El Operón Lactosa

EL OPERÓN LACTOSA

Ruiz Agelvis, Claudia Jeannette

Universidad Nacional Experimental del TáchiraVicerrectorado AcadémicoDecanato de Investigación

Coordinación de Ciencias Exactas y Naturales

Introducción

Regulación de la expresión génica

Regulación de la síntesis de un transcrito y su producto proteico

Regulación génica se lleva a cabo en varios niveles, de los que se pueden nombrar:

1. Síntesis del transcrito primario de ARN2. Procesamiento post-transcripcional del ARNm3. Degradación del ARNm4. Traducción5. Modificación de proteínas6. Degradación de proteínas.

Proteínas • Arquitectura de la célula• Actividades enzimáticas• Interacciones con el ambiente • Otras propiedades fisiológicas

Determinan

Expresión constitutiva

Siempre se transcriben

Expresión regulable

Se transcriben según la situación

Introducción

Genes estructurales

Codifican para un producto proteico o ARN

Genes reguladores

Codifican para una proteína o ARN involucrada en la regulación de la expresión de otros genes

Proteínas estructurales

Enzimas Proteínas reguladoras

Mecanismo básico para la regulación

Señales moleculares

Unión de proteínas reguladoras

Modulación de tasa de transcripción

La molécula reguladora debe tener un sensor que interactúe con factores apropiados en el ambiente celular para que su rol regulador pueda responder a las necesidades de la célula en todo momento

Introducción

Interior Exterior Sitios específicos del ADN adyacentes a región codificante

de la proteína

Sitio de inicio de la transcripción → promotor

Introducción

Modelo regulatorio. Gen regulador codifica para una proteína que actúa como sitio diana en el ADN. Fuente: Lewin (1999)

Interacción puede regular un gen diana de forma positiva (la interacción activa el gen) o de forma negativa (la interacción desactiva el gen)

Regulación génica en los procariotas

Bacterias necesitan regular la síntesis de sus proteínas

Fuentes de Carbono:

• Lactosa • Glucosa• Maltosa• Ramnosa• Galactosa• Xilosa

La célula no sintetiza simultáneamente todas las enzimas, es necesario que su síntesis esté estrictamente regulada

Regulación génica en los procariotas

• Debe ser capaz de conectar y desconectar la transcripción de cada gen o grupo de genes específicos.

Para lograr regulación, la célula debe cumplir con dos requisitos:

• Debe ser capaz de reconocer las condiciones ambientales según las cuales los correspondientes genes deben ser activados o desactivados.

Componentes básicos de la regulación transcripcional en procariotas.

La regulación de la transcripción requiere de dos tipos de interacciones ADN-proteína

Una de estas interacciones determina donde comienza la transcripción.

Promotor + ARN polimerasa

El otro tipo de interacción decide si la transcripción se lleva a cabo

Proteínas reguladoras activadoras o represoras

+ operador

Inicio de la transcripciónTodo gen debe tener un promotor o

no podrá ser transcritoRegulación positiva o negativa

Regulación positiva

Activador se une a su ADN diana para que la transcripción

comience

Regulación negativa

Evita que represor se una al sitio diana para comenzar la

transcripción

Componentes básicos de la regulación transcripcional en procariotas.

Fuente: Griffith et al. (2004)

El Operón Lactosa

Fuente: www.nobelprize.org

François Jacob

Jacques Monod

André Lwoff

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/themes/medicine/jacob/

El Operón Lactosa

Regulación del operón lac. El gen I produce continuamente represor. El represor se une a la región operadora (O), bloqueando la ARN polimerasa unida al promotor (P), que no puede transcribir los genes estructurales adyacentes. Cuando hay lactosa, ésta se une al represor y cambia su forma, de modo que ya no puede unirse a O. La ARN polimerasa puede entonces transcribir los genes estructurales Z, Y y A y se producen las tres enzimas. Fuente: Griffith et al. (2002)

