1

KAUNO TECHNOLOGIJOS UNIVERSITETAS

TVIRTINU: ………………………

Kauno technologijos universiteto

Cheminės technologijos fakulteto

Dekanas

Eugenijus Valatka

2017 m. lapkričio mėn. …..d.

ŽEMĖS ŪKIO, MAISTO ŪKIO IR ŽUVININKYSTĖS

MOKSLINIO TYRIMO IR TAIKOMOSIOS VEIKLOS

PROJEKTO

Lietuvos juodmargių galvijų pieno technologinių savybių

išskirtinumo tyrimai

GALUTINĖ ATASKAITA

Projekto vadovas

Daiva Leskauskaitė

Kaunas 2017

2

VYKDYTOJŲ SĄRAŠAS

Daiva Leskauskaitė, KTU Maisto mokslo ir

technologijos katedros profesorė

Darbo vadovė. Darbo programos parengimas,

informacijos rinkimas, literatūros analizė ir

ataskaitos rengimas.

Milda Keršienė, KTU Maisto mokslo ir

technologijos katedros docentė

Tyrimai, rezultatų apdorojimas ir ataskaitos

rengimas.

Ina Jasutienė, KTU Maisto mokslo ir

technologijos katedros lektorė

Tyrimai, rezultatų apdorojimas

Andrius Jaskūnas, KTU Fizikinės ir

neorganinės katedros lektorius

Tyrimai, rezultatų apdorojimas

Aurimas Urbutis, KTU Fizikinės ir

neorganinės katedros lektorius

Tyrimai, rezultatų apdorojimas

Ingrida Kaniauskienė, KTU Maisto mokslo

ir technologijos katedros projekto vykdytoja

Tyrimai ir mėginių logistika

3

TURINYS

ĮVADAS 5

PAGRINDINĖ DALIS 8

1. Literatūros apžvalga 8

1. 1. Lietuvos juodmargių karvių savybės 8

1.2. Karvių pieno baltymų sudėtis 9

1. 3. Pieno koaguliacija 11

1.4. Pieno termostabilumo savybės 18

1.5. Pieno biologinė vertė 21

1.6. Apibendrinimas ir tyrimo uždavinių pagrindimas 24

2. Tyrimo objektai ir metodai 26

2. 1. Pieno mėginių surinkimas 26

2.2. Pieno mėginių paruošimas analizei ir tyrimo organizavimas 26

2.3. Tyrimo metodai

2.4. Statistinė analizė

2.5. Pieno mėginių paruošimas baltymų virškinamumo analizei ir tyrimo

organizavimas

2.6. Pieno baltymų virškinamumo tyrimas in vitro metodu

2.7. Pieno baltymų virškinamumo įvertinimui naudoti analizės metodai

2.8. Raugintų gėrimų eksperimentinės gamybos ir tyrimo organizavimas

2.9. Sūrių eksperimentinės gamybos ir tyrimo organizavimas

26

29

30

32

33

35

36

3. Rezultatai ir jų aptarimas 38

3.1. Juodmargių karvių pieno sudėtis priklausomai nuo holšteinizacijos laipsnio

3.2. Juodmargių karvių pieno sudėtis priklausomai nuo sezono

3.3. Juodmargių karvių pieno baltymų frakcijų kokybinė sudėtos priklausomai nuo

galvijų holšteinizacijos laipsnio

38

39

41

3.4 Juodmargių karvių pieno technologinės savybės priklausomai nuo

holšteinizacijos laipsnio

3.5. Koreliacijos tarp juodmargių karvių pieno sudėties ir technologinių savybių

3.6. Riebaluose tirpių vitaminų kiekis juodmargių karvių piene priklausomai nuo

holšteinizacijos laipsnio ir sezono

3.7. Pieno baltymų virškinamumo tyrimai

3.8. Raugintų pieno gėrimų iš juodmargių karvių pieno eksperimentinė gamyba ir

kokybės vertinimas

3.9. Sūrių iš juodmargių karvių pieno eksperimentinė gamyba ir išeigos vertinimas

46

51

52

54

67

70

IŠVADOS 72

PROJEKTO REZULTATŲ POPULIARINIMAS 74

Literatūros sąrašas 75

PRIEDAI 86

4

SANTRUMPOS

A.r. – aminorūgštys

KKF – kazeino kalcio fosfatas

UAT – ultra aukšta temperatūra

TKT – terminės koaguliacijos trukmė

ESCh – efektyvioji skysčių chromatografija

GDL – gliukono–delta–laktonas

Leu – leucinas

NK – nekoaguliuojantis pienas

RKT – rūgštinės koaguliacijos trukmė

SCh–ESI–MS/MS – skysčių chromatografijos – elektrostrauto jonizacijos – tandeminės masių

spektrometrijos metodas

SDS-PAGE – elektroforezės metodas

VTE – vandenyje tirpus ekstraktas

CN – kazeinas

αs1 - CN- αS1-kazeinas

αs2 - CN- αS2-kazeinas

β-CN - β-kazeinas

κ-CN - κ-kazeinas

β-LG – β-laktoglobulinas

α-LA - α-laktoalbuminas

FKT – fermentinės koaguliacijos trukmė

RKT – rūgštinės koaguliacijos trukmė

5

ĮVADAS

Pieno sektorius Lietuvoje išlieka prioritetine žemės ūkio šaka, jo produkcijos vertė bendrosios

žemės ūkio produkcijos struktūroje sudaro virš 20 proc. Pieno produktų eksportas sudaro apie 30

proc. viso žemės ūkio ir maisto produktų eksporto, kuriam sunaudojama apie 60 proc. parduoto

perdirbti pieno. Didėjantys reikalavimai šalies ir užsienio rinkose reikalauja nuolatinio pieno

produkcijos kokybės gerinimo, kuris neįmanomas be aukštos kokybės žalio pieno gamybos.

Žalio pieno kokybę galima užtikrinti nuosekliai plėtojant gyvulių selekciją bei į šalį įvežant

aukštos veislinės vertės gyvulius, tačiau pastarasis būdas yra brangus ir ne visada pateisina

lūkesčius. Kitas būdas, kuris populiarus Šiaurės Europos šalyse, yra naudoti savo šalyje

užaugintą veislinę medžiagą kuri yra nuolatos gerinama ir yra prisitaikiusi prie vietos klimatinių

sąlygų.

Lietuvoje atliekami pieninių galvijų eksterjero vertinimo tyrimai orientuojami į karvių

ilgaamžiškumą, pieningumą, pieno riebumą bei baltymingumą, didinamas atsparumas ligoms,

tobulinamas jų prisitaikymas prie pramoninės technologijos, mažinamos pašarų sąnaudos

produkcijos vienetui. ŽŪM užsakymu 2014 m. buvo atliktas mokslinis tiriamasis darbas

„Gerinančiųjų veislių įtakos Lietuvos juodmargių ir Lietuvos žalųjų kontroliuojamų karvių

produktyvumui, eksterjerui ir ilgaamžiškumui tyrimai“. Tiriamuoju laikotarpiu nuo 2013-05-10

iki 2014-11-10 įvertinta Lietuvos juodmargių galvijų populiaciją pagal gerinančiųjų veislių

„kraujo laipsnį“. Įvertintas Lietuvos juodmargių, holšteino, Olandijos juodmargių ir kt.

juodmargių veislių kontroliuojamų karvių vidutinis „kraujo laipsnis“. Nustatytas vidutinis visos

kontroliuojamos juodmargių populiacijos kraujo laipsnis pagal gerinančiąsias veisles. Tyrimai

parodė teigiamą Holšteino veislės įtaką juodmargių karvių produktyvumui ir neigiamą ūkinio

naudojimo trukmei, tačiau dėl didelės vidugrupinės variacijos, sąlygotos ūkinių sąlygų įvairove,

produktyvumo rodiklių mažėjimas nebuvo statistiškai reikšmingas. Optimaliu balu pagal kūno

bendro išsivystymo požymius įvertintų juodmargių karvių holšteinizacijos laipsnis svyravo nuo

60,8 iki 71,6 proc.; pagal galūnių požymius - nuo 61,1 proc. iki 67,4 proc; pagal tešmens

požymius - nuo 61,6 proc. iki 72,8 proc. (Ataskaita, 2014)

Tačiau iki šiol Lietuvoje nubuvo nuoseklių tyrimų, siekiant nustatyti žalio pieno technologines

savybes, įvertinti veiksnius, nuo kurių šios savybės priklauso ir tikslingai panaudoti žalią pieną

tam tikrų pieno produktų gamybai. Taip pat nėra skelbtų duomenų apie karvių pieno baltymų

kiekybinę ir kokybinę sudėtį.

Per pastaruosius du dešimtmečius pieno perdirbėjai didelį dėmesį skyrė žalio pieno baltymų

kiekiui, ir mažiau domėjosi pieno baltymų kiekybine sudėtimi, t.y. kokiomis proporcijomis

pasiskirstę pieno baltymai. Švedų mokslininkai palyginę karvių pieno sudėtį 1970 m. ir 1996 m.

nustatė, kad nors bendras baltymų kiekis piene išliko panašus, kazeino dalis pieno baltymuose

ženkliai sumažėjo (Lindmark-Månsson ir kt., 2003). Sumažėjusios kazeino dalies pieno

baltymuose pasekmė tai, kad tam pačiam sūrio kiekiui pagaminti reikalingas didesnis pieno

kiekis. Panašius duomenis paskelbė ir Prancūzijos mokslininkai (Coulon ir kt., 2001), kurie

pabrėžė pieno baltymų sudėties svarbą, siekiant aprūpinti pieno perdirbėjus pienu, tinkamu

įvairių pieno produktų gamybai.

Pieno baltymų sudėties klausimai nagrinėjami daugelyje pasaulio pienininkystės mokslo centrų,

tačiau praktinio šių tyrimų rezultatų diegimo pavyzdžių nėra daug. Vienas iš progresą šioje

srityje ribojančių veiksnių – paprastų metodų, kuriais būtų galima nustatyti kazeino kiekį piene,

nebuvimas. Be to, pieno baltymų genetinis variantas yra susijęs tiek su baltymų sudėtimis, tiek

su pieno technologinėmis savybėmis (Jakob ir Puhan, 1992; Martin ir kt., 2002).

Galima pagrįstai manyti, kad šiandien stebimas karvių pieno baltymų sudėties pasikeitimas yra

efektyvių selekcijos programų vykdymo priežastis. Publikuojami duomenys apie pieno genotipo

skirtumus tarp vietinių ir modernių galvijų veislių (Lien ir kt., 1999) patvirtina šį teiginį.

6

Tarptautinės Pienininkystės Federacijos duomenimis tiek Europoje, tiek pasaulyje didėja pieno

kiekis, iš kurio gaminamas sūris (International Dairy Federation, 2012). Europoje ir Šiaurės

Amerikoje tokio pieno kiekis per pastaruosius dešimt metų padidėjo 10% ir dabar sudaro apie 50

% viso pagaminamo pieno. ŽŪMPRIS duomenimis 2015 m. sūrių Lietuvos pieno perdirbėjai

pagamino 101,42 tūkst., iš kurių Lietuvos rinkoje pardavė 41,19 tūkst. t, į kitas ES šalis pardavė

42,72 tūkst. t sūrių, o į trečiųjų šalių rinkas pardavė 12,99 tūkst. t sūrių.

Sūrių gamybai reikalingas pienas, pasižymintis geromis koaguliacijos savybėmis ir gera

fermentinės sutraukos sinereze. Todėl pasauliniuose pienininkystės mokslo centruose atlikta

nemažai tyrimų, kurie parodė, kad informacija pieno koaguliacijos savybes svarbi tiek sūrių

gamybos išeigai, tiek kokybei. Pieno koaguliacijos savybių tyrimai atliekami ir laboratoriniame

(Alipanah ir Kalashnikova, 2007) ir pramoniniame lygmenyje (Summer ir kt., 2003; De Marchi

ir kt., 2008).

Kita populiarų pieno produktų grupė – rauginto pieno produktai, kurių per metus pasaulyje

pagaminama daugiau kaip 25 mln tonų (International Dairy Federation, 2012). Taigi, tai svarbi

pieno pramonės dalis. Lietuvos pieno perdirbėjai gamina įvairų raugintų pieno produktų

asortimentą –jogurtus, rūgpienį, kefyrą, raugintas pasukas bei varškę ir varškės produktus.

Gaminant raugintus pieno produktus, svarbiausias technologinis etapas – pieno fermentacija

pienarūgštėmis bakterijomis, kurios metu mažėja pH, todėl kazeino micelėse esantis netirpus

kalcio fosfatas ima tirpti, o neigiamai įkrautos kazeino dalelės praranda krūvį. Kazeino dalelių

agregacija prasideda, kai pH pasiekia kazeino izoelektrinį tašką (pH 4,6) (Lucey, 2009). Siekiant

gauti geresnėmis tekstūros savybėmis pasižyminčius rauginto pieno produktus, prieš rauginimą,

pienas apdorojamas aukštoje temperatūroje, tam kad įvyktų β-LG denatūracija ir jis galėtų

sudaryti kompleksus su kazeinu arba agreguotis tarpusavyje. Tai turi teigiamos įtakos rūgštinės

sutraukos klampai (Donato ir Guyomarc’, 2009). Rūgštinės sutraukos susidarymui gali turėti

įtakos keletas veiksnių, tarp kurių pieno sudėtis, perdirbimo sąlygos (Lucey, 2009) ir pieno

genetiniai veiksniai (Hallen ir kt., 2009).Tačiau nėra nustatytų aiškių priklausomybių tarp karvių

pieno genetinių savybių ir jo technologinių savybių, svarbių rūgštinės sutraukos susidarymui.

Šiame moksliniame tyrime iškeltas darbo tikslas – nustatyti Lietuvos juodmargių galvijų pieno

baltymų frakcijų kiekybinę sudėtį bei jos įtaką pieno technologinėms savybėms, siekiant

išaiškinti tokio pieno tikslingą panaudojimą aukščiausios kokybės pieno produktų gamybai.

Tyrimų objektu pasirinkome juodmargių karvių pieną. Lietuvos juodmargių veislė sukurta

vietinius galvijus iš pradžių kryžminant su įvairių veislių, vėliau – su Olandijos juodmargiais,

Ostfryzais bei Švedijos juodmargiais galvijais. Veislė patvirtinta 1951 m. Iš Lietuvos juodmargių

karvių kurių 2014-2015 m. buvo 106,05 tūkst., primelžta 7253 kg 4,31 proc. riebumo ir 3,33

proc. baltymingumo pieno. Šiandien Lietuvos juodmargių genofondui tobulinti ir produktyvumui

didinti naudojami Danijos juodmargių, Vokietijos juodmargių, Holšteinų ir Anglijos fryzų

galvijai.

Darbas atliktas dviem etapais. Pirmajame etape nustatyti Lietuvos juodmargių galvijų pieno

sudėties pagrindiniai komponentai, tame skaičiuje kazeino ir atskirų jo frakcijų kiekis, kalcio,

vitaminų A ir D kiekis. Taip pat atlikti Lietuvos juodmargių galvijų pieno technologinių savybių

tyrimai, ypatingą dėmesį skiriant fermentinių sūrių ir raugintų pieno produktų svarbios pieno

koaguliacijos savybėms bei pieno konservų gamybai svarbioms pieno termostabilumo savybėms.

Šis darbo etapas truko nuo 2016 m. balandžio mėn. iki 2017 m. balandžio mėn.

Surinkus pakankamai duomenų apie juodmargių karvių pieną ir juos apdorojus buvo apskaičiuoti

koreliacijos koeficientai tarp pieno technologinių savybių ir pieno baltymų frakcijų sudėties,

siekiant išsiaiškinti pieno išskirtinumą tam tikrų pieno produktų gamybai. Taip pat nustatyta

pieno sudėties ir technologinių savybių priklausomybė nuo karvių holšteinizacijos laipsnio ir nuo

sezono. Darbo pabaigoje, atlikus raugintų pieno produktų bei fermentinių sūrių eksperimentines

gamybas iš skirtingomis technologinėmis savybėmis pasižyminčio juodmargių karvių pieno,

buvo parengtos rekomendacijos pieno gamintojams bei perdirbėjams dėl pieno tikslinės atrankos

7

tam tikrų pieno produktų gamybai. Siekiant nustatyti iš juodmargių karvių pieno pagamintų

baltyminių produktų (raugintų produktų, fermentinių sūrių) biologinę vertę, ištirtas pieno

baltymų virškinamumas skrandyje bei plonosiose žarnose in vitro, kuris buvo vertintas tokiais

rodikliais: baltymų hidrolizės laipsniu, baltymų hidrolizės produktų kokybine sudėtimi bei

baltymų hidrolizės metu susidariusių peptidų kokybinė ir kiekybinė sudėtimi. Tokie juodmargių

karvių pieno tyrimai Lietuvoje atlikti pirmą kartą.

8

PAGRINDINĖ DALIS

1. Literatūros apžvalga

1.1 Lietuvos juodmargių karvių savybės

Valstybės įmonės Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centro ( ŽŪIKVC) duomenimis šiuo

metu Lietuvoje kontroliuojami galvijai 36 karvių veislių, iš jų 4 yra vietinių galvijų. Daugiausia

šalyje auginama juodmargių veislės galvijų. Šie sudaro apie 62 % visų laikomų pieninių galvijų,

32 % – Lietuvos žalieji.

Lietuvos juodmargiai galvijai buvo sukurti kryžminant vietinius galvijus pradžioje su įvairių

veislių, o vėliau su Olandijos juodmargiais, Ostfryzais bei Švedijos juodmargiais galvijais ir

vėliau veisiant mišrūnus tarpusavyje. Savarankiška veisle Lietuvos juodmargiai pripažinti 1951

m. (Jukna, 1998). Sukūrus vientisą veislininkystės sistemą, atsižvelgiant į galvijų ūkio plėtojimo

kryptis ir tendencijas, pradėta Lietuvos juodmargių selekcija ir pagal kitus ūkiškai bei

ekonomiškai svarbius požymius: tinkamumą mechanizuotai melžti, pieno baltymingumą,

penėjimosi, mėsines ir kitas savybes. Lietuvos juodmargiai buvo masiškai gerinami Olandijos

juodmargiais. Visos šios priemonės padėjo susiformuoti šiuolaikinėms produktyvumo bei

veislinėms Lietuvos juodmargių savybėms (Jukna, 1998).

Pastaraisiais dešimtmečiais Lietuvos juodmargių genofondui tobulinti ir produktyvumui didinti

naudojami Danijos juodmargių, Vokietijos juodmargių, Holšteinų ir Anglijos fryzų galvijai.

Lietuvos veisiamų juodmargių galvijų genealogijos duomenimis, Lietuvos juodmargiams gerinti

intensyviai naudojant holšteino bei holšteinizuotų juodmargių veislių bulius, pradėjo sparčiai

didėti jų palikuonių skaičius ir mažėti Olandijos bei kitų šalių neholšteinizuotų juodmargių bulių

palikuonių (Paleckaitis, 2002).

Lietuvos juodmargių produktyvumą ženkliai gerina Holšteinų buliai. Masinė Lietuvoje veisiamų

juodmargių galvijų holšteinizacija prasidėjo 1982 m., kai į šalį buvo pradėti importuoti

holšteinizuoti Vokietijos juodmargiai buliai. Holšteinai produktyviąsias bei ūkines savybes

stabiliai perduoda palikuoniams sukryžminus su kitomis veislėmis. Iš holšteinų karvių 2014 –

2015 m. vidutiniškai primelžta 8536 kg 4,26 proc. riebumo ir 3,34 proc. baltymingumo pieno.

2014 - 2015 m. Lietuvoje buvo kontroliuojama 17453 Holšteinų veislės karvių. Nustatyta, kad

pieno baltymingumas iš juodmargių grupės didžiausias senojo genotipo Lietuvos juodmargių

karvių - 3,35 proc., kai vidutinis visų Lietuvoje kontroliuojamų veislių galvijų pieno

baltymingumas – 3,36 proc. (Apyskaita Nr. 78, 2016).

Lietuvoje galvijų produktyvumo kontrolė vykdoma siekiant nustatyti kiekvieno gyvulio pieno

sudėtį ir kokybę. Gauti duomenys kaupiami ir naudojami kryptingai gyvulių atrankai, veislinės

vertės nustatymui, gyvulių reprodukcijos organizavimui, pašarų racionų sudarymui. Remiantis

sukauptais duomenimis, vidutinis juodmargių galvijų pieno primilžis 2004-2011 metais svyravo

nuo 5303 - 6437 kg, tačiau kiekvienais metais vidutinis pieno primilžis didėjo. 2004 m.

didžiausias pieningumas buvo Holšteinų - 6603 kg. Lietuvos juodmargių pieno produktyvumas

panašus į kitų šalių juodmargių karvių primilžio vidurkį. Vidutinis karvių pieno riebumas

juodmargių galvijų populiacijoje svyruoja nuo 4,25 proc. iki 4,33 proc. Arčiausiai pieno riebumo

vidurkio yra Lietuvos juodmargių veislė. Vidutinis pieno baltymingumas juodmargių karvių

populiacijoje svyruoja nuo 3,31 proc. iki 3,37 proc. Pats mažiausias pieno baltymingumas yra

Britanijos juodmargių karvių. Arčiausiai juodmargių galvijų populiacijos vidurkio yra Lietuvos

9

juodmargių karvių pieno baltymingumas, jis yra pastoviausias. Gana pastovus ir didesnis už

vidurkį yra Holšteinų veislės karvių pieno baltymingumas. Juodmargių galvijų populiacijos

vidurkį atitinka Lietuvos ir Vokietijos karvių pieno baltymingumas (Žilinskaitė, G., 2013).

Greta globalizuotų juodmargių pieninių galvijų didėja senojo genotipo Lietuvos juodmargių

galvijų populiacija. Lietuva, pasirašydama 1992 m. birželio 11 d. Rio de Žaneire „Biologinės

įvairovės konvenciją“ (http://www.un.org/en/events/biodiversityday/convention.shtml),

įsipareigojo išsaugoti mūsų šalies gyvulių veislių genetinį fondą. Nacionaliniai genetiniai

ištekliai, kurių išskirtiniai paveldimi požymiai susiformavę Lietuvoje, turi selekcinę, ekonominę,

mokslinę, ekologinę, kultūrinę, istorinę reikšmę ir yra svarbi pasaulinės žemės ūkio įvairovės

dalis. Senojo genotipo Lietuvos juodmargių galvijų populiacijos dydis 2016 m. buvo 1975

galvijai, 1279 iš jų - veislinės patelės. Gyvūnai laikomi 132 Lietuvos ūkiuose

(https://zum.lrv.lt/lt/naujienos/patvirtinta-nauja-lietuvos-ukiniu-gyvunu-genetiniu-istekliu-

issaugojimo-programa). Vidutiniškai iš karvės primelžiama 5612 kg 4,31 % riebumo ir 3,35 %

baltymingumo pieno.

Mums prieinamoje literatūroje nepavyko rasti duomenų apie Lietuvos juodmargių karvių pieno

technologines savybes. Visi iki šiol Lietuvoje atlikti tyrimai buvo skirti pieninių galvijų genotipų

vertinimui pagal gerinančiųjų veislių kraujo (genų) laipsnį, nustatant optimalius vietos

sąlygomis. Šiose studijose į vertinamus rodiklius nebuvo traukiami pieno baltymų frakcijų

kokybinė bei kokybinė sudėtis ir pieno technologinės savybės.

1.2 Karvių pieno baltymų sudėtis

Pienas - tai įvairialypis skystis, susidedantis iš daugelio medžiagų, iš kurių svarbiausios yra

vanduo, laktozė, riebalai, baltymai, organinės rūgštys ir mineralinės medžiagos. Šiame darbe

pagrindinis tyrimo objektas bus pieno baltymų frakcijos. Pieno baltymai yra heterogeninė

molekulių grupė, kurioje nustatyta virš 200 skirtingų junginių (Ng-Kwai-Hang, 2002), iš kurių

svarbiausi yra šeši.

Tradiciškai pieno baltymai skirstomi pagal jų tirpumą esant pH 4,6. Baltymai, kurie iškrenta į

nuosėdas, esant pH 4,6, yra kazeinas, o baltymai likę tirpale – išrūgų baltymai. Karvių piene,

kuriame paprastai yra apie 3,5 % baltymų, kazeinai sudaro 80 % , o 20 % yra išrūgų baltymai (1

lentelė).

1 lentelė. Pieno baltymų charakteristikos (pagal Bittante, 2012)

Baltymai Trumpinys Molekulinė

masė, kD

Koncentracija

piene, g/l

Aminorūgščių likučiai PO4

grupių

skaičius Bendras Pro Cys

αs1-kazeinas αs1-CN 23,6 10,0 199 17 0 8-9

αs2-kazeinas αs2-CN 25,2 2,6 207 10 2 10-13

β-kazeinas β-CN 24,0 9,3 209 35 0 5

κ-kazeinas κ-CN 19,0 3,3 169 20 2 1-3

β-laktoglobulinas β-LG 18,0 3,2 162 8 5 0

α-laktoalbuminas α-LA 14,2 1,2 123 2 8 0

Jaučio serumo

albuminas

BSA 66,3 0,4 582 28 35 0

Imuniniai

globulinai

Ig <1000,0 0,7 8,4% 2,3% +

Kiti 0,8

1.2.1 Kazeinai ir kazeino micelė

Pirmasis kazeino išskyrimą iš pieno aprašė Berzelius 1814 m. Ilgai buvo manoma, kad tai vienas

baltymas. Kazeino heterogeniškumą pirmą kartą nustatė Mellander 1939 m., panaudodamas

10

elektroforezės metodą, kuriuo pagal baltymų mobilumą elektros lauke išskirstė tris kazeino

frakcijas: α -CN, β-CN ir γ-CN.

Dar vėliau Waugh ir von Hippel (1956) nustatė, kad α-CN savo ruožtu galima suskirstyti į dar

dvi frakcijas – αs-CN (jautrią kalciui) ir κ-CN (nejautrią kalciui). O 1969 m. surasta, kad αs-CN

frakcija sudaryta iš 2 proteinų – αs1-CN ir αs2-CN (Annan ir Manson, 1969), o γ-CN yra β-CN

segmentas po jo proteolitinio skaldymo plazminu (Groves, 1969). Taigi, šiandien žinome, kad

kazeinas sudarytas iš αs1-CN, αs2-CN, β-CN ir κ-CN frakcijų, kurių proporcijos piene yra

4:1:4:1.

Kazeinų antrinė ir tretinė struktūros mažai organizuotos, nes jų peptidinėje grandinėje daug

prolino liekanų (Fox ir McSweeney, 1998). Dėl šios priežasties šildant pieną kazeinai atsparūs

denatūracijai, nes nėra tvarkingos struktūros, kuri galėtų „išsilankstyti“. Tuo paaiškinamas ir

kazeinų polinkis proteolizei be išankstinės denatūracijos. Kazeinų peptidinei grandinei būdinga

amfifilinė struktūra, nes poliniai ir nepoliniai regionai šioje grandinėje pasiskirstę netolygiai.

Visa tai kartu su nemažu prolino ir fosfatų kiekiu sudaro prielaidas kazeinams formuoti miceles.

Fosfato grupės esteriniais ryšiais prijungtos prie kazeinų per serino hidroksilines grupes. Šie

fosfoserino likučiai prijungia kalcį, kuris savo ruožtu jungiasi su koloidiniu kalcio fosfatu

(KKF). Būtent šiais ryšiais kazeinai sujungiami į miceles. Iš viso piene esančio kalcio (apie 1200

mg/l) beveik pusė yra kazeino micelėse.

Esant tokioms baltymų ir kalcio koncentracijoms, kurios randamos piene, kalcis turėtų išsodinti

αs1-CN, αs2-CN ir β-CN baltymus, prisijungdamas prie jų fosfoserino likučių. Tačiau κ-CN yra

ne tik tirpus kalcyje, jis jungiasi su kitais kazeinais ir juos stabilizuoja inicijuodamas micelių

susidarymą ir taip užtikrindamas stabilią koloidinę būseną (Farrell ir kt., 2006).

Piene apie 95 % kazeino yra koloidinėje būklėje, kazeino micelėse. Dėl kazeino micelės

struktūros iki šiol vyksta mokslinės diskusijos. Pasiūlyti keli kazeino micelės modeliai, ir nors

nei vienam iš jų nėra visiško mokslininkų bendruomenės pritarimo, sutariama dėl kelių bendrinių

kazeino micelės struktūros principų. Kazeino micelėje kazeino molekulės išlaikomos kartu

jungiant per koloidinį kalcio fosfatą. κ-CN išsidėstęs kazeino micelės išoriniame sluoksnyje ir

taip stabilizuojamas hidrofobinė kazeino molekulės dalis (1paveikslas). Schmid pasiūlė

submicelių modelį, pagal kurį micelės struktūra sudaryta iš submicelių su dideliu arba mažu κ-

CN kiekiu (Pav. 1a). KKF klasteriai ir hidrofobinė sąveika palaiko submiceles kartu taip, kad

tos, kuriose κ-CN daugiau, yra išsidėsčiusios micelės paviršiuje. κ-CN hidrofilinė ir neigiamai

įkrauta C-terminalinė aminorūgšties liekana kyšo iš micelės, kurios struktūra atvira ir porėta, ir

taip sudaro „plaukuotą“ micelės apvalkalą, kuris veikiant sterinėms ir elektrostatinėms atostūmio

jėgoms apsaugo submiceles nuo agregacijos bei flokuliacjos (Walstra, 1999).

1 paveikslas. Kazeino micelės modeliai: a) submicelės modelis pagal Walstra, 1999; b)

„Plaukuotas“ modelis pagal Holt ir Horne, 1996; c) dviejų sąveikų modelis pagal Horne, 1998.

11

Holt 1992 m. pasiūlytame kazeino micelės modelyje pritaria stabilizuojančio κ-CN sluoksnio ir

surišančio KKF funkcijoms micelėje, tačiau prieštarauja submicelių egzistavimui. Jo modelyje

micelės yra pristatomos kaip mineralizuotas, skersiniais ryšiais susiūtas baltymų gelis, kurį

sudaro susipynusios, lanksčios kazeino molekulės (Pav. 1b). KKF klasteriai reaguoja su kazeino

molekulių fosfoserino likučiais ir taip susidaro mikro-gelio dalelės (Holt ir Horne, 1996). Šiame

modelyje nenumatyta, kokia yra κ-CN, kuris neturi KKF klasterio, funkcija, taip pat nepaaiškinta

κ-CN išsidėstymo kazeino micelės paviršiuje funkcija (Horne, 2002). Į šiuos klausimus atsakė

Horn, kuris išvystė Holt pasiūlytą kazeino micelės modelį. Šioje naujoje koncepcijoje įrodyta,

kad micelės stabilumą užtikrina tai, kad hidrofobinė sąveika micelėje stipresnė už elektrostatines

atostūmio jėgas (Farrell ir kt., 2006). Amfifilinės kazeino molekulės veikia kaip blokiniai

kopolimerai, susiūti hidrofobinės sąveikos regionais ir susidariusiais tilteliais tarp KKF klasterių

(Pav. 1c). Taigi, micelės struktūra vertinama kaip vidinė gelio tipo struktūra su nanoklasteriais iš

kalcio ir fosfato (Horne, 1998). Elektroninės mikroskopijos būdu gautas individualios kazeino

micelės vaizdas parodė, kad jai būdingas nelygus paviršius be apvalkalo. Dalgleish su kolegomis

(2004) pasiūlytame naujausiame kazeino micelės modelyje jai būdinga vamzdinė struktūra su

tarpais ir κ-CN, išsidėsčiusiu micelės paviršiuje.

Kazeino micelės vidutinis skersmuo yra apie 120 nm, o ribos yra nuo 50 iki 500 nm (Fox ir

Brodkorb, 2008). Stabilizuojanti κ-CN funkcija ir jo vaidmuo ribojant micelės augimą,

apsprendžia, kad κ-CN yra tas baltymas, nuo kurio priklauso kazeino micelės dydis. Nustatyta,

kad piene, kuriame κ-CN daugiau, kazeino micelės buvo mažesnės, lyginant su pienu, kuriame

buvo mažiau κ-CN (Dalgleish ir kt., 1989; Donnelly ir kt., 1984; Risso ir kt., 2007).

1.2.2 Išrūgų baltymai

Išrūgų baltymai apibūdinami kaip pieno baltymai, kurie išlieka tirpūs esant pH 4.6. Yra trys

išrūgų baltymų frakcijos - β-LG, α-LA ir jaučio serumo albuminai (BSA), kurių kiekis išrūgų

baltymų frakcijoje sudaro atitinkamai 50, 20 it 10 %. Likusi dalis – tai imunoglobulinai (Ig) ir

keletas kitų baltymų, tarp kurių yra fermentų. Dauguma išrūgų baltymų yra globulės, kurioms

skirtingai nei kazeino micelėms būdinga tvarkinga, gerai organizuota antrinė ir tretinė baltymo

molekulės struktūra. Dėl šios priežasties išrūgų baltymai lengvai denatūruoja šildant, kai

temperatūra viršija 60°C (DeWit ir Klarenbeek, 1984).

Išrūgų baltymuose yra sąlyginai daug cisteino likučių, kurie gali formuoti disulfidinius ryšius

molekulės viduje (Fox ir McSweeney, 1998). Denatūruojant β-LG molekulei reaktingos SH

grupės išsidėsto molekulės išorėje ir formuoja papildomus disulfidinius ryšius tiek tarp β-LG

molekulių, tiek su κ-CN (Creamer ir kt., 2004; Lowe ir kt., 2004; Sawyer, 1969). α-LA svarbus

dėl dalyvavimo laktozės sintezėje (Ng-Kwai-Hang, 2002). Žinoma, kad β-LG ir α-LA sintezė

vyksta pieno liaukose, o BSA yra pagrindinis kraujo serumo baltymas ir į pieną patenka

tiesiogiai iš kraujo. Ig yra kompleksas baltymų, kurie užtikrina organizmo imuninės sistemos

apsaugą. Didžiausias šių baltymų kiekis yra krekenose, net iki 100 g/l. Praėjus savaitei po

apsiveršiavimo jų kiekis sumažėja iki 1 g/l.

