstream/123456789/747/1/Revised%20CAPSULES.pdf

40. European Pharmacopoeia 7th Edition. Capsules. Capsulae. 01/2008:0016.

46

41. Rabadiya B., Rabadiya P. A review: Capsule shell material from gelatin to non animal origin

material. JPRBS, 2013; Volume 2(3):42 – 71.

42. Dave R. H. Overview of pharmaceutical excipients used in tablets and capsules. Drug topics.

[Interaktyvus] 2008. [Žiūrėta 2015-03-09]. Prieiga per internetą:

http://drugtopics.modernmedicine.com/drug-topics/news/modernmedicine/modern-medicine-

news/overview-pharmaceutical-excipients-used-tablets?page=full

43. Gad S. C. Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Production and Processes. Hoboken:John

Wiley & Sons. 2008. p. 248.

44. Stegemann S. Hard gelatin capsules today – and tomorrow. 2nd edition. Capsugel Library

[Interaktyvus] 2002. [Žiūrėta 2015-03-14]. Prieiga per interentą:

http://capsugel.com/media/library/hard-gelatin-capsules-today-and-tomorrow.pdf

45. Lumay G., Boschini F., Traina K., Bontempi S., Remy J. – C., Cloots R., Vandewalle N.

Measuring the flowing properties of powders and grains. Powder Technology 2012; 224:

19 – 27.

46. Pinheiro V. A., Kaneko T. M., Robles Velasco M. V., Consiglieri V. O. Development and in

vitro evaluation of extended – release theophylline matrix capsules. Brazilian Journal of

Pharmaceutical Sciences 2007; vol. 43, n. 2, abr./jun.

47. Ratnam G. V., Ravi G., Harish G., Duraivel S., Pragati K. B. Formulation of venlafaxine

sustained release capsule dosage form. Journal of Chemical and Pharmaceutical Sciences.

2013; JCPS Volume 6 Issue 1.

48. Yerramsetty P., Vijaya Ratna D. J., Reddy V. R., Kumar P. Formulation, Development and

Evaluation of delayed release capsules of Duloxetine Hydrochloride made of different Enteric

Polymers. International Journal of Drug Development & Research. 2012. Vol. 4. Issue 1.

49. Pranskūnienė Ž., Bernatonienė J., Kalvėnienė Z., Masteikova R, Mekas T., Velžienė S.,

Ivanauskas K., Suchockas V., Mintauckienė I., Savickas A. New formula herbal pellets

demonstrate a uniform and stable release of the active ingredients in vitro. Acta Poloniae

Pharmaceutica ñ Drug Research, 2013; Vol. 70 No. 4: 727 – 736.

50. European Pharmacopoeia 7th Edition. Dissolution test for solid dosage forms. 01/2010:20903.

51. European Pharmacopoeia 7th Edition. Recommendations on Dissolution testing.

07/2010:51701.

52. European Pharmacopoeia 7th Edition. Powder flow. 01/2010:20936.

53. European Pharmacopoeia 7th Edition. Uniformity of mass of single-dose preparations.

01/2008:20905.

47

54. Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., Rice – Evans C. Antioxidant

activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology

& Medicine, 1999; Vol. 26, Nos. 9/10: 1231–1237.

55. Kalim M. D., Bhattacharyya D., Banerjee A., Chattopadhyay S. Oxidative DNA damage

preventive activity and antioxidant potential of plants used in Unani system of medicine. BMC

Complementary and Alternative Medicine 2010, 10:77.

56. Abou – zeid L., Baraka H. N. Combating oxidative stress as a hallmark of cancer and aging:

Computational modeling and synthesis of phenylene diamine analogs as potential antioxidant.

Saudi Pharmaceutical Journal 2014; 22: 264–272.

57. Schmid F. X. Biological Macromolecules: UV – visible Spectrophotometry. Encyclopedia of

life sciences. [Interaktyvus] 2001. [Žiūrėta 2014-11-17] Prieiga per internetą:

http://tinyurl.com/kn6rnwb

58. Nawrot R., Tomaszewski Ł., Czerwoniec A. & Goździcka – Józefiak A. Identification of a

Coding Sequence and Structure Modeling of a Glycine – Rich RNA – Binding Protein

(CmGRP1) from Chelidonium majus L. Plant Mol Biol Rep 2013; 31:470 – 476.

59. Hasan I., Ozeki Y., Kabir S. R. Purification of a novel chitin-binding lectin with antimicrobial

and antibiofilm activities from a Bangladeshi cultivar of potato (Solanum tuberosum). Indian

Journal of Biochemistry & Biophysis. Vol. 51, April 2014, pp. 142-148.