El Operón LactosaRepresor lac

Dos sitios de reconocimiento

Secuencia operadora específica del operón lac

Lactosa y ciertos análogos. Sitio alostérico

Represor pierde afinidad por

operador

Represor + lactosa

INDUCCIÓN

Lactosa y derivados = inductores

Descubrimiento del sistema lac: control negativo

Metabolismo de la lactosa. La enzima ᵦ-galactosidasa cataliza una reacción en la que se añade agua al enlace ᵦ-galactósido para romper la lactosa en galactosa y glucosa. La enzima permeasa de la lactosa es necesaria para el transporte de la lactosa al interior de la célula. Fuente: Griffith et al. 2002


Mecanismo de inducción

Presencia de galactósidos (inductores)

Producción de grandes cantidades de ᵦ-

galactosidasa

Experimento de Jacob y Monod

Aminoácidos marcados

radiactivamente

Células en crecimiento

Antes o después de añadir inductor

Añadidos aAl añadir inductor:

síntesis de enzima (3 min)Al quitar inductor: se detiene síntesis

Conclusión: célula posee un mecanismo para conectar y desconectar la expresión de genes en respuesta a señales ambientales


Adición de inductor resulta en inducción rápida de ARNm de lac, y es seguida luego de un período lag por la síntesis de las enzimas; al remover el inductor cesa rápidamente la síntesis. Fuente Lewin (1999)

Balance entre síntesis y degradación de ARNm

Síntesis de enzima cesa

Genes que se controlan juntos

Estructura del IPTG, un inductor del operón lac. La ᵦ-galactosidasa no rompe el enlace ᵦ-D-tiogalactósido. Ello permite manipular la concentración intracelular de este inductor. Fuente: Griffith et al. 2002.

Jacob y Monod – Análisis de mutantes

ᵦ-galactosidasa (Y)Permeasa (Z)

Transacetilasa (A)

Cada enzima determinada por un gen diferente

Genes controlados coordinadamente –

ligados en cromosoma

Una sola molécula de ARNm

Organización en clúster de genes estructurales Z, Y y A.

Fuente: Lewin (1999)

El gen I tiene su propio promotor y

terminador

Genes que se controlan juntos

Organización de genes de procariotas ≠ organización de genes de eucariotas

El gen I

Mutante Sintetiza las 3 enzimas ᵦ-galactosidasa PermeasaTransacetilasa

Mutantes constitutivos

Locus I Controla inducibilidad de enzimas lac

I+ (silvestre)Sintetizan niveles máximos de enzimas lac sólo en presencia del inductor

I- (mutante) Sintetizan niveles máximos de las enzimas lac tanto en presencia como en ausencia del inductor.

El represor

El represor mantiene el operón lac inactivo al unirse al operador. La forma del represor se compone de una serie de dominios conectados. Fuente: Lewin (1999)

Sin inductor

Adición del inductor convierte al represor en una forma inactiva que no puede unirse al operador. Esto permite que la ARN polimerasa inicie la transcripción. Fuente: Lewin (1999)

El represor

Con inductor. Para el sistema lac, el inductor puede ser lactosa o algún derivado de esta

I+ es dominante en trans sobre los alelos I -

El represor

Efecto de varias combinaciones de mutaciones en los estados inducido y no inducido, sobre la producción de ᵦ-galactosidasa y permeasa


El represor

La naturaleza recesiva de las mutaciones I- demuestra que el represor actúa en trans. Aunque el gen I- no sintetiza represor activo, el gen silvestre I+ proporciona un represor funcional que se une a los dos operadores de una célula diploide y bloquea la expresión del operón lac (en ausencia del inductor)


IS elimina la respuesta al inductor – Mutación de represor en sitio alostérico

El represor


IS células diploides = Lac-

Represor siempre se une a operador

El operador y el operón

OC es un operador constitutivo, se expresa en estado no inducido e inducido


Operador tiene dominancia en cis Interacción física de un elemento con genes adyacentes a él

El operador y el operón

Modelo simplificado del operón lac. Los 3 genes, Z, Y y A se expresan coordinadamente. El producto del gen I, el represor, bloquea la expresión de los genes Z, Y y A mediante la interacción con el operador O. El inductor inactiva al represor impidiendo así su interacción con el operador. Cuando esto ocurre, el operón se expresa al máximo nivel. Fuente: Griffith et al. (2004)

El promotor lac

Algunas secuencias específicas del ADN son importantes para que la ARN polimerasa transcriba eficazmente los genes de E. coli. Las secuencias encuadradas, situadas aproximadamente 35 y 10 nucleótidos antes del sitio de inicio de la transcripción, están muy conservadas en todos los promotores de E. coli. Mutaciones en esas regiones provocan efectos leves (color dorado) o graves (marrón) sobre la transcripción. Fuente: Griffith et al. 2004.