1.3 Pieno koaguliacija

Tai, kad kazeino micelės lieka tirpale, esant natūraliam pieno pH 6.7, priklauso nuo micelės

paviršiuje esančio κ-CN C-terminalinės aminorūgšties likučio neigiamo krūvio ir hidrofiliškumo.

Galimi du būdai sukelti micelių agregaciją: fermentinis (sūrio gamyboje) ir rūgštinis (raugintų

pieno produktų gamyboje). Šių reakcijų rezultatas didele dalimi priklauso nuo įvairių

komponentų kiekių ir proporcijų piene, ypatingai svarbi yra pieno baltymų sudėtis.

1.3.1 Pieno koaguliacijos nustatymo metodai

Pieno koaguliavimo savybės nustatomos įvairiais metodais. Galima matuoti koaguliavimo

trukmę (KT), kuri apibrėžiama kaip trukmė nuo koagulianto įdėjimo iki koaguliacijos pradžios.

Kartu su šiuo rodikliu matuojamas susidariusios sutraukos kietumas, praėjus tam tikram laikui

nuo koagulianto įdėjimo.

12

Paprasčiausias pieno koaguliacijos savybių nustatymo metodas, naudojamas tiek moksliniuose

tyrimuose, tiek pieno pramonėje, yra laktodinamografija. Ši technika matuoja pieno, laikomo

tam tikroje temperatūroje, klampą praėjus tam tikram laikui po koagulianto įdėjimo. Ir nors

mokslinių tyrimų laboratorijose pastaraisiais metais dažnai naudojamas dinaminės reometrijos

metodas (Glantz ir kt., 2010; Frederiksen ir kt., 2011; Jakob ir kt., 2011) populiariu pieno

koaguliacijos savybių nustatymo prietaisu išlieka Formagrafas (itališkai formaggio reiškia sūris;

Foss Electric A/S, Hillerod, Danija). Juo galima vienu metu analizuoti kelis pieno mėginius.

Prietaiso veikimo esmė – fiksuojama mažos švytuoklės, įmerktos į tiesiškai vibruojantį

koaguliuojančio pieno mėginį, elgesys. Dėl gelio susidarymo švytuoklė judančiame piene

veikiama tam tikra jėga per minutę (McMahon ir Brown, 1982). Ši jėga matuojama ir prietaisas

užrašo tipinę kreivę, kuri parodyta 2 paveiksle.

2 paveikslas. Pieno koaguliacijos savybių nustatymo formagrafu diagrama, pagal kurią nustatomi

trys rodikliai: r = FKT, min – fermentinės koaguliacijos trukmė; k20, min – sutraukos kietėjimo

laikas; a30, mm - sutraukos kietumas, praėjus 30 min po koagulianto įdėjimo (McMahon ir

Brown (1982).

Iš gautos kreivės galima nustatyti tris parametrus, charakterizuojančius pieno koaguliacijos

savybes: 1) fermentinės koaguliacijos trukmę (FKT, min), kuri nustatoma matuojant intervalą

nuo nulio (koagulianto įdėjimas į pieną) iki laiko, kai bazinė linija ima platėti; 2) sutraukos

kietėjimo laikas (SK), intervalas nuo gelio susidarymo pradžios (FKT) iki laiko, kai virpesių

plotis pasiekia 20 mm - k20; 3) sutraukos kietumas, praėjus 30 min po koagulianto įdėjimo - a30.

3 paveikslas. Formagrafu gautų įprastinių kreivių klasifikacija (Annibaldi ir kt., 1977).

Šių trijų parametrų kombinacija panaudota klasifikuojant pieną pagal koaguliacijos savybes į

tokias klases: optimalus, suboptimalus, defektinis ir nekoaguliuojantis (Pav.3). Lyginant su

optimalia kreive (A tipas), B tipo pienas yra lėtos koaguliacijos pienas, greitai formuojantis

sutrauką ir būdingas vėlyvos laktacijos karvėms; C tipo pienas, atvirkščiai, yra greitos

koaguliacijos pienas, ilgai formuojantis sutrauką ir dažnai pastebimas, kai karvių laktacija

ankstyva; D tipo pienas yra greitos koaguliacijos pienas, greitai formuojantis sutrauką ir tokiame

piene paprastai būna daug kazeino ir kiek žemesnis pH; E tipo pienas – lėtos koaguliacijos

pienas, ilgai formuojantis minkštą sutrauką, dažnai sutinkamas, kai piene didelis somatinių

13

ląstelių kiekis arba karvės serga kitomis pieno sekrecijos ligomis; F tipo pienas – E tipo pieno

ekstremalus variantas, kai koaguliacija įvyksta labai vėlai, būdingas didesnio pH pienui ir kai

karvės serga klinikiniu mastitu; DD tipo pienas – greitos koaguliacijos pienas, greitai

formuojantis kietą sutrauką, būdingas pienu su žemu pH; FF tipo pienas – nekoaguliuojantis

pienas (NP) (Annibaldi ir kt., 1977).

1.3.2 Fermentinė koaguliacija

Fermentinės koaguliacijos metu vyksta kazeino micelės dalinė hidrolizė fermentu reninu, o po

jos seka micelių agregacija, jungiantis joms per kalcio tiltelius (Fox irMcSweeney, 1998).

Reninas tradiciškai gaunamas iš veršelių skrandžio gleivinės ir yra dviejų skrandžio proteazių –

chimozino ir pepsino mišinys (Andrén, 2002). Chimozinas yra aktyvesnis komponentas fermentų

mišinyje, kuris skelia κ-CN peptidinėje grandinėje ryšį tarp Phe105-Met106. Chimozino

katalizuojama pieno koaguliacija vyksta trimis fazėmis. Pirmoje fazėje fermentinės hidrolizės

metu κ-CN skyla į para- κ-CN ir hidrofilinį kazeino makropeptidą, kuris ištirpsta išrūgose. Dėl

šios priežasties kazeino micelės praranda neigiamai įkrautas grupes ir jų sterinė stabilizacija

sumažėja (Senge ir kt., 1997). Kai apie 70% κ-CN hidrolizuojasi, micelių koloidinis stabilumas

tiek sumažėja, kad gali spontaniškai prasidėti antroji agregacijos fazė. Pradeda formuotis gelis,

nes molekulių grandinės jungiasi į erdvinį tinklą, veikiant hidrofobinei sąveikai ir susidarant

kalcio tilteliams tarp grandinių. Trečioje fazėje išrūgos išstumiamos iš susidariusio kazeino

tinklo akelių, vyksta sinerezė. Koaguliaciją galima paspartinti, mažinant pH, didinant kalcio

kiekį ir temperatūrą (agregacija nevyksta, jei temperatūra žemesnė nei 20 oC). Sinerezė

skatinama keliant temperatūrą, pH ir didinant slėgį, pvz., maišant.

1.3.3 Rūgštinė koaguliacija

Vykstant rūgštinei koaguliacijai kazeino micelių savybės keičiasi mažinant pieno pH (Lucey ir

Singh, 1997). Dėl to KKF disocijuoja iš micelės, neigiami krūviai kazeino micelėse

neutralizuojami ir jos agreguojasi, kai pasiekiamas kazeino izoelektrinis taškas pH 4.6. Susidaro

porėtas, silpnai sujungtų agregatų tinklas. Pienas, skirtas raugintų pieno produktų gamybai prieš

fermentaciją įprastai apdorojamas aukštoje temperatūroje (90 oC, 5 – 10 min) ir tai turi didelės

reikšmės galutiniam produktui. Kai terminio apdorojimo temperatūra viršija 60 oC, išrūgų

baltymai (daugiausiai β-LG) denatūruoja ir todėl per disulfidinius ryšius sudaro kompleksus su

κ-CN, esančiu ant kazeino micelės paviršiaus (McKenzie ir kt., 1971), arba formuoja tirpius

agregatus (Guyomarc'h ir kt., 2003; Haque ir Kinsella, 1988). Dėl šios priežasties susidaro

kietesnė sutrauka, nes didėja rūgštinio gelio struktūrą palaikančių ryšių kiekis ir stiprumas

(Dannenberg ir Kessler, 1988a), kadangi denatūravę išrūgų baltymai komplekse su kazeino

micelėmis jungiasi vienas su kitu (Lucey ir Singh, 1997). Dar daugiau, baltymų koncentracija

rūgštinėje sutraukoje didėja, nes denatūravę išrūgų baltymai aktyviai dalyvauja struktūros

susidaryme.

1.3.4 Veiksniai, turintys įtakos pieno koaguliacijai

Pieno koaguliacija kompleksinis procesas, kuriam turi įtakos įvairūs veiksniai. Svarbiausi iš jų

yra pH, kalcio kiekis ir temperatūra. Koaguliacijos laikas mažėja mažėjant pH ir didėjant

temperatūrai. Kalcio teigiama įtaka koaguliacijai pasireiškia tiek didėjant KKF komplekse

esančio kalcio kiekiui, tiek laisvo kalcio jonų kiekiui.

Daugelio veiksnių įtaka pieno koaguliacijai yra persipynusi, o pieno baltymų frakcijų sudėtis,

kuri gali turėti įvairios reikšmės pieno koaguliacijai, bus aptarta vėliau. Pirmiausiai reikia

pabrėžti, kad visi šie veiksniai gali keistis priklausomai nuo genetinio varianto, tačiau nustatyta ir

veislės (Auldist ir kt., 2004; Chiofalo ir kt., 2000; Malossini ir kt., 1996), laktacijos stadijos

(Ostersen ir kt., 1997), sezono ir pašarų (Christian ir kt., 1995; Macheboeuf ir kt., 1993), karvių

sveikatos (Grandison ir Ford, 1986) įtaka pieno sudėčiai. Mastitu sergančių karvių pienas

pasižymi dideliu pH ir mažu kazeino kiekiu, todėl turi neigiamos įtakos sūrių gamybai (Barbano

ir kt.,1991; Leitner ir kt., 2006).

14

Nekoaguliuojantį (NK) pieną mokslininkai tyrinėja nuo 1920 – ųjų metų (Cassandro ir kt., 2008;

Claesson, 1965; Comin ir kt., 2008; Ikonen ir kt., 1999a; Ikonen ir kt., 2004; Jõudu ir kt., 2007;

Koestler, 1925; Losi ir kt., 1982; Okigbo ir kt., 1985c; Tervala ir Antila, 1985; Wedholm ir kt.,

2006b). Tokio pieno priežastys iki galo nėra suprastos. Tokios padėties priežastis – neišaiškinta

kazeino micelės struktūra ir pieno koaguliacijos proceso kompleksiškumas, kuris priklauso nuo

daugelio veiksnių. Tačiau buvo pripažinta, kad NK pienas, kuris būdingas vėlyvos laktacijos

(Flüeler, 1978; Okigbo ir kt., 1985c) arba mastitu sergančioms karvėms (Koestler, 1925; Okigbo

ir kt., 1985a), paplitęs ir tarp sveikų, vidutinės laktacijos karvių (Ikonen ir kt., 2004; Tyrisevä ir

kt., 2003). Taigi, šis reiškinys nepriklauso tik nuo aplinkos veiksnių. Ikonen ir kt. 1999a nustatė

didelius skirtumus tarp veislinių bulių, kurių dukterys gamina NK pieną, ir to priežastimi

didžiąja dalimi įvardino genetinius skirtumus. Buvo identifikuoti du genai, galimai susiję su NK

pieno gamyba (Tyrisevä ir kt., 2008). Tačiau genetinis polinkis gaminti NK pieną nepaneigia

didelės aplinkos bei sudėties veiksnių įtakos pieno koaguliacijai. Paskelbti duomenys, kad

padidinus kalcio kiekį galima sugrąžinti koaguliacijos savybę NK pienui, tiesa, pasiekti gerai

koaguliuojančio pieno savybių pasiekti nepavyko (van Hooydonk ir kt., 1986).

1.3.5 Karvių veislės įtaka pieno koaguliacijos savybėms

Karvių veislių įtaka pieno koaguliacijai tiriama jau daugelį metų, tačiau skelbtus duomenis sunku

vertinti ir lyginti, nes tyrimai buvo atliekami skirtingomis sąlygomis, naudojant skirtingus

analitinius instrumentus. Pirmiausiai skyrėsi aplinkos sąlygos, t.y. šėrimo racionas, mėginių

kiekis paimtas iš kiekvienos karvės, intervalai tarp mėginių paėmimo, mėginių konservavimo

būdas ir laikymo sąlygos, mėginių paruošimas analizei (terminis apdorojimas, koagulianto kiekis

ir jo įdėjimo būdas), koaguliacijos temperatūra, analizės trukmė, rezultatų pateikimas ir

apdorojimo būdas. Dėl šių priežasčių analizuoti ir lyginti galima tik tuos rezultatus, kai tyrimai

atlikti vienu metu analizuojant kelių karvių veislių pieno koaguliacijos savybes.

Bittante su kolegomis 2012 m. paskelbė studiją, kurioje pabandė palyginti skirtingų karvių

veislių pieno koaguliacijos savybes (Bittante ir kt., 2012 m). Šioje studijoje mokslininkai

apdorojo duomenis remdamiesi šiais kriterijais: 1) neįprastomis sąlygomis atliktų tyrimų

duomenys apie pieno koaguliacijos savybes nebuvo nagrinėjami; 2) kadangi daugiausia

duomenų paskelbta apie Holšteinų veislės karvių pieno savybes, ši veislė studijoje naudota kaip

referencinė; 3) kadangi tiek kintamumo apimtis, tiek pastebėti skirtumai veislės viduje, dažnai

buvo proporcingi vidutinėms pieno koaguliacijos savybių rodiklių reikšmėms, pateiktoms tam

tikrame tyrime, studijos autoriai išreiškė tam tikros karvių veislės pieno koaguliacijos savybių

vidutinius rodiklius kaip santykį tos veislės rodiklio su Holšteinų veislės karvių pieno rodikliu,

priimant kad jis lygis 1,00; 4) taip gauti santykiai panaudoti skaičiuojant rodiklių vidurkius ir

standartinius nuokrypius kiekvienai veislei.

Holšteino veislės karvių pieno koaguliacijos savybių rodiklių vidutinės reikšmės, apskaičiuotos

iš 33 tyrimų rezultatų, buvo tokios: FKT - 14.1 min; k20 - 9.2 min ir a30 - 29.9 mm;

standartiniai nuokrypiai dideli ir atitinkamai kiekvienam iš rodiklių buvo 35, 34 ir 27%. Taigi,

Hošteinų veislės karvių pienui būdinga ilgesnis fermentinės sutraukos susidarymo laikas ir

ilgesnis laikas, reikalingas pasiekti sutraukos kietumą - 20 mm.

Airšyrų veislės karvių pieno koaguliacijos savybės charakterizuotos kiek ilgesne FKT, ilgesniu

k20 ir didesniu a30, lyginant su Holšteinų veislės karvių pienu. Nustatyta, kad Švedijos

žalmargių karvių pieno koaguliacijos savybės labai geros; šios veislės karvių pienas greičiau

koaguliuoja, lyginant su Holšteino veislės karvių pienu, be to surinktų rezultatų standartiniai

nuokrypiai buvo mažesni nei apskaičiuoti kitų veislių galvijams. Džersių veislės karvių pieno

visi trys koaguliacijos savybių rodikliai svyravo labai didelėse ribose, nors jų vidutinės reikšmės

buvo geros. Studijoje pateikti duomenys parodė, kad Simentalių ir Montbeliarde veislių karvių

pieno koaguliacijos savybės taip pat geresnės nei Holšteinų veislės karvių, bet ne tokios geros

kaip Švedijos žalmargių. Apie vietinių veislių karvių pieno koaguliacines savybes paskelbtų

rezultatų nėra daug. Išimtis – Suomijos pieninių galvijų veislės ir Anglero veislės karvių pienas,

15

kurių koaguliacinės savybės buvo panašios į Holšteinų veislės karvių pieno savybes. Italijos

vietinių veislių Rendena ir Modikana karvių pieno koaguliacinės savybės geresnės nei Švedijos

žalmargių. Apibendrinant duomenis, studijos autoriai padarė išvadą, kad karvių veislių, kurios

kilusios iš Centrinės – Pietų Europos regionų, ypač Alpių regiono, pienas charakterizuojamas

trumpesniu FKT, greitesniu k20, ir didesniu a30 lyginant su Centrinės-Šiaurės Europos regionu.

1.3.6 Pieno baltymų genetinio polimorfizmo įtaka pieno koaguliacijos savybėms

Pieno baltymų genetinis polimorfizmas

Genetinis polimorfizmas – tai dviejų arba daugiau nukleotidų egzistavimas populiacijoje tame

pačiame lokuse vienu metu. Kitaip sakant tai DNR sekos skirtumai tarp individų, jų grupių ar

populiacijų. Genetinis polimorfizmas atsiranda dėl mutacijų. Paprasčiausias genetinio

polimorfizmo tipas yra vieno nukleotido polimorfizmas, kai egzistuoja mažiausiai du jo variantai

ir retesnysis alelis pasitaiko dažniau nei 1% bendroje populiacijoje. Vieno nukleotido

polimorfizmas gali sąlygoti aminorūgščių pasislinkimą. Struktūriniai baltymų variantai atsiranda

dėl mutacijų, kurios sąlygoja vienos arba kelių aminorūgščių sekos polipeptidinėje grandinėje

pakeitimą. Pirmą kartą pieno baltymų polimorfizmas buvo nustatytas 1955 m. β-LG

(Aschaffenburg ir Drewry), o vėliau polimorfizmas nustatytas visiems pieno baltymams

(Aschaffenburg, 1961; Blumber ir Tombs, 1958; Grosclaude ir kt., 1976; Neelin, 1964;

Thompson ir kt., 1962).

Aminorūgščių sekos pasikeitimas žinomuose pieno baltymų - αs1-CN, β-CN, κ-CN ir β-LG,

genetiniuose variantuose parodytas 2 lentelėje. αs1-CN B variante yra vienu neigiamu krūviu

daugiau nei C variante, nes Gly pakeistas Glu. β-CN B variantas turi du teigiamai įkrautų

aminorūgščių likučius (Arg ir His), todėl lyginant su A1 ir A2 variantais, jis turi atitinkamai

vienu arba dviem teigiamais krūviais daugiau. Pasikeitimai tarp κ-CN A, B ir E variantų yra

išsidėstę kazeino makropolipeptido grandinės viduryje, kur A variante yra du polinių

aminorūgščių likučiai - Thr136 ir Asp148, E variante yra pakeisti hidrofobinių aminorūgščių Ile

ir Ala likučiais. Be to E varianto 155 pozicijoje Ser pakeista Gly. Tai, kad β-LG A variante yra

Asp, reiškia, kad šis baltymo genetinis variantas yra labiau neigiamai įkrautas nei β-LG B

variantas.

2 lentelė. Aminorūgščių pakeitimai pieno baltymų genetiniuose variantuose, nustatytuose

Švedijos pieniniuose galvijuose (pagal Bittante, 2012)

Baltymai Genetiniai

variantai

Aminorūgštis ir jos pozicija genetiniame variante

αs1-CN B 192 Glu

C 192 Gly β-CN A1 67 His 106 His 122 Ser

A2 67 Pro 106 His 122 Ser

A3 67 Pro 106 Gln 122 Ser

B 67 His 106 His 122 Arg κ-CN A 136 Thr 148 Asp 155 Ser

B 136 Ile 148 Ala 155 Ser

E 136 Thr 148 Asp 155 Gly β-LG A 64 Asp 118 Val

B 64 Gly 118 Ala

Pieno baltymų genetinis polimorfizmas gali būti jų skirtingų fizikinių cheminių savybių

priežastimi. Buvo nustatyta, kad tarp kazeino micelių, kuriose vyravo αs1-CN C, β-CN B ir κ-

CN B baltymų variantai, kuriuose aminorūgščių sekos pakeitimai sąlygojo mažiau neigiamai

įkrautų funkcinių grupių, atostūmio jėgos sumažėja, lyginant su micelėmis, kuriose yra kazeino

variantai, turintys daugiau neigiamai įkrautų funkcinių grupių (McLean, 1986). O tai savo ruožtu

16

gali skatinti kazeino agregaciją. Kadangi daugelis aminorūgščių sekos pakeitimų κ-CN

genetiniuose variantuose nustatyta kazeino makropeptido dalyje (C-terminalas), kuris

atskeliamas fermentinės koaguliacijos hidrolizės fazės metu, šios mutacijos gali būti nesvarbios

agregacijos fazės eigai, t.y. neturi įtakos susidariusios sutraukos kietumui. Tačiau koaguliacijos

laikas, t.y. trukmė, per kiek laiko, veikiant chimozinui nutrūksta ryšys tarp Phe105-Met106, gali

priklausyti nuo neigiamai įkrautų funkcinių grupių kiekio kazeino micelėje, kurių skaičius

skirtingame κ-CN genetiniame variante yra skirtingas.

Pieno baltymų polimorfizmas ir baltymų sudėtis

Bendrai, κ-CN B alelis susijęs su didesne κ-CN koncentracija piene, lyginant su A aleliu

(Aaltonen ir Antila, 1987; Bobe ir kt., 1999; Ehrmann ir kt., 1997; Graml ir Pirchner, 2003;

Ikonen ir kt., 1997; Lodes ir kt., 1997; Mayer ir kt., 1997; McLean ir kt., 1984; van Eenennaam

ir Medrano, 1991), o taip pat su didesniu bendru baltymų kiekiu. Tuo tarpu κ-CN E alelis, susijęs

su mažesniu κ-CN kiekiu, lyginant su B ir galimai su A aleliais (Ikonen ir kt., 1997; Oloffs ir kt.,

1992). Karvės, kurioms nustatytas β-CN B alelis, gamina pieną, kuriame yra daugiau baltymų ir

daugiau β-CN frakcijos baltymų (McLean ir kt., 1984; Ng-Kwai-Hang ir kt., 1986). Yra

paskelbti duomenys, kad priklausomai nuo genetinio varianto baltymų ir kazeino keikis piene

mažėja tokia tvarka A1A1 > A1A2 > A2A2 (Jakob ir Puhan, 1994; Ng-Kwai-Hang ir kt., 1986).

Nustatyta, kad β-LG B varianto kiekis ženkliai mažesnis nei A varianto kiekis piene, kuriame

taip pat nustatytas ir padidėjęs bendras kazeino kiekis (Braunschweig ir Leeb, 2006; Ehrmann ir

kt., 1997b; Ford ir kt., 1993; Lodes ir kt., 1997; Lundén ir kt., 1997; Mayer ir kt., 1997; Ng-

Kwai-Hang ir Kim, 1996).

Pieno baltymų polimorfizmas ir pieno koaguliacijos savybės

Pieno baltymų genetinio varianto įtaka pieno koaguliacijos savybėms dažnai siejama su

pasikeitusia pieno baltymų kokybine sudėtimi. Karvių pienas, kuriam būdingas heterozigotinis κ-

CN AB genotipas pasižymi geresnėmis fermentinės koaguliacijos savybėmis, lyginant su pienu,

kuriame vyrauja κ-CN AA genotipas; nustatyta, kad jo FKL ir k20 mažesnis atitinkamai 9 ir 30

%, o a30 padidėjo 26 %. Daugelyje studijų įrodyta, kad κ-CN B alelis sąlygoja geresnes pieno

fermentinės koaguliacijos savybes (Davoli ir kt., 1990; Ikonen ir kt., 1997; Mayer ir kt., 1997;

Pagnacco ir Caroli, 1987; Schaar, 1984; van den Berg ir kt., 1992), kai tuo tarpu κ-CN A alelis

sąlygoja ilgesnį koaguliacijos laiką ir minkštesnę susidariusią sutrauką. Blogiausios

koaguliacijos savybės priskirtos pienui, kuriame nustatytas κ-CN E alelis (Caroli ir kt., 2000;

Ikonen ir kt., 1999; Lodes ir kt., 1996; Oloffs ir kt., 1992). Estijos mokslininkai nustatė, kad

pieno, kuriame vyrauja κ-CN homozigotinis EE genetinis variantas, fermentinės sutraukos

kietumas buvo mažesnis, lyginant su pienu, kuriame nustatytas κ-CN AA genetinis variantas,

tačiau jo FKL buvo geresnis (Joudu ir kt., 2009).

β-CN įtaka pieno koaguliacijos savybėms tyrinėta mažiau nei κ-CN. Taip gali būti todėl, kad ši

kazeino frakcija turi nedaug įtakos fermentinės sutraukos susidarymui, nepriklausomai nuo

vyraujančio β-CN genotipo. Nustatyta, kad pienas, kuriame identifikuotas β-CN B alelis,

pasižymėjo geresnėmis koaguliacijos savybėmis nei pienas su β-CN A aleliu. Didesnė sūrių

išeiga gauta juos gaminant iš pieno, kuriame vyravo β-CN A1A1 lyginant su A1A2 (Marziali ir

Ng-Kwai-Hang, 1986), ir β-CN A2B lyginant su β-kazeinu A2A2 (Mayer ir kt., 1997).

Pieno baltymų genetinių variantų įtaka sūrių išeigai tokia pati kaip ir pieno koaguliacijos

savybėms (Rahali ir Ménard, 1991; Schaar ir kt., 1985; Walsh ir kt., 1995; Walsh ir kt., 1998;

van den Berg ir kt., 1992).

Nors β-LG tiesiogiai nedalyvauja fermentinės kazeino koaguliacijos procese, kai ji vyksta

termiškai neapdorotame piene, buvo įrodyta, kad β-LG genetinis variantas turi įtakos žalio pieno

koaguliacijos savybėms (Ng-Kwai-Hang ir kt., 2002). Be to yra duomenų, kad β-LG B variantas

sąlygoja didesnes sūrių išeigas, lyginant su β-LG A variantu (Lodes ir kt., 1996; Schaar ir kt.,

17

1985; van den Berg ir kt., 1992). Tai gali būti paaiškinta tuo, kad β-LG genetinis variantas

susijęs su kazeino kiekiu piene.

Jensen atliktame labai geromis koaguliacijos savybėmis pasižyminčio pieno tyrime, panaudojant

dvi-dimensinę gelio elektroforezę kartu su masių spektrometrija, nustatyta, kad piene vyravo β-

CN, κ-CN ir β-LG B genetiniai variantai (Jensen ir kt.,2012). Šiame darbe taip pat nustatyta, kad

κ-CN glikozidinimo ir fosforilinimo laipsnis nebuvo susijęs nei su karvių veisle nei su pieno

koaguliacijos savybėmis.

Rūgštinės koaguliacijos priklausomybė nuo šildant pieną vykstančios reakcijos tarp β-LG ir κ-

CN laipsnio buvo nustatyta skirtingiems baltymų variantams. Reakcija vyko greičiau, kai piene

vyravo B genetiniai variantai tiek β-LG, tiek κ-CN, lyginant su A variantais (Allmere ir kt.,

1998). β-LG B variantas taip pat susietas su kietesnio rūgštinio gelio susidarymu, tuo tarpu

nenustatyta skirtumų tarp rūgštinio gelio kietumo, kai piene vyrauja A ir B κ-CN alelės (Allmere

ir kt., 1998). Taip pat įrodyta, kad β-LG A variantas sąlygoja didesnį pieno terminį stabilumą,

lyginant su B variantu (Dannenberg ir Kessler, 1988; Manderson ir kt., 1999; Manderson ir kt.,

1998; McKenzie ir kt., 1971). Tiriant kazeino frakcijų įtaką rūgštinei koaguliacijai, nenustatyta

reikšmingos priklausomybės tarp β-CN variantų A1, A2, A3 ir B (Hallen ir kt., 2009) arba κ-CN

variantų A ir B (Allmere ir kt., 1998), A, B ir E (Hallen ir kt., 2009) rūgštinės koaguliacijos

laikui arba susidariusios sutraukos kietumui. Tuo tarpu αs1-CN variantas BB, κ-CN variantas

AB ir β-LG variantas BB turi įtakos geresnei raugintų pieno produktų tekstūrai ir didesnei

klampai (Jakob ir Puhan, 1992).

Tai, kaip pieno baltymų savybių pokyčiai turi įtakos pieno koaguliacijos savybėms, apima:

genotipo įtaką bendram baltymų kiekiui, atskirų kazeino frakcijų kiekiui ir proporcijoms, pieno

rūgštingumui ir mineralinių medžiagų kiekiui. Kelių studijų autoriai priėjo vieningos išvados,

kad pieno baltymų genetinis variantas turi įtakos tiek atskirų pieno baltymų frakcijų kiekybinei,

tiek kokybinei sudėčiai (Ng-Kwai-Hang ir kt., 1987; Lodes ir kt., 1996; Ikonen ir kt., 1999,

2001; Buchberger ir Dove, 2000; Boettcher ir kt., 2004; Barber ir kt., 2005). Taip pat įrodyta,

kad kazeino micelės dydis priklauso nuo genetinio varianto (McMahon ir Brown, 1984; Lodes ir

kt., 1996). Kai kurių pieno baltymų frakcijų kiekis sąlygoja pieno koaguliacijos savybes

(Marziali ir Ng-Kwai-Hang, 1986; Politis ir Ng-Kwai-Hang, 1988; Auldist ir kt., 2004; Joudu ir

kt., 2008). Taigi, padidėjus arba bendram κ-CN kiekiui, arba jo santykiniam kiekiui bendrame

baltymų kiekyje, piene sumažėja absoliutiniai arba santykiniai kiekiai αs1-CN ir αs2-CN

frakcijų, todėl keičiasi pieno pH iki vertės, kuri yra palanki geroms pieno koaguliacijos

savybėms. Bet kokia β-CN įtaka pieno koaguliacijos savybėms išlieka kontraversiška (Auldist ir

kt., 2004; Wedholm ir kt., 2006; Joudu ir kt., 2008, 2009; Bonfatti ir kt., 2011). Kai kurie pieno

savybių pokyčiai gali būti priskirti kokybiniams (t.y. struktūriniams) skirtumams tarp alelių

pieno baltymų genuose arba kiekybiniams skirtumams (t.y. tam tikrų baltymų kiekiui). Todėl kai

kurie mokslininkai stengėsi išsiaiškinti, kokiu lygiu genetinio baltymų varianto įtaka pieno

koaguliacijos savybėms gali būti paaiškinta per jo įtaką tam tikros baltymų frakcijos kiekiui

piene arba kokiu lygiu tokie skirtumai yra nepriklausomi nuo šios įtakos (Aaltonen r Antila,

1987; Ikonen ir kt., 1997; Heck ir kt., 2009; Bonfatti ir kt., 2010).

Pieno baltymų genetinio varianto ir pieno koaguliacijos savybių skirtumai priklausomai nuo

karvės veislės

Skirtingoms karvių veislėms būdingi svyravimai tarp rezultatų, kaip dažnai nustatomos tam

tikros pieno baltymų alelių formos. Kyla klausimas – kiek sąlyginai svarbi veislės ar pieno

baltymų genotipo įtaka pieno koaguliacijos savybėms? Koks ryšys egzistuoja tarp šių parametrų?

Ikonen su kolegomis palygino Suomijos airšyrų ir Suomijos fryzų veislių karvių pieno

koaguliacijos savybes ir nustatė, kad veislei priskirtinas skirtumas buvo sumažintas 38 %

rodikliui FKL ir 20 % rodikliui a30 po to, kai buvo koreguota veislės įtaka β-CN, κ-CN ir β-LG

genetiniams variantams (Ikonen ir kt., 1999). Panašus tyrimas buvo atliktas ir su Airijos fryzų,

JAV holšteino-fryzų, Montbeliardų ir Normandų karvių veislių pienu (Auldist ir kt., 2002).

18

Šiame tyrime pakoregavus skirtingų veislių karvių pieno tik κ-CN genetinį variantą, pavyko

sumažinti FKT rodiklį nuo 20 iki 35%, k20 rodiklį nuo 41 iki 58%, o a60 rodiklį nuo 0 iki 31%.

Taigi, akivaizdu, kad skirtumo tarp dviejų karvių veislių pieno koaguliacijos savybių laipsnis,

kuris priskirtinas pieno baltymų genetinio varianto svyravimams, yra priklausomas nuo to, kaip

dažnai aptinkamas alelių skirtumas tose veislėse, ypač κ-CN frakcijoje.

2013 m. Švedijos ir Danijos mokslininkai publikavo duomenis, gautus ištyrus trijų pagrindinių

Skandinavijos karvių veislių – Danijos holšteinų, Danijos džersių ir Švedijos žalųjų, pieno

koaguliacijos savybes. Mokslininkai nustatė ženklius skirtumus tarp tirtų karvių veislių pieno

savybių – geriausiomis koaguliacijos savybėmis pasižymėjo Danijos džersiai, lyginant su kitomis

dviem tirtomis veislėmis. Be to nustatyta, kad 2 % tirtų Danijos holšteino pieno mėginių ir net 16

% Švedijos žalųjų pieno mėginių buvo priskirta nekoaguliuojančio pieno kategorijai. Nustatyti

pieno baltymų genetiniai polimorfizmai reikšmingai koreliavo su pieno koaguliacijos savybes

nusakančiais rodikliais – FKL ir sutraukos kietėjimo lygiu. Nustatyta, kad αs1-CN C, β-CN B ir

κ-CN genetiniai variantai turėjo teigiamos įtakos pieno koaguliacijai, o β-CN A2 turėjo ženkliai

neigiamą įtaką. Taip pat nustatyta, kad ne tik individualūs kazeino genotipai, bet ir αs1-CN - β-

CN - κ-CN kompozicija išryškino stiprias asociacijas tirtose veislėse ir daugiau ar mažiau atitiko

individualių baltymų genotipų rezultatus. Mokslininkai apibendrino gautus duomenis, kad sūrių

gamybai skirto pieno optimalią sudėtį galima užtikrinti kontroliuojant nepageidaujamų pieno

baltymų genetinių variantų aptikimo dažnumą ir taip apsisaugant nuo karvių, kurios gamina

blogomis koaguliacijos savybėmis pasižymintį pieną, skaičiaus didėjimo. Taikant selektyvinę

veislininkystę galima pasiekti, kad visų trijų tirtų veislių karvių pienas savo savybėmis tiktų

sūrių gamybai ir taip padidinti gaminamo sūrio išeigas.