60. Narita H., Asaka Y., Ikura K., Matsumoto S., Sasaki R. Isolation, characterization and

expression of cationic peroxidase isozymes released into the medium of cultured tobacco cells.

Eur. J. Biochem. 1995;228: 855-862.

48

7. PRIEDAI

7.1. Tezės, pristatytos Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencijoje 2014

BALTYMŲ FRAKCIJŲ, PRATURTINTŲ LEKTINAIS, IŠ ECHINACEA

PURPUREA L. MOENCH , CHELIDONIUM MAJUS L., CETRARIA ISLANDICA

L. ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Luka Šiatkutė, Greta Kalvaitytė, Jovita Juodsnukytė

Farmakognozijos katedra, Neuromokslų institutas

Vadovas: Prof. N. Savickienė, prof. D. Majienė

Sparčiai augant lėtinėmis ligomis sergančių žmonių skaičiui, vis labiau domimasi natūraliomis

antioksidaciniu poveikiu pasižyminčiomis prevencinėmis priemonėmis. Antioksidacinis aktyvumas –

tai gebėjimas neutralizuoti laisvųjų radikalų poveikį ir tokiu būdu sumažinti jų daromą žalą organizmui,

sustiprinti ląstelės apsaugos sistemas ir atkurti pažeistas struktūras. Antioksidaciniu aktyvumu

pasižymi ir kai kuriuose augaluose aptinkami biologiškai aktyvūs junginiai – lektinai. Tai neimuninės

kilmės baltyminės medžiagos, atpažįstančios bei gebančios jungtis prie įvairių angliavandenių.

Lektinai geba sukelti eritrocitų bei kitų ląstelių agliutinaciją, mitogeninę limfocitų stimuliaciją,

inicijuoja supresinių ląstelių gamybą, histamino išsiskyrimą iš bazofilų bei putliųjų ląstelių, sustiprina

makrofagų fagocitozę, slopina auglio ląstelių bei grybelių augimą, pasižymi imunomoduliuojančiu

poveikiu in vivo, taip pat toksiškumu ląstelėms ir daugeliu kitų savybių.

Darbo tikslas:

Baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, iš Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių,

Chelidonium majus L. žolės, Cetraria islandica L. gniužulų, antioksidacinio aktyvumo įvertinimas.

Uždaviniai:

1. Ištirti Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių, Chelidonium majus L.

žolės, Cetraria islandica L. gniužulų lektinų turinčių baltymų frakcijų antioksidacinį

aktyvumą, panaudojant ABTS (azinobisetilbenzotiazolinsulfo rūgšties) radikalus.

2. Palyginti tiriamų objektų antioksidacinį aktyvumą.

49

Darbo metodika:

Taikytas ABTS radikalų-katijonų surišimo metodas. Naudota spektrofotometrinė

analizė, kai absorbcijos maksimumas – 734 nm bangos ilgio. ABTS radikalas po

aktyvavimo kalio persulfatu laikytas tamsioje, vėsioje vietoje 16 valandų. Naudotas buferinis

fosfato druskos tirpalas (PBS), užtikrinantis 7,4 pH reikšmę.

Tyrimas vykdytas į PBS tirpalą pilant skirtingus kiekius lektinų (mikrolitrais) ir pridedant aktyvuoto

kalio persulfatu ABTS tamsiai žalios spalvos tirpalo. Sumaišius šiuos reagentus, vykdyta

spektrofotometrinė analizė. Gauti rezultatai lyginti su kontroliniu tirpalu – ABTS radikalu-katijonu

PBS tirpale.

Rezultatai:

1. Paveikus Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių baltymų frakciją, turinčią lektinų,

aktyvuotu ABTS tirpalu, absorbcija pradeda mažėti, esant 50µl baltymų 1ml tirpalo. Esant 75µl

baltymų 1ml tirpalo, absorbcija sumažėjo beveik dvigubai ir toliau mažėjo didinant baltymų,

praturtintų lektinais, kiekį tirpale.

2. Paveikus Chelidonium majus L. žolės baltymų frakciją, turinčią lektinų, aktyvuotu ABTS tirpalu,

absorbcija palaipsniui mažėjo. Mažiausia absorbcija stebėta, esant 7 µl didžiųjų ugniažolių žolės

baltymų1 ml tirpalo.

3. Paveikus Cetraria islandica L. gniužulų baltymų frakciją, turinčia lektinų, aktyvuotu ABTS tirpalu,

absorbcija palaipsniui mažėjo. Mažiausia absorbcija (0,457) pasiekiama, esant 300 µl baltymų 1 ml

tirpalo.

Išvados:

1. Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių, Chelidonium majus L. žolės, Cetraria

islandica L. Ach. gniužulų baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, pasižymėjo antioksidaciniu

aktyvumu, surišant ABTS radikalą.

2. Stipriausias antioksidacinis aktyvumas būdingas Chelidonium majus L. žolės baltymų frakcijai.

3. Silpniausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo Cetraria islandica L. gniužulų baltymų frakcija.

50

7.2. Pristatytas stendinis pranešimas konferencijoje 5th

International Conference

on Pharmaceutical Sciences and Pharmacy Practise, dedicated to 145th

Anniversary of prof. Petras Raudonikis 2014

Evaluation of antioxidant activity of proteins isolated from Chelidonium majus L.

herb and production of capsules with protein fractions

Greta Kalvaitytė1, Nijolė Savickienė

1, Arūnas Savickas

2, Gitana Žvirblytė

3, Olga Kandelinskaya

4,

Helena Grischenko4

1 Department of Pharmacognosy, Medical academy of Lithuanian University of Health Sciences,

Lithuania; 2Departmet of Drug Technology and Pharmaceutical Management, Lithuanian University

of Health Sciences, Lithuania; 3

Institute of Biotechnology, Vilnius University, Lithuania,

4V.F.Kuprevich Institute of Experimental Botany of Belarus Academy of Sciences, Belarus

kalvaitytegreta@gmail.com

Some biological activities of Chelidonium majus L. (family Papaveraceae) may depend on the

presence of proteins. A dimeric, chitin-binding protein, which is rich in glycine and cysteine amino

acids (Willy J. Peumans, 1985), has antiviral and antifungal activities (Qing Yao et al., 2010).

Nucleases can induce apoptosis (Nawrot R. et al., 2008). Protein-bound polysaccharide (CM-Ala)

affects like antitumor immunostimulator (Song J. et al, 2002). Several protein (superoxide dismutase,

peroxiredoxin and catalaze) have antioxidant activity (H. Zauber et al., 2014). A rational way to have a

beneficial effect of this plant is to make herbal preparation in solid or liquid dosage form for oral use.

One of the choices could be capsules, which have many advantages: availability of different sizes and

shapes, which make capsules easily recognizable; effective masking of unacceptable taste of active

ingredients and easy digestion in the stomach (Allen Loyd V, 1999).

Aim of experiment: to evaluate antioxidant activity of protein fractions isolated from Chelidonium

majus L. herb and to produce capsules with these protein fractions.

Experimental tasks:

1. To evaluate antioxidant activity of protein fractions isolated from Chelidonium majus L. herb.

2. To convert a liquid form of protein fraction into solid.

3. To encapsulate obtained mass.

51

Materials and methods:

1. Protein fractions isolated from Chelidonium majus L. herb were obtained from

V.F.Kuprevich Institute of Experimental Botany of Belarus Academy of Sciences.

2. Antioxidant activity of protein fraction was evaluated by using ABTS (2,2'-azino-bis-3-

ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) method (R. Re et al, 1999) . Absorbance of ABTS

free radical cation (50 µL), mixed with different quantities of protein fraction, was

measured in Phosphate Buffered Saline (PBS) medium at 734 nm wavelength. Blank - a

solution of 50 µL ABTS and 950 µL PBS.

3. Evaluated liquid form of protein fractions was mixed with absorbents - silicified

microcrystalline cellulose Prosolv® and colloidal silicon dioxide Aerosil®. This mixture

was left to dry for a night at room temperature.

4. The obtained mass of proteins after sifting through 2mm sieve was encapsulated with

capsulation machine in „0“size hard gelatin capsules.

5. Results were analyzed with MS Excel. Results are statistically significant (p<0.05).

Results: The strongest antioxidant activity (71.29%) detected when volume of proteins solution in

1mL of sample solution with ABTS and PBS is 7µL and amount of proteins in it is 0.056µg.

Every produced capsule weights 0.34g±0.0024g and has 0.061g±0.001g of dry powder of proteins and

0.279g±0.002g of excipients: 0.064g±0.002g of Aerosil® and 0.214g±0.001g of Prosolv®.

Conclusions: Antioxidant activity increases with increasing protein concentration in the solution.

Capsules with protein fractions were produced by using absorbents Prosolv® and Aerosil®, which

allowed avoiding high temperature appliance to eliminate water. Further studies about antioxidant

activity of protein solution from capsules of Chelidonium majus L. herb are required.