Caracterización del represor lac y del operador lac

Fuente: Lewin (1999).

Estudios realizados por Walter Gilbert y Benno Müller-Hill

Represor está formado por cuatro subunidades idénticas, con 4 sitios de unión a IPTG

In vitro, el represor se une al operador y se despega en presencia de IPTG

Caracterización del represor lac y del operador lac

Secuencia de bases en el operador lac al que se une el represor

Secuencia de bases en el sitio de unión CAP al cual se une el complejo CAP-AMPc

Secuencias en color son palíndromos. El punto es el centro de la simetría

Fuente: Griffith et al. 2004.

Existe una alta especificidad en el reconocimiento represor-operador

Represión catabólica del operón lac: control positivo

Control catabólico del operón lac. La inducción del operón por la lactosa es máxima cuando el AMPc y CAP (Proteína activadora de los genes catabólicos) forman un complejo. Fuente: Griffith et al. (2004)

Niveles altos de glucosa → no hay AMPc

Niveles bajos de glucosa → hay AMPc

Represión por catabolito

Operón lac permanece inactivo en mutantes que no convierten ATP en AMPc y en mutantes que no tienen CAP


En ausencia de lactosa, que sirve como inductor, el represor Lac se une al operador. Independientemente de los niveles de AMPc y de la presencia de CAP, la producción de ARNm está bloqueada Fuente: Griffith et al. (2002)


Cuando está presente la lactosa, ésta se une al represor, que ya no puede unirse al operador; sin embargo, sólo se producen pequeñas cantidades de ARN, porque la presencia de glucosa mantiene bajos los niveles de AMPc, y por lo tanto, no se forma ni se une al promotor el complejo CAP-AMPc. Fuente: Griffith et al. (2002).


Cuando el represor está inactivado por la lactosa y hay altos niveles de AMPc por la ausencia de glucosa, el AMPc se une a CAP. El complejo AMPc-CAP se une entonces al promotor, el operón lac se activa y produce grandes cantidades de ARNm. Fuente: Griffith et al. (2002)


Unión de CAP al promotor genera curvatura mayor a 90° en al ADN, aumentando la afinidad de la ARN polimerasa al promotor

Control positivo y negativo

Control por el represor y el inductor Control negativo

Sistema CAP-AMPc Control positivo

Proteínas activadoras o represoras

Deben poder existir en dos estados: uno en el que pueda unirse a su diana en el ADN y otro en el que no pueda hacerlo.

Interacción de dos sitios diferentes: dominio de unión al ADN y el otro es un sitio alostérico


En el control negativo, un represor activo (R) bloquea la expresión de los genes del operón ABC uniéndose al sitio operador (O). Cuando el represor está inactivo, los genes se expresan. El represor puede ser inactivado por un inductor o por mutación. Fuente: Griffith et al. (2002)


En el control positivo, se requiere la presencia de un factor activo para que ocurra la expresión génica. Pequeñas moléculas pueden convertir un factor inactivo en activo, como es el caso del AMPc y la proteína CAP. El activador se une a la región controladora I. Fuente: Griffith et al. (2002)


Acción de los efectores alostéricos sobre las actividades de unión al ADN de los activadores y represores. Fuente: Griffith et al. (2004)

Resumen • Regulación génica actúa principalmente a nivel de transcripción.

• Expresión de los genes puede ser constitutiva o regulable.

• Modelo de regulación génica en procariotas: operón lac

• Elementos del operón lac: POZYA

• Represor lac está unido a operador impidiendo la transcripción.

• La presencia de un inductor inactiva al represor y permite la expresión de los genes lac

• En el operón lactosa la regulación puede ser negativa o positiva (represión por catabolito)

• La regulación positiva depende de la presencia/ausencia de glucosa y lactosa, lo cual está relacionado a los niveles de AMPc

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