Panašias išvadas padarė ir studijos apie karvių pieno koaguliacijos savybių genetinius aspektus

autoriai (Bittante, ir kt., 2012). Jie teigia, kad pieno baltymų genetinių variantų įtaka pieno

koaguliacijos savybėms iš dalies paaiškinama genetinių variantų poveikiu kiekybinei ir

kokybinei pieno baltymų frakcijų sudėčiai.

1.3.7 Pieno koaguliacijos savybių priklausomybė nuo kalcio kiekio

Kazeino micelėje be baltymų yra kalcio ir fosforo (Gaucheron, 2005). Fosforas micelėje gali būti

kaip koloidinio kalcio fosfato dalis (KKF) arba kovalentiniais ryšiais prijungtas prie kazeino kaip

fosfato grupė (fosfo-kazeinas). Fosfato grupės, kurios nedalyvauja vidiniuose KKF junginiuose

labai svarbios formuojant fermentinę sutrauką (antroji fermentinės koaguliacijos fazė),

sudarydama Ca tiltelius tarp parakazeino micelių (Green ir Grandison, 1993). Žinoma, kad

pienas nekoaguliuoja todėl, kad vyksta pokyčiai antrojoje fermentinės sutraukos susidarymo

fazėje, tuo tarpu kai κ-CN hidrolizė buvo nustatyta ir nekoaguliuojančiame piene (Frederiksen ir

kt. 2011). Atlikus tyrimus su individualių Džersių ir Holšteinų veislių karvių pienu, nustatyta,

kad didesnis koloidinio kalcio, fosforo ir magnio kiekis siejasi su geresnėmis pieno koaguliacijos

savybėmis (Jensen ir kt. 2012b). Tačiau šioje studijoje nebuvo analizuota atskirai koloidinio ir

nekoloidinio kalcio įtaka pieno savybėms.

Italijos mokslininkai (Malacarne ir kt., 2013) ištyrę geromis ir blogomis pieno koaguliacijos

savybėmis pasižymintį pieną nustatė, kad geromis koaguliacijos savybėmis pasižymėjo pienas,

kuriame buvo daugiausiai koloidinio kalcio, fosfo-kazeino ir koloidinio magnio. Tuo tarpu

nekoaguliuojančiame piene nustatytos mažiausios šių rodiklių vertės. Tarp gerai koaguliuojančio

ir nekoaguliuojančio pieno mėginių nenustatyta statistiškai patikimų skirtumų, tiriant koloidinio

neorganinio fosforo kiekį. Tačiau didesnis bendras kazeino micelės mineralizacijos laipsnis

teigiamai veikia pieno koaguliacijos savybes.

1.4 Pieno termostabilumo savybės

Termostabilumas tai pieno, grietinėlės, sterilizuotų sutirštintų produktų, koloidinės sistemos

savybės, įgalinčios išlaikyti baltymų stabilumą, esant aukštai temperatūrai, be matomų

19

koaguliacijos požymių. Šiluminė pieno koaguliacija yra laikoma sudėtingu reiškiniu, kuriam

įtakos turi keletas sąveikų ir sąlygų vienu metu. Termostabilumo nebuvimas yra laikomas

technologine problema, kurią būtina spręsti ir kuri dažniausiai pasitaiko, gaminant konservuotus

pieno produktus. Būsimi gaminamo produkto defektai pasireiškia ne tik apdorojant žalią pieną

aukštoje temperatūroje, kuomet jau pastebima per greita pieno baltymų koaguliaciją, bet taip pat

produkto struktūros kitimas sandėliavimo metu, kuris dažniausiai pasireiškia produkto

išsisluoksniavimu, atsiskiriant tam tikram vandens kiekiui produkto paviršiuje.

Netermostabilus pienas šiuo metu tampa gana dideliu iššūkiu pieno perdirbimo įmonėms. Tokio

pieno perdirbimas ne tik paveikia galutinio produkto kokybę, bet yra žalingas ir technologiniuose

procesuose naudojamai įrangai. UAT procese, netermostabilus pienas užteršia šilumokaičius,

suformuodamas nuosėdas, kurios nusėda ant vamzdžių vidinių sienelių. Tokiu atveju, perdirbant

netermostabilų pieną yra rekomenduojama vengti šiluminio apdorojimo UAT. Kalbant apie

gaminamus produktus, kaip technologinė priemonė, esant gamybiniam būtinumui, iš

netermostabilaus pieno galima gaminti raugintus pieno produktus, taikant technologinio proceso

parametrų korekciją – terminio apdorojimo rėžimų švelninimas, žeminant pasterizacijos

temperatūrą ir trumpinant išlaikymo trukmę. Tačiau tokiu atveju produktų tekstūra, nors ir bus

vienalytė, tačiau produktai bus mažesnio klampio (skystesni), o jų sineretinis stabilumas laikymo

metu bus blogesnis. Vis dėl to, rekomenduojama netermostabilų pieną panaudoti rūgštiniu būdu

gaminamos varškės gamybai.

Dėl šių priežasčių mokslininkai ir pieno technologai atlieka nemažai tyrimų, siekiant atrasti ryšį

tarp pieno sudėties savybių ir technologinių procesų, vykstančių produktų gamybos metu.

1.4.1 Pieno termostabilumo nustatymo metodai

Pagal LMaI rekomendacijas pieno perdirbimo įmonėms, pieno termostabilumo nustatymui gali

būti taikomi keli metodai: nustatymas su etilo alkoholiu, panaudojant skirtingas alkoholio

koncentracijas, nustatymas su CaCl2 panaudojant skirtingas tirpalo koncentracijas, ir šiluminio

atsparumo vertinimas, matuojant pieno baltymų terminės koaguliacijos laiką.

Naudojant atsparumo etilo alkoholiui metodą, pienas skirstomas į 5 klases. I ir II klasės pienas

vertinamas kaip tinkamas pieno konservų gamybai, I – III klasės pienas – sterilizuoto pieno

gamybai, o IV ir V klasės pienas vertinamas kaip nešviežias ar nenatūralus, neatsparus

šiluminiam apdorojimui; tokio pieno terminio apdorojimo metu galima pieno baltymų

koaguliacija. Šiluminio atsparumo metodu pienas vertintas pagal baltymų terminio koaguliavimo

trukmę (TKT), min. Metodas nenumato pieno skirstymo į klases pagal šį rodiklį.

Ieškant atsakymo į klausimą, kodėl žalio pieno termostabilumą vertinant skirtingais metodais

gaunami rezultatai ne visada sutampa, reikia panagrinėti šių metodų principus. Pieno alkoholinio

stabilumo metodas įvertina fizinės pieno būklės pasikeitimą – baltymų koaguliaciją, dėl baltymų

denatūracijos, veikiant organiniu tirpikliu – etilo alkoholiu. Koaguliacija (iš lotynų kalbos

„coagulatio“ - krešėjimas, sutirštėjimas) — koloidinio tirpalo (dispersinės sistemos) dalelių

sukibimas į stambesnes, dėl ko susidaro stambesni telkiniai, paprastai iškrentantys į nuosėdas.

Veikiant pieno baltymus etilo alkoholiu jis dehidratuoja baltymų tirpalo koloidines daleles,

įvyksta baltymų denatūracija, kurios metu suyra ketvirtinė, tretinė ir antrinė baltymų struktūra, o

pirminė išlieka nepakitusi. Baltymo molekulėje nelieka nekovalentinių sąveikų tarp atomų ir

funkcinių grupių, o visos molekulės erdvinės struktūros gali lengvai kontaktuoti su tirpiklio

molekulėmis. Baltymų denatūracijos intensyvumas priklauso nuo etilo alkoholio tirpalo

koncentracijos.

Šiluminio atsparumo metodas pagrįstas cheminių reakcijų, vykstančio pieno terminio

apdorojimo metu, pobūdžio bei intensyvumo įvertinimu. Kaitinant pieną vyksta daugelis

tarpusavyje susijusių ir konkuruojančių reakcijų, kurių poveikis technologinėms pieno savybėms

yra skirtingas ir keičiasi priklausomai nuo pieno terminio apdorojimo režimo: kaitinimo

temperatūrai pakylant nuo 63 °C (pasterizavimas žemoje temperatūroje) iki 145 °C

20

(sterilizavimas aukštoje temperatūroje) vykstančių reakcijų intensyvumas skirtingas. Fox savo

straipsnyje apibendrino kaitinimo metu vykstančių reakcijų įtaką baltymų dribsnių susidarymui

piene ir šiuos pokyčius sugrupavo sekančiai: rūgštingumo didėjimas, kalcio fosfato tirpumo

pasikeitimas, Mejero reakcija, kazeino modifikacija bei denatūruotų baltymų –SH grupių sąveika

(Fox, 1981). Keičiantis pieno cheminei sudėčiai, ypač baltymų sudėčiai, šių reakcijų

intensyvumas keičiasi, o tai savo ruožtu gali turėti įtakos pieno termostabilumui (Horne ir Muir,

1990).

Išsamų abiejų pieno terminio stabilumo metodų - alkoholinio ir šiluminio atsparumo -

palyginimą atliko mokslininkai Horne ir Muir (1990). Apibendrindami tyrimų rezultatus

mokslininkai padarė išvadą, kad alkoholinio tyrimo metu papildomai su pienu įmaišomas

atitinkamas alkoholio kiekis, kuris ir sukelia baltymų dribsnių susidarymą. Tuo tarpu šiluminio

atsparumo testo metu, pieno mėginys kaitinamas apibrėžtoje temperatūroje, o kaitinimo procesas

sukelia chemines reakcijas, sąlygojančias pieno sistemos pokyčius. Tokio kaitinimo metu

suaktyvinama visą eilė reakcijų, kurių intensyvumą lemia individualios fizikinės-cheminės pieno

savybės. Mokslininkai daro išvadą, kad abu pieno terminio stabilumo metodai, fiksuodami pieno

būsenos pokyčius, nėra tapatūs.

1.4.2 Pieno sudėties ir savybių įtaka termostabilumui

Pieno pH rodiklis turi didžiausią įtakos pieno termostabilumui (O‘Connell ir Fox, 2003). Pieno

alkoholinio stabilumo bei šiluminio atsparumo priklausomybės nuo pH pobūdis pateiktas 4

paveiksle.

A B

4 paveiklas. A) alkoholinio stabilumo-pH profilis; B) Pieno šiluminio atsparumo – pH

profilis: - A tipo pienas, ---- B tipo pienas (O‘Connell ir Fox, 2003)

Palyginę pieno alkoholinio stabilumo ir šiluminio stabilumo priklausomybės nuo pH tendencijas

matome, kad jei alkoholinis pieno stabilumas tiesiogiai priklauso nuo pieno pH (A), tai žalio

pieno šiluminis atsparumas ir jo priklausomybė nuo pH apsprendžiama pieno tipo (B). A tipo

pienui šiluminis atsparumas, įvertintas terminio koaguliavimo trukme (TKT) labai priklauso nuo

pieno pH. Pasiekus max vertę ties intervalu pH 6,5-6,7, A tipo pieno terminio koaguliavimo

trukmė ženkliai sumažėja ir pasiekia savo minimalią vertę, po kurios jau išlieka tiesioginė TKT

ir pH priklausomybė. Tuo tarpu B tipo pieno terminio koaguliavimo trukmė tiesiogiai priklauso

nuo pieno pH ir didėja didėjant pH reikšmei. Žinoma, kad pieno tipą apsprendžia karvių genetika

ir daugelyje šalių dominuoja A tipo pienas [8].

Sezoniškumo įtaka žalio pieno sudėties pokyčiams ir termostabilumui tyrinėjama jau ilgą laiko

tarpą. Daugelyje mokslinių straipsnių aprašyta, kad žalio pieno sudedamųjų dalių koncentracijos

ir fizikinės – cheminės savybės gali skirtis ištisus metus ir nevienodu mastu. Heck su kolegomis

(2009) teigia, kad mažesnis riebalų ir baltymų kiekis žaliame piene aptinkamas vasaros metu, nei

21

žiemą, ir tokius rodiklius sąlygoja temperatūros pokyčiai bei karvėms duodamų pašarų sudėtis.

Tuo tarpu Faka ir kolegų (2009) tyrimai parodė, kad aukštesnis Ca2+

jonų kiekis ir žemesnis pH

yra susiję su gana prastu lieso pieno miltelių šiluminiu stabilumu ir atvirkščiai. Tokie ir kiti

panašūs pokyčiai, vykstantys per sezoną, turi didelės įtakos žalio pieno perdirbimo įmonėse

gaminamų produktų kokybei.

Didžioji dalis tyrimų rezultatų parodė, kad termostabilumo pokyčius, tam tikrais sezonais, iš

dalies sukelia natūralios urėjos kiekio piene kitimas.

1.5 Pieno biologinė vertė

1.5.1 Pieno vitaminų sudėtis

Vitaminai yra svarbi pieno sudedamoji dalis. Jų kiekis piene nepastovus ir priklauso nuo

daugelio veiksnių, kurių pagrindinai – veislė, karvės fiziologinė būklė, pašarų kokybė ir metų

laikas. Vieni vitaminai į pieną patenka per pašarus, kitus sintetina mikroorganizmai, esantys

galvijo virškinamajame trakte. Svarbu, kad piene yra beveik visi žmogui reikalingi vitaminai.

Riebaluose tirpūs vitaminai yra A, D, E, K. Vitamino A grupei priklauso A1 A2 vitaminai ir

karotenoidai, kurie yra vitamino A provitaminai. Šių vitaminų, perskaičiavus į retinolį, vidutinis

kiekis piene - 40 µg/100g (Walstra, 1999). Vitaminas A lengvai oksiduojasi, ypač šviesoje ir

esant aplinkoje metalų jonams. Pasterizacijos metu vitamino A kiekis gali sumažėti 20-30 %.

Laikant atšaldytą pieną vitamino A kiekis taip pat mažėja.

Vitamino D aktyvumu pasižymi 2 junginiai – ergokalciferolis (vitaminas D2) ir cholekalciferolis

(vitaminas D3). Vitaminų D kiekis piene kinta nuo 0,03 iki 0,15 µg/100g. Šie vitaminai pasižymi

stabilumu. Jų kiekis nekinta pasterizuojant bei sterilizuojant pieną, taip pat laikymo metu.

Vitaminas D atsparus oksidacijai ir šviesos poveikiui.

1.5.2 Pieno baltymų biologinė vertė

Maisto baltymai, peptidai ir aminorūgštys atlieka daug fiziologinių funkcijų, tokių kaip baltymų

sintezė organizme, dalyvauja virškinimo sistemos veiklos palaikyme bei metabolizmo

procesuose, ACE inhibitorinėmis savybėmis apsižymintis baltyminės kilmės junginiai reikalingi

normaliam kraujospūdžiui palaikyti ir kt. (Devle ir kt., 2012). Pagal mitybos specialistų

rekomendacijas baltymai turi sudaryti apie 30 % dienos raciono. Baltymų biologinė vertė

nustatoma analizuojant ne tik nepakeičiamų aminorūgščių kiekį atpalaiduojamą dėl proteolizės

virškinimo metu, bet ir biologiškai aktyvių peptidų susidarymą. Pagal šias savybes galima

prognozuoti baltymų pasisavinamumą. Bioaktyvių peptidų fiziologinis poveikis pasireiškia jiems

patekus į kraują pro žarnų epitelio sieneles. Atliekama daug tyrimų, siekiant ištirti bioaktyvių

peptidų susidarymo ir veikimo sistemas, nuo kurių priklauso maisto baltymų biologinė kokybė.

Pieno baltymų virškinamumas

Žmogaus virškinamajame trakte maisto produktų skaidymas iki monomerų vyksta keliais

etapais. Burnoje produktas pirmiausia apdorojamas mechaniškai, t.y. sukramtomas, padidinamas

paviršiaus plotas. Seilių liaukų išskiriami fermentai maltazė ir amilazė pradeda krakmolo

skaidymą, čia pH 7,5–8. Skrandyje pradedamas baltymų virškinimas, susidaro peptidai,

aminorūgštys. Pagrindinis proteolitinis fermentas – pepsinas. Šis fermentas aktyvus tik rūgščioje

terpėje (skrandžio pH 2,0±0,2, kurį nulemia esančios druskos rūgšties koncentracija). Virškinimo

skrandyje metu baltymai nesuskaidomi iki galo. Baltymai visiškai hidrolizuojami žarnyne,

veikiant pankreatino peptidazėms, tripsinui, chimotripsinui. Kasos išskiriamose sultyse yra

lipazės, kuri skaido tulžies druskų emulguotus riebalus iki glicerolio ir riebiųjų rūgščių, maltazės,

22

suskaidančios krakmolo amilolitinio skilimo produktus iki gliukozės ir proteolitinio fermento

tripsino. Mažamolekulius junginius organizmas pasisavina pro žarnų sieneles (Petrauskas, 2005).

Maisto produktų virškinamumui tirti naudojami įvairūs in vitro modeliai. Dažniausiai taikomas

virškinamumo tyrimas statinėje in vitro sistemoje, naudojant dirbtines arba natūralias žmogaus

virškinamojo trakto sultis. Mėginiai imami tam tikrais laiko intervalais ir analizuojami. Metodas

leidžia įvertinti skirtumus tarp substratų virškinamumo, virškinimo produktų pasisavinamumo ir

naudingumo bei kt. Sistemos parametrai, fermentai, jų aktyvumai ir elektrolitai parenkami tokie,

kad gauta visuma būtų kuo artimesnė fiziologiniam procesui, pavyzdžiui peristaltiniai

virškinamojo trakto judesiai imituojami mėginį maišant, eksperimentų metu palaikoma

temperatūra artima žmogaus vidinei temperatūrai – 37 ºC (Delve ir kt., 2012).

Maisto produktai, turintys tokią pačią cheminę sudėtį gali turėti skirtingą struktūrą bei maistinę

vertę. Žinios apie maisto komponentų fizikinį elgesį virškinimo metu leidžia ištobulinti produktų

apdorojimo metodus taip, jog individo organizmas pasisavintų maksimalų kiekį naudingų

medžiagų per optimalų laiką.

Baltymai visiškai hidrolizuojami žarnyne, kuriame terpės pH7, veikiant pankreatino

peptidazėms, tripsinui, chimotripsinui. Pieno baltymų hidrolizės produktai – aminorūgštys ir

peptidai naudingi ne tik mitybiniu atžvilgiu, bet ir dėl bioaktyvių peptidų, kurie žmogaus

organizmu turi teigiamą biofunkcinę naudą (3 lentelė). 6-8 aminorūgščių ilgio peptidų grandinės

dažnai atsparios tolimesnei hidrolizei ir gali būti pasisavintos per žarnų epitelio sieneles

(Mohanty ir kt., 2016, Koph-Bolanz ir kt., 2014).

Atlikta daug tyrimų, kuriuose analizuojama tam tikrų pieno produktų virškinamumas. Žinoma,

jog skirtingi rezultatai gaunami tiriant skirtingo riebumo pieną virškinamumą (Phelan ir kt.,

2009). Pieno produktų virškinimui įtakos turi substratų mikrostruktūra, todėl baltymų proteolizė

vyksta skirtingai lyginant skystus ir pusiau skystus produktus (Rinaldi ir kt., 2014). Baltymų

virškinimo dinamika taip pat priklauso nuo kazeino ir išrūgų baltymų santykio (Rioux ir

Turgeon, 2014). Barbe ir kt. (2014) atliko tyrimą, kuriame tyrė iš to paties pieno pagamintų

skirtingų sutraukų virškinamumo skirtumus (ta pati cheminė sudėtis ir panašios reologinės

savybės) – baltymų proteolizę ir aminorūgščių absorbciją. Rezultatai parodė, jog virškinimo

skirtumai yra labai akivaizdūs. Fermentinė sutrauka virškinama lėčiau, iš jos atpalaiduojama

mažiau aminorūgščių, nei iš rūgštinės sutraukos.

Bioaktyvūs peptidai

Žmogaus mitybai baltymų hidrolizės produktai svarbūs ne tik kaip mitybinių elementų šaltinis,

bet ir kaip bioaktyvūs junginiai arba prekursoriai. Peptidų aktyvumas priklauso nuo jiems

būdingų aminorūgščių sudėties ir sekos. Būdingas bioaktyvių peptidų aminorūgščių sekos ilgis

yra nuo 3 iki 20. Maži peptidai (2–3 a.r. ilgio) greičiau absorbuojami, per žarnyno membranas

juos perneša aktyvios pernašos sistemos. Didesni virškinimo metu susidarantys peptidai taip pat

gali būti pernešti pro membranas esant tam tikroms aplinkybėms, pavyzdžiui uždegiminėms

ligoms. Po virškinimo atpalaiduoti tiek dipeptidai, tripeptidai, tiek kazeinomakropeptidas (64 a.r.

grandinė, 8000 Da) randami žmogaus kraujo plazmoje, serume, piene (Nongonierma ir Fitzerald,

2015).

Bioaktyvūs peptidai naudingi ligų, ypač neužkrečiamų, tokių kai nutukimas, diabetas, vėžys

prevencijai. Žinomos jų funkcijos pateiktos 3 lentelėje (Mohanty, 2016).

23

3 lentelė. Iš pieno baltymų gaunamų bioaktyvių peptidų funkcijos (Mohanty, 2016)

Funkcija Peptidų grupė

Virškinimo sistemos gerinimas Antimikrobiniai

Imunomoduliatoriai

Opioidai

Širdies ir kraujotakos sistemos gerinimas ACE inhibitoriai (ACE - angiotensiną

konvertuojantys fermentai)

Antitrombotiniai

Anti cholesteroliniai

Anti hipertenziniai

Imuninė apsauga Imunomodulaitoriai

Citomoduliatoriai

Nervų sistemos stiprinimas Opioidai

Kaulų sveikata Kalcį surišantys peptidai

Laktoferinas

Svorio reguliavimas Sotumą sukeliantis glikomakropeptidas

Opioidai

Bioaktyvūs peptidai iš pieno baltymų gali būti gauti tokiais būdais: pieno fermentacija

proteolitinėmis startinėmis kultūromis, proteolitiniais mikrobiologinės ar augalinės kilmės

fermentais arba fermentine hidrolize virškinimo fermentais (Phelan, 2009).

Nustatyta, jog kazeino virškinimo imitavimo metu gaunamas panašus fosfopeptidų profilis kaip

ir po kazeino hidrolizės tripsinu. Fosfopeptidai tampa sąlyginai atsparūs tolimesnei hidrolizei,

manoma, jog jie apsaugo metalų jonus nuo nusėdimo šarminėje terpėje žarnyne, todėl yra

naudingi mineralinių medžiagų pasisavinimui. Daugiausia fosfopeptidų gaunama iš αs1–kazeino

frakcijos 43–59, 45–55, 59–79, 66–74, 60–74, 106–119, β–kazeino frakcijos 1–25, 30–50, 1–28,

αs2–kazeino 2–21, 56–70, 55–75, 126–136, 138–149 a.r. sekų regionų (Cruz-Huerta ir kt., 2015,

Adt ir kt., 2011).

Pastaraisiais metais atlikta nemažai tyrimų kuriuose nustatyti ir rūgštinio gelio produktų

virškinimo metu susidarantys peptidai (jogurto) (Maeno ir kt., 1996, Jin ir kt., 2016) bei iš

fermentiniu būdu traukinto pieno pagamintų sūrių virškinimo metu susidariusių bioaktyvių

junginių profiliai bei savybės: ACE inhibitoriai (β–kazeino 108–113, 114–121, 177–183, 193–

202, 193–198 a.r. sekos fragmentai, αs1–kazeino frakcijos 90–94, 143–149 a.r. sekos fragmentai,

αs2–kazeino 89–95 a.r. sekos fragmentas) (Stuknyte ir kt., 2015, Sofia ir kt., 2005, Contreras ir

kt., 2009), opioidai β–kazomorfinai (β–kazeino 60–66 a.r. sekos fragmentas) (De Noni ir kt.,

2015) bei jų antagonistai (αs1–kazeino frakcijos 90–95, 90–96, 91–95 a.r. sekos fragmentai, κ–

kazeino – 35–41, 58–61, 25–34, 158–164 a.r. sekos fragmentai), antioksidacinėmis savybėmis

pasižymintys peptidai (β–kazeino 1–25 a.r. sekos fragmentas) (Pepe ir kt., 2013, Phelan ir kt.,

2009). Antimikrobinėmis savybėmis pasižymi iš κ–kazeino atskeliami peptidai (106–116, 106–

112, 113–116, 103–111 a.r. sekos fragmentai).

24

1.6 Apibendrinimas ir tyrimo uždavinių pagrindimas

Žalio pieno technologinės savybės svarbios tiek pieno gamintojams, tiek pieno perdirbėjams.

Kaip parodė literatūros apžvalgoje surinkti duomenys dažnos žalio pieno technologinio

perdirbamumo problemos, su kuriomis susiduria pieno perdirbėjai, tai – netermostabilus pienas ir

nekoaguliuojantis pienas. Pirmuoju atveju pienas negali būti termiškai apdorotas aukštoje

temperatūroje, t.y. iš jo negalima pagaminti pieno konservų, UAT geriamojo pieno. Be to

netermostabilus pienas užteršia šilumokaičius, suformuodamas nuosėdas, kurios nusėda ant

vamzdžių vidinių sienelių ir taip patiriamos papildomos išlaidos įrengimų higienai bei remontui.

Nekoaguliuojantis arba blogai koaguliuojantis pienas – sūrių bei raugintų produktų gamintojų

problema. Dėl tokio pieno mažėja sūrių išeigos, prastėja raugintų pieno produktų kokybė.

Netermostabilaus pieno priežastys:

Pieno pH – A tipo pieno termostabilumas didžiausias, esant pH 6,6, o B tipo pieno

termostabumumas didėja, didėjant pH.

Didelė sezono įtaka pieno termostabilumui, kuri paaiškinama pieno sudėties pokyčiais,

priklausomai nuo metų laiko, šėrimo sąlygų. Didžioji dalis tyrimų rezultatų parodė, kad

termostabilumo pokyčius, tam tikrais sezonais, iš dalies sukelia natūralios urėjos kiekio

piene kitimas.

Prieinamoje literatūroje nepavyko rasti duomenų apie karvių veislės įtaką pieno

termostabilumui.

Pieno termostabilumas priklauso nuo pieno baltymų genetinių variantų. β-LG A variantas

sąlygoja didesnį pieno terminį stabilumą, lyginant su β-LG B variantu.

Yra netiesioginė pieno baltymų frakcijų kiekio įtaka termostabilumui. Padidėjus arba

bendram κ-CN kiekiui, arba jo santykiniam kiekiui bendrame baltymų kiekyje, piene

sumažėja absoliutiniai arba santykiniai kiekiai αs1-CN ir αs2-CN frakcijų, todėl keičiasi

pieno pH iki vertės, kuri yra palanki geram pieno termostabilumui.

Blogų pieno koaguliacijos savybių priežastys:

Nustatyta karvių veislės, laktacijos stadijos, karvių sveikatos įtaka pieno koaguliacijos

savybėms.

Nėra tiesioginės priklausomybės tarp karvių laikymo sąlygų, šėrimo raciono,

primelžiamo pieno kiekio ir pieno koaguliacijos savybių.

Stipri priklausomybė tarp pieno baltymų kokybinės sudėties ir pieno koaguliacijos

savybių.

Pieno baltymų genetinių variantų įtaka pieno koaguliacijos savybėms iš dalies

paaiškinama genetinių variantų poveikiu kiekybinei ir kokybinei pieno baltymų frakcijų

sudėčiai.

Genetinių veiksnių tiesioginės ir netiesioginės įtakos pieno koaguliacijos savybėms

schema pateikta 5 paveiksle.

25

5 paveikslas. Tiesioginė ir netiesioginė genetikos įtaka pieno koaguliacijos savybėms (pagal

Bittante ir kt., 2012).

Atsižvelgiant į literatūros apžvalgos duomenis apie įvairių veiksnių įtaką pieno technologinėms

savybėms buvo iškeltas darbo tikslas – nustatyti Lietuvos juodmargių galvijų pieno baltymų

frakcijų kiekybinę sudėtį bei jos įtaką pieno technologinėms savybėms, siekiant išaiškinti tokio

pieno tikslingą panaudojimą aukščiausios kokybės pieno produktų gamybai.

Darbo tikslui pasiekti suformuluoti uždaviniai:

1. Ištirti Lietuvos juodmargių galvijų pieno sudėties komponentus, nuo kurių priklauso pieno

produktų kokybė, išeiga ir biologinė vertė: kazeino ir atskirų jo frakcijų kiekis, kalcio, vitamino

D kiekis.

2. Ištirti Lietuvos juodmargių galvijų pieno technologines savybes, susieti jas su pieno baltymų

frakcijų sudėties tyrimų rezultatais, siekiant išsiaiškinti pieno išskirtinumą tam tikrų pieno

produktų gamybai.

3. Įvertinti genetinių veiksnių įtaką Lietuvos juodmargių galvijų pieno baltymų frakcijų

kokybinei sudėčiai bei pieno technologinėms savybėms.

4. Parengti rekomendacijas pieno gamintojams bei perdirbėjams dėl pieno tikslinės atrankos tam

tikrų pieno produktų gamybai.

26

2. Tyrimo objektai ir metodai

2.1. Pieno mėginių surinkimas

Tyrimas atliekamas dviem etapais: 1) 2015 m. lapkritis – 2016 m. kovas mėn.; 2) 2016 m.

balandžio – 2017 m. balandžio mėn.

Tyrimui naudoti individualių karvių pieno mėginiai.

Pirmojo etapo metu pieno mėginiai buvo renkami Alytaus rajone iš šešių ūkių, kuriuose

auginamos Lietuvos juodmargės karvės. Surinkta 225 pieno mėginių iš 45 karvių. Vidutinis

pieno mėginių ėmimo dažnis – 1 kartą per mėnesį.

Antrojo etapo metu pieno mėginiai buvo renkami Alytaus rajone iš 5 ūkiuose auginamų

juodmargių veislės karvių. Tyrimui buvo atrinkta 50 karvių, kurios sugrupuotos į 4 grupes pagal

holšteinizacijos laipsnį (4 lentelė).

4 lentelė. Karvių grupavimas pagal holšteinizacijos laipsnį

Grupės

Nr.

Karvių veislė Holšteinizacijos laipsnis Vnt.

I Senojo genotipo Lietuvos juodmargiai SG-H <50 20

II Lietuvos juodmargiai + Holšteinai H = 50÷69 10

III Lietuvos juodmargiai + Holšteinai H = 70÷79 10

IV Lietuvos juodmargiai + Holšteinai H = 80÷90 10

Atliktų tyrimų apimtis pateikta 5 lentelėje. Vidutinis pieno mėginių ėmimo dažnis – 1 kartą per

mėnesį. Iš viso surinkta ir ištirta 550 pieno mėginių.

5 lentelė. Tyrimų apimtis – periodas: 2016 m. balandžio - 2017 m. balandžio mėn.

Karvių grupės pagal holšteinizacijos

laipsnį

0-49

SG-I

50-69

II

70-79

III

80-90

IV

Viso

Tirtų karvių skaičius 20 10 10 10 50

Tirtų mėginių skaičius 220 110 110 110 550

2.2. Pieno mėginių paruošimas cheminės sudėties bei technologinių savybių analizei ir

tyrimo organizavimas

Ryte pamelžto pieno mėginiai atšaldomi iki +4 oC temperatūros ir padalinami į dvi dalis. Į vieną

dalį pieno įdedama konservanto „Broad Spectrum Microtabs“ (Advanced Instruments, Inc; Masačusetsas, JAV) ir ji vežama į VĮ „Pieno tyrimai“. Į kitą dalį pieno konservanto nededami,

pienas vežamas į KTU Maisto mokslo ir technologijos katedrą.

VĮ „Pieno tyrimai“ nustatomi šie pieno mėginių sudėties ir kokybės rodikliai: baltymų kiekis,

riebalų kiekis, laktozės kiekis, urėjos kiekis, somatinių ląstelių kiekis.

KTU Maisto mokslo ir technologijos katedroje nustatomi šie pieno mėginių sudėties, kokybės ir

technologinių savybių rodikliai: pieno baltymų kokybinė sudėtis - β-LG, αs1-CN, αs2-CN, β-

CN, κ-CN, kalcio kiekis, vitaminų A ir D kiekiai, pH, fermentinės koaguliacijos savybės,

rūgštinės koaguliacijos savybės, termostabilumas, buferiškumas.

2.3.Tyrimo metodai

2.3.1. Pieno sudėties nustatymo metodai

Baltymų, riebalų, laktozės ir urėjos kiekio nustatymas

Šių pieno sudedamųjų dalių kiekiai nustatomi iš to paties pieno mėginio. Prieš tyrimą pieno

mėginiai pašildomi vandens vonelėje iki 40oC ir pavartomi, kad vienodai pasiskirstytų riebalai.

27

Riebalų, baltymų ir laktozės kiekiai nustatomi rutininiu metodu infraraudonųjų spindulių

prietaisu Lactoscopu „LactoScope FTIR” (FT 1.0. 2001; Delta Instruments, Olandija). Tiriant

matuojama kiekvieno komponento (riebalų, baltymų, laktozės) vidutinių infraraudonųjų

spindulių specifinio bangų ilgio absorbcija. Pagal sugertos energijos kiekį ir yra skaičiuojamas

šių pieno sudedamųjų dalių kiekis (LST ISO 9622:2000).

Kalcio kiekio nustatymas

Kalcio kiekis piene buvo nustatytas atominės absorbcinės spektrinės analizės metodu. Analizė

atlikta Perkin Elmer AAnalyst 400 spektrometru. Kalcio atomizacijai panaudota liepsna, gauta

deginant acetileno ir oro mišinį (C2H2 – 2,7 l/min, oras – 10 l/min). Elektromagnetinės

spinduliuotės šaltinis – tuščiavidurio katodo kalcio lempa, kurios spinduliuotės absorbcija

nesužadintais kalcio atomais buvo matuojama esant 422,67 nm bangos ilgiui.

Kalcio koncentrcija mėginiuose buvo nustatoma gradavimo grafiko metodu, paruošiant 0,5-2

mg/l etaloninius kalcio tirpalus ir išmatuojant jų optinį tankį. Standartiniu tirpalu buvo naudotas

Jenway 1000 ppm kalcio tirpalas.

Pieno mėginiai buvo ruošiami 100 ml matavimo kolbose, įpilant po 100 µl kambario

temperatūros pieno ir praskiedžiant iki matavimo ribos. Kiekvieną kartą ruošiant mėginius įpilta

100 µl pieno dozė buvo pasveriama, kad tiksliai sužinoti jos masę, reikalingą kalcio kiekiui

perskaičiuoti į mg/100 g. Kad liepsnoje nesusidarytų kalcio ir fosforo junginiai ir nesumažėtų

kalcio signalo intensyvumas, ruošiant pieno mėginius buvo pridedamas 10 ml 1% koncentracijos

lantano priedas. Analogiškas lantano priedas buvo naudotas ir ruošiant etaloninius bei lyginamąjį

tirpalus.

Vitamino D3 kiekio nustatymas

Standartinių vitaminų tirpalų paruošimas. Vitamino D2 ir D3 standartiniai etanoliniai tirpalai

ruošti pagal ISO 14892:2002 standartą1, koncentracija 20 mg/100 ml. Iš standartinių tirpalų,

atitinkamai atskiedus etanoliu, gaminti darbiniai tirpalai, kurių koncentracija 2 ir 0,02 mg/100

ml. Taip pat paruoštas D2 ir D3 mišinio etaloninis tirpalas, kuriame kiekvieno vitamino

koncentracija yra 0,02mg/100ml.

Mėginio paruošimas. 2-3 g tiriamo mėginio sumaišyta su 0,2g askorbo rūgšties, trupučiu

pirogalolo, 4 ml KOH, 8 ml etanolio ir 1 ml standartinio D2 vitamino tirpalo. 2 min leidžiama

azoto srovė ir paliekama hidrolizei per naktį kambario temperatūroje pastoviai maišant tamsoje.

Kitą dieną ekstrahuojama 9 ml H2O ir 10 ml heksano. Surenkamas viršutinis sluoksnis

išgarinimui, o apatinis dar du kartus ekstrahuojamas 10 ml heksano. Po išgarinimo gautas sausas

likutis tirpintas 1 ml mobilios fazės (95 proc. metanolio/5 proc. H2O), nufiltruotas per 0,45µm

porų dydžio membraninį filtrą ir analizuotas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

Efektyvioji skysčių chromatografija: naudota Shimadzu Prominence chromatografinė įranga

(Shimadzu Corp., Japonija) su diodų matricos detektoriumi ir automatiniu mėginių įvedimo

įrenginiu, LC Solutions programinė įranga, kolonėlė YMC-Pack ODS-A (porų dydis 5 μm,

150×4 mm, YMC Co). Nustatytas bangos ilgis 265 nm, kolonėlės temperatūra 40 o

C, judrioji

fazė sudaryta iš 95 % metanolio ir 5 % vandens, tekėjimo greitis 1 ml/min. Injekcijos tūris 50 μl.

Kiekybiškai vitaminas D3 apskaičiuotas pagal vidinį D2 standartą.

Vitamino A kiekio nustatymas

Vitaminas A mėginiuose nustatytas pagal LST EN 12823-1 standartą2. Mėginiai ruošti taip pat

kaip vitamino D3 tyrimui, chromatograma registruota esant 325 nm bangos ilgiui kartu su

1 ISO 14892:2002 Dried skimmed milk – Determination of Vitamin D content using high-performance

liquid chromatography. 2 LST EN 12823-1 Maisto produktai. Vitamino A nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos

metodu. 1 dalis. Visai trans-retinolio nustatymas.

28

vitamino D analize. Vitamino A kiekis apskaičiuotas pagal išorinio visai trans-retinolio standarto

smailės plotą.

2.3.2. Kazeino frakcijų kokybinės sudėties nustatymo metodas

Standartinių tirpalų paruošimas. Kiekvienos kazeino frakcijos etaloninis standartinis tirpalas

paruoštas ištirpinus 250 mg αs-kazeino standarto (grynumas 70%), 250 mg β- kazeino (grynumas

98%) ir 100 mg κ- kazeino (grynumas 70%) 10 ml denatūruojančio buferio, susidedančio iš 8 M

šlapalo, 165 mM Tris buferio, 44 mM natrio citrato ir 0,3 % (v/v) β-merkaptoetanolio. Bendras

visų kazeino frakcijų standartinis tirpalas paruoštas sumaišius po 1 ml kiekvieno koncentruoto

standartinio etaloninio tirpalo ir 2 ml denatūruojančio buferio. Šiame etape kiekvienos kazeino

frakcijos skiedimo koeficientas lygus 5. Po to šį gautą standartinį tirpalą maišant su

denatūruojančiu buferiu pagal 6 lentelėje pateiktą schemą, gauti keturi įvairių koncentracijų

tirpalai αs1-, αs2-, β-, κ-kazeino gradavimo grafikų sudarymui. Kadangi αs1- ir αs2- atskirų

standartų nėra galimybės įsigyti, jų koncentracija apskaičiuota iš αs koncentracijos, priimant kad

karvių pienui jų santykis yra 4:1 (Bonizzi ir kt., 2009).

Pieno mėginių paruošimas. Pienas nucentrifuguotas 5000 aps/min, 20 min, 4 °C temperatūroje,

atskirti riebalai ir gautas liesas pienas sandariuose polipropileno indeliuose saugotas -20 ºC

temperatūroje iki analizės. Analizės dieną mėginiai atšildyti ir 400 μl pieno sumaišyta su 1,6 ml

denatūruojančio buferio. Skiesti mėginiai perfiltruoti per 0,45µm porų dydžio celiuliozės

membraninį filtrą ir analizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

6 lentelė. Kazeino frakcijų etaloninių tirpalų paruošimo schema ir koncentracijos

Standartas Skiedimo schema Frakcijų koncentracija, g/l

Standartinis

tirpalas, ml

Buferinis

tirpalas, ml

κ-CN β-CN αs-CN αs1-CN αs2-CN

1 0,4 1,6 0,28 0,98 0,70 0,56 0,14

2 0,8 1,2 0,56 1,96 1,40 1,12 0,28

3 1,2 0,8 0,84 2,94 2,10 1,68 0,42

4 1,6 0,4 1,12 3,92 2,80 2,24 0,56

Efektyvioji skysčių chromatografija: naudota Shimadzu Prominence chromatografinė įranga

(Shimadzu Corp., Japonija) su diodų matricos detektoriumi ir automatiniu mėginių įvedimo

įrenginiu, LC Solutions programinė įranga, atvirkščių fazių kolonėlė Vydac 218TP C18 (porų

dydis 5μm 300A, 250x4,6mm, Grace Alltech, JAV). Nustatytas bangos ilgis 220 nm, kolonėlės

temperatūra 35 o

C, tekėjimo greitis 1 ml/min. Judriosios fazės binarinis gradientas sudarytas iš

eliuento A 0,1 % trifluoracto rūgšties vandenyje ir eliuento B 0,07 % trifluoracto rūgšties

acetonitrile. Gradiento programa: 0 – 5 min izokratinė elioucija 4 % B, 5 – 15 min linijinis

gradientas B nuo 4 iki 25 %, 15 – 29 min linijinis gradientas B nuo 25 iki 45 %, 29 – 32 min

linijinis gradientas B nuo 45 iki 90 %, 32 – 35 min izokratinė eliucija 90 % B, 35 – 40 min

linijinis gradientas į pradines sąlygas 4 % B. Injekcijos tūris 20 μl. Kiekybiškai kazeino frakcijos

apskaičiuotos remiantis gradavimo grafikais.

2.3.3. Pieno kokybės nustatymo metodai

Somatinių ląstelių skaičiaus nustatymas

Tyrimas atliekamas naudojant matuoklį Somascope, dirbantį srauto citometrijos principu.

pH nustatymas

Pieno aktyvusis rūgštingumas matuotas WTW Inolab pH 720 (Gemini BV Laboratory,

Netherlands) pH‑metru.

29

2.3.4. Pieno technologinių savybių nustatymas

Termostabilumo nustatymas

Termostabilumui nustatyti naudojamas šiluminio atsparumo metodas. Glicerinu užpildytas

termostatas įjungiamas ir įkaitinamas iki (140 ± 1) °C temperatūros. Kai termostate pasiekiama

reikiama temperatūra pienu užpildyti (apie 10 ml) mėgintuvėliai, gerai užsuktais kamšteliais,

atsargiai panardinami į įkaitusį gliceriną ir įjungiamas sekundmatis. Kas 3 min mėgintuvėliai

ištraukiami ir stebima baltymų koaguliacija. Po 10 min mėginių kaitinimo, mėgintuvėliuose

esantis pienas analizuojamas kas 1 min. Mėgintuvėliai su pienu negali būti ištraukiami iš

termostato ilgiau kaip 0,5 min. Pastebėjus baltymų koaguliaciją (baltymų dribsnius), fiksuojamas

laikas, kuris ir yra pieno termostabilumo rodiklis.

Buferiškumo nustatymas

Pieno buferiškumo nustatymui imama 25 ml pieno ir pH-metru išmatuojamas pieno aktyvusis

rūgštingumas pH. Po to į pieną įpilama 4 ml 0,1 M HCl tirpalo. Pienas išmaišomas ir laikomas

kambario temperatūroje. Po 1 h išmatuojamas pieno pH. Išmatuotas pH skirtumas prieš valandą

ir po 1 valandos atitinka pieno pH kritimą kaitinant pieną nuo 20 °C iki 120 °C.

Fermentinės koaguliacijos savybės

Pieno mėginiai atvėsinami iki 4 °C temperatūros ir po 50 ml supilami į centrifugavimo

mėgintuvėlius. Centrifuguojama 5000 aps/min. greičiu, 20 min, 4 °C temperatūroje. Po

centrifugavimo nuimamas išsiskyręs grietinėlės sluoksnis ir likęs liesas kaitinamas 60 °C

temperatūroje 30 min. Po kaitinimo pienas atvėsinamas iki 4–6 °C temperatūros. Atvėsę pieno

mėginiai toliau analizuojami kitą dieną. Liesas pienas pašildomas iki 30 °C temperatūros ir

laikomas 10 min. Į pašildytą mėginį įdedama šviežiai paruošto fermento chimozino. tirpalas

paruoštas taip, kad į pieno mėginį jo būtų įdedama 0.04 IMCU/1 ml pieno. Išmaišytas mėginys

supilamas į reometro analizavimo cilindrą. Matavimai buvo atlikti Physica MCR 301 (Anton

Paar, Messtechnik, Vokietija) reometru naudojant cilindras–cilindras geometrinę sistemą

(vidinio cilindro skersmuo – 25 mm). Reologinių rodiklių matavimo sąlygos: analizės trukmė –

60 min; temperatūra 30 °C; dažnis – 1 Hz; deformacija – 0,003. Reologiniai rodikliai – klampos

bei elastingumo moduliai G‘ ir G“, nustatomi kas 1 min. Fermentinės koaguliacijos trukmė

(FKT) fiksuojama, kai G‘=G“. Fermentinės sutraukos stiprumas nustatomas kaip G‘ vertė

praėjus 40 min po fermento įdėjimo į pieną.

Rūgštinės koaguliacijos savybės

Pieno mėginiai atvėsinami iki 4 °C temperatūros ir po 50 ml supilami į centrifugavimo

mėgintuvėlius. Centrifuguojama 5000 aps/min, 20 min, 4 °C temperatūroje. Po centrifugavimo

nuimamas išsiskyręs grietinėlės sluoksnis ir likęs liesas kaitinamas 95 °C temperatūroje 5 min.

Po kaitinimo pienas atvėsinamas iki 4 – 6 °C temperatūros. Atvėsę pieno mėginiai toliau

analizuojami kitą dieną. Liesas pienas pašildomas iki 30 °C temperatūros ir laikomas 10 min. Į

pašildytą mėginį įdedama 3 % atsverto glukono-delta-laktono (GDL), išmaišoma. Išmaišytas

mėginys supilamas į reometro analizavimo cilindrą. Matavimai buvo atlikti Anton Paar Physica

MCR 301 (Austrija) reometru naudojant cilindras-cilindras geometrinę sistemą (vidinio cilindro

skersmuo – 25 mm). Reologinių rodiklių matavimo sąlygos: analizės trukmė – 60 min;

temperatūra 30 °C; dažnis – 1 Hz; deformacija – 0,003. Reologiniai rodikliai – klampos bei

elastingumo moduliai G‘ ir G“, nustatomi kas 1 min. Rūgštinės koaguliacijos trukmė (RKT)

identifikuojama, kai G‘=G‘‘. Rūgštinės sutraukos stiprumas nustatomas kaip G‘ vertė praėjus 40

min po fermento įdėjimo į pieną.

2.4. Statistinė duomenų analizė

Visi matavimai atlikti tris kartus. Rezultatai pateikti kaip trijų matavimų vidurkiai su

apskaičiuotu standartiniu nuokrypiu. Sezoniškumo įtaka pieno sudėties ir technologiniams

rodikliams bei koreliacijos tarp jų apskaičiuotos naudojant SAS 9.4 statistinį paketą.

30

Sezoniškumo įtaka, apskaičiuota naudojant Mano-Vitnio-Vilkoksono sumų kriterijų palyginimo

metodą, laikyta reikšminga kai P<0,05.

2.5. Pieno mėginių paruošimas pieno baltymų virškinamumo analizei ir tyrimo

organizavimas

Eksperimentui atrinktas geromis koaguliavimo savybėmis ir dideliu κ–kazeino kiekiu

pasižymintis Lietuvos senojo genotipo juodmargės karvės pienas bei palyginimui paimtas

Holšteino veislės juodmargės karvės pienas, pasižymintis analogiškomis savybėmis. Tolesniems

tyrimams naudoto pieno sudėtis pateikta 7 lentelėje (pavasario ir vasaros sezonų duomenys).

7 lentelė. Rūgštinės ir fermentinės koaguliacijos sutraukų gamybai atrinkto pieno duomenys

Rodikliai

Lietuvos senojo genotipo

juodmargės karvės pienas

Holšteinio veislės juodmargės

karvės pienas

Vidurkis SD Vidurkis SD

FKT, min. 16,40 3,13 16,80 4,32

G‘F40, Pa 65,25 12,26 70,16 10,84

RKT, min. 23,50 2,89 24,1 3,52

G‘R40, Pa 70,35 9,15 69,17 11,53

Kazeino

frakcijos,

g/l

κ 2,92 0,41 3,07 0,34

αS2 1,79 0,24 1,63 0,43

α S1 7,92 0,72 7,17 0,45

β 18,36 1,90 17,73 1,36

bendras kiekis 31,00 3,02 29,61 2,28

Ca, mg/100g pieno 124,16 3,32 105,76 6,74

Iš šio pieno imituojant pramonėje vykstančius procesus pagaminta po dvi rūgštinės ir

fermentinės koaguliacijos sutraukas. Jose nustatyti sausų medžiagų ir baltymų kiekiai, naudojant

standartinius metodus. Likę sutraukų mėginiai užšaldyti -20 °C iki baltymų virškinamumo

tyrimų. Tolesniems tyrimams naudotų pieno sutraukų sudėtis pateikta 8 lentelėje.

8 lentelė. Rūgštinės ir fermentinės sutraukos mėginių sudėties rodikliai

Rodiklis

Rūgštinė sutrauka iš: Fermentinė sutrauka iš:

Lietuvos senojo

genotipo

juodmargės

karvės pieno

Holšteino veislės

juodmargės

karvės pieno

Lietuvos senojo

genotipo

juodmargės

karvės pieno

Holšteino

veislėsjuodmargės

karvės pieno

Drėgmė, % 66,93 67,00 59,36 59,47

Baltymai, % 13,98 14,54 13,75 14,40

Baltymai

sausojoje

medžiagoje, %

42,26 44,07 33,84 35,53

Fermentinės koaguliacijos sutraukos gamyba

Fermentinės koaguliacijos sutrauka gaminta į 1,0 l kiekvienos karvės pieno įdėjus pienarūgščių

bakterijų, inkubuota 30 °C temperatūroje apie 2 val. (pH–6,5), tada įdėtas reikiamas kiekis

fermento. Praėjus 30 min. nuo fermento įdėjimo pradžios pieno gelis buvo visiškai susidaręs.

Siekiant atskirti išrūgas sutrauka buvo pjaustyta 35 °C temperatūroje 35 min., susiformavę

varškės grūdeliai supilti į sūrmaišį ir palikti išrūgų nuvarvėjimui 1,5 val.

Rūgštinės koaguliacijos sutraukos gamyba

Rūgštinės koaguliacijos sutrauka gaminta į 1,0 l kiekvienos karvės pieno įdėjus reikiamą kiekį

mezofilinio raugo. Inkubuota 28 °C temperatūroje. Praėjus 14 val. nuo pienarūgščių bakterijų

31

įdėjimo pradžios pieno gelis buvo visiškai susidaręs (pH–4,5). Siekiant atskirti išrūgas sutrauka

buvo pjaustyta keliant temperatūra nuo 28 °C iki 55 °C per 1,5 val., susiformavę varškės

grūdeliai supilti į sūrmaišį ir palikti išrūgų nuvarvėjimui 1,5 val.

Lietuvos senojo genotipo juodmargės karvės pieno ir iš Holšteino veislės karvės pieno

pagamintų fermentinės bei rūgštinės sutraukų virškinamumo tyrimų in vitro metodu mėginių

schema pateikta 6 paveiksle.

6 paveikslas. Iš Lietuvos senojo genotipo juodmargės karvės pieno ir iš Holšteino veislės karvės

pieno pagamintų fermentinės bei rūgštinės sutraukų virškinamumo in vitro metodu mėginių

schema (oranžine spalva pažymėti mėginiai, kurių tyrimai atlikti Arhuso universitete).

Virškinamumo imitavimo in vitro procesas, fluoresamininis aminorūgščių ir peptidų nustatymas

bei baltymų proteolizės produktų kokybinė analizė SDS-PAGE metodu atlikti Lietuvoje. Peptidų

identifikavimas SCh-ESI-MS/MS metodu atliktas Danijoje, Arhuso universitete, Maisto mokslo

departamente, cheminės analizės laboratorijoje (FOOD) (Aarhus University, Campus Foulum,

Blichers Alle20, 8830 Tjele, Denmark).

Pienas

Holšteino veislės karvės (HV)

Rūgštinės sutraukos (R) vandenyje tirpus

ekstraktas (4)

Po 30 min. virškinimo skrandyje (S1) (4-1)

Po 1 val. virškinimo skrandyje (S2) (4-2)

Po 2 val. virškinimo skrandyje (S3) (4-3)

Po 30 min. virškinimo žarnyne (Ž1) (4-4)

Po 1 val. virškinimo žarnyne (Ž2) (4-5)

Po 2 val. virškinimo žarnyne (Ž3) (4-6)

Fermenitnės sutraukos (F)

vandenyje tirpus ekstraktas (VTE) (3)

Po 2 val. virškinimo skrandyje (S3) (3-3)

Po 30 min .virškinimo žarnyne (Ž1) (3-4)

Po 1 val. virškinimo žarnyne (Ž2) (3-5)

Po 2 val. virškinimo žarnyne (Ž3) (3-6)

Po 30 min. virškinimo skrandyje (S1) (3-1)

Po 1 val. virškinimo skrandyje (S2) (3-2)

Lietuvos senojo genotipo juodmargių veislės karvės

(LV)

Rūgštinės sutraukos (R) vandenyje tirpus ekstraktas (VTE) (2)

Po 30 min. virškinimo skrandyje (S1) (2-1)

Po 1 val. virškinimo skrandyje (S2) (2-2)

Po 2 val. virškinimo skrandyje (S3) (2-3)

Po 30 min. virškinimo žarnyne (Ž1) (2-4)

Po 1 val. virškinimo žarnyne (Ž2) (2-5)

Po 2 val. virškinimo žarnyne (Ž3) (2-6)

Fermentinės sutraukos (F)

vandenyje tirpus ekstraktas (VTE) (1)

Po 30 min. virškinimo skrandyje (S1) (1-1)

Po 1 val. virškinimo skrandyje (S2) (1-2)

Po 2 val. virškinimo skrandyje (S3) (1-3)

Po 30 min .virškinimo žarnyne (Ž1) (1-4)

Po 1 val. virškinimo žarnyne (Ž2) (1-5)

Po 2 val. virškinimo žarnyne (Ž3) (1-6)

32

2.6. Pieno baltymų virškinamumo tyrimas in vitro metodu

Dirbtinių skrandžio ir žarnų sulčių paruošimas

Kiekvieno individo fermentų aktyvumas burnos, skrandžio ar žarnyno sekretuose skiriasi, todėl

tyrėjai eksperimentuose taip pat naudoja įvairios sudėties dirbtines virškinimo sultis. Šiame

darbe dirbtinėms sultimis pagaminti naudojami tokie fermentų kiekiai, kad jų proteolitinis ir

lipolitinis aktyvumai atitiktų vidutines natūralių sulčių aktyvumų reikšmes, nustatytas ankstesnių

tyrimų metu, naudojant in vitro modelius su natūraliomis žmonių virškinimo sultimis

(Malinauskytė ir kt., 2014). Dirbtinių sulčių cheminė sudėtis pateikta 9 lentelėje.

9 lentelė. Virškinimo tirpalų sudėtis bei jų fermentų aktyvumas (pagal Malinauskytė ir kt., 2014)

DSST (Dirbtinės skrandžio

sultys)

DPŽST (Dirbtinės plonosios žarnos

sultys)

Fermentai ir

pagrindiniai

komponentai

6,9 g pepsino 1,36 g pankreatino

10,8 g tulžies druskų

Fiziologinio skysčio

komponentai

2 g NaCl

7 ml HCl

H2O

174,2 ml 0,9 % NaCl

82,6 ml 0,15 M HCl

17,4 ml 2,0 M HCl

400,7 ml 0,15 M

NaHCO3

280 ml d. H2O

H2O

Kiekis 1000 ml 1000 ml

pH 2 7

Proteolitinis

aktyvumas 36±0,5 U/ml 17±0,2 U/ml

Lipazės aktyvumas - 800±0,9 U/ml

DSST gaminimas: 2 g natrio ir 7 ml druskos rūgšties ištirpinta 1 litre distiliuoto vandens ir

pridėta 6,9 g pepsino. pH koreguotas iki 2, naudojant 2,0 M HCl. Pagamintas DSST laikytas

4 °C temperatūroje. Tokio tirpalo proteolitinis aktyvumas 36±0,5U/ml.

DPŽST gaminimas: sumaišyta 174,22 ml 0,9 % NaCl, 82,58 ml 0,15 M HCl, 17,42 ml 2,0 M

HCl, 400,7 ml 0,15 M Na2HCO3, 278,75 ml H2O ir pridėta 1,36 g pankreatino bei 10,8 g tulžies

rūgščių druskų. pH koreguotas iki pH 7, naudojant 4,0 M NaOH, vandens pripilta iki 1 l. DPŽST

proteolitinis aktyvumas 17±0,2 U/ml, lipazės aktyvumas 800±0,9 U/ml.

Švieži DSST ir DPŽST tirpalai buvo ruošti kiekvieną kartą prieš pradedant sutraukų virškinimo

procesą.

Vandenyje tirpūs fermentinės ir rūgštinės sutraukų vandenyje tirpūs ekstraktai (VTE) paruošti

remiantis Adt ir kt. (2011) 6 g varškės homogenizuota su 12ml vandens 10 min. kambario

temperatūroje. VTE gautas nucentrifugavus (4 °C temp., 5000g, 20 min.) homogenizatą.

Fermentinės ir rūgštinės sutraukų virškinimas atliktas in vitro remiantis Ming-Fang ir kt. (2014)

aprašyta metodika. Virškinimo proceso trukmė – 4 val. 2 val. imituojamas virškinimas

skrandyje, likusias 2 val. – žarnyne. Mėginiai imami praėjus 30 min., 60 min., 120 min. (S1, S2,

S3 atitinkamai) po virškinimo skrandyje bei po 30 min., 60 min., 120 min. (Ž1, Ž2, Ž3

atitinkamai) po virškinimo žarnyne (6, 7 pav.).

33

7 paveikslas. Virškinimo imitavimo in vitro metodu schema

In vitro virškinimo imitavimo procesas atliktas mėgintuvėlius su substratu ir dirbtinėmis

virškinimo sultimis bei 1,00±0,05 g stiklinių rutuliukų (maišymo elementai) patalpinus vandens

vonioje su purtykle (GFL 1092, Vokietija), kurioje palaikoma 37 ºC temperatūra, purtoma 100

aps/min greičiu. Procesas imituojamas palaikant 1:2 substrato:fermento tirpalo santykį skrandžio

fazėje bei 1:4 žarnyno fazėje. Imitacinio substrato kąsnio dydis – 6,00±0,02g, viršinimo sulčių

(DSST) kiekis pradžioje 8 ml, po 1 val. įpilta dar 4 ml (imituojamas skrandžio sulčių dinaminis

išsiskyrimas žmogaus virškinimo sistemoje). Virškinimo skrandyje metu mėginių pH 2–3.

Virškinimas žarnyne imituotas į mėginius po 2 val. virškinimo skrandyje įpylus po 12 ml

dirbtinių žarnų sulčių (DPŽST), pH 6–7.

Mėginiuose fermentų veikla nutraukta nedelsiant neutralizuojant NaOH/HCl iki pH 7 ir atšaldant

iki 4 ˚C temperatūros. Nesuvirškintos medžiagos pašalintos mėginius nucentrifugavus (4 ˚C,

5000 g, 20 min.). Supernantai užšaldyti iki tolimesnių proteolizės greitį ir dydį leidžiančių

įvertinti rodiklių nustatymo, t.y. laisvų aminorūgščių ir peptidų kiekio nustatymo fluoresaminiu

metodu bei baltymų proteolizės produktų kokybinės analizės SDS–PAGE metodu. Mėginiai,

kurie buvo vežami į FOOD laboratoriją prieš užšaldymą papildomai centrifuguoti 10K filtrais

(Milipore, Cork, Ireland) (8 pav.). Tokiu būdu iš sistemos pašalinti fermentai ir užtikrintas

biocheminių reakcijų sustabdymas.

8 paveikslas. Mėginių paruošimas analizei FOOD laboratorijoje (Arhuso universitete)

2.7. Pieno baltymų virškinamumo įvertinimui naudoti analizės metodai

Fluoresamininis aminorūgščių ir peptidų nustatymas

Į virškinimo sultis išsiskyrusių baltymų hidrolizės produktų kiekybinė analizė atlikta pagal Zhao

ir kt. (2017) aprašytą metodiką atliekant fluoresamininį aminorūgščių ir peptidų nustatymą.

Metodo esmė – fluoresaminas (fluramas) dedamas į mėginį kuriame jungiasi su laisvų

aminorūgščių ir peptidų pirminėmis amino grupėmis sudarydamas fluorescuojantį junginį.

34

75 μl virškinamo mėginio centrifugato sumaišyta su 75 μl 24 % trichloracto rūgšties (24 g

TCA/100 ml vandens) ir laikyta ledo vonelėje 30 min., kol nusėdo baltymai. Nusodintas mišinys

centrifuguotas 4800 rpm 20 min. 4 ˚C temperatūroje. Supernantai buvo praskiesti 1mM HCl

tirpalu (skrandžio fazės mėginių skiedimas 1:50, žarnyno – 1:100). 30 μl skiesto mėginio

sumaišyta su 900 μl 0,1 M borato buferio (pH 8) ir 300 μl fluramo tirpalo (0,2 mg fluramo

bevandeniame acetone). 250 μl mėginio pilta į baltos nepermatomos matavimo lėkštelės (Costar

3912) šulinėlius. Analizė buvo atlikta praėjus 40 min. nuo fluramo tirpalo įpylimo pradžios

lėkštelę patalpinus į spektrofluorometrinį skaitytuvą (FLUOstar Omega reader BMG Labtech,

Offenburg, Germany), (eksitacija 355 nm, emisija 460 nm). Kiekybinė analizė buvo atlikta

naudojant Leu standartinę kreivę iš 0,1 M Leu tirpalo (32,75 mg Leu ištirpinta 25 ml 1 mM HCl)

paruošiant 6 skirtingų koncentracijų (0,5 – 3 mM) tirpalus, kurie buvo analizuoti lygiai taip pat

kaip virškinimo mėginiai. Laisvų aminorūgščių ir peptidų pirminių amino grupių kiekis

išreiškiamas mMol Leu ekvivalentais.

Baltymų hidrolizės produktų kokybinė analizė elektroforezės metodu

Į virškinimo sultis išsiskyrusių baltymų hidrolizės produktų kokybinė analizė buvo atlikta

elektroforezės metodu skirstant junginius natrio dodecilsulfato (SDS) poliakrilamido gelyje

(PAGE). Mėginiai buvo praskiesti iki 0,7 mg/ml koncentracijos su ličio dodecilsulfato (LDS)

buferiu. Paruošti mėginiai buvo centrifuguoti 15 s. 13400 rpm greičiu ir pakaitinti 70 °C temp.

10 min. Atvėsinti mėginiai buvo dar kartą centrifuguoti ir patalpinti į NuPAGE 4–12 % Bis-Tris

elektroforezės mini gelio (Invitrogen, Kalifornija, JAV) šulinėlius (5 µg). Elektroforezė buvo

vykdyta naudojant XCell II Mini-Cell (Novex, Kalifornija, JAV) sistemą, užpildytą MOPS SDS

buferiniu tirpalu, esant 200 V įtampai, srovei pirmas 30 min esant 70mA, likusias 30 min. –

40 mA iki kol dažo linija pasiekia frakcionuojančio gelio apačią.

Gelis buvo nudažytas poliakrilamido gelio dažu 0,1 % Coomassie briliantinis mėlis R-250 (2 %

konc. fosforo r., 15 % amonio sulfato, 17 % etanolio, 0,1 % Coomassie briliantinio mėlio) 25°C

temp. nuolat purtant 12 val. Po nudažymo gelis buvo blukintas ultrafiltruotame vandenyje 1–

1,5 val. ir nufotografuotas.

Peptidų identifikavimas SCh-ESI-MS/MS metodu

Peptidų profilio analizė atlikta pagal metodą aprašytą Le ir kt.

(2016). Peptidų analizė atlikta mėginiams prieš virškinimą (VTE), po 2 val virškinimo skrandyje

(S3) ir po 2 val virškinimo žarnyne (Ž3) imitavimo bei liofilizuotam pienui iš kurio buvo

pagamintos pieno sutraukos. VTE, S3 ir Ž3 mėginiai paruošti tam tikrą kiekį (teorinė baltymų

koncentracija prieš virškinimą – 20mg/ml) skiedžiant su 40mM TEAB tirpalu iki 100μl.

Mėginiai redukuoti įpilant 20μl DTE tirpalo (20mg ištirpinta 1 ml 40 mM TEAB) ir inkubuojant

60 ˚C temperatūroje 10min. Kambario temperatūroje atvėsinti mėginiai alkilinti įpilant 20 μl IA

(50 mg ištirpinta 1 ml 40mM TEAB), inkubuojant 37˚C temperatūroje tamsoje. Kambario

temperatūroje atvėsinti mėginiai parūgštinti iki pH 2–3 su 20 μl 10 % skruzdžių rūgšties. Pieno

mėginiai paruošti rehidratuojant liofilizuotus pieno miltus (10 % pieno miltelių vandenyje). 40 μl

rehidratuoto pieno atskiesta su 160 μl 40 mM TEAB, redukavimo bei alkilinimo procedūros

atliktos identiškai kaip virškinimo mėginiams, vietoj 20 μl agentų įpylus po 10 μl. 3 μl 10 %

skruzdžių rūgšties įpilta nusodinti kazeinui (pH ne mažiau kaip 4,6). Nuosėdos pašalintos

centrifuguojant, 15 000 g 10 ˚C 10 min. Visi mėginiai centrifuguoti (14 000g, 4 ˚C, 10 min.)

filtravimo mėgintuvėliuose (Milipore, Cork, Ireland), tokiu būdu pašalinti didesni nei 3 kDa

baltymų fragmentai. Paruošti mėginiai užšaldyti ir laikyti iki analizės -20 ˚C temperatūroje.

Mėginiai analizuoti naudojant Aeris peptidų kolonėlę C18 (250 mm x 21 mm, dalelių dydis 3,6

μm), (Phenomenex, Torrance, CA, USA) Agilent 1200 serijos skysčių chromatografu, kuris

35

tiesiogiai sujungtas su HCT jonų gaudykle (Bruker Daltonics, DE). Analizei naudoti eliuentai –

tirpiklis A (0,1 % skruzdžių rūgštis) bei tirpiklis B (90 % acetonitrilo, 0,1 % skruzdžių rūgštis).

Jų gradiento programa: 0–40 % B pirmas 80 min. ir išauga iki 80 % per sekančias 15 min.,

tėkmės greitis 200 μl/min. Mėginio analizės trukmė 110 min, injekcijos tūris – 5μl. Masių

spektrometras skenavo junginius kurių m/z (molinė masė padalinta iš peptido krūvio) buvo nuo

250 iki 1800, MS/MS – nuo 100 iki 1200 m/z. MS/MS. Spektrų analizavimui naudotos

DataAnalysis (4,0 versija) ir Biotools ( 3,1 versija) programos (Brucer Daltonic, Bremen, DE)

bei Mascot (Matrix Science, MA, US) duomenų bazė. Peptidų paieškos ir identifikavimo

kriterijai: Bos Taurus, jokių modifikacijų ir fermentų skaldymo specifikacijų, oksiduotų ir

fosforilintų formų atpažinimas. Identifikuoti peptidai kiekvienai kazeino frakcijai atskirai,

junginiai kurių atitikimo baltymo aminorūgščių sekai balas pakankamas (P<0,05) priimti kaip

teigiamas rezultatas automatiškai, kitų peptidų spektrai analizuoti ir atrinkti rankiniu būdu.

2.8. Raugintų pieno gėrimų eksperimentinės gamybos ir tyrimo organizavimas

Eksperimentui naudotas 2017 m. vasario ir kovo mėn. surinktas 17 skirtingo holšteinizacijos

laipsnio juodmargių karvių pienas, kurio sudėtis pateikta 10 lentelėje. Taip pat pagal aukščiau

aprašytą metodiką nustatytos visų 10 lentelėje išvardintų pieno mėginių rūgštinės koaguliacijos

savybės.

10 lentelė. 2017 m. vasario ir kovo mėn. surinkto skirtingo holšteinizacijos laipsnio judmargių

karvių pieno sudėtis

Holšteini

zacijos

laipsnis

Karvės Nr.

Pieno sudėtis

Baltymai, % Riebalai, % Laktozė, % Urėja, mg/ %

vasario

mėn.

kovo

mėn.

vasario

mėn.

kovo

mėn.

vasario

mėn.

kovo

mėn.

vasario

mėn.

kovo

mėn.

0-49

7536-10 3,45 3,43 5,07 5,59 4,34 4,51 6,0 25,0

7095-19 3,12 3,19 4,04 3,91 4,09 4,15 2,0 9,0

0520-20 3,33 3,82 4,56 6,46 4,58 4,42 11,0 17,0

0771-21 3,52 3,52 3,93 4,67 4,27 4,22 6,0 23,0

7033-21 4,05 4,00 4,97 5,34 4,34 4,37 5,0 12,0

6270-23 3,14 3,18 3,30 3,38 4,57 4,55 7,0 10,0

7495-31 3,16 3,34 2,60 4,40 4,46 4,43 0,0 6,0

50-69

9473-59 5,19 5,17 5,45 5,55 4,04 4,56 14,0 9,0

4612-62 3,62 3,96 4,92 5,28 4,23 4,21 4,0 13,0

9052-64 3,62 3,80 5,64 5,33 4,58 4,47 15,0 15,0

2294-68 4,13 4,15 5,72 6,08 4,38 4,35 17,0 22,0

70-79

2634-70 3,63 3,61 5,42 5,54 4,48 4,55 4,0 17,0

3371-75 4,28 4,22 4,28 4,28 3,51 3,58 9,0 21,0

8065-80 3,68 3,70 3,78 4,39 4,56 4,36 5,0 4,0

80-90

4648-84 4,65 4,67 4,72 4,68 4,25 4,35 4,0 12,0

0543-85 4,47 4,42 4,85 4,81 4,58 4,62 16,0 10,0

7524-89 4,68 4,66 4,76 5,12 4,41 4,47 4,0 17,0

Iš kiekvieno pieno mėginio imituojant pramonėje vykstančius procesus pagamintas raugintas

pienas ir jogurtas. Gaminant raugintą pieną, pieno rauginimui buvo naudojamas Chr. Hansen

FLORA DANICA (Danija) liofilizuotas mezofilinis raugas, kurį sudaro Lactococcus lactis

subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris. Gaminant

jogurtą pieno rauginimui buvo naudojamas Chr. Hansen FLORA DANICA (Danija) liofilizuotas

termofilinis raugas, kurį sudaro Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus ir Streptococcus

thermophilus. Įvertintos šių produktų kokybės savybės: pH, sinerezė ir reologinės

caharkteristikos. Produktų kokybė įvertinta praėjus po pagaminimo 1 parai ir 10 paroms,

produktus laikant 6 oC temperatūroje.

36

Rauginto pieno ir jogurto reologinių charakteristikų nustatymas

Raugintų pieno gėrimų reologines caharkteristikas įvertinome užrašydami poslinkio įtempio

priklausomybės nuo deformacijos greičio kreives, gautas Physica MCR 301 (Anton Paar,

Messtechnik, Vokietija), naudojant cilindras-cilindre geometrijos sistemą, esant 20C

temperatūrai. Deformacijos greitis 5 min didintas nuo 0 iki 500 s-1

ir iš karto mažintas nuo 500

iki 0 s-1

.

Eksperimentinės tekėjimo kreivės buvo palygintos su su Oswald de Waele modelio lygtimi:

,nK

čia: - šlyties įtempis (Pa); – deformacijos greitis (s-1

); K – konsistencijos koeficientas, kuris

yra klampos rodiklis; n – tekėjimo indeksas, kuris yra nuokrypio nuo niutoniniams skysčiams

būdingų savybių rodiklis.

Rauginto pieno ir jogurto sinerezės nustatymas

Raugintų pieno gėrimų sinerezė nustatyta kaip išsiskyrusių išrūgų kiekis (procentais) 40 g

mėginio supylus į piltuvą padengtą filtro popieriumi ir įstatytą į graduotą matavimo cilindrą. Šio

tyrimo metu buvo fiksuojama kiek ml išrūgų išsiskiria iš mėginio iš pradžių kas 2 min, o nuo 20

min – kas 5 min. Matavimas baigiamas po 70 min.

2.9. Sūrių eksperimentinės gamybos ir tyrimo organizavimas

Eksperimentui naudotas 2017 m. birželio mėn. surinktas juodmargių karvių pienas, kuris

pasižymėjo geromis fermentinės koaguliacijos savybėmis. Buvo sudaryti du pieno mėginiai

(po10 litrų): 1 – iš senojo genotipo juodmargių karvių pieno ir 2 – iš holšteinizuotų juodmargių

karvių pieno. Pieno mėginių sudėtis ir duomenys apie jų fermentinės koaguliacijos savybes

pateikta 11 lentelėje.

11 lentelė. Sūrių gamybai naudotų pieno mėginių sudėtis ir fermentinės koaguliacijos savybės.

Pieno

mėginys

Titruo-

jamas

rūgštin-

gumas, oT

Pieno sudėtis, % Fermentinės

koaguliacijos

savybės

Sausųjų

medžiagų

kiekis

Riebalų

kiekis

Baltymų

kiekis

Kazeino

kiekis

Nebalty-

minio

azoto

kiekis

FKT,

min

G‘, Pa

Senojo

genotipo

juodmargių

karvių

20,7±0,0 13,4±0,1 4,55±0,05 3,24±0,1 2,62±0,04 0,027±

0,002

16,00 24,00

Holšteino

juodmargių

karvių

20,6±0,1 12,22±0,05 3,5±0,0 3,29±0,1 2,52±0,01 0,024±

0,001

14,00 55,00

Iš abiejų žalio pieno mėginių buvo gaminamas Goudos tipo fermentinis sūris, naudojant KTU

Maisto mokslo ir technologijų kompetencijos centro sūrių gamybos įrangą pagal toliau aprašytą

technologinį procesą.

Kiekvienas žalio pieno mėginys (po10 litrų) buvo supiltas į sūrių gamintuvą, kuriame buvo

pasterizuojamas 75 oC temperatūroje 3 min. Po pasterizacijos pienas buvo atvėsinamas iki 32

oC

37

temperatūros ir į jį įdedma 2 g sauso mezofilinių pienarūgščių kultūrų raugo CHN-19 (Chr.

Hansen, Danija), susidedančio iš Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp.

lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris ir Lactococcus lactis subsp. diacetylactis.

Praėjus 30 – 40 min nuo užraugimo pradžios, kai pieno pH sumažėja 0,1 dalimi, įpilamas renino

fermentas (Hansen sticks, CHR Hansen, Danija), kuris paruošiamas 10 ml H2O i6tirpinant

0,18 gfermento, ir mišinys gerai išmaišomas 5-6 min. Traukinama 31-32 °C temperatūroje iki

sutraukos susidarymo. Nustačius traukinimo pabaigą, kai susidaro pakankamai kieta fermentinė

sutrauka, ji supjaustoma per 15 min. Nupilama apie 30 proc. išsiskyrusių išrūgų. Siekiant

intensyvesnio išrūgų išsiskyrimo, supjaustyta sutrauka šildoma, palaipsniui per 40 min keliant

jos temepratūrą iki 40 oC. Sutvirtėję ir apdžiūvę sūrio grūdeliai supilami į sūrdrobę ir palaikomi

10-15 min, kol išsiskiria išrūgos. Gauta sūrio grūdelių masė padalinama po 300-320 g į 3 dalis ir

sudedama į sūrių presavimo formas su tinkliniais įdėklais. Sūrių formos presuojamos 5 h

kambario temperatūroje, naudojant 3 bar slėgį ir kas valandą apverčiant sūrio galvą sūrio

formoje, siekiant vienodo sūrio galvos suslėgimo. Paskui iš formų išimti sūriai sūdomi sūryme

(20% NaCl) 10 oC temperatūroje 5 h. Išimti iš sūrymo sūriai brandinami klimo kameroje, kurioje

palaikoma 15 oC temperatūra ir 80 % drėgnumas 60 parų. Per pirmasias 2savaites sūrių galvos

buvo vartomos kas 1-3 dienas. Praėjus 30 parų nuo brandinimo pradžios, sūrių galvos buvo

vakuumuotos plastikinėje plėvelėje. Po brandinimo sūriai pasverti, atlikta jų cheminė analizė ir

apsaičiuota sūrių gamybos išeiga.

Pieno ir sūrių sudėties nustatymas bei sūrių išeigos apskaičiavimas

Pieno mėginiai analizei buvo imami iš sūrių gamintuvo prieš pasterizaciją. Sūrio cheminė analizė

atlikta po brandinimo. Pieno titruojamasis rūgštingumas nustatytas pagal Žalio pieno pirminių

kokybės rodiklių įvertinimo instrukciją (2006). Pieno sausųjų medžiagų kiekis nustatytas pagal

LST IDF 21B:1996 standartą3, riebalų kiekis – pagal LST ISO 2446:2008 standartą

4. Pieno ir

sūrio bendras baltymų kiekis, kazeino kiekis ir nebaltyminio azoto kiekis – pagal LST EN ISO

8968-1:2014 standartą5. Sūrio sausųjų medžiagų kiekis nustatytas pagal LST EN ISO

5534:2005/P:20076.

Taip pat pagal aukščiau aprašytą metodiką nustatytos visų 11 lentelėje išvardintų pieno mėginių

fermentinės koaguliacijos savybės.

Sūrių išeiga apskaičiuota pagal formules:

𝐼š(𝑔

100𝑔 𝑝𝑖𝑒𝑛𝑜) =

𝑠ū𝑟𝑖𝑜 𝑚𝑎𝑠ė (𝑔) × 100

𝑝𝑖𝑒𝑛𝑜 𝑚𝑎𝑠ė (𝑔)

𝐼š(𝑠ū𝑟𝑖𝑜 𝑠. 𝑚.

100𝑔 𝑝𝑖𝑒𝑛𝑜) =

𝑠ū𝑟𝑖𝑜 𝑠. 𝑚. 𝑚𝑎𝑠ė (𝑔) × 100

𝑝𝑖𝑒𝑛𝑜 𝑚𝑎𝑠ė (𝑔)

𝐼š(𝑠ū𝑟𝑖𝑜 𝑏𝑎𝑙𝑡.

100𝑔 𝑝𝑖𝑒𝑛𝑜 𝑏𝑎𝑙𝑡.) =

𝑠ū𝑟𝑖𝑜 𝑏𝑎𝑙𝑡𝑦𝑚ų 𝑚𝑎𝑠ė (𝑔) × 100

𝑝𝑖𝑒𝑛𝑜 𝑏𝑎𝑙𝑡𝑦𝑚ų 𝑚𝑎𝑠ė (𝑔)

Sūrių išeigų skaičiavimai atlikti, apskaičiavus trijų sūrių gamybų rezultatų vidurkius.

3 LST IDF 21B:1996. Pienas, grietinėlė ir sutirštintas pienas. Bendrojo sausųjų medžiagų kiekio nustatymas

(pamatinis metodas). 4 LST ISO 2446:2008. Pienas. Riebalų kiekio nustatymas.

5 LST EN ISO 8968-1:2014. Pienas ir pieno gaminiai. Azoto kiekio nustatymas. 1 dalis. Kjeldalio principas ir žalio

baltymo skaičiavimas. 6 LST EN ISO 5534:2005/P:2007. Sūris ir lydytas sūris. Visuminio sausųjų medžiagų kiekio nustatymas (pamatinis

metodas)

38

3. Rezultatai ir jų aptarimas

3.1. Juodmargių karvių pieno sudėtis priklausomai nuo galvijų holšteinizacijos laipsnio

Pagal projekte numatytą darbo planą duomenys apie juodmargių karvių pieno sudėtį ir

technologines savybes buvo surinkti per periodą nuo 2016 m. balandžio mėn. iki 2017 m.

balandžio mėn.

12 lentelėje pateikta žalio pieno cheminė sudėtis atskirose juodmargių karvių grupėse,

suskirstytose pagal holšteinizacijos laipsnį. Pagal riebalų kiekį senojo genotipo juodmargių

pienas statistiškai reikšmingai (p<0,05) skyrėsi nuo juodmargių su įvairiu holšteinizacijos

laipsniu pieno ir buvo mažiausias – 4,65±1,10 %. Didžiausias riebalų kiekis – 5,12±1,05 %,

nustatytas piene juodmargių, kurių holšteinizacijos laipsnis buvo 80-90 %. Galima pastebėti, kad

didėjant galvijų holšteinizacijos laipsniui, riebalų kiekis jų piene didėjo.

12 lentelė. Analizuojamų pieno mėginių pieno sudėties vidutinės reikšmės tirtose grupėse pagal

juodmargių karvių holšteinizacijos laipsnį

Juodmargių

karvių

holšteinizacijos

laipsnis

Pieno sudėties rodikliai

Riebalai, % Baltymai, % Laktozė, % Urėja, mg/%* Ca, mg/100g

0-49

min 1,74 2,69 3,27 13,00 100,27 max 7,96 6,15 5,00 40,00 168,05

vidurkis 4,68a 3,57

a 4,37ab 21,82

a 116,58a

SD 1,10 0,47 0,20 6.61 13,55

50-69

min 1,64 2,61 3,20 13,00 99,55 max 7,75 5,19 4,79 35,00 175,80

vidurkis 4,75ab 3,61

a 4,34a 21,26

a 118,71a

SD 1,28 0,44 0,24 5,88 13,31

70-79

min 2,82 2,79 3,20 13,00 99,76 max 8,45 6,26 4,68 40,00 157,60

vidurkis 4,83ab

3,65a 4,29

a 20,76

a 117,43

a

SD 1,07 0,62 0,29 7,21 12,98

80-90

min 2,61 2,88 3,82 13,00 100,90 max 8,03 5,92 4,89 40,00 158,60

vidurkis 5,12b 3,58

a 4,42b 22,73

a 115,32a

SD 1,05 0,44 0,17 8,36 10,48 * baltymų apykaita organizme normali, kai urėjos piene randama 15÷30 mg%, todėl urėjos kiekis mažesnis nei 13

mg/% ir didesnis nei 40 mg/% į rezultatus neįtraukti.

Analizuojant pieno baltymų kiekį juodmargių karvių grupėse, suskirstytose pagal

holšteinizacijos laipsnį, statistiškai reikšmingų skirtumų nepavyko nustatyti. Mažiausiai baltymų

buvo nustatyta senojo genotipo juodmargių karvių grupėje ir grupėje, kurios holšteinizacijos

laipsnis buvo 80 – 90 %, atitinkamai 3,57±0,47 % ir 3,58±0,44 %. Daugiausiai baltymų -

3,65±0,62 % buvo juodmargių karvių, kurių holšteinizacijos laipsnis 70 - 79%, piene.

Analizuojant 12 lentelės duomenis matome, kad didėjant juodmargių holšteinizacijos laipsniui

laktozės kiekis jų piene keitėsi netolygiai. Vidutinis laktozės kiekis nustatytas senojo genotipo

juodmargių piene buvo 4,37±0,20 %, o didžiausias – labiausiai holšteinizuotų karvių piene, t.y.

4,42±0,17 %. Analizuojant urėjos kiekį juodmargių piene, matome, kad didėjant holšteinizacijos

laipsniui karvių grupėse iki 80 %, urėjos kiekis nežymiai mažėjo ir jo vidurkiai svyravo siaurose

ribose nuo 20,76 iki 21,82 mg%. Tačiau 80-90 % holšteinizuotų karvių grupėje urėjos kiekis

didesnis – 22,73±8,36 mg%.

39

Ca vidutinis kiekis juodmargių karvių grupėse, suskirstytose pagal holšteinizacijos laipsnį

svyravo nuo 115,32±10,48 iki 118,71±13,31 mg/100g, ir juodmargių holšteinizacijos įtakos šiam

rodikliui nebuvo nustatyta. Nagrinėjant šį pieno sudėties rodiklį visose galvijų grupėse

pastebėtas Ca kiekio svyravimas labai plačiuose intervaluose. Senojo genotipo juodmargių

pienui šis intervalas buvo 100,27 – 168,05 mg/100g, o juodmargių karvių grupėje, kurios

holšteinizacijos laipsnis buvo 80 – 90 %, atitinkamai 100,90 – 158,60 mg/100g.

Gauti duomenys apie juodmargių pieno sudėtį priklausomai nuo galvijų holšteinizacijos laipsnio

skiriasi nuo anksčiau skelbtų duomenų apie Lietuvos juodmargių pieno sudėtį. 2007 m. LSMU

Veterinarijos akademijoje atliktame tyrime nustatyta, kad geriausias pieno riebumas (4,73 %)

buvo, kai juodmargių karvių holšteinizacijos laipsnis buvo 62-73%, o daugiausiai baltymų –

3,2% nustatyta senojo genotipo juodmargių piene. Autorė teigia, kad didėjant holšteinizacijos

laipsniui bandoje, mažėjo pieno baltymingumas, tačiau šis ryšys nebuvo statistiškai patikimas

(Kačinskaitė-Žuvaitienė, 2007).

Kito tyrimo metu, įvertinus kraujo (genų) laipsnio įtaką Lietuvos pieninių galvijų populiacijos

karvių produktyvumui, pieno sudėčiai, eksterjerui, ilgaamžiškumui nustatyta, kad karvių

produktyvumo didėjimas su holšteinizacijos laipsnio kitimu nėra tolygus. Nuo 75 proc. iki 87,5

proc. holšteinizacijos laipsnio pastebimas karvių produktyvumo mažėjimas vidutiniškai po 114

kg pieno per 305 dienų laktaciją, lyginant su 62,5-75 proc. holšteinizacijos laipsnio karvių

produktyvumu. Pieno riebalų ir baltymų produkcijos kitimui, priklausomai nuo karvių

holšteinizacijos laipsnio nustatytos analogiškos tendencijos.

Nustatytas Ca kiekis piene panašus į kitų autorių skelbtus duomenis apie kalcio kiekį Holšteino

veislės karvių piene. Švedijos mokslininkai nustatė, kad Holšteino veislės karvių piene, kuris

pasižymėjo geromis koaguliacijos savybėmis, Ca kiekis buvo 127,14 mg%, blogomis

koaguliacinėmis savybėmis - 112,02 mg%, o piene, kuris nekoaguliavo, kalcio kiekis buvo

106,23 mg% (Jensen ir kt., 2012). Taigi, pagal mūsų duomenis apie Ca kiekį, galima

prognozuoti, kad visose juodmargių grupėse, nepriklausomai nuo holšenizacijos laipsnio, gali

būti pieno su įvairiomis koaguliacijos savybėmis.

3.2. Juodmargių karvių pieno sudėtis priklausomai nuo sezono

Tai, kad pieno cheminė sudėtis priklauso nuo sezono, yra nustatę tiek Lietuvos, tiek užsienio

tyrėjai. Šias priklausomybes neabejotinai lemia pašarų sudėties pokyčiai, kai vasaros metu

galvijų šėrimo racioną didžiaja dalimi sudaro žolė ir jie ganomi lauke. Kai kurie karvių pieno

sudėties pokyčiai sezono metu yra gerai ištyrinėti ir lengvai numanomi. Analizuojant VĮ Pieno

tyrimai 1998 – 2015 m.m. periodo duomenis apie Lietuvos karvių pieno sudėtį, matome, kad

pavasario-vasaros sezonais pieno riebalų kiekis mažesnis, lyginant su rudens-žiemos sezonais, o

didžiausias baltymų kiekis būdingas rudens sezono pienui (http://tau.pieno-

tyrimai.lt/statistika/plsql/statLenteles.analize). Tačiau nežiūrint bendrų tendencijų, absoliutinės

pieno sudėties rodiklių reikšmės skirtingais metais ir ypatingai nustatant individualių karvių

pieno sudėties rodiklius, yra skirtingos. Todėl išlieka aktualūs individualių karvių pieno sudėties

tyrimai, priklausomai nuo galvijų veisliės, sezono ir kitų veiksnių.

13 lentelėje pateikta Lietuvos juodmargių karvių žalio pieno cheminė sudėtis atskirose pieno

mėginių grupėse, suskirstytose pagal sezoną. Žiemos sezonui priskirti 2016 ir 2017 m.m. sausio

ir vasario mėnesiai, pavasario – kovo, balandžio ir gegužės mėnesiai, vasaros – birželio, liepos ir

rugpjūčio mėnesiai, rudens – rugsėjo, spalio ir lapkričio mėnesiai.

40

13 lentelė. Analizuojamų pieno mėginių pieno sudėties vidutinės reikšmės tirtose grupėse pagal

sezoną

Sezonas Pieno sudėties rodikliai

Riebalai, % Baltymai,

%

Laktozė,

%

Urėja, mg/% Ca, mg/100g

Pavasaris

min 2,12 2,61 3,42 2,00 100,9

max 7,42 5,92 5 47,00 136,7

vidurkis 4,75a 3,49a 4,43 b 19,99 b 115,33 ab

SD 1,14 0,50 0,20 8,74 11,45

Vasara

min 1,64 2,69 3,20 4,00 99,69

max 7,76 4,38 4,64 55,00 168,00

vidurkis 4,74a 3,47a 4,34 ab 25,11 c 112,85 a

SD 1,18 0,35 0,24 14,02 13,21

Ruduo

min 2,24 2,83 3,77 2,00 100,36

max 7,96 5,23 4,87 40,00 139,64

vidurkis 4,95a 3,71b 4,33 a 18,66 b 116,98 b

SD 1,68 0,46 0,19 8,86 12,30

Žiema

min 2,60 3,03 4,07 4,00 102,40

max 7,64 6,26 4,81 40,00 175,80

vidurkis 5,00a 3,69b 4,34 a 12,71 a 125,22 c

SD 1,02 0,51 0,26 8,65 11,59

Didžiausią riebalų kiekį juodmargių karvių piene nustatėme žiemos sezono metu – 5,00 ±1,02 %.

Ir nors sezonas neturėjo statistiškai reikšmingos įtakos šiam pieno rodikliui, iš 13 lentelės

duomenų galime pastebėti, kad pieno riebumas pavasario-vasaros sezonais buvo mažesnis nei

rudens – žiemos sezonais. Didžiausias baltymų kiekis, kurį nustatėme, priklauso žiemos

(3,69±0,51 %) ir rudens (3,71±0,46 %) sezonų pieno mėginiams. Šios baltymų koncentracijos

statistiškai patikimai (P<0,05) didesnės už pavasario sezono pieno mėginių baltymų

koncentraciją (3,49±0,50 %). Rudens sezono pieno baltymingumas statistiškai patikimai didesnis

(P<0,05) už už vasaros sezono pieno baltymingumą (3,47±0,35 %). Mūsų gauti rezultatai

sutampa sutampa su Jungtinių tautų statistika ir prieštarauja Chen ir kt. (2014) gautiems

rezultatams – šių mokslininkų tirtuose pieno mėginiuose (įvairių veislių pieniniai galvijai)

didžiausia baltymų koncentracija buvo nustatyta vasaros ir pavasarios sezonais.

Nustatėme, jog sezonas turėjo reikšmingos įtakos ir laktozės kiekiui juodmargių karvių piene.

Pavasario sezono metu nustatyta 4,43 ±0,20 % laktozės ir tai statistiškai patikimai (P<0,05)

daugiau lyginant su laktozės kiekiu, nustatytu kitų sezonų metu.

Urėjos kiekis juodmargių galvijų piene mūsų duomenimis svyruoja nuo 2,00 iki 55,00 mg %.

Vasaros sezono mėginiuose nustatytas didžiausias vidutinis urėjos kiekis piene, kuris lygus

25,11±14,02 mg % (13 lentelė). Šio junginio, kitaip vadinamo karbamidu, koncentracija piene

parodo ar gyvulio mitybos racione yra pakankamai baltyminių medžiagų. Albaaj, Foucras ir

Raboissond (2017) duomenimis karvių piene, priklausomai nuo laktacijos, urėjos kiekis svyruoja

nuo 20 iki 40 mg%. Lietuvos juodmargių karvių piene kitų tyrėjų duomenimis randama

vidutiniškai 20,37±0,37 mg% urėjos, o Lietuvos žalųjų ir juodmargių piene nustatytas vidutinis

urėjos kiekis 2004–2005 metų laikotarpiu buvo 26,14 mg% (Juozaitienė ir kt., 2016).

41

Mūsų tyrime nustatytas vidutinis kalcio kiekis pavasario ir vasaros sezonų metu buvo atitinkamai

115,33±11,45 mg/100 g ir 112,85±13,21 mg/100 g. Šis pieno sudėties rodiklis palaipsniui didėjo

rudenį, o didžiausia koncentracija, kuri statistiškai patikimai (P<0,05) didesnė už pavasario ir

vasaros sezono koncentracijas, buvo nustatyta žiemos sezono pieno mėginiuose – 125,22±11,59

mg/100 g pieno. Šiuos rezultatus galime palyginti su Frederiksen ir kt., (2011) gautais

rezultatais tiriant Danijos holšteinų veislės karvių pieną. Jis pasižymi geromis koaguliavimo

savybėmis, o vidutinė bendro kalcio koncentracija siekia 134,9 mg/100g (n=193). Šų tyrėjų

duomenimis pieno mėginiuose, kurių FKT buvo nuo 20 iki 60 min. (vidutinio greičio

koaguliacija), bendras kalcio kiekis lygus 121,0 mg/100g (n=119) ir sutampa su didžiausia mūsų

nustatyta kalcio koncentracija piene. Kita mokslininkų grupė (Jensen ir kt., 1995) nustatė, jog

Džersių veislės karvių piene randama didesnė kalcio koncentracija, Danijos holšteinų veislės

karvių piene silpnomis koaguliavimo savybėms pasižyminčiame piene bendras kalcio kiekis

siekia 145,8 mg/100g, o geromis koaguliavimo savybėmis pasižyminčiame piene – net 163,2

mg/100g.

3.3 Juodmargių karvių pieno baltymų frakcijų kokybinė sudėtis priklausomai nuo galvijų

holšteinizacijos laipsnio

Toliau detaliau panagrinėsime juodmargių karvių pieno baltymų frakcijų sudėtį. Kazeino frakcijų

ir β-laktoglobulino kiekis senojo genotipo Lietuvos juodmargių veislės karvių piene nustatytas

pirmą kartą, naudojant ESCh metodą. Frakcijos skirstytos naudojant atvirkščių fazių C18 (Vydac

2018TP, 5 µm 250 mm x 4,6 mm) kolonėlę. Hidrofiliškiausios kazeino frakcijos κ-kazeino

sulaikymo trukmė kolonėlėje trumpiausia – junginys išstumiamas ir identifikuojamas diodų

matricos detektoriumi (λ=220 nm) vidutiniškai po 25 min. Po 26 min. chromatogramose

matomas αs2–kazeino pikas, αs1– ir β–kazeinai identifikuoti praėjus 28,5 ir 29,6 min. atitinkamai

nuo mėginio injekcijos pradžios. Pagrindinis išrūgų baltymas β–laktoglobulinas yra

hidrofobiškesnis už visas kazeino frakcijas, jo sulaikymo kolonėlėje trukmė – apie 31 min. (9

pav.). Šie mūsų gauti chromatografijos rezultatai sutampa su kitų tyrėjų duomenimis (Bonfatti ir

kt., 2008, Bonizzi ir kt., 2009, Barbef ir kt., 2014).

9 pav. Tipinė kazeino frakcijų ir β-laktoglobulino pieno mėginiuose chromatograma.

Literatūroje nurodoma (Bonfatti ir kt., 2008) jog piene kazeino frakcijų santykis αs1:αs2: β:κ

santykis lygus 4:1:4:1, o β-lg santykis su bendru kazeino kiekiu – 1:3. Mūsų rezultatai apie

Lietuvos juodmargių karvių pieno kazeino kokybinę sudėtį parodė panašų santykį tarp atskirų

kazeino frakcijų vidutinių reikšmių (14 lentelė) ir tarp pieno β–lg bei bendro kazeino kiekio.

42

14 lentelė. Analizuojamų pieno mėginių kazeino frakcijų ir β-laktoglobulino sudėties vidutinės reikšmės tirtose grupėse pagal juodmargių karvių

holšteinizacijos laipsnį

Holštei-

nizacijos

laipsnis

β-lg,

% Bendras

CN, %

Kazeino frakcijų sudėtis, % Santykinė baltymų sudėtis paskaičiuiota pagal bendrą

baltymų kiekį *, % m/m

κ-CN αs2-CN αs1-CN β-CN CN**

skaičius κ-CN αs2-CN αs1-CN β-CN

0-49

Min 0,48 1,99 0,17 0,10 0,55 0,58 45,69 4,70 2,87 13,75 23,22

Max 1,12 4,02 0,71 0,41 1,36 2,29 91,35 13,21 10,60 33,89 54,03

Vidurkis 0,76

a 2,94a 0,32

a 0,20a 0,95

a 1,58a 78,20

a 8,16a 5,39

a 25,76a 41,10

a

SD 1,46 0,37 0,08 0,05 0,12 0,22 8,41 1,58 1,41 3,36 6,76

50-69

Min 0,44 2,01 0,24 0,10 0,66 0,69 60,43 6,01 2,56 17,70 24,02

Max 1,04 4,02 0,58 0,37 1,34 2,06 99,80 14,55 10,55 43,07 63,16

Vidurkis 0,74

a 3,14b 0,35

b 0,22a 1,01

b 1,57a 85,25

b 9,46b 5,81

ab 27,49b 42,49

a

SD 0,12 0,33 0,07 0,06 0,12 0,25 9,20 1,71 1,61 3,82 5,57

70-79

Min 0,47 2,06 0,18 0,08 0,64 0,71 43,55 3,69 2,13 14,55 21,01

Max 1,16 4,27 0,60 0,42 1,33 2,21 99,70 13,05 9,83 37,35 59,41

Vidurkis 0,76a 3,07

ab 0,33ab 0,21

a 0,98ab 1,56

a 83,37ab 8,79

ab 5,84ab 26,84

ab 42,87a

SD 0,16 0,48 0,07 0,06 0,15 0,3 14,91 1,71 1,64 4,72 9,29

80-90

Min 0,49 2,08 0,21 0,09 0,7 1,06 47,12 3,85 2,56 15,59 22,76

Max 1,19 4,26 0,5 0,380 1,31 2,17 99,43 13,33 10,28 35,09 58,41

Vidurkis 0,75

a 3,11ab 0,32

a 0,21a 0,97

ab 1,61a 85,48

b 8,93ab 5,96

b 27,39ab 45,24

b

SD 0,13 0,37 0,06 0,05 0,12 0,2 9,92 1,64 1,64 3,61 6,18

* m/m, kazeino frakcijos masė padalinta iš bendro baltymų kiekio ir *100; ** CN skaičius – paskaičiuotas kaip (CN/baltymų kiekis) * 100

43

Toliau detaliau panagrinėsime juodmargių karvių pieno baltymų frakcijų sudėtį priklausomai

nuo galvijų holšteinizacijos laipsnio. Iš duomenų apie bendrą kazeino kiekį (14 lentelė) matome,

kad mažiausiai kazeino nustatyta senojo genotipo juodmargių grupėje – 2,94±0,37 %, o 50-69 %

holšteinizuotų karvių grupėje kazeino kiekis statistiškai patikimai (P<0,05) didesnis – 3,14±0,33

%. Grupėse, kuriose buvo 70 – 79 % ir 80 – 90 % holšteinizuotos juodmargės, kazeino kiekis

skyrėsi nežymiai ir jo vidutinės reikšmės nustatytos atitinkamai 3,07 ±0,48 % ir 3,11±0,37 %.

Lyginant gautus rezultatus su kitų šalių mokslininkų skelbtais rezultatais apie Holšteino veislės

karvių pieno sudėtį, matome, kad mes nustatėme kiek didesnius kazeino kiekius. Švedijos

mokslininkai Holšteino veislės karvių piene rado 2,55 – 2,77 % kazeino (Jensen ir kt., 2012), o

Danijos mokslininkai nustatė, kad Holšteino veislės karvių piene yra 2,78 % kazeino (Fredriksen

ir kt., 2011). Estų mokslininkų duomenimis Estijos holšteino veislės karvių piene buvo didesnis

kazeino kiekis – 2,93 % (Joutu ir kt., 2008).

Nagrinėdami atskirų kazeino frakcijų sudėtį skirtingo holšteinizacijos laipsnio juodmargių karvių

pieno mėginiuose, esminių skirtumų tarp kazeino kokybinės sudėties nematome. κ-CN kiekis

svyravo ribose 0,32 – 0,35 %, β-CN – ribose 1,56 – 1,61 %, αS1-CN - ribose 0,95 – 1,01 % ir

αS2-CN – ribose 0,20 – 0,22 %. Statistiškai patikimi skirtumai (P<0,05) nustatyti tarp κ-CN ir

αS1-CN kiekių senojo tipo juodmargių pieno ir 50-69 % holšenizuotų juodmargių pieno.

Estijos mokslininkų, tyrusių Holšteino veislės karvių pieno kazeino kokybinę sudėtį, duomenys

panašūs į mūsų gautus duomenis. Joutu ir kolegų (2008) rezultatai parodė, kad Estijos holšteino

veislės karvių piene nustatytas β-CN kiekis – 1,39 %, αS1-CN kiekis – 0,98 %, αS2-CN kiekis –

0,19 %.

Lietuvos juodmargių pieno α–kazeinų kiekiai, kuriuose nustatėme, yra panašūs į Italijos fryzų

veislės karvių piene esančius kiekius. Didžiausias skirtumas lyginant savo rezultatus su Italijos

fryzų veislės karvių pieno rezultatais matomas β–CN frakcijos koncentracijos atžvilgiu. Lietuvos

juodmargių karvių pieno vidutinė β–CN koncentracija (1,56 -1,61 %) ženkliai didesnė už

Bonizzi ir kt. (2009) nustatytą β–CN koncentraciją (tik 1,14 %). Ha ir kt. (2014) atliko tyrimą,

kuriame tyrė Džersių veislės karvių pieno baltymų frakcijų sudėtį. Mokslininkas gavo ženkliai

didesnį kiekį αs1–kazeino frakcijos (2,12±0,34%) nei nustatėme mes Lietuvos juodmargių veislės

karvių piene – 0.95 – 1.01 %.

Kadangi pastebėjome, kad mokslinėje literatūroje skelbti rezultatai apie karvių pieno kazeino

frakcijų sudėtį varijuoja labai plačiose ribose, pabandėme apibendrinti skelbtus duomenis.

Apibendrintus publikuotus rezultus ir jų palyginimą su Lietuvos juodmargių karvių kazeino

frakcijų sudėties rezultatais pateikiame 15 lentelėje, kurioje kazeino frakcijų sudėtis paskaičiuota

pagal bendrą baltymų kiekį.

15 lentelė. Santykinė kazeino sudėtis įvairių veislių karvių piene (paskaičiuota pagal bendrą

baltymų kiekį, % m/m)

Kazeino frakcija Literatūros šaltinių duomenys apie

įvairių Europos Šiaurės šalių veislių

karvių pieno kazeino kokybinę sudėtį*

Mūsų tyrimų duomenys apie

Lietuvos juodmargių karvių

pieno kazeino kokybinę sudėtį

κ-CN 4,01 – 10,46 8,16 – 9,46

αS1-CN 29,48 – 35,61 25,76 – 27,49

αS2-CN 6,72 – 12,11 5,39 – 5,96

β-CN 27,17 – 37,14 41,10 – 45,24

*Heck ir kt., 2009, Bonfatti ir kt., 2011, Guztavsson ir kt, 2014, Demeter ir kt., 2010

44

Iš 15 lentelės duomenų matome, kad pagal κ-CN kiekį Lietuvos juodmargių karvių pienas telpa į

ribas, kurios nurodomos kitų mokslinkų tyrimų rezultatuose. Tačiau pagal αS1-CN, αS2-CN ir β-

CN frakcijų santykinį kiekį, Lietuvos juodmargių karvių pienas skiriasi. Mūsų duomenimis

santykinis αS1-CN, αS2-CN frakcijų kiekis mažesnis už kitose šalyse karvių piene nustatytas

šio rodiklio reikšmes, o β-CN frakcijos santykinis kiekis – didesnis. Galima teigti, jog Lietuvos

senojo genotipo juodmargių karvių pienas turi pakankamai didelę κ–kazeino koncentraciją, kas

yra svarbu pieno fermentinės koaguliacijos savybėms.

Mes taip pat nustatėme, jog Lietuvos juodmargių veislės karvių piene vidutinė pagrindinio išrūgų

baltymo β–laktalbumino koncentracija svyruoja nuo 0,74 iki 0,76 %. Gauta koncentracija yra

šiek tiek mažesnė už Bonfatti ir kt. (2011) nustatytą β-laktalbumino vidutinę koncentraciją

įvairių veislių karvių piene– 0,86±0,09 g/l.

Toliau detaliau panagrinėsime pieno baltymų frakcijų sudėties pokyčius priklausomai nuo

sezono (16 lentelė). Iš duomenų apie bendrą kazeino frakcijos kiekį matome, kad sezonas turėjo

statistiškai reikšmingos (P<0,05) įtakos kazeino kiekiui piene; mažiausiai kazeino nustatėme

žiemos sezono mėginiuose (2,91 ±0,27%), o daugiausiai vasaros sezono mėginiuose – 3,20±0,44

%.

Mūsų tyrime gauta didžiausia κ–CN frakcijos koncentracija vasaros bei rudens sezonais

(0,34±0,18 %). Vasaros bei rudens sezonų pieno κ–CN koncentracija statistiškai patikimai

(P<0,05) didesnė už pavasario ar žiemos sezonų pieno κ–CN koncentraciją. Tokios pačios

tendencijos nustatytos ir kitoms kazeino frakcijoms.

45

16 lentelė. Analizuojamų pieno mėginių kazeino frakcijų ir β-laktoglobulino sudėties vidutinės reikšmės tirtose grupėse pagal sezoną

Sezonas β-lg,

% Bendras

CN, %

Kazeino frakcijų sudėtis, % Santykinė baltymų sudėtis paskaičiuiota pagal bendrą

baltymų kiekį *, % m/m

κ-CN αs2-CN αs1-CN β-CN CN**

skaičius κ-CN αs2-CN αs1-CN β-CN

Pavasaris

Min 0,47 2,07 0,17 0,10 0,66 0,71 43,55 3,68 2,49 14,55 21,01

Max 1,10 3,86 0,53 0,37 1,30 1,95 98,93 13,42 9,82 34,49 56,24

Vidurkis 0,76a 3,01

a 0,31a 0,21

a 0,96a 1,53

a 84,46a 8,83

b 5,81b 26,97

ab 42,74a

SD 0,15 0,35 0,06 0,05 0,13 0,21 10,77 1,67 1,55 3,88 6,74

Vasara

Min 0,44 2,01 0,19 0,15 0,64 0,69 57,29 5,65 4,14 16,96 23,21

Max 1,19 4,35 0,58 0,41 1,36 2,29 99,79 12,51 11,15 33,38 56,50

Vidurkis 0,78a 3,20

b 0,34b 0,23

b 1,03b 1,63

b 87,66b 9,20

a 6,56a 27,26

a 44,41b

SD 0,13 0,44 0,07 0,06 0,15 0,27 10,03 1,48 1,60 3,79 7,17

Ruduo Min 0,51 2,06 0,18 0,14 0,65 1,04 45,69 4,69 3,68 13,75 23,56

Max 1,36 4,26 0,60 0,42 1,35 2,18 99,43 14,55 9,58 43,06 59,41

Vidurkis 0,79a 3,13

b 0,34b 0,22

b 0,98ab 1,60

b 84,03a 8,89

b 5,95b 26,43

b 42,64a

SD 0,15 0,41 0,08 0,05 0,13 0,21 11,15 1,73 1,39 3,92 6,77

Žiema

Min 0,49 2,06 0,21 0,14 0,65 0,89 47,12 4,18 2,13 15,36 22,76

Max 1,06 4,26 0,51 0,42 1,35 1,89 99,70 13,21 6,47 33,78 52,78

Vidurkis 0,69b 2,91

c 0,29c 0,16

c 0,96a 1,50

a 79,23c 7,88

c 4,34c 26,01

b 40,75c

SD 0,09 0,27 0,06 0,03 0,09 0,15 9,89 1,48 0,80 3,34 5,28

* m/m, kazeino frakcijos masė padalinta iš bendro baltymų kiekio ir *100; ** CN skaičius – paskaičiuotas kaip (CN/baltymų kiekis) * 100

46

3.4. Juodmargių karvių pieno technologinės savybės priklausomai nuo holšteinizacijos

laipsnio ir sezono

Greta juodmargių karvių pieno sudėties analizės, atlikome ir jo technologinių savybių tyrimus.

Lietuvoje tokie tyrimai buvo atlikti pirmą kartą. Pieno technologinės savybės ypatingai svarbios

pieno perdirbėjams, kurie siekia gerinti pieno produktų kokybę, didinti gamybos efektyvumą.

Žinoma, kad pieno technologinės savybės priklauso nuo jo cheminės sudėties ir pirmiausia nuo

pieno baltymų sudėties. Todėl pirmiausia pateikiame juodmargių karvių pieno technologinių

savybių rezultatus, priklausomai nuo galvijų holšteinizacijos laipsnio (17 lentelė) ir sezono (18

lentelė), o tolesniuose etapuose nagrinėsime koreliacinius ryšius tarp pieno sudėties ir jo

technologinių savybių.

Pieno buferiškumas - technologinė pieno savybė, kuri priklauso nuo baltymų ir mineralinių

medžiagų pasiskirstymo pieno sausosiose medžiagose ir vandens fazėje. Salaun ir kolegos

(2005) pasiūlė, kad pieno buferiškumui tiesioginės įtakos turi tirpūs fosfatai, koloidinis kalcio

fosfatas, citratai, bikarbonatai, kazeinas ir išrūgų baltymai. Kiti mokslininkai tokių

priklausomybių tarp pieno buferiškumo ir jo sudėties nenustatė (Chen, ir kt., 2012). Yra

duomenų apie sezono įtaką šiam rodikliui (Harris ir kt., 2002); Kalifornijos mokslininkai nustatė

didžiausias pieno buferiškumo reikšmes gruodžio mėn., o mažiausias – rugsėjo mėn. Tačiau

tikėtina, kad šiam rodikliui didžiausios įtakos turi galvijų laikymo sąlygos ir šėrimo racionas.

Mūsų duomenimis pieno buferiškumui juodmargių holšteinizacijos laipsnis (17 lentelė) neturėjo

reikšmingos įtakos.

17 lentelė. Analizuojamų pieno mėginių technologinių savybių rodiklių vidutinės reikšmės

tirtose grupėse pagal juodmargių karvių holšteinizacijos laipsnį

Juodmargių

karvių

holšteinizacijos

laipsnis

Pieno technologiniai rodikliai

Buferišku-

mas, ΔpH

Termosta-

bilumas,

min

Fermentinės

koaguliacijos

Rūgštinės

koaguliacijos

FKT,

min

G’40,

Pa

RKT,

min

G’40,

Pa

0-49

min 0,16 4,00 7,00 0,002 16,00 0,02

max 1,27 20,00 60,00 113,00 42,00 99,70

vidurkis 0,65ab

14,44a 24,86

a 20,69

a 27,14

a 44,81

a

SD 0,15 4,92 10,12 28,25 7,81 32,43

50-69

min 0,23 3,00 11,00 0,01 17,00 0,02

max 1,11 20,00 60,00 50,40 55,00 90,00

vidurkis 0,63a 14,84

a 25,82

a 18,82

a 28,25

a 38,55

a

SD 0,16 4,88 10,55 13,48 6,01 31,70

70-79

min 0,31 3,00 12,00 0,05 25,00 0,17

max 1,54 20,00 60,00 79,80 48,00 70,30

vidurkis 0,67b 14,40

a 32,87

b 10,33

a 32,11

a 46,04

a

SD 0,17 4,93 14,99 15,42 8,05 27,93

80-90

min 0,33 4,00 7,00 0,02 22,00 9,34

max 6,85 20,00 60,00 190,00 34,00 80,30

vidurkis 0,73ab

14,84a 25,07

a 20,63

a 26,43

a 47,80

a

SD 0,66 4,49 10,60 31,48 2,97 22,25

Senojo genotipo karvių grupėje vidutinė pieno buferiškumo reikšmė buvo 0,65±0,15, o

didžiausio holšteinizacijos laipsnio karvių grupėje - 0,73±0,15. Grupėse, kuriose buvo 50 – 69 %

ir 70 – 79 % holšteinizuotos juodmargės, pieno buferiškumas nustatytas atitinkamai 0,63 ir 0,67.

Tačiau pavyko nustatyti sezono įtaką šiam rodikliui (18 lentelė). Mažiausiu buferiškumu

47

pasižymėjo pavasario pienas – 0,49±0,15, o kitų sezonų pienui nustatytas statistiškai patikimai

(P<0,05) didesnis pieno buferiškumas, kurio vidutinės reikšmės buvo intervale 0,71 – 0,76.

18 lentelė. Analizuojamų pieno mėginių technologinių savybių rodiklių vidutinės reikšmės

tirtose grupėse pagal sezoną

Sezonas

Pieno technologiniai rodikliai

Buferišku-

mas, ΔpH

Termosta-

bilumas,

min

Fermentinės

koaguliacijos

Rūgštinės

koaguliacijos

FKT,

min

G’40,

Pa

RKT,

min

G’40,

Pa

Pavasaris

min 0,29 5,00 7,00 0,05 22,00 15,30

max 0,78 20,00 60,00 105,00 40,00 96,00

vidurkis 0,49 a 14,29 a 25,49 b 16,94 a 26,88a 52,26

1 b

SD 0,15 4,78 10,44 22,20 4,43 27,77

Vasara

min 0,5 5,00 9 0,01 14 0,02

max 0,83 20,00 60 88,80 60 9,34

vidurkis 0,76 b 14,68 a 20,95 a 23,55 a 27

a 1,91 a

SD 0,57 4,03 10,87 23,04 19 4,15

Ruduo

min 0,3 3,00 17,00 0,03 17 0,04

max 1,11 20,00 60,00 50,40 48 33,46

vidurkis 0,71 b 14,65 a 30,95 c 17,38 a 28,5

a 12,99a

SD 0,09 5,59 11,77 25,18 7 13,65

Žiema

min 0,63 4,00 14,00 0,12 21,00 28,30

max 1,54 20,00 60,00 190,0 41,00 97,70

vidurkis 0,72 b 14,97 a 30,16 c 19,23 a 26,86a 61,13b

SD 0,15 4,75 11,78 27,37 4,29 20,33

Statistiškai patikimų skirtumų nepavyko nustatyti tarp skirtingo holšteinizacijos laipsnio galvijų

grupių pieno termostabilumo (17 lentelė). Šios technologinės savybės vidutinės reikšmės

svyravo intervale 14,40 -14,84 min. Reikia pastebėti, kad pieno termostabilumui nustatyti dideli

šio rodiklio kitimo intervalai; pavyzdžiui, senojo genotipo karvių grupių pieno termostabilumas

keitėsi nuo 2,00 iki 20,00 min. Sezonas taip pat neturėjo įtakos juodmargių karvių pieno

temostabilumui (18 lentelė). Visais atvejais pieno termostabilumo kitimo intervalas buvo didelis,

o vidutinės reikšmės svyravo nuo 14, 29 iki 14,97 min.

Tolesnei duomenų analizei pagal termostabilumą pieno mėginius suskirstėme į tris grupes: 1)

gero termostabilumo, kai mėginiai atlaikė šiluminį apdorojimą ≥ 20, 2) vidutinio

termostabilumo, kai mėginiai atlaikė šiluminį apdorojimą nuo 15 iki 20 min; 3) blogo

termostabilumo, kai mėginiai atlaikė šiluminį apdorojimą < 15 min. (19 lentelė).

19 lentelė. Pieno termostabilumo pasiskirstymas pagal holšteinizacijos grupes

Juodmargių karvių

holšteinizacijos

laipsnis ir mėginių

skaičius

Pieno termostabilumas, min

≥ 20 15 ÷ 20 < 15

Vnt. % Vnt. % Vnt. %

0-49 40 23 56 32 80 45

50-69 25 28 28 32 35 40

70-79 20 22 32 35 39 43

80-90 19 23 29 35 36 43

Viso: 104 24 145 33 190 43

48

Matome, kad iš visų tirtų 439 pieno mėginių tik 104 mėginiai pasižymėjo geru termostabilumu,

t.y. 24% mėginių. Daugiausiai nustatyta blogo termostabilumo pieno mėginių – 43%, o vidutinio

termostabilumo mėginiai sudarė 33 % nuo visų mėginių kiekio. Panašias proporcijas

pastebėsime ir analizuodami pieno termostabilumo duomenis skirtingose juodmargių karvių

grupėse pagal holšteinizacijos laipsnį. Senojo genotipo juodmargių karvių grupėje gero

termostabilumo pieno buvo 23 %, vidutinio – 32%, o blogo - 45%. Grupėje, kurią sudarė 80-90

% holšteinizuotos juodmargės, gero termostabilumo pieno taip pat buvo 23 %, vidutinio – 35%,

o blogo - 43%.

Termostabilumas yra svarbus pieno, kuris bus naudojamas sterilizacijai, UAT pasterizavimui ar

garinimui parametras. Tai aktuali problema pieno pramonėje, nors Singh (2004) nustatė, jog tarp

blogų (<15 min.) termostabilumo savybių ir komercinio sterilizavimo proceso koreliacija yra

silpna. Žinoma, kad termostabilumui įtakos turi β–laktoglobulino kiekis bei urėjos koncentracija.

Į pieno, kurio pH 6,3–6,7 įdėjus 25 mg% urėjos arba β–laktoglobulino termostabilumas

pagerinamas reikšmingai (Lin ir kt., 2016).

Kitos pieno technologinės savybės, ypatingai svarbios sūrių gamintojams – pieno fermentinės

koaguliacijos savybės. Jas vertinome dviem rodikliais – fermentinės koaguliacijos trukme (FKT)

ir susidariusios fermentinės sutraukos stiprumu (G‘40).

Sutraukos stiprumas kai kuriose studijose fiksuojamas praėjus 60 min. nuo fermento įdėjimo

(Glantz ir kt., 2015), tačiau remiantis Frederiksen ir kt. (2011) bei Gustavson ir kt. (2014)

darbais nusprendėme fiksuoti sutraukos stiprumą praėjus 40 min. nuo fermento įdėjimo pradžios.

Pagal šiuos mokslininkus geromis koaguliacijos savybėmis pasižyminčio pieno grupei

priskiriamas pienas, kurio sutraukos stiprumo vertė praėjus 40 min. nuo eksperimento pradžios

didesnė už 350 Pa. Pagal Jensen ir kt. (1995) nekoaguliuojančiu pienu laikomas tas, kuris

nesudaro sutraukos per 60 min, o G‘40 lygi 0 Pa. Gerai koaguliuojančiu pienu laikomas tas, kuris

sudaro sutrauką per 20 min. ar mažiau. Mūsų darbe geros fermentinės koaguliacijos kriterijaisi

pasirinkta laikyti tik koaguliacijos trukmę, kuri turi būti mažesnė kaip 20 min ir fermentinės

sutraukos stiprumą, kurios rodiklis G‘40 > 50 Pa.

Kaip matome iš duomenų pateiktų 17 lentelėje trumpiausia fermentinės sutraukos susidarymo

trukmė nustatyta senojo genotipo juodmargių karvių grupės pienui – 24,86±10,12 min. Kitų

grupių karvių pienui nustatytos didesnės FKT reikšmės, nors statistiškai patikimai (P<0,05)

skyrėsi tik 70-79 % holšteinizuotų juodmargių karvių pieno FKT reikšmė, kuri buvo -

32,87±14,99 min. Kito pieno fermentinės koagulacijos rodiklio - fermentinės sutraukos

stiprumo, priklausomybė nuo galvijų holšteinizacijos laipsnio buvo panaši. Stipriausią

fermentinę sutrauką sudarė pienas iš senojo genotipo karvių grupės; jo vidutinė G’40 reikšmė

buvo 20,69 Pa. Holšteinizuotų juodmargių karvių pieno fermentinės sutraukos stiprumo

vidutinės reikšmės buvo mažesnės. Statistinis duomenų apdorojimas parodė, kad sezonas šiam

rodikliui statistiškai patikimos įtakos neturi.

Analizuodami sezono įtaką pieno fermentinės koaguliacijos savybėms, nustatėme, kad FKT

statistiškai patikimai (P<0,05) priklausė nuo sezono (18 lentelė). Greičiausiai fermentinę

sutrauką pienas sudarė vasaros sezono metu; vidutinė FKT reikšmė - 20,95 ±10,87 min.

Lėčiausia fermentinę sutrauką sudarė rudens pienas – vidutiniškai per 30,95±11,77 min. Vasaros

pienui nustatyta ir stipriausia fermentinė sutrauka, kurios vidutinė G’40 reikšmė buvo 23,55 Pa.

49

Kitais sezonais nustatyta juodmargių pieno fermentinės sutraukos G’40 reikšmės buvo mažesnės,

nors statistiškai reikšmingi skirtumai tarp jų nebuvo nustatyti.

Pagal fermentinės sutraukos susidarymo laiką pieno mėginius suskirstėme į tris grupes: geros

koaguliacijos pienas, kurio FKL buvo 20 min, blogos koaguliacijos pienas, kurio FKL buvo

20÷60 min ir nekoaguliuojantis pienas, kuris po 60 min nesudarė sutraukos (20 lentelė). Iš taip

sugrupuotų duomenų matome, kad įvertinus 355 pieno mėginių FKT, rasti 19 mėginiai, kurie

nekoaguliavo, t.y. 5,35 % visų pieno mėginių. Kitų šalių autorių publikacijose taip pat randame

duomenų apie nekoaguliuojantį pieną. 2011 m. Danijos mokslininkai pristatė studiją apie trijų

karvių veislių: Džersių, Danijos žalųjų ir Danijos holšteinų pieno koaguliacijos savybes. Tarp

džersių karvių pieno nebuvo rasta nekoaguliuojančio, o Danijos holšteinų grupėje toks pienas

sudarė 3%, kai tuo tarpu Danijos žalųjų grupėje nekoaguliuojančio pieno buvo net 17%

(Frederiksen ir kt., 2011). Kita Danijos mokslininkų grupė tyrė trijų senojo genotipo veislių

karvių pieno koaguliacijos savybes. Nustatyta, kad iš 28 Danijos žalųjų veislės karvių pieno

mėginių 4 mėginiai nekoaguliavo, o iš 23 Švedijos kalnų veislės karvių pieno mėginių

nekoaguliavo 1 mėginys. Visi Jutlandijos veislės karvių pieno mėginiai koaguliavo; jų buvo tirta

12.

Daugiausiai mėginių su mažu FKT buvo tarp senojo genotipo juodmargių karvių; šioje grupėje

net 42,75 % mėginių FKT buvo 20, be to šioje grupėje aptiktas tik 1 nekoaguliavęs mėginys.

Daugiausiai nekoaguliavusių mėginių rasta grupėje, kurią sudarė 70-80% holšteinizuotos

juodmargės; net 14 pieno mėginiai iš 65 tirtų mėginių nekoaguliavo, o tai sudarė 21,54% toje

grupėje. Juodmargių grupėse, kurių holšteinizacijos laipsnis buvo 50-69 ir 80-90%

nekoaguliavusio pieno mėginių nebuvo, o mėginiai, kurių FKL buvo 20 sudarė atitinkamai

5,00 ir 1,01 %.

20 lentelė. Fermentinės koaguliacijos trukmė juodmargių karvių grupėse pagal holšteinizacijos laipsnį

Fermentinės

koaguliacijos

trukmė, min

0-49 50-69 70-79 80-90

Viso:

vnt. % vnt. % vnt. % vnt. % vnt. %

<20 56 42,75 15 25,00 15 23,08 36 36,36 122 34,37

20-60 74 56,49 42 70,00 36 55,38 62 62,63 214 60,28

60 1 0,76 3 5,00 14 21,54 1 1,01 19 5,35

Viso: 131

60

65

99

355

Pieno mėginius suskirstėme į grupes ir pagal kitą fermentinės koagulicijos savybę – sutraukos

stiprumą G’40 . Pieno mėginius suskirstėme į tris grupes: geros koaguliacijos pienas, kurio G’40

buvo > 50 Pa, blogos koaguliacijos pienas, kurio G’40 buvo 1 – 50 Pa ir labai blogos

koaguliacijos pienas pienas, kurio G’40 < 1 Pa (21 lentelė). Iš taip sugrupuotų duomenų matome,

kad įvertinus 183 pieno mėginių G’40, 11 mėginių pasižymėjo gera koaguliacija, tai sudarė 6 %

visų tirtų mėginių. Svarbu pažymėti, kad kaip ir FKT rodiklio atveju, daugiausia pieno mėginių,

kurių G’40 rodiklis atitiko geros fermentinės koaguliacijos reikalavimus, buvo senojo genotipo

juodmargių grupėje. Toks pienas šioje grupėje sudarė 10,1 %. Daugiausiai labai blogos

koaguliacijos mėginių rasta grupėje, kurią sudarė 70-79% holšteinizuotos juodmargės - net 32,4

% mėginių toje grupėje nustatytas G’40 <1 Pa. Šioje grupėje nustatyta ir daugiausia

nekoaguliuojančio pieno mėginių.

50

Taigi, šiame darbo etape galime teigti, kad senojo genotipo karvių pienas pasižymi geromis

fermentinės koaguliacijos savybėmis lyginant su holšteinizuotų galvijų pienu. Tyrimo metu

daugiausia pieno mėginių su trumpa FKT ir stipria fermentine sutrauka nustatyta senojo genotipo

juodmargių karvių grupėje. Labai svarbu, kad šioje grupėje aptiktas tik 1 nekoaguliavęs pieno

mėginys.

21 lentelė. Fermentinės sutraukos stiprumas G’40 juodmargių karvių grupėse pagal holšteinizacijos

laipsnį

0-49 50-69 70-79 80-90

< 1,0

Pa

1-50

Pa

> 50

Pa

< 1,0

Pa

1-50

Pa

> 50

Pa

< 1,0

Pa

1-50

Pa

> 50

Pa

< 1,0

Pa

1-50

Pa

> 50

Pa

vidurkis 0,35 15,32 91,76 0,30 19,50 50,40 0,36 12,16 79,8 0,29 17,49 142,05

SD 0,22 15,13 19,28 0,34 12,18 0,00 0,32 9,99 0 0,37 10,37 67,81

Vnt. n= 11 51 7 3 35 1 11 22 1 7 32 2

Proc.: 15,9 73,9 10,1 7,7 89,7 2,6 32,4 64,7 2,9 17,1 78,0 4,9

Kita pieno technologinių savybių grupė, kurią vertinome šiame darbe - pieno rūgštinės

koaguliacijos savybės. Jas taip pat vertinome dviem rodikliais – rūgštinės koaguliacijos trukme

(RKT) ir susidariusios rūgštinės sutraukos stiprumu (G‘40). Duomenys pateikti 17, 18 ir 23 bei

24 lentelėse.

Mūsų duomenimis geriausiomis rūgštinės koaguliacijos savybėmis pasižymėjo pienas

juodmargių, kurių holšteinizacijos laipsnis 80-90 %. Šios grupės galvijų pienas sudarė stipriausią

rūgštinę sutrauką per trumpiausią trukmę; RKT - 26,14±2,97 G’40 - 47,80±22,25 Pa. Tačiau

statistinis duomenų apdorojimas parodė, kad galvijų holšteinizacijos laipsnis šiems rodikliams

statistiškai patikimos įtakos neturi. Palyginimui Švedijos raudonųjų veislės karvių rūgštinės

koaguliacijos laikas kinta nuo 5,7 min. iki 66,9 min., vidutinė reikšmė – 28,2±10,5 min., taigi yra

pieno, kuris nesudaro rūgštinės sutraukos per 60 min. (Wedhlom ir kt., 2006).

Nustatėme, kad juodmargių karvių rūgštinė sutrauka susidaro greičiausiai žiemos sezono pieno

mėginiuose (26,86±4,29 min.), o lėčiausiai rudens sezono mėginiuose (28,57±7,00 min.).

Pavyko nustatyti statistiškai patikimą sezono įtaką rūgštinės sutraukos stiprumo rodikliui.

Duomenų analizė parodė, kad didžiausia G’40 reikšmė nustatyta žiemos sezono pieno mėginiams,

o kitų sezonų pieno rūgštinės sutraukos stiprumas buvo statistiškai patikimai (P<0,05) mažesnis.

23 lentelė. Rūgštinės koaguliacijos trukmė juodmargių karvių grupėse pagal holšteinizacijos

laipsnį

Rūgštinės

koaguliacijos

trukmė, min

0-49 50-69 70-79 80-90 Viso:

vnt. % vnt. % vnt. % vnt. % vnt. %

<20 4 7,1 0 0 0 0 0 0 4 3,3

20÷30 40 71,4 23 71,9 7 70 20 87,0 90 74,4

30 12 21,4 8 25 3 30 3 13,0 26 21,5

Viso: 56 32 10 23 121

51

24 lentelė. Rūgštinės sutraukos stiprumas G’40 juodmargių karvių grupėse pagal holšteinizacijos

laipsnį

0-49 50-69 70-79 80-90

< 1,0

Pa

1-50

Pa

> 50

Pa

< 1,0

Pa

1-50

Pa

> 50

Pa

< 1,0

Pa

1-50

Pa

> 50

Pa

< 1,0

Pa

1-50

Pa

> 50

Pa

vidurkis 0,11 28,00 71,09 0,03 21,45 74,48 0,17 47,00 68,50 0 29,95 70,13

SD 0,10 18,42 16,06 0,01 8,22 19,68 0,00 0,00 2,55 0 12,58 8,84

Proc.: 21,1 26,3 52,6 15,4 46,2 38,5 25,0 25,0 50,0 0 55,6 44,4

Kaip ir fermentinės koaguliacijos rodiklių atveju, rūgštinės koaguliacijos rodiklius nagrinėjome,

grupuodami pieno mėginius į tris grupes pagal RKT ir G’40 rodiklius (23 ir 24 lentelės).

Kiekvienoje juodmargių karvių grupėje identifikavę geros koaguliacijos ir blogos koaguliacijos

pieno mėginius pagal RKT ir G’40 rodiklių reikšmes, kaip ir fermentinės koaguliacijos atveju,

galime teigti, kad geriausiomis rūgštinės koaguliacijos savybėmis pasižymi senojo genotipo

karvių pienas. Šioje karvių grupėje nustatyta 7,1% pieno mėginių, kurių RKT buvo < 20 min. ir

52,6 % pieno mėginių, kuių rūgštins sutraukos stiprumo rodiklis buvo > 50 Pa.

3.5. Koreliacijos tarp juodmargių karvių pieno sudėties ir technologinių rodiklių.

Apskaičiuotos koreliacijos bei jų reikšmingumo lygmuo (P<0,05 reikšmė žymima *, P<0,01

reikšmė žymima **, P<0,001 reikšmė žymima ***) juodmargių karvių pieno sudėties ir

technologinių rodiklių. Rezultatai pateikti 18 lentelėje. Stipria koreliacija laikoma ta, kurios

reikšmė 0,7–1,0 (raudona spalva), vidutine – 0,5–0,7 (žalia spalva), silpna 0,2–0,5 (geltona

spalva), jei reikšmė <0,2 – koreliacijos nėra (nekoreliuojantys rezultatai į lentelę nedėti). Iš

skaičiavimų imties pašalinti nekoaguliuojančio ir daugiau kaip 500 tūkst./ml somatinių ląstelių

turinčio pieno mėginių rezultatai.

Remdamiesi kitų mokslininkų atliktų tyrimų duomenimis, kėlėme hipotezę, jog bus gautos

stiprios koreliacijos tarp tokių rodiklių: FKT arba RKT ir κ–kazeino koncentracijos, αs2–kazeino

koncentracijos, κ–kazeino kiekio santykio su bendru kazeino kiekiu, kalcio kiekio (Ca,

mg/100g), baltymų (B, %), riebalų (R, %) koncentracijų piene (Jensen, 1995, Chen ir kt, 2014);

termostabilumo ir urėjos kiekio, pieno pH, kalcio kiekio, β-laktoglobulino koncentracijos (Lin ir

kt., 2016, Singh, 2004); buferiškumo (ΔpH) ir somatinių ląstelių skaičiaus (SLS, tūkst./ml),

kalcio kiekio, bendro baltymų kiekio (B, %) (Jensen, 1995, Salaun ir kt, 2005).

Atlikę skaičiavimus radome stiprių, vidutinių ir silpnų koreliacijų. Stiprios koreliacijos

nustatytos tarp κ–kazeino kiekio, β–kazeino kiekio, bendro kazeino kiekio ir rūgštinės sutraukos

stiprumo. Vidutinio stiprumo koreliacijos nustatytos tarp κ–kazeino kiekio bei kalcio kiekio ir

RKT; αs2–, αs1–kazeinų, β–laktoglobulino, kalcio kiekių bei pH ir rūgštinės sutraukos stiprumo.

Silpnos koreliacijos taip pat nustatytos tarp šių rodiklių: αs1–kazeino, β–kazeino kiekio bei β–

laktoglobulino ir RKT; αs2–kazeino kiekio, urėjos koncentracijos bei laktozės kiekio ir pH; pH ir

buferiškumo (ΔpH). Tarp termostabilumo ir sudėties rodiklių koreliacijų nenustatėme.

Tarp fermentinės koagulacijos ir sudėties rodiklių mūsų darbe nustatytos tik silpnos koreliacijos.

Didėjant κ–kazeino, β–kazeino bei bendro kazeino kiekiui, FKT trumpėja, didėjant pH FKT

ilgėja. Fermentinės sutraukos stiprumui teigiamos įtakos turi κ–kazeino, β–kazeino, αs1–kazeino

bei bendro kazeino kiekiai, kalcio koncentracija.

52

25 lentelė. Koreliacinis ryšys tarp juodmargių galvijų pieno sudėties ir technologinių rodiklių

Sudėties

rodiklis

Technologinis

rodiklis Koreliacija

Sudėties

rodiklis

Technologinis

rodiklis Koreliacija

κ–kazeinas g/l

RKT, min.

0,57*** κ–kazeinas g/l

FKT, min.

-0,26**

αs1–kazeinas

g/l 0,48** β–kazeinas g/l -0,24**

β–kazeinas g/l 0,40** Kazeino suma

g/l -0,21*

β–

laktoglobulinas

g/l

0,35* κ–

kazeinas:suma -0,25**

κ–

kazeinas:suma 0,55*** pH 0,24**

Ca, mg/100g

pieno 0,51** κ–kazeinas g/l

G'F40, Pa

0,33**

κ–kazeinas g/l

G'R40, Pa

-0,78** αs1–kazeinas

g/l 0,29*

αs2–kazeinas

g/l -0,69** β–kazeinas g/l 0,34**

αs1–kazeinas

g/l -0,69**

Kazeino suma

g/l 0,30*

β–kazeinas g/l -0,70** κ–

kazeinas:suma 0,34*

Kazeino suma

g/l -0,78**

Ca, mg/100g

pieno 0,20

β–

laktoglobulinas

g/l

-0,60* αs2–kazeinas

g/l

pH

0,25**

κ–

kazeinas:suma -0,65** U, mg/proc. 0,28**

Ca, mg/100g

pieno -0,67**

L, proc. -0,25**

pH ΔpH 0,42*** pH -0,47*

3.6. Riebaluose tirpių vitaminų kiekis juodmargių karvių piene priklausomai nuo

holšteinizacijos laipsnio ir sezono

Šiame tyrime nustatėme dviejų vitaminų – A ir D3, kiekį juodmargių karvių piene. Abu šie

vitaminai priskiriami riebaluose tirpių grupei, kuriai būdinga perteklinio kiekio įtakojama

toksiškumo problema bei galimas deficitas, kuomet su maistu gaunami nepakankami kiekiai.

Riebaluose tirpūs vitaminai A ir D3 buvo tiriami ne visuose pieno mėginiuose. Buvo atrinkta 10

karvių: keturios iš pirmosios grupės (0 – 49 holšteinizacijos laipsnis) ir po dvi iš kitų trijų tirtų

karvių grupių.

53

26 lentelė. Vitaminų D3 ir A kiekis skirtingo holšteinizacijos laipsnio karvių pieno mėginiuose,

µg/100g

Rodiklis Grupė pagal holšteinizacijos laipsnį

0–49 50–69 70–79 80–90

Mėginių skaičius, n 32 18 19 19

Vitaminas D3 1,13±0,66a

1,05±0,67a

1,27±0,94a

0,67±0,36b

Ribos min-max 0,42-2,54 0,4-2,50 0,38-2,94 0,13-1,53

Vitaminas A 78,51±31,37a

86,72±48,85a

114,54±50,46c

67,66±31,14b

Ribos min-max 33,53-164,09 26,14-195,20 32,89-216,19 28,09-161,19

± standartinis nuokrypis, a, b, c

–vidurkiai, lentelės eilutėse pažymėti skirtingomis raidėmis, statistiškai reikšmingai

skiriasi tarpusavyje (p<0,05)

Iš tyrimų rezultatų matyti, kad visoms grupėms būdingas tirtų vitaminų kiekio išsibarstęs kitimas

pieno mėginiuose (26 lentelė). Didžiausia vidutinė vitamino D3 vertė 1,27 µg/100g ir A vertė

114,54 µg/100g nustatyta holšteinizacijos laipsnio 70-79 grupėje, mažiausia – vitamino D3 0,67

ir A 67,66 µg/100g – holšteinizacijos laipsnio 80-90 grupėje. Atlikta statistinė analizė (esant

tikimybei p<0,05) parodė statistiškai reikšmingą skirtumą tarp tirtų grupių vertinant vitamino D3

koncentraciją piene, kuris statistiškai mažiausias holšteinizacijos laipsnio 80-90 grupės karvių

piene (0,67±0,36 µg/100g), taip pat statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas vitamino A

kiekio atžvilgiu: holšteinizacijos laipsnio 70-79 grupės karvių piene vitamino A koncentracija

didžiausia (114,54±50,46 µg/100g), o holšteinizacijos laipsnio 80-90 grupės – mažiausia

(67,66±31,14 µg/100g). Galima teigti, jog mažiausias vitaminų A ir D3 kiekis būdingas

holšteinizacijos laipsnio 80-90 grupės karvių pienui (H81, H85), o didžiausias vitamino A kiekis

karvių pienui, kurių holšteinizacijos laipsnis H70, H75.

Vertinant sezoniškumo įtaką vitaminų kiekiui piene nustatyta, kad mažiausia vitamino D3

vidutinė vertė buvo pavasarį 0,75 µg/100g ir žiemą 0,78 µg/100g, tai 2 kartus mažiau nei vasaros

ir 1,5 karto mažiau nei rudens sezone (27 lentelė). Statistiškai reikšmingai skyrėsi vidutinis

vitamino D3 kiekis vasaros sezone – jis buvo didžiausias (1,56 µg/100g), nors maksimali viso

tyrimo laikotarpiu nustatyta vertė 2,94 µg/100g buvo rudens sezone.

Vitamino A vidutinės vertės mažesnės buvo vasarą (79,83 µg/100g) ir pavasarį (80,8 µg/100g),

tačiau lyginant su vitaminu D3 tokio pat ryškaus pokyčio tarp skirtingų sezonų nematyti.

Didžiausia vidutinė vitamino A vertė nustatyta žiemos periodu (98,38 µg/100g), tačiau

didžiausias viso tyrimo laikotarpiu nustatytas vitamino A kiekis piene buvo pavasario sezone –

216,19 µg/100g. Kaip matome, vitamino A kiekis kito labai plačiose ribose, statistinė analizė

neparodė reikšmingų skirtumų tarp vitamino kiekio pavasario, vasdaros, rudens ir žiemos

laikotarpiu.

27 lentelė. Vitaminų D3 ir A kiekis skirtingais sezonais karvių pieno mėginiuose, µg/100g.

Rodiklis Sezonas

Pavasaris Vasara Ruduo Žiema

Mėginių skaičius, n 30 20 25 13

Vitaminas D3 0,75±0,30a 1,56±0,84

b 1,15±0,86

a 0,78±0,35

a

Ribos min-max 0,25-1,51 0,38-2,54 0,13-2,94 0,4-1,44

Vitaminas A 80,8±37,59a 79,83±40,55

a 89,43±52,29

a 98,38±36,90

a

Ribos min-max 26,14-216,19 33,06-153,91 34,02-195,20 32,89-178,44

± standartinis nuokrypis, a, b

– vidurkiai, lentelės eilutėse pažymėti skirtingomis raidėmis, statistiškai reikšmingai

skiriasi tarpusavyje (p<0,05)

54

Kadangi pieno sudedamosios dalys nėra stabilios ir jų kiekybinė bei kokybinė įvairovė priklauso

nuo daugelio veiksnių, manoma jog vasaros (ganykliniu) laikotarpiu piene esančių sausųjų

medžiagų (vitaminų, makro(mikro) elementų, baltymų, riebalų ir kt.) aptinkami didesni kiekiai

nei tvartiniu, kuomet gyvulio organizme sunaudojamos per vasarą sukauptos mineralinių

medžiagų ir vitaminų atsargos. Taip pat teigiama, jog įtakos turi žiemos metu tiekiami

konservuoti pašarai (silosuota žolė, džiovintas šienas), kurie maistingumu neprilygsta šviežiai

žolei.

Apibendrinus visus 88 ištirtus pieno mėginius, nustatyta, kad vidutinis vitamino D3 kiekis buvo

1,05±0,71 µg/100g ir A kiekis 85,65±42,62 µg/100g. Vidutinis tirto pieno riebumas buvo

4,87±1,10 %. Vertinant koreliaciją tarp vitaminų kiekio, nustatyta silpna priklausomybė tarp

vitaminų D3 ir A (r 0,39), tačiau ryšio tarp pieno riebumo ir vitamino A kiekio nenustatyta (r

0,01), o ryšys tarp riebumo ir vitamino D3 kiekio labai silpnas – r lygi 0,12.

Vitamino A ir D kiekis juodmargių karvių piene tirtas pirmą kartą. 2013 m. LSMU Veterinarijos

akademijoje buvo atliktas tyrimas, kuriame nustatytas kito riebaluose tirpaus vitamino –

vitamino E kiekis piene. Nustatyta, kad iš pieno ūkių paimtuose pieno mėginiuose didžiausias

vitamino E kiekis buvo Lietuvos žalųjų karvių ūkyje vasarą 0,85 mg/kg, žiemą – 0,80 mg/kg.

Mažiausias vitamino E kiekis vasaros piene nustatytas mišriame karvių ūkyje 0,72 mg/kg,

žiemos piene – Lietuvos juodmargių karvių ūkyje 0,63 mg/kg. Tyrimo autoriai padarė išvadą,

kad pasterizacijos procesas, sandėliavimo laikas ir temperatūra, brandinimo trukmė mažina

vitamino E kiekį piene ir jo produktuose. Taip pat vitamino kiekis priklauso nuo sezoniškumo,

vasarą gaunamame piene ir iš jo pagamintuose produktuose nustatomas didesnis vitamino E

kiekis nei žiemos piene. Nuo šėrimo raciono kinta vitamino E kiekis, nes ganykliniu laikotarpiu,

gyvuliai gauna daugiau žaliųjų, vitaminingųjų pašarų, nei šaltuoju metų laiku (Kačinskaitė-

Žuvaitienė, 2007).

3.7. Pieno baltymų virškinamumo tyrimai

Pieno baltymų biologinė vertė įprastai išreiškiama jų aminorūgščių sudėtimi. Žinoma, kad

didesnis nepakeičiamųjų aminorūgščių kiekis lemia aukštesnę šių baltymų biologinę vertę,

lyginant su kitais, ypač augalinės kilmės, baltymais. Tačiau baltymų biologinės vertės

nustatymui ne mažiau svarbu yra žinoti, kaip greitai žmogaus organizmas gali pasisavinti

baltymus, t.y. koks yra jų biologinis prieinamumas.

Šiame tyrimų etape lyginome senojo genotipo karvių ir Holšteino veislės karvių pieno baltymų

biologinę vertę, atlikdami pieno bei iš jo pagamintų rūgštinės ir fermentinės sutraukos

virškinamumo tyrimus in vitro. Tuo tikslu imitavome pieno baltymų virškinimą skrandyje bei

plonosiose žarnose ir skirtingais virškinimo etapais vertinimo tokius rodiklius: baltymų

hidrolizės laipsnį fluoresamininiu metodu, baltymų hidrolizės produktų kokybinę sudėtį SDS-

PAGE metodu bei baltymų hidrolizės metu susidariusių peptidų kokybinę ir kiekybinę sudėtį

SCh-ESI-MS/MS metodu.

3.7.1 Pieno baltymų hidrolizės laipsnio įvertinimas virškinimo in vitro etapuose

Iš senojo genotipo ir Holšteino veislės karvių pieno pagamintų rūgštinės bei fermentinės

sutraukų proteolizės laipsnis virškinimo metu įvertintas naudojant fluoresamininę analizę, kuria

nustatomas laisvų aminorūgščių ir peptidų pirminių amino grupių kiekis, išreikštas mMol Leu

ekvivalentais. Nustatėme, kad visų mėginių virškinimo metu laisvų aminorūgščių ir mažos

molekulinės masės peptidų koncentracija palaipsniui didėja veikiant proteolitiniams virškinimo

fermentams (10 pav.). Virškinimo skrandyje metu (S1, S2, S3 mėginiai atitinkamai paimti po 30

min., 60 min., 120 min. virškinimo skrandyje imitavimo) abiejų veislių karvių pieno produktų

hidrolizavimo tendencijos panašios. Akivaizdus skirtumas atsiranda prasidėjus virškinimo

55

žarnyne etapui (Ž1, Ž2, Ž3 mėginiai atitinkamai paimti po 30 min., 60 min., 120 min. virškinimo

žarnyne imitavimo). Nustatėme, jog po 4 valandų virškinimo imitavimo in vitro sistemoje (Ž3)

daugiau (500 mMol Leu ekvival.) mažos molekulinės masės junginių buvo atskelta nuo baltymų

grandinės rūgštiniu būdu gamintoje sutraukoje nei nuo baltymų fermentiniu būdu gamintoje

sutraukoje (350-400 mMol Leu ekvival.). Barbe ir kt. (2014) aprašė tyrimą, kurio metu nustatyta,

jog pieno rūgštiniai ir fermentiniai geliai pasižymi skirtinga virškinimo kinetika. Įrodyta, jog

pieno baltymų koaguliavimo procesas turi įtakos pieno produktų mitybinei vertei atpalaiduojamų

aminorūgščių atžvilgiu. Virškinant fermentiniu būdu gautą pieno sutrauką į kraujo plazmą

patenka ženkliai mažesni kiekiai aminorūgščių nei virškinant rūgštinės koaguliacijos būdu gautą

pieno sutrauką. Toks skirtumas aiškinamas tuo, jog fermentiniu būdu koaguliavusio pieno

kazeino micelės pH yra aukštesnis nei rūgštiniu būdu (pH 4,6), todėl praeina ilgesnis laikas, kol

pepsinas pradeda hidrolizuoti baltymus (pepsinolizė prasideda kai terpės pH 2). Taip pat

hidrolizės skirtumai gali atsirasti dėl skirtingos sutraukų makrostruktūros. Tik 25 % kazeino

aminorūgščių pavidalu aptinkama kraujo plazmoje praėjus 12 valandų po virškinimo pradžios,

kai tuo tarpu pasisavinama 90 % rūgštiniu būdu koaguliavusių pieno baltymų (Vercruysse ir kt.,

2005, Ming-Fang ir kt., 2014).

Tiek iš Lietuvos senojo genotipo juodmargės karvės veislės pieno, tiek iš Holšteino veislės

karvės pieno pagamintos rūgštinės sutraukos virškinimo tendencijos mažos molekulinės masės

junginių susidarymo atžvilgiu panašios (atitinkamai LV–R ir HV–R kreivės). Priešingai šiai

tendencijai, akivaizdus skirtumas matomas tarp iš skirtingų karvių veislių pieno pagamintos

fermentinės sutraukos virškinimo – nuo fermentinės sutraukos, pagamintos iš holšteinizuotos

veislės karvių pieno, atskeliamas didesnis kiekis laisvų aminorūgščių ir peptidų (skirtumas apie

50 mMol Leu ekvival.).

Lyginant pieno baltymų koaguliacijos įtaką laisvų aminorūgščių susidarymui, matoma, jog

didesnis laisvų aminorūgščių ir peptidų kiekis randamas fermentinės sutraukos (LV–F, HV–F)

nei rūgštinės sutraukos (LV–R, HV–R) VTE mėginiuose (11 pav.)

10 pav. Laisvų amino grupių skaičius (išreikštas mMol Leu ekvivalentų koncentracija mėginyje)

kitimas pieno baltymų virškinimo metu: LV–F – fermentinė sutrauka, pagaminta iš senojo

genotipo karvių pieno, LV–R – rūgštinė sutrauka, pagaminta iš senojo genotipo karvių pieno,

HV–F – fermentinė sutrauka, pagaminta iš Holšteino veislės karvių pieno, HV–R – rūgštinė

sutrauka, pagaminta iš Holšteino veislės karvių pieno. Mėginių skiedimas, nepriklausomai nuo

virškinimo etapo, normalizuotas pagal mažiausią skiedimą.

56

11 pav. Laisvų amino grupių skaičius, išreikštas mMol Leu ekvivalentais, skirtingu būdu gautų

sutraukų vandenyje tirpiuose ekstraktuose

Pieno mėginiuose laisvų aminorūgščių kiekis buvo toks mažas, kad identifikuoti nepavyko.

Žinoma, jog sveikų karvių piene baltymų skilimas nevyksta. Baltymų skilimo produktų daugėja

didėjant somatinių ląstelių skaičiui (SCC) karvių užkrėstų S. Uberis piene (Larsen ir kt., 2004).

3.7.2. Pieno baltymų proteolizės produktų kokybinis įvertinimas įvairiuose virškinimo in

vitro etapuose

Anksčiau aptartus rezultatus apie mažos molekulinės masės baltymų skilimo produktų didėjimo

tendencijas virškinimo metu patvirtina ir baltymų hidrolizės produktų kokybinės analizės

rezultatai, kuriuos gavome SDS–PAGE metodu. Žinoma, kad kazeino frakcijų molekulinė masė

yra 11÷25 kDa. 12 paveiksle matoma, jog virškinimo pradžioje visų sutraukų mėginiuose

vyrauja didesnės molekulinės masės azoto junginiai (kazeino frakcijos). Tai rodo, jog baltymai

nėra pilnai suvirškinami skrandyje. Svarbiausias baltymų virškinimo ir pasisavinimo etapas –

proteolizė, įvyksta žarnyne (Vercruysse ir kt., 2005). Prasidėjus virškinimo plonosiose žarnose

etapui tiek fermentinės tiek rūgštinės sutraukos virškinimo sultyse matoma, jog

stambiamolekuliai junginiai yra visiškai hidrolizuoti iki mažos molekulinės masės (<11 kDa)

azoto junginių (kazeino frakcijos hidrolizės produktų).

Abiejų veislių karvių pieno sutraukų vandens ekstraktų (VTE) profiliai yra panašūs. Ant

poliakrilamido gelio matomas vandenyje ištirpęs kazeinas bei galimai β–laktoglobulinas (18

kDa) (Farrell ir kt., 2004); šis baltymas teoriškai turėjo būti pašalintas išrūgų atskyrimo metu (žr.

3.5 skyrių), tačiau likučiai galimai liko prikibę prie kazeino micelių aglomeratų iki išplovimo

vandeniu – VTE paruošimo.

57

12 pav. Sutraukų baltyminių medžiagų kitimo profiliai virškinimo metu, nustatyti elektroforezės

metodu (SDS-PAGE)

3.7.3. Baltymų virškinimo in vitro metu susidariusių peptidų profilis

Peptidų profilio analizė SCh–ESI–MS/MS metodu atlikta skirtingų karvių (Lietuvos senojo

genotipo juodmargės karvės veislės LV, Holšteino veislės karvės HV) skirtingais būdais

(fermentiniu F ir rūgštiniu R) pagamintų sutraukų vandeniniams ekstraktams (VTE) ir

mėginiams po 2 val. virškinimo skrandyje (S3) ir 2val. virškinimo žarnose (Ž3). Gauti peptidai

identifikuoti naudojant Mascot duomenų bazę ir priskirti tam tikros kazeino frakcijos (β, αs1, αs2

arba κ) proteolizės produktams.

Biologiškai aktyvūs peptidai gali susidaryti dviem keliais: pačiuose pieno produktuose,

priklausomai nuo jų gamybos sąlygų ir baltymų skilimo procesų bei žmogaus organizme,

virškinant pieno baltymus. Tyrimo metu identifikuoti bioaktyvūs peptidai, susidarę tiek

technologinio proceso, tiek virškinimo imitavimo in vitro sistemoje metu.

Analizuodami duomenis radome peptidų, kurie atskelti ne tik nuo kazeino bet ir nuo β–

laktoglobulino baltymo molekulės. Kad rūgštinės ir fermentinės sutraukų mėginiuose galimai yra

β–laktoglobulino parodė ir elektorforezės rezultatai (12 pav).

Peptidų, atskeltų nuo išrūgų baltymo β–laktoglobulino radome tik mėginiuose po sutraukų 2 val.

virškinimo skrandyje. Pasibaigus virškinimo žarnyne imitavimo procesui β–laktoglobulino

hidrolizė buvo įvykusi pilnai. Abiejų tiriamų karvių pieno sutraukų iš β–laktoglobulino pepsino

atskeltų peptidų profilis panašus (28 lentelė). Literatūroje pažymima, jog natyvinis β–

laktoglobulinas yra atsparesnis virškinimui skrandžio fermentais nei kazeinas dėl savo antrinės

struktūros (Zhao ir kt., 2017), tačiau Pinto ir kt. (2014) nustatė, jog β–laktoglobulinas tampa

jautresnis virškinimo fermentams po kaitinimo ir yra visiškai suvirškinamas po 40 min. veikimo

pepsinu (aktyvumas 3800 U/mg).

28 lentelė. Rūgštinės ir fermentinės sutraukų virškinimo in vitro skrandžio etapo pabaigoje

susidarę peptidai, kurių prekursorius išrūgų baltymas β–laktoglobulinas

Identifikuota

masė

Teorinė

masė

Padėtis

grandinėje

Peptidas S3 mėginys

LV-F LV-R HV-F HV-R

901,508 901,502 12–19 IQKVAGTW + + + +

955,502 955,509 33–41 DAQSAPLRV + + + +

1068,636 1068,593 32–41 LDAQSAPLRV + + + +

1104,559 1104,585 02–11 IVTQTMKGLD + + + +

1129,581 1129,613 10–19 LDIQKVAGTW +

1488,641 1488,735 42–54 YVEELKPTPEGDL + + +

58

Atlikę mėginių chromatografinę analizę, kaip detektorių naudojant masių spektroskopą, ir

išanalizavę duomenis duomenų bazėje Mascot (Matrix Science, MA, US) identifikavome 317

skirtingus peptidus, atskeltus fermentinės ir rūgštinės sutraukų technologinio proceso metu, arba

šių sutraukų virškinimo in vitro metu, veikiant proteazėms (pepsino, tripsino, chimotripsino ir

kt., esančioms virškinimo sulčių sudėtyje. Nustatėme, kad 151 peptidas buvo atskeltas nuo β–

kazeino molekulės, 81 peptidas nuo αs1–kazeino molekulės, 25 – nuo αs2–kazeino molekulės ir

60 – nuo κ–kazeino molekulės. Iš viso identifikavome 317 skirtingų peptidų (iš jų 10

fosfopeptidų), kurių prekursorius yra pagrindinis pieno baltymas kazeinas. Kazeinas sudaro apie

80 % visų pieno baltymų, αs1–, αs2–, β–, ir κ–kazeinų frakcijos pasiskirsčiusios atitinkamai

santykiais 4:1:4:1 (Bionizzi ir kt., 2009). Mūsų tyrimo duomenimis gautų peptidų kokybinis

pasiskirstymas apytiksliai lygus 3:1:6:2. Schmelezer ir kt. (2007) atliko β–kazeino frakcijos

rūgštinę hidrolizę su HCl bei hidrolizę pepsinu ir identifikavo 125 skirtingus peptidus. Zhao ir kt.

(2017) atliko išgryninto β–kazeino virškinamumą in vitro sistemoje ir identifikavo tik 14

peptidų. Kai kurie iš jų rasti ir šio tiriamojo darbo mėginiuose (fragmentai 193–209, 193–207,

129–142, 177–189, 164–176).

Peptidų, gautų iš tam tikros pieno baltymų frakcijos pasiskirstymas mėginiuose pavaizduotas 13

paveiksle.

13 pav. Peptidų, gautų iš sutraukų skirtingų kazeino frakcijų technologinio proceso ir virškinimo

metu, kiekybinis pasiskirstymas

Diagramoje matoma, jog daugiausiai peptidų tiek technologinio proceso metu tiek virškinimo

skirtinguose etapuose metu buvo atskelta nuo β–kazeino grandinės, nes tai didžiausia kazeino

frakcija. Svarbu pažymėti, kad Lietuvos senojo genotipo juodmargių karvių pieno fermentinės

sutraukos proteolizės profilis pasižymi didžiausiu skirtingų peptidų kiekiu.

Identifikuoti peptidai sudaryti iš mažiausiai 5 (rasta visuose mėginiuose), daugiausiai 25

aminorūgščių (identifikuotas peptidas atskeltas nuo Holšteino veislės karvės pieno rūgštinės

sutraukos β–kazeino frakcijos po 2 val. virškinimo skrandyje) (žr. 1 priedas). Bioaktyvūs

peptidai, gaunami iš pieno baltymų, paprastai būna sudaryti iš 2–20 aminorūgščių (Mohanty ir

kt., 2016). Mažos molekulinės masės peptidams priskyrėme peptidus, kurie sudaryti iš 3–9

aminorūgščių (Koph-Bolanz ir kt., 2014). Mažų – didelių peptidų pasiskirstymas mėginiuose

pavaizduotas 14 pav.

59

Fermentinės ir rūgštinės sutraukų vandeniniuose ekstraktuose (VTE mėginiai) nustatytas

mažesnis bendras peptidų kiekis (ypač mažos molekulinės masės), nei tų pačių sutraukų

mėginiuose po virškinimo. Abiejų sutraukų virškinimo metu atskeliamų nuo baltymų grandinės

peptidų skaičius didėja: po 2 val. virškinimo žarnyne (Ž3 mėginiai) bendras peptidų skaičius yra

didesnis nei po 2 val. virškinimo skrandyje (S3 mėginiai). 14 paveiksle matoma, jog po

virškinimo plonosiose žarnose daugėja didesnių peptidų, o mažos molekulinės masės peptidų

skaičius nežymiai mažėja.

14 pav. Peptidų, gautų iš sutraukų skirtingų kazeino frakcijų technologinio proceso ir virškinimo

metu, kiekybinis pasiskirstymas mėginiuose pagal aminorūgščių kiekį.

3.7.4 Baltymų skilimo ir peptidų susidarymo skirtumai fermentinėje bei rūgštinėje

sutraukoje

Tiek fermentinėje, tiek rūgštinėje sutraukoje peptidai pradeda formuotis pieno technologinio

apdorojimo metu. Pienarūgštės raugo bakterijos, naudojamos rūgštinės sutraukos gamyboje kaip

pagrindinis technologinis veiksnys bei fermentinės sutraukos gamyboje pH sumažinimui iki

fermento renino optimalaus pH (6–6,6), išskiria fermentus, kurie pradeda baltymų hidrolizę.

Išanalizavę VTE peptidų atskeltų nuo β–kazeino grandinės profilius gavome, kad iš 55 skirtingų

peptidų tik 4 rasti visuose mėginiuose (15 pav.). 20 peptidų radome tik abiejų veislių karvių

pieno fermentinių sutraukų vandeniniuose ekstraktuose, 5 peptidai buvo identifikuoti tik

Lietuvos senojo genotipo juodmargės karvės pieno fermentinėje sutraukoje. Abiejų analizuojamų

karvių pieno rūgštinėse sutraukose rasti 9 peptidai, 7 peptidai identifikuoti tik Lietuvos senojo

genotipo juodmargės karvės rūgštinės sutraukos VTE, peptidų būdingų tik Holšteino veislės

karvės pieno rūgštinei ar fermentinei sutraukai nerasta. Iš κ–kazeino grandinės fermentinės

sutraukos gamybos metu buvo atskelta mažiau peptidų nei rūgštinės sutraukos gamybos metu

(16 pav.). Identifikavome 5 peptidus (vienas iš jų pasižymi bioaktyvumu), kurie būdingi abiejų

tiriamų veislių karvių pieno fermentinėms sutraukoms. 3 iš šių 5 peptidų rasti ir rūgštinių

sutraukų vandeniuose ekstraktuose. Rūgštinės sutraukos vandeniuose esktraktuose rasta iš viso

20 peptidų, iš kurių 8 būdingi tik Lietuvos senojo genotipo juodmargės karvės pieno rūgštinei

sutraukai, 3 – Holšteino veislės karvės pieno rūgštinei sutraukai. 45 % peptidų būdingi abiejų

veislių karvių rūgštinių sutraukų vandeniniams ekstraktams. Iš αs2–kazeino rūgštinės sutraukos

gamybos metu neatskeltas nė vienas peptidas, rasti 3 peptidai, kurie būdingi abiejų tiriamų

60

karvių veislių pieno fermentinių sutraukų vandeniniams ekstraktams. αs1–kazeino grandinė

technologinio proceso metu suskaldyta taip, kad 9 % peptidų rasti visuose tirtuose mėginiuose,

41 % peptidų būdingi tik fermentinių sutraukų vandeniniams ekstraktams, 14 % identifikuota tik

rūgštinių sutraukų vandeniniuose ekstraktuose (iš viso 21 peptidas). 3 peptidai būdingi tik

Lietuvos senojo genotipo juodmargės karvės pieno fermentinei sutraukai, tuo tarpu 2 peptidai

rasti tik Holšteino veislės karvės pieno fermentinės sutraukos vandeniniame ekstrakte. 1 peptidas

būdingas tik Holšteino veislės karvės pieno rūgštinei sutraukai, Lietuvos senojo genotipo

juodmargės karvės pieno rūgštinėje sutraukoje nerasta peptidų, kurie būtų būdingi tik jai vienai.

Gauta tendencija, jog didesnis skirtingų peptidų kiekis rastas fermentinės sutraukos mėginiuose

prieš virškinimą. Fluoresamininės analizės, kurios metu nustatytas laisvų amino grupių kiekis,

išreikštas mMol Leu ekvivalentais, rezultatai parodė, jog daugiau mažos molekulinės masės

junginių yra mėginiuose, kurie pagaminti naudojant pienarūgštes bakterijas ir fermentą, o ne vien

pienarūgštes bakterijas (15 pav). Renino poveikis labiausiai pasireiškia 167–209 β–kazeino

grandinės fragmente. Čia akivaizdžiai atskelta daugiau skirtingų peptidų nuo fermentinės

sutraukos vandeninių ekstraktų (LV–F ir HV–F kreivės), nei nuo rūgštinės sutraukos vandeninių

ekstraktų (LV–R ir LV–F kreivės). Rūgštinės sutraukos β–kazeino 41–81 regionas jautresnis

hidrolizei nei fermentinės sutraukos 16 pav.

15 pav. Vandenyje tirpių ekstraktų (VTE) β–kazeino frakcijos hidrolizės produktų profilis

61

Fermentinės sutraukos gamybos metu hidrolizuotas αs2–kazeino grandinės galas – 166–195

regionas. Kai tuo tarpu αs1–kazeino grandinės hidrolizės produktų rasta daugiausiai atskeltų nuo

grandinės pradžios.

Fermentinės sutraukos gamyboje κ–kazeino suskaldymas ties jautriausia jungtimi (105–106) yra

svarbiausias žingsnis fermentinės sutraukos susidarymo procese (Frederiksen ir kt., 2011).

Išanalizavus fermentinių sutraukų VTE gautas 1 peptidas atskeltas nuo para–κ–kazeino

grandinės (96–105), likę 4 yra glikomakropeptido hidrolizės produktai. Glikomakropeptido

grandinės galinės grupės neatsparios hidrolizei, 3 peptidai rasti ir rūgštinių sutraukų

vandeniniuose ekstraktuose. Kiti peptidai, identifikuoti rūgštinių sutraukų mėginiuose atskelti

nuo 21–85 κ–kazeino grandinės dalių.

16 pav. Vandenyje tirpių ekstraktų (VTE) κ–kazeino frakcijos hidrolizės produktų profilis

Karčiųjų peptidų susidarymas priklauso nuo gamybai naudojamų pienarūgščių bakterijų. Jų

pagrindiniai prekursoriai αs1–ir β–kazeinai. Šie peptidai turi įtakos galutinio produkto skoniui.

Sutraukų VTE mėginiuose nustatėme kartųjį peptidą atskeltą nuo β–kazeino grandinės (176–182

fragmentas, KAVPYPQ) (Lemieux ir Simard, 1992).

62

3.7.5 Peptidų profilio kitimas pieno fermentinės ir rūgštinės sutraukų virškinimo in vitro

metu

β–kazeino hidrolizė

50 % bendro skirtingų peptidų atskeltų nuo β–kazeino grandinės identifikuotų po 2 val.

virškinimo skrandyje imitavimo in vitro sistemoje būdingi abiejų tiriamų karvių pieno abiejų tipų

sutraukų S3 mėginiams, iš jų 16 % pasižymi bioaktyvumu. 10 % bioaktyvių peptidų atsparūs

tolimesnei hidrolizei ir rasti Ž3 mėginiuose po virškinimo žarnyne imitavimo in vitro sistemoje.

1 peptidas būdingas tik Holšteino veislės karvės pieno abiejų tipų sutraukų Ž3 mėginiams.

Skirtumų tarp sutraukos tipo virškinimo žarnyne peptidų profilio atžvilgiu daugiau – rasta 3 ir 2

peptidai būdingi tik atitinkamai fermentinių ir rūgštinių sutraukų Ž3 mėginiams nepriklausomai

nuo karvės veislės. 13 peptidų rasti tik viename kažkuriame Ž3 mėginyje iš 4 (6 peptidai – LV–

F–S3 mėginyje, 2 – LV–R–S3, 2 – HV–F–S3, 3 – HV–R–S3). Po 2 val. virškinimo žarnyne rasti

44 skirtingi peptidai, 8 iš jų pasižymi bioaktyviomis savybėmis, 5 iš jų būdingi abiejų tiriamų

karvių abiejų tipų sutraukų Ž3 mėginiams. 35 % peptidų rastų Ž3 mėginiuose buvo rasti ir S3

mėginiuose. 50 % bendro skirtingų peptidų skaičiaus identifikuoti visuose Ž3 mėginiuose, 1

peptidas būdingas tik senojo genotipo Lietuvos juodmargės karvės pieno abiejų tipų sutraukų Ž3

mėginiams, 3 – Holšteino veislės karvės pieno abiejų tipų sutraukų Ž3 mėginiams, 1 iš jų

pasižymi biologiniu aktyvumu (VYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQT 59–80 fragmentas)

αs1–kazeino hidrolizė

58 % skirtingų peptidų atskeltų nuo αs1–kazeino grandinės identifikuotų po 2 val. virškinimo

skrandyje imitavimo in vitro sistemoje būdingi abiejų tiriamų karvių pieno abiejų tipų sutraukų

S3 mėginiams, iš jų 18 % pasižymi bioaktyvumu, 36 % peptidų yra atsparūs tolimesnei

hidrolizei ir žarnyno fermentų veiklai, todėl randami ir mėginiuose po 2 val. virškinimo žarnyne

(Ž3 mėginiai). 4 peptidai yra būdingi tik Lietuvos senojo genotipo juodmargės karvės pieno

sutraukos proteolizės skrandyje produktams (1 peptidas būdingas tik rūgštinės sutraukos S3

mėginiui, 1 – tik fermentinės sutraukos S3 mėginiui), 5 peptidai būdingi tik Holšteino veislės

karvės peno sutraukos proteolizės skrandyje produktams (3 iš jų būdingi tik rūgštinės sutraukos

mėginiui po virškinimo (S3)). 2 peptidai būdingi abiejų tiriamų karvių rūgštinių sutraukų S3

mėginiams, kai tuo tarpu tik fermentinių sutraukos S3 mėginiui būdingų peptidų nerasta.

Mėginiuose po 2 val. virškinimo žarnyne imitavimo in vitro sistemoje radome 38 skirtingus

peptidus, 42 % identifikavome visuose Ž3 mėginiuose. 2 peptidai buvo identifikuoti tik

fermentinių sutraukų Ž3 mėginiuose, 1 peptidas tik rūgštinių abiejų karvių veislių pieno sutraukų

Ž3 mėginiuose. Peptidų, būdingų tik vienos kažkurios veislės abiejų tipų sutraukų Ž3 mėginiams

nenustatėme.

αs2–kazeino hidrolizė

40 % bendro skirtingų peptidų atskeltų nuo αs2–kazeino grandinės identifikuotų po 2 val.

virškinimo skrandyje imitavimo in vitro sistemoje skaičiaus būdingi abiejų tiriamų karvių pieno

abiejų tipų sutraukų S3 mėginiams. Abiejų veislių karvių pieno sutraukų S3 mėginiai tarpusavyje

nesiskiria peptidų profiliu, skirtumas yra tik tarp skirtingų sutraukų S3 mėginių. Visi peptidai

hidrolizuojami iki aminorūgščių per 2 val. virškinimo žarnyne imitavimą in vitro sistemoje – Ž3

mėginiuose nerastas nė vienas peptidas, kurį būtume nustatę ankščiau. 41 % peptidų rastų Ž3

mėginiuose būdingas visiems. Radome po 1 peptidą, kuris būdingas: tik Lietuvos senojo

genotipo juodmargės karvės pieno abiejų tipų sutraukų Ž3 mėginiams; tik Holšteino veislės

karvės pieno abiejų tipų sutraukų Ž3 mėginiams; tik fermentinių sutraukų Ž3 mėginiams

nepriklausomai nuo pieno, bei tik rūgštinių sutraukų Ž3 mėginiams nepriklausomai nuo pieno.

Visuose Ž3 mėginiuose rastas bioaktyvumu pasižymintis peptidas (AMKPW 189–193

fragmentas).

63

κ–kazeino hidrolizė

2 peptidai, kurie buvo būdingi rūgštinių sutraukų VTE mėginiams išlieka arba atsiranda visuose

mėginiuose po 2 val. virškinimo skrandyje imitavimo in vitro sistemoje, vienas iš jų atsparus

tolimesnei hidrolizei ir rastas visuose Ž3 mėginiuose. 65 % peptidų, kuriuos radome S3

mėginiuose yra būdingi visiems keturiems tirtiems S3 mėginiams. Juose nustatėme 2

bioaktyvumu pasižyminčius peptidus (VQVTSTAV 162–169 fragmentas, FSDKIAKYIPIQ 18–

29 fragmentas). Rasta po 1 peptidą, kuris būdingas tik fermentinių sutraukų Ž3 mėginiams

nepriklausomai nuo pieno, bei tik rūgštinių sutraukų Ž3 mėginiams nepriklausomai nuo pieno.

Po 2 val. virškinimo imitavimo žarnyne in vitro sistemoje nustatėme 3 peptidus, kurie radome ir

mėginiuose po virškinimo skrandyje fazės. Iš 17 peptidų būdingų Ž3 mėginiams 6 rasti visuose

mėginiuose nepriklausomai nuo karvės veislės ar sutraukos tipo, 3 peptidai būdingi tik

fermentinių sutraukų Ž3 mėginiams, 2 tik rūgštinių sutraukų mėginiams.

3.7.6 Bioaktyvūs peptidai, nustatyti pieno fermentinės ir rūgštinės sutraukų virškinimo in

vitro metu

Bioaktyvūs peptidai iš pieno baltymų gali būti gauti tokiais būdais: pieno fermentacija

proteolitinėmis startinėmis kultūromis, proteolitiniais mikrobiologinės ar augalinės kilmės

fermentais arba fermentinė hidrolizė virškinimo fermentais (Phelan ir kt., 2009).

Remiantis užsienio autorių bioaktyvių peptidų, gaunamų iš pieno baltymų virškinimo metu,

tyrimais, išnagrinėtas Lietuvos senojo genotipo juodmargių veislės karvės ir Holšteino veislės

karvės pieno rūgštinių ir fermentinių sutraukų bioaktyvumu pasižyminčių peptidų atpalaidavimo

profilis virškinimo metu ir prieš virškinimą (VTE). Rezultatai pateikti 2 priedo lentelėse.

Tarp bioaktyviomis savybėmis pasižyminčių peptidų daugiausiai identifikavome ACE

inhibitorinį poveikį turinčių peptidų: 27 peptidai iš 30. Šie inhibitoriai sumažina širdies,

kraujagyslių ligų riziką (Stuknyte ir kt., 2015, Ondetti ir kt., 1977). Pieno baltymų peptidams taip

pat būdingas antioksidacinis veikimas (Petrat-Melin ir kt., 2014). Šiame tiriamajame darbe

neidentifikuotas nė vienas antioksidaciniu veikimu pasižymintis peptidas.

Daugiausia bioaktyvių peptidų radome atskeltų nuo β–kazeino frakcijos, iš viso 14. 11 iš jų ACE

inhibitoriai, o likę trys - imunomoduliatorinis–antmikrobinis peptidas, β–kazoksinas bei

katepsino B inhibitorius. Taip pat daug ACE inhibitorių atskelta nuo αs1–kazeino proteolizės

metu (11 peptidų). Stuknyte ir kt. (2015) ištyrė peptidus gautus iš 12 skirtingų rūšių sūrių

vandeninių ekstraktų ir po veikimo virškinimo fermentais, pasižyminčius ACE inhibitoriniu

poveikiu. Analizuotų peptidų (β–kazeino 84–86, 74–76, 134–138, 133–138 ir αs1–kazeino 90–

93, 90–94, 143–148, 143–149 fragmentai) koncentracija VTE buvo labai plačiose ribose – nuo

0,87 iki 331 mg/kg. Mokslininkė nustatė, kad peptidų kiekis priklausė nuo gamybos būdo ir

brandinimo laiko – sūrio laikymo metu daugėja bioaktyviomis savybėmis pasižyminčių peptidų.

Mūsų darbe analizuotų šviežiai pagamintų sutraukų VTE mėginiuose anksčiau minėti peptidai

neidentifikuoti.

Svarbu paminėti, kad akivaizdžių bioaktyvių peptidų profilio skirtumų fermentinėse ir rūgštinėse

sutraukose nepastebėta. Daugelis bioaktyvių peptidų identifikuoti visuose mėginiuose. Po

Holšteino veislės karvės pieno fermentinės ir rūgštinės sutraukų virškinimo žarnyne išlieka ACE

inhibitoriniu poveikiu pasižymintis peptidas buvęs β–kazeino 59–80 padėtyje, kai tuo tarpu po

Lietuvos senojo genotipo juodmargės karvės pieno sutraukų virškinimo žarnyne jo nelieka (17

pav.). VTE rasti mėginiai neišliko virškinimo metu ir buvo suskaidyti iki aminorūgščių, todėl jų

potencialus fiziologinis poveikis galimai nepasireikštų vartotojo sveikatai.

64

17 pav. Bioaktyvūs peptidai, atskelti nuo β–kazeino grandinės sutraukos gamybos metu (VTE),

po virškinimo skrandyje (S3), po virškinimo žarnyne (Ž3)

Po Senojo genotipo Lietuvos juodmargės karvės pieno abiejų tipų sutraukų virškinimo skrandyje

(LV–F–S3 ir LV–R–S3 mėginiai) identifikuotas ACE inhibitorius, kuris užėmė 25–32

(VAPFPEVF) padėtį αs1–kazeino molekulėje, nerastas Holšteino veislės sutraukų Ž3 mėginiuose

po virškinimo žarnyne (18 pav.). Kiti bioaktyvūs peptidai, kuriuos identifikavome po virškinimo

žarnyne fazės (ties Ž3) rasti visuose mėginiuose. VTE rasti mėginiai taip pat neišliko virškinimo

metu ir buvo suskaidyti iki aminorūgščių, todėl jų potencialus fiziologinis poveikis galimai

nepasireikštų vartotojo sveikatai. Dauguma bioaktyvių peptidų identifikuotų po virškinimo

skrandyje rasti ir mėginiuose po virškinimo žarnyne, taigi bioaktyvūs peptidai yra atsparūs

tolimesnei hidrolizei.

65

18 pav. Bioaktyvūs peptidai atskelti nuo αs1–kazeino grandinės sutraukos gamybos metu (VTE),

po virškinimo skrandyje (S3), po virškinimo žarnyne (Ž3)

Peptidai po κ–kazeino virškinimo skrandyje (S3 mėginiai) neidentifikuoti po virškinimo žarnyne

(Ž3 mėginiai) (19 pav.).

66

19 pav. Bioaktyvūs peptidai atskelti nuo κ–kazeino grandinės sutraukos gamybos metu (VTE),

po virškinimo skrandyje (S3), po virškinimo žarnyne (Ž3)

Po αs2–kazeino virškinimo skrandyje identifikuotas ACE inhibitoriniu poveikiu pasižymintis

peptidas rastas visuose mėginiuose (20 pav.)

20 pav. Bioaktyvūs peptidai atskelti nuo αs2–kazeino grandinės sutraukos gamybos metu (VTE),

po virškinimo skrandyje (S3), po virškinimo žarnyne (Ž3)

Fosfopeptidai

Tarp identifikuotų peptidų radome tik 10 peptidų turinčių fosforo (29 lentelė). Crus-Huerta ir kt.

(2015) atliko tyrimą, kurio metu po 1 val. virškinimo skrandyje ir 1val. virškinimo žarnyne

imitavimo in vitro identifikavo 44 peptidus, kuriuose yra fosforo grupę prisijungusio serino.

Manoma, kad fosfopeptidai, turintys grandinėje tris fosforilintas serino molekules, prie kurių

67

prisijungusios dvi glutamo rūgšties molekulės (fragmentas SpSpSpEE), yra atsparūs tolimesnei

hidrolizei ir jų funkcija žarnyne – metalų jonų apsaugojimas nuo nusėdimo (Crs-Huerta ir kt.,

2015).

29 lentelė. Identifikuoti kazeinofosfopeptidai po pieno baltymų virškinimo žarnyne (S3

mėginiuose)

Nr.

Identifik

uota

masė

Teorinė

masė

Padėtis

grandinėje

Peptidas

Kazeino

frakcija

Mėginys

LV

-F

LV

-R

HV

-F

HV

-R

1 2261,845 2264,061 75-93 FQSPEEQQQTED

ELQDKIHP β + + + +

2 1222,489 1222,523 110-119 EIVPNSPAEER αs1 + + + +

Mūsų tyrimo rezultatai parodė, jog po virškinimo žarnyne imitavimo nuo kazeino atskelti tik 2

fosfopeptidai, kurie galimai atsparūs tolimesnei hidrolizei ir turi potencialią naudą vartotojo

sveikatai (29 lentelė). Su Crus-Huerta ir kt. (2015) gautais duomenimis sutampa tik peptidas Nr.

2. Fosforą prisijungusių aminorūgščių kiekis priklauso nuo genetinio varianto, ir gali būti

skirtingas skirtingų veislių ar individų karvių pieno baltymams (Caroli ir kt., 2009).

3.8. Raugintų pieno gėrimų iš juodmargių karvių pieno eksperimentinė gamyba ir kokybės

vertinimas

Siekiant išsiaiškinti juodmargių karvių pieno išskirtinumą tam tikrų pieno produktų gamybai,

pusiau gamybinėmis sąlygomis buvo pagaminti du populiariausi rauginti pieno gėrimai –

rūgpienis ir jogurtas. Šiam eksperimentui buvo atrinktas individualus 17 skirtingo

holšteinizacijos laipsnio juodmargių karvių pienas, pamelžtas 2017 m. vasario – kovo mėn.

Rauginti pieno gėrimai buvo gaminami iš nenormalizuoto pieno, t.y. jo baltymų ir riebalų sudėtis

nebuvo pakeisti. Raugintų pieno produktų gamybai naudoto pieno sudėtis pateikta 2.8 skyriuje

10 lentelėje. Buvo įvertinta kiekvieno pieno mėginio rūgštinės koaguliacijos savybės bei iš jo

pagamintų raugintų pieno gėrimų kokybės rodikliai – pH, sinerezė (išrūgų išsiskyrimas) ir

reologinės charakteristikos, kurių svarbiausia – konsistencijos koeficientas. Kokybės rodikliai

buvo nustatomi technologinio proceso pabaigoje, t.y. praėjus 1 dienai po surauginimo, kai

pasibaigia rauginto pieno gėrimo brandinimas ir praėjus 10 dienų po technologinio proceso,

siekiant įvertinti produkto pokyčius laikymo metu.

30 ir 31 lentelėse pateikti duomenys apie individualių juodmargių karvių pieno rūgštinės

koaguliacijos savybes ir iš šio pieno pagaminto rūgpienio bei jogurto kokybės savybes.

68

30 lentelė. Skirtingo holšteinizacijos laipsnio judmargių karvių pieno rūgštinės koagulicijos

savybės ir iš šio pieno pagaminto rūgpienio kokybės rodikliai

Holšteini

-zacijos

laipsnis

Karvės

Nr.

Rūgštinės

koagulacijos savybės

Rauginto pieno kokybės rodikliai, 1

para po pagaminimo

Rauginto pieno kokybės rodikliai, 10

parų po pagaminimo

RKT,

min

G’40, Pa pH Išrūgų

kiekis %

po 60

min

K,

konsis-

tencijos

koef.

n,

takumo

koef.

pH

Išrūgų

kiekis

% po

60 min

K,

konsis-

tencijos

koef.

n,

takumo

koef.

H0-49 7536-10 22 67,0-67,3 4,52 36,88 2,36 0,38 4,46 36,25 4,79 0,31

7095-19 24 53,6-65,9 4,56 36,00 2,57 0,36 4,38 34,38 4,98 0,39 0520-20 26-31 17,2-39,8 4,70 35,00 1,01 0,41 4,52 39,39 1,64 0,37 0771-21 25 97,7-99,7 4,59 23,75 3,54 0,36 4,39 21,38 6,42 0,27 7033-21 26-27 47,7-56,4 4,61 35,63 2,63 0,32 4,37 29,25 4,71 0,36 6270-23 23 75,9-78,7 4,56 25,98 3,12 0,35 4,48 23,44 6,22 0,27 7495-31 24 61,9-62,4 4,60 40,63 2,32 0,32 4,50 40,00 4,48 0,37

H50-89 9473-59 22-25 78,6-96,0 4,62 27,50 3,18 0,34 4,49 26,25 7,04 0,35 4612-62 27-32 15,3-47,8 4,48 33,13 1,61 0,39 4,40 32,50 3,49 0,37 9052-64 26-28 28,6-29,5 4,71 33,75 1,03 0,39 4,43 30,63 2,84 0,32 2294-68 24-27 54,1-63,9 4,60 33,13 2,56 0,34 4,40 30,75 6,11 0,25 2634-70 25-40 0,17-47,0 4,68 38,75 1,09 0,39 4,49 37,50 1,67 0,35 3371-75 27 66,7-70,3 4,57 30,50 2,90 0,33 4,37 27,00 5,15 0,34 8065-79 25-27 42,5-49,0 4,61 38,75 1,81 0,37 4,42 36,88 2,45 0,39 4648-84 24-28 35,3-42,4 4,69 32,00 1,77 0,38 4,38 30,50 2,20 0,33 0543-85 26-28 34,3-40,2 4,60 37,20 1,83 0,34 4,41 32,25 2,55 0,35 7524-89 23-24 68,8-80,3 4,70 33,75 2,84 0,33 4,39 30,13 5,78 0,36

31 lentelė. Skirtingo holšteinizacijos laipsnio judmargių karvių pieno rūgštinės koagulicijos

savybės ir iš šio pieno pagaminto jogurto kokybės rodikliai

Holšteini

-zacijos

laipsnis

Karvės

Nr.

Rūgštinės

koagulacijos savybės

Jogurto kokybės rodikliai, 1 para po

pagaminimo

Jogurto kokybės rodikliai, 10 parų po

pagaminimo

RKT,

min

G’40, Pa pH Išrūgų

kiekis %

po 60

min

K,

konsis-

tencijos

koef.

n,

takumo

koef.

pH

Išrūgų

kiekis

% po

60 min

K,

konsis-

tencijos

koef.

n,

takumo

koef.

H0-49 7536-10 22 67,0-67,3 4,61 46,25 4,37 0,58 4,44 35,00 7,85 0,37 7095-19 24 53,6-65,9 4,57 50,00 4,05 0,54 4,46 36,88 8,02 0,37 0520-20 26-31 17,2-39,8 4,75 41,88 3,91 0,46 4,46 46,88 4,09 0,42 0771-21 25 97,7-99,7 4,59 38,13 5,51 0,40 4,53 39,38 9,84 0,30 7033-21 26-27 47,7-56,4 4,68 33,13 4,94 0,44 4,52 31,25 7,33 0,45 6270-23 23 75,9-78,7 4,71 41,25 5,04 0,41 4,60 35,63 9,96 0,36 7495-31 24 61,9-62,4 4,59 45,00 3,17 0,44 4,45 36,25 7,38 0,31

H50-89 9473-59 22-25 78,6-96,0 4,59 41,88 5,63 0,41 4,59 34,38 9,81 0,31 4612-62 27-32 15,3-47,8 4,58 38,13 3,83 0,44 4,46 43,13 4,99 0,25 9052-64 26-28 28,6-29,5 4,70 44,38 3,49 0,30 4,41 39,38 4,81 0,27 2294-68 24-27 54,1-63,9 4,72 41,88 4,89 0,43 4,42 36,88 8,27 0,31 2634-70 25-40 0,17-47,0 4,61 45,00 1,53 0,40 4,35 46,25 2,94 0,33 3371-75 27 66,7-70,3 4,57 33,75 4,46 0,39 4,34 30,63 8,47 0,23 8065-79 25-27 42,5-49,0 4,60 43,75 4,81 0,29 4,37 32,50 7,29 0,26 4648-84 24-28 35,3-42,4 4,60 41,88 2,55 0,49 4,45 38,13 7,21 0,33 0543-85 26-28 34,3-40,2 4,69 50,00 2,49 0,46 4,44 31,88 2,69 0,46 7524-89 23-24 68,8-80,3 4,63 37,50 4,46 0,43 4,50 38,75 9,24 0,33

Analizuodami lentelėse pateiktus duomenis galime teigti, kad visų pieno mėginių RKT buvo

panaši ir svyravo ribose nuo 22 iki 32 min. Tačiau pagal rūgštinės sutraukos stiprumą po 40 min

koaguliacijos, pieno mėginiai ženkliai skyrėsi. Iš 17 tirtų pieno mėginių, 4 sudarė labai stiprią

rūgštinę sutrauką, kurios G’40 >70 Pa, 6 - vidutinio stiprumo sutrauką, jų G‘=50-70 Pa, o 7 –

69

sudarė silpną rūgštinę sutrauką, jų G‘<50 Pa. Taip pat svarbu pažymėti, kad iš pieno mėginių,

kurie buvo charakterizuoti kaip sudarantys stiprią rūgštinę sutrauką, pagaminti tiek rūgpienis,

tiek jogurtas buvo klampesni (vertinome pagal konsistencijos koeficientą), geriau sulaikantys

išrūgas (vertinome filtravimo metodu pagal išsiskyrusių išrūgų kiekį po 60 min.). Visais atvejais

pastebėjome raugintų pieno gėrimų struktūros tvirtėjimą laikymo metu. Praėjus 10 parų po

technologinio proceso pabaigos rūgpienio ir jogurto konsistencijos koeficientas didėjo, o

sinerezė mažėjo. Tokia tendencija buvo užregistruota beveik visuose mėginiuose. Tai labai

svarbi technologinė rūgštinės sutraukos savybė, leidžianti užtikrinti produktų kokybę laikymo

metu.

Toliau analizavome, ar karvių holšteinizacija turi įtakos iš jų pieno pagamintų rūgpienio bei

jogurto kokybei. Iš 28 lentelėje pateiktų duomenų matome, kad iš senojo genotipo karvių pieno

pagamintas rūgpienis pasižymėjo klampia tekstūra ir geromis išrūgų sulaikymo savybėmis. Iš

tirtų 7 mėginių, 2 mėginiams nustatytas konsistencijos koeficientas, praėjus 10 d po

technologinio proceso, buvo 6,22 – 6,42, 4 mėginiams konsistencijos koeficientas buvo ribose

4,48 -4,98 ir tik vienam mėginiui nustatytas mažas konsistencijos koeficientas – 1,64. Iš 28

lentelės duomenų matome, kad klampiausios tekstūros rūgpieniui buvo nustatytas mažiausias

išsiskyrusių išrūgų kiekis – 21,38-23,44 %. Daugiausiai išrūgų (39,39 %) išsiskyrė iš rūgpienio,

kuris buvo charaterizuotas kaip mažiausios klampos. Iš holšteinizuotų karvių pieno pagaminus

rūgpienį pastebėjome, kad iš tirtų 10 mėginių 2 rūgpienio mėginiams nustatytas didelis

konsistencijos koeficientas – 6,11 – 7,04, tuo tarpu net 6 mėginiams nustatytas mažas

konsistencijos koeficientas – 1,67 – 2,84. Taigi, gaminant rūgpienį iš senojo genotipo karvių

pieno, tik 14 % rūgpienio mėginių pasižymėjo mažu klampumu ir intensyviu išrūgų išsiskyrimu

iš produkto, ką galima vertinti kaip prastą produkto kokybę. Gaminant rūgpienį iš holšteinizuotų

karvių pieno prasta kokybe pasižymėjo 60 % tirtų mėginių.

Labai svarbu pažymėti, kad baltymų kiekis senojo genotipo karvių piene buvo mažesnis lyginant

su holšteinizuotų karvių pienu (žr. 2.8 skyriaus 10 lentelę). Įprastai rūgpienio konsistencija

priklauso nuo dviejų veiksnių – baltymų kieko ir naudojamų raugų kultūrų. Šiuo atveju visi

pieno mėginiai buvo raugiami tomis pačiomis kultūromis, o baltymų kiekis senojo genotipo

juodmargių karvių pieno mėginiuose buvo 3,12 – 4,05 %, o holšteinizuotų karvių pieno

mėginiuose didesnis – 3,62 – 5,19 %. Nepaisant mažesnio baltymų kiekio iš senojo genotipo

juodmargių karvių pieno pagamintas rūgpienis buvo geresnės kokybės; jam nustatyta didesnės

klampos struktūra, iš kurios blogiau išsiskyrė išrūgos.

Analogiškus rezultatus gavome ir atlikę eksperimentinę jogurto gamybą. Iš skirtingo

holšteinizacijos laipsnio judmargių karvių pieno pagaminto jogurto kokybės rodikliai pateikti 29

lentelėje. Kaip ir rūgpienio atveju, iš holšteinizuotų karvių pieno pagaminus jogurtą

pastebėjome, kad iš tirtų 10 mėginių tik 2 rūgpienio mėginiams nustatytas didelis konsistencijos

koeficientas – 9,24-9,81, tuo tarpu net 6 mėginiams nustatytas mažas konsistencijos koeficientas

– 2,69 – 4,99. O gaminant jogurtą iš senojo genotipo karvių pieno, tik 14 % jogurto mėginių

pasižymėjo mažu klampumu (konsistencijos koeficientas – 4,09) ir intensyviu išrūgų išsiskyrimu

iš produkto (46,88 %), ką galima vertinti kaip prastą produkto kokybę. Gaminant jogurtą iš

holšteinizuotų karvių pieno prasta kokybe pasižymėjo 60 % tirtų mėginių.

70

3.9 Sūrių iš juodmargių karvių pieno eksperimentinė gamyba ir išeigos vertinimas

Juodmargių karvių pieno technologinių savybių tyrimai parodė, kad senojo genotipo karvių

pienas pasižymėjo geromis fermentinėmis koaguliacijos savybėmis, lyginant su holšteinizuotų

galvijų pienu. Tyrimo metu daugiausia pieno mėginių su trumpa FKT ir stipria fermentine

sutrauka nustatyta būtent senojo genotipo juodmargių karvių grupėje. Labai svarbu, kad šioje

grupėje aptiktas tik 1 nekoaguliavęs pieno mėginys. Todėl šiame tyrimų etape siekėme

išsiaiškinti juodmargių karvių pieno išskirtinumą sūrių gamybai. Pusiau gamybinėmis sąlygomis

buvo pagaminti Goudos tipo punskiečiai sūriai.

Eksperimentui naudotas 2017 m. birželio mėn. surinktas juodmargių karvių pienas, kuris

pasižymėjo geromis fermentinės koaguliacijos savybėmis. Buvo sudaryti du pieno mėginiai

(po10 litrų): 1 – iš senojo genotipo juodmargių karvių pieno ir 2 – iš holšteinizuotų juodmargių

karvių pieno. Pieno mėginių sudėtis ir duomenys apie jų fermentinės koaguliacijos savybes

pateikta 2.9 skyrias 11 lentelėje. Pieno mėginiai analizei buvo imami iš sūrių gamintuvo prieš

pasterizaciją, o sūrio cheminė analizė atlikta po brandinimo. Pagal gautus rezultatus apskaičiuota

sūrio išeiga. Duomenys pateikti 32 lentelėje.

32 lentelė. Skirtingo holšteinizacijos laipsnio judmargių karvių pieno sudėties rodikliai ir iš šio

pieno pagaminto sūrio išeigos.

Karvių

veislė

Pieno sudėtis Pieno fermentinės

koaguliacijos savybės

Sūrių išeigos

Baltymų

kiekis, %

Kazeino

kiekis, %

FKT, min G’40, Pa g sūrio/100 g

pieno

g sūrio

s.m./100 g

pieno

g sūrio

baltymų/100 g

pieno baltymų

Senojo

genotipo

juodmargių

karvių

3,29 2,52 16 14 19,0 6,13 79,72

Holšteino

juodmargių

karvių

3,26 2,52 14 55 15,9 5,79 83,58

Pasirenkant pieną sūrių gamybai jo mėginiai, reprezentuojantys senojo genotipo juodmargių

karvių pieną ir Holšteino juodmargių karvių pieną, buvo sudaryti taip, kad abu mėginiai turėtų

vienodą baltymų ir kazeino kiekį ir kad abu mėginiai pasižymėtų geromis fermentinės

koaguliacijos savybėmis. Apskaičiavus iš tokio pieno pagamintų sūrių išeigas, nustatėme, kad

vertinant sūrių išeigą pagal visą pieno kiekį, kurio reikia pagaminti sūriui ir pagal sūrio sausųjų

medžiagų kiekį, didesnės išeigos buvo sūrių, kuriuos gaminome iš senojo genotipo juodmargių

karvių pieną.

Remiantis gautais rezultatais galime teigti, kad 1 kg puskiečio sūrio pagaminti reikia 5,263 kg

senojo genotipo juodmargių karvių pieno ir 6,289 kg Holšteino juodmargių karvių pieno.

Taip pat iš 32 lentelės duomenų matome, kad gaminant sūrį iš senojo genotipo juodmargių

karvių pieno, iš 100g pieno į sūrį pereina 6,13 g pieno sausųjų medžiagų. Tuo tarpu gaminant

sūrį iš Holšteino juodmargių karvių pieno, iš 100 g pieno į sūrį pereina 65,79 g pieno sausųjų

71

medžiagų. Kiek kitokie rezultatai gaunami, skaičiuojant sūrio išeigas pagal baltymų kiekį.

Gaminant sūrį iš senojo genotipo juodmargių karvių pieno iš 100 g piene esančių baltymų, į sūrį

pereina 79,72 g baltymų. Tuo tarpu gaminant sūrį iš Holšteino juodmargių karvių pieno iš 100 g

piene esančių baltymų, į sūrį pereina daugiau baltymų - 83,58 g. Tai reiškia, kad pirmuoju atveju

didesnis baltymų kiekis pereina į išrūgas. Pamatavus baltymų kiekį išrūgose nustatėme, kad

išrūgose, gautose po sūrių iš senojo genotipo juodmargių karvių pieno gamybos, baltymų kiekis

buvo 0,83 %, o išrūgose po sūrių iš Holšteino juodmargių karvių pieno gamybos, baltymų kiekis

buvo 0,77 %. Todėl galima daryti prielaidą, kad pakoregavus sūrių gamybos procesą taip, kad

sumažėtų baltymų kiekis išrūgose, pavyzdžiui, padidinant supjaustytos sutraukos šildymo

temperatūrą, sūrių išeigą iš senojo genotipo juodmargių karvių pieno būtų galima dar padidinti.

72

IŠVADOS

1. Ištyrus juodmargių karvių pieno cheminę sudėtį atskirose juodmargių karvių grupėse,

suskirstytose pagal holšteinizacijos laipsnį, nustatyta, kad: pagal riebalų kiekį senojo genotipo

juodmargių pienas statistiškai reikšmingai (p<0,05) skyrėsi nuo juodmargių su įvairiu

holšteinizacijos laipsniu pieno ir buvo mažiausias – 4,65±1,10 %; pagal baltymų kiekį išsiskyrė

senojo genotipo juodmargių karvių grupė ir grupė, kurios holšteinizacijos laipsnis buvo 80 – 90

%, jose nustatyta mažiausiai baltymų atitinkamai 3,57±0,47 % ir 3,58±0,44 %; Ca vidutinis

kiekis juodmargių karvių grupėse, suskirstytose pagal holšteinizacijos laipsnį svyravo nuo

115,32±10,48 iki 118,71±13,31 mg/100g, ir juodmargių holšteinizacijos įtakos šiam rodikliui

nebuvo nustatyta.

2. Ištyrus juodmargių karvių pieno baltymų frakcijų sudėtį nustatėme, kad mažiausiai kazeino

buvo senojo genotipo juodmargių grupėje – 29,4±0,37 %, o 50-69 % holšteinizuotų karvių

grupėje kazeino kiekis statistiškai patikimai (P<0,05) didesnis – 3,14±0,33 %. Pagal atskirų

kazeino frakcijų sudėtį skirtingo holšteinizacijos laipsnio juodmargių karvių pieno mėginiuose,

esminių skirtumų tarp kazeino kokybinės sudėties nenustatyta: κ-CN kiekis svyravo ribose 0,32

– 0,35 %, β-CN – ribose 1,56 – 1,61 %, αS1-CN - ribose 0,95 – 1,01 % ir αS2-CN – ribose 0,20

– 0,22 %. Statistiškai patikimi skirtumai (P<0,05) nustatyti tarp κ-CN ir αS1-CN kiekių senojo

tipo juodmargių pieno ir 50-69 % holšenizuotų juodmargių pieno.

3. Nustatyta, kad sezonas turėjo statistiškai reikšmingos (P<0,05) įtakos kazeino kiekiui piene;

mažiausiai kazeino nustatėme žiemos sezono mėginiuose (2,91 ±0,27%), o daugiausiai vasaros

sezono mėginiuose – 3,20±0,44 %. Vasaros bei rudens sezonų pieno κ–CN koncentracija

statistiškai patikimai (P<0,05) didesnė už pavasario ar žiemos sezonų pieno κ–CN koncentraciją

ir jos vidutinė reikšmė buvo 0,34±0,18 %.

4. Iš visų tirtų 439 juodmargių karvių pieno mėginių geru termostabilumu pasižymėjo tik 24%

mėginių: daugiausiai nustatyta blogo termostabilumo pieno mėginių – 43%, o vidutinio

termostabilumo mėginiai sudarė 33 % nuo visų mėginių kiekio. Panašios proporcijos nustatytos,

analizuojant pieno termostabilumo duomenis skirtingose juodmargių karvių grupėse pagal

holšteinizacijos laipsnį: senojo genotipo juodmargių karvių grupėje gero termostabilumo pieno

buvo 23 %, vidutinio – 32%, blogo - 45%, o grupėje, kurią sudarė 80-90 % holšteinizuotos

juodmargės, gero termostabilumo pieno taip pat buvo 23 %, vidutinio – 35%, o blogo - 43%.

5. Pirmą kartą nustatytos Lietuvos juodmargių karvių fermentinės sutraukos savybės parodė, kad

senojo genotipo karvių pienas pