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Ospedale S. Camillo
Roma, 26 Marzo 2015
Antonella Matteocci
UOC SIMT - Laboratorio di Immunoematologia Eritro-Piastrinica
Lo Stato dell’Arte della Diagnostica Immunoematologica: Criticità, Innovazione e Sicurezza
Competenza, Professionalità e Sicurezza:
PROGRAMMI EDUCAZIONALI IN IMMUNOEMATOLOGIA
Argomenti
• Introduzione
• Storia naturale degli anticorpi e implicazioni cliniche
• Tecnologie
• Automazione
• Test di Coombs Diretto
• Biologia Molecolare
• Antigene RhD e MEN (D-Variant, cffDNA, EFM)
• Titolazione ABO
• Conclusioni
Diagnostica Immunoematologica
Roma, 26.03.2015
LABORATORIO DI IMMUNOEMATOLOGIA
I e II LIVELLO
Qualificazione Emocomponenti
Indagini finalizzate alla prevenzione e
gestione della MEFN
Immunoematologia molecolare
Diagnostica immuno-piastrinica
Immunoematologia sierologicadi II livello
Globuli Rossi
Piastrine
Diagnostica Immunoematologica
Pre-trasfusionalePazienti
Monitoraggio ABO trapianti
Diagnostica AEA
Registro e Banca Gruppi Rari
Evoluzione delle Tecnologie in Immunoematologia
Nuove Tecnologie
Sierologiche e
Automazione
Biologia molecolare sistemi G-E/HPA
Genotipizzazione RHD fetale da plasma materno
1900-1945
1990-2000
2005- 2010
1980-1990
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Diagnostica Immunoematologica
Roma, 26.03.2015
Sistemi Gruppo-Ematici
339 antigeni
296 antigeni appartenenti a 34 Sistemi (ISBT)
19 antigeni appartenenti a Collezioni (ISBT)
24 antigeni appartenenti a Serie (ISBT)
46 geni
1.653 alleli
Blood Group Antigen Gene Mutation Database (dbRBC) aggiornato al 23 Marzo 2015
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STORIA NATURALE DEGLI ANTICORPI E IMPLICAZIONI CLINICHE
Diagnostica Immunoematologica
Roma, 26.03.2015
SIGNIFICATIVITA’ CLINICA
Clinicamente significativi Raramente significativiA volte significativi
Generalmente
Clinicamente
Significativi
A volte
Clinicamente
Significativi
Clinicamente
non Significativi se non reagiscono a
37°C
Generalmente
clinicamente
non significativi
A e B Ata A1 HLA/Bg
Rh Colton H Ch/Rg
Kell Cromer Lea Cost
Kidd Dombrock Lutheran JMH
Duffy Gerbich M, N Knops
S, s, U Indian P1 Leb
P, PP1Pk Jra Sda Xga
Vel Lan
H in Oh LW
Diego Scianna
Yta
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%
D
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c
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l
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A
n
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I
b
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d
i
e
sMonths after first detection
RBC ANTIBODY PERSISTENCE
Schonewille H, Transfusion 2000
Anti-D
Anti-C
Anti-c
Anti-E
Sistema Rh
Months after first detection
RBC ANTIBODY PERSISTENCE
Schonewille H, Transfusion 2000%
D
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I
b
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s
Altri sistemi
Anti-Jk
Anti-Fy
Anti-K
Anti-S
FATALITIES REPORTED TO FDA FOLLOWING BLOOD
COLLECTION AND TRANSFUSION
Annual Summary for Fiscal Year 2013
/www.fda.gov/biologicsbloodvaccines/safetyavailability/reportaproblem/transfusiondonationfatalities/default.htm.
DHTR , 1:6,000
DHTR fatali, 1:400,000
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Serious Hazards of Transfusion (SHOT)
Bolton-Maggs P, Cohen H, Watt A et al: Annual SHOT report 2013
www.shotuk.org
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SISTRA – SISTEMA INFORMATIVO DEI SERVIZI TRASFUSIONALI
Centro Nazionale Sangue
Regione Lazio
Anni 2012-2013
Reazioni Trasfusionali
2012N.
2013N.
TotaleN.
Totale%
Emolisi immunologica
1 3 *4 1.31
Emolisi non immunologica
0 3 3 0.98
Infezioni trasmesse
0 0 0 0
Altre reazioni trasfusionali
124 174 298 97.7
Trasfusione noncorretta senza
esiti clinici
0 0 0 0
Totale 125 180 305 100
*N.1 sintomatologia lieve; N.3 Necessità di intervento terapeutico
D
K
c
IMMUNOGENICITA’ SISTEMI GRUPPO-EMATICI
E
k
s
Fya
e
70%
0,01%
C
Jka
S
Jkb
“GIBLETT EQUATION”, 1961
CA Tormey, Blood 2009
H Schonewille, Transfusion 2006
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TECNOLOGIE IN
IMMUNOEMATOLOGIA
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Diagnostica Immunoematologica
Roma, 26.03.2015
Requisiti di un Sistema Diagnostico
Immunohematology, 2013
Sensibilità
Specificità
VPP
VPN
Efficienza
Riproducibilità
Facilità d’uso
Turnaroundtime
Costi
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Sensibilità
Specificità
INNOVAZIONE E METODI DIAGNOSTICI
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Diagnostica Immunoematologica
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SPRCA
CAT
Provetta
Provetta
CAT
SPRCA
The authors tested 368 samples containing antibodies of clinically significant specificities
Sensibilità nello screening anticorpale
Diagnostica Immunoematologica
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MethodTube LISS
IAGTDiaMed-ID
Ortho
BioVue
Bio-Rad
Scangel
CLB Mast
Cell-Bind
Biotest
Solid
Screen
Immucor
Capture-
R
Sensitivity 43.2% 93.5% 90.5% 94.6% 94.0% 89.7% 97.3%
Diagnostica Immunoematologica
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DG GelGrifols
Diamed –ID Ortho BioVue
Volume emazietest
50µl 50µl 50µl
Volume siero campione
25µl 25µl 40µl
Tempoincubazione 37°C
15 min 15 min 10 min
Tempo centrifugazione
9 min 10 min 5 min
AUTOMAZIONE IN
IMMUNOEMATOLOGIA
Diagnostica Immunoematologica
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Diagnostica Immunoematologica
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AUTOMAZIONE E SICUREZZA
Standardizzazione
Metodiche, Lettura e
Interpretazione
Tracciabilità
Risultati, User,
Lotti Reagenti
Identificazione Campioni e
Reagenti
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Piattaforme Analitiche in Immunoematologia
Astra Formedic
A. De Mori
BioradDiamed
Grifols Immucor OrthoClinical
Diagnostics
Tecnologia MicropiastraEMT
CATMicropiastraFase solida
CATMicroarray
MicropiastraSPRCA
Microarray
CAT
Analizzatori MediaElevata
Produttività
LIFE 2Qwalys 3
Tango InfinityIH1000
WADianaErytra
EchoNEO
AutovueInnova
Caricamento N.campioni
80160/544
120/180 48/96 20/224 42
Nuovi strumenti
IH500 Vision
Biologia Molecolare
RHD Fetal kit Progenika Bioarray
Diagnostica piastrinica
NEOLifecodes
Tecnologie e Apparecchiature nella Regione Lazio al 31.12.14
Diagnostica Immunoematologica
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Galileo/Neo Immucor
60%
Innova Ortho
55%
IH1000
Diamed
32%
Erytra
Grifols
18%
Tango Biorad5%
Qwalys Astra Formedic 5%
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Integrazione Tecnologie
Diagnostica Immunoematologica
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Micropiastra
Fase solida
Donatori
Test 1°livello
Pazienti/Donatori
Test 2° livello
Agglutinazione su colonna
Pazienti
Test 1°livello
Assegnazione Urgenze
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TEST DI
COOMBS
DIRETTO
LA BIOLOGIA MOLECOLARE IN IMMUNOEMATOLOGIA
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Diagnostica Immunoematologica
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RAZIONALE
Limiti sierologia
Studio geni-alleli varianti
ABO/RhD
Bio-nano-tecnologie
(microarray)
Piattaforme ad elevata
produttivitàDia
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Diagnostica Immunoematologica
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Limiti delle Tecniche Sierologiche
Presenza di campi misti nei
politrasfusi o trapiantati
Difficoltà nella tipizzazione in
pazienti con TAD +
Utilizzo di alcuni sieri rari e costosi,
scarsa reattività
Difficoltà nella definizione di
varianti ABO e/o RhD (discrepanze)
Mancata definizione della D-zigosità
Performance limitata per la tipizzazione
estesa su larga scala
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• PCR-SSP
• PCR-RFLP
Bassa Produttività
• PCR RealTime
• PCR SBT
Media Produttività
• Microarray
• MALDI-TOF MS
• SNaPshot
Elevata Produttività
M
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D
I
M
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E
C
O
L
A
R
I
Limiti della Biologia Molecolare
IL GENOTIPO NON E’ IL FENOTIPO
Gene non ancora
scoperto
Mancanza alleli per
gruppi etnici
Meccanismo molecolare complesso
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a SNP in regioni
codificanti
SNP in regioni non codificanti
Tecniche Sierologiche
“reference”
Tecniche Molecolari “support”
REPORT FINALE
LA GESTIONE DEI TEST MOLECOLARI RICHIEDE UNA
“EXPERTISE” SPECIFICA
INTEGRAZIONE APPROPRIATA DELLE TECNOLOGIE
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ESECUZIONE PROFICIENCY TEST
Antigene RhD e MEN
Diagnostica Immunoematologica
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LA TIPIZZAZIONE RhD NELLA PREVENZIONE DELLA MENRaccomandazioni MEN – SIMTI 2014
• MADRE
• NEONATO
• PADRE
• FETO
DEFINIZIONE VARIANTI RHD
DETERMINAZIONE DELLA D-ZIGOSITÀ PATERNA
GENOTIPIZZAZIONE RHD FETALE DA PLASMA MATERNO
(NIPD non invasive prenatal diagnosis)
Diagnostica Immunoematologica
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Varianti dell’antigene RhD
Genetica molecolare
Espressione membrana
Antisieri Tecnologie
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D-variant a confronto:
“la realtà non è sempre come appare”.
VARIANTI N. SITIANTIG/ EMAZIA
TuttiEpitopi
Presenti
ProduzioneAc anti-D
Paziente Donatore PosizioneMembrana
RoutineTyping
Partial -D 200-10.000
NO SI RhD NEG RhD POS Esterna NEG/POS
Weak -D 60-5.200 SI/NO NO/SI RhD NEG/RhD POS
RhD POS Interna POS/NEG
DEL 20-36 SI SI/NO RhDNEG/??
RhD POS Interna NEG
Reid ME, Lomas-Francis C. The blood group antigen facts book, 3nd ed. San Diego, USA, Elsevier Academic Press; 2012.
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D-variant Esoni Associazione con
fenotipo Rh
N. Siti Antigenici/
Emazia
D-weak tipo 2 9 cE 500
DVI tipo1 4,5 cE 300-1.000
DVI tipo2 4,5,6 Ce 1.600-2.900
DVII 2 Ce 3.600-8.400
Diagnostica Immunoematologica
Roma, 26.03.2015ISBT 2011
Test D-weak e DEL
Perché determinare il genotipo RHD fetale?
Diagnostica prenatale non invasiva (NIPD) da plasma materno
Raccomandazioni MEN – SIMTI 2014
Individuare coppia madre D-neg/feto D-pos(in Italia circa 85.000 RhD neg)
Corretta gestione delle immunoglobuline anti-D in fase antenatale (28^ settimana)
Gestione delle donne D-neg con anticorpo anti-D e partner eterozigote
(valutazione D-zigosità)
Tra
nsf
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20
07
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G, 2
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20
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11-17 settimane: 3% DNA fetale (range: 0,4%-12%)37-43 settimane: 6% DNA fetale (range: 2,3%-11,4%)
Genotipizzazione RHD Fetale in Europa
Finning
K, et al
Scheffer
PG, et al
Rouillac-Le
Sciellour
C, et al
Pavia
Roma
Tiblad
E, et al
Clausen
FB, et al
LIMITI DEL METODO: PCR REAL TIME
• Sensibilità 9̴9-100 % FALSI NEGATIVI (DNA fetale scarso) 0,05% (Transfusion 2013)
• Specificità 9̴8-99% FALSI POSITIVI (contaminazioni, varianti RhD materne, chimerismo - cellule fetali di pregresse gravidanze) 1-2% (Vox Sanguinis, 2012)
• Mancanza di un Marcatore Fetale (marker epigenetico)
Promoter del gene Maspin (SERPINB5) (Chim, 2005)_ Ipometilazione del DNA fetale (placenta)_ Ipermetilazione del DNA materno
Promoter del gene RASSF1A (Chan, 2006) : – Ipermetilazione del DNA fetale (placenta)– Ipometilazione del DNA materno
MASTER MEDICINA
TRASFUSIONALE Firenze, 13.01.2015
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Diagnostica Immunoematologica
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Valutazione EFM
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Post-partum: 75% 1.500 UI
70% EFM dopo il parto, 30% per eventi dopo 20^ settimana
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QUALE METODO UTILIZZARE?
TITOLAZIONE ABO
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Significato clinico degli anticorpi ABO
MALATTIA EMOLITICA NEONATO
TRASFUSIONE PLASMA/PIASTRINE
TRAPIANTO ORGANI SOLIDI (RENE)
TRAPIANTO CSE
TRASFUSIONE GLOBULI ROSSI
Incompatibilità Maggiore
Incompatibilità Minore
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Antigeni A e B sono
oligosaccaridi presenti
anche su cellule
endoteliali ed epiteliali di
rene, cuore, fegato,
polmone e pancreas.
Trapianto di Rene ABOi: titolo
Titolo anti-A1 e anti-B:≤8 (titolo “sicuro”), ≤32
Incompatibilità per antigene A2: a rischio minore
Titolo anti-A1 e anti-B:≥128 (bassa sopravvivenza)
Shimmura et al,
2007
Tobian et al, 2010
Jordan et al,
2009
Crew et al, 2010
Alto rischio immunologico: elevato titolo iniziale, 2°trapianto, rebound
post-plasmaferesi
Montgomery et al,
2009
Stegall et al,
2004
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a 10% trapianti da
vivente
Migliore
sopravvivenza a
lungo termine
25-30%
incompatibilità
ABO/HLA
Programmi di
desensibiliz-
zazione
Accomodation
Quando eseguire il titolo nel trapianto di rene ABOi?
TITOLAZIONE POST-TRAPIANTO (AMBULATORIALE)
2 /gg settimana – 15gg 1 g/settimana – 1 g/mese
TITOLAZIONE POST-TRAPIANTO (OSPEDALIZZATO)
Ogni giorno 3 gg/settimana – 15gg
TITOLAZIONE PRE-TRAPIANTO
- 1 mese Plasmaferesi
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TRAPIANTO DI CSE:INCOMPATIBILITA’ ABO
Incompatibilità ABO
40-50%
Maggiore
20-25%
Minore
20-25%
Bidirezionale
5%
Daniel Johnson and Schwarz, 2011
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Major AB0 incompatibility: potential adverseconsequences and recommended interventions
Recipientisoagglutinins
incompatible (anti-A, anti-B, anti-AB) with
donor RBCs
-Group A,B and AB donor and group O
recipient
- Group AB donorand group A or B
recipient
- Immediate hemolysis
- Delayed RBC engraftment
- PRCA
- RBC reduction if >30 ml RBC and/or if
-Recipient isoagglutinin titers >32
- Transfuse ABO appropriate bloodproducts
Isoagglutininsremoval before
transplantation withPEX or
immunoadsorption Daniel Johnson and Schwarz, 2011
DefinitionABO Blood
Type
Potential
Adverse
Consequences
Interventions
LE “VARIABILI” NELLA TITOLAZIONE
TECNOLOGIA
EMAZIE NOTE (pool, singole, tipizzazione A1/A2)
Diluente, % GR, rapporto plasma/GR, t incubazione
PIPETTE PUNTALI
APPARECCHIATUREOPERATORE
END-POINT
(weak+, 1+)
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VARIABILITA’ TRA LABORATORI
30 LABORATORI
GIAPPONESI:
COMPARAZIONE 4
TECNOLOGIE -
CITOFLORIMETRIA
3 LABORATORI
EUROPEI: 3 DIFFERENZE
CON METODO IN HOUSE,
1 CON METODO IN
GELRIPRODUCIBILITA’
2003: 29 LABORATORI
GIAPPONESI
2004: 38 LABORATORI
GIAPPONESI
VARIABILITA’ E “METODO STANDARD”
35 LABORATORI AMERICANI
END POINT PROVETTA: weak+
END-POINT GEL-CARD:1+
GEL-CARD RIDUCEVA
LA VARIABILITA’ SE
COMPARATA ALLA
PROVETTA
Conclusioni - 1
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Screening e Identificazione
anticorpale
TCD
Definizione status RhD
Valutazione EFM
Diagnostica Molecolare
Titolazione ABO
Trapianti
VANTAGGI E LIMITI DELLE TECNOLOGIE IN USO
Punti di Forza delle Tecnologie
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Sensibilità
Ac a basso titolo - DEL
Tempi brevi di esecuzione test
Specificità
Specificità
Utilizzo 8 colonne
CONCLUSIONI - 2
Sicurezza Trasfusionale
Sistemi e Metodi
Diagnostici
Competenze del
Personale
Programmi EQA
