Determinación cuantitativa de proteína en muestra problema por

medio de métodos espectrofotométricos

Bioquímica ExperimentalGrupo 5Equipo 5

Ávila Jaimes Verónica

Becerril Román María del Mar J.

Toro Jaimes Jorge Oswaldo.

Corona Ortega Luis Ángel

Román

Resumen

Se llevó a cabo la cuantificación de la proteína contenida en una muestra problema por medio de la elaboración de una curva estándar a partir de albúmina sérica bovina (BSA). Se empleó el método de Lowry que consiste en la formación de un color azul dado por iones metálicos en

solución reducidos por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la proteína estudiada. Se midió la absorbancia de las disoluciones en un espectrofotómetro a

750 nm

Introducción

La colorimetría es cualquier análisis que permita el cálculo de una concentración a partir de la medición de la absorbancia de un cromóforo coloreado, es decir, que absorba en la región del visible y reúna unas características tales que se pueda aplicar la ley de Lambert-Beer.

Una de las colorimetrías más utilizadas en Bioquímica es aquella conocida como método de Lowry. Se basa en que los grupos fenólicos de las tirosinas presentes en las proteínas

reducen al reactivo de Folin-Ciocalteau (una mezcla de sales de tungstato y molibdato que, en su forma oxidada, es de color amarillo). Además, se añade cobre para que: a) desdoble a

la proteína al formar enlaces de coordinación y b) acelere la reacción entre los grupos fenólicos (que son oxidados a quinonas) y el reactivo de Folin-Ciocalteau (que al reducirse

es de color azul pálido).

Variables

Variables controladas: cantidades de reactivo A y B, longitud de onda empleada (750 nm).

Variable independiente: cantidad de BSA.

Variable dependiente: absorbancia a 750 nm.

Hipótesis

Si el producto derivado de la reacción de la BSA con el reactivo de Folin-Ciocalteau cumple con la ley de Lambet-Beer, entonces el valor de la absorbancia será directamente proporcional a la cantidad de BSA en la

muestra.

Objetivos

Realizar una curva patrón de Albúmina Sérica Bovina (BSA), utilizando el espectrofotómetro.

Determinar la concentración de proteínas en una muestra problema, utilizando los datos de la curva patrón.

Materiales y reactivosMaterial: Celdas de metacrilato grado UV para espectrofotómetro Tubos de microfuga 1 gradilla para tubos de microfuga 1 caja con puntas de 200 µL (amarillas) para micropipeta. 1 caja con puntas de 1000 µL (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta 10 µL 1 Micropipeta 20-200 µL 1 Micropipeta 200-1000 µL Vórtex Espectrofotómetro (por grupo)

Materiales y reactivosReactivos:

Albúmina de suero bovino (BSA) a una concentración de 1 mg/mL. Solución problema de proteínas (los profesores la proporcionarán)

Solución de carbonato-tartrato-cobre (CTC; 10% Na2CO3, 0.1 % CuSO4

y 0.2 % de tartrato de Na+ y K+) 10% Dodecilsulfato de sodio (SDS)

0.8 N NaOH

Reactivo A. Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes iguales de CTC, 10% SDS,

0.8 N NaOH y H2Odestilada.

Reactivo B. Dilución del reactivo de Folin- Ciocalteu. 1 volumen de reactivo + 5 volúmenes de H2O.

Guardar en frasco ámbar. Preparar preferentemente poco antes de usarse.

Procedimiento

Tabla 1. Reactivos y cantidades para realizar la determinación de proteínas utilizando el método de Lowry.

Resultados

Tubo H₂O (µL) BSA (1mg/mL)Reactivo A

(µL) Reactivo B (µL) A 750nm

1 450 0 500 250 02 445 5 500 250 0.1193 440 10 500 250 0.134 435 15 500 250 0.1495 430 20 500 250 0.2126 425 25 500 250 0.3227 420 30 500 250 0.3488 415 35 500 250 0.456 Cantidad de proteína (µg)9 425 25 500 250 0.203 16.25

10 400 50 500 250 0.277 22.4

Tabla 1.1 Reactivos y cantidades añadidos para realizar la curva patrón de BSA y la determinación de la concentración de proteínas de una muestra problema, utilizando el método de Lowry.

Resultados

0 5 10 15 20 25 30 35 400

2

4

6

8

10

12

f(x) = NaN x + NaNR² = 0 Curva Estándar de BSA

Cantidad de Proteína (µg)

Abs

orba

ncia

Gráfica 1.1 Valores de absorbancia de las muestras de BSA en función de la cantidad de proteína para la construcción de una curva estándar.

ResultadosAlgoritmo de cálculo

Discusión

Conclusión

Escribe un breve resumen de los descubrimientos en función de los resultados de los experimentos. Es necesario indicar si los datos

refuerzan la hipótesis y explicar las razones para que lo hagan o no.

Obras citadas

Badui, S. D.: “Química de los alimentos” 3ªed. Alambra Mexicana, México D.F: 2004.188-189

García-Segura, Juan Manuel et al. :“Técnicas instrumentales de análisis en Bioquímica” 3ªreimp. Síntesis, S.A. Madrid, España: 2007.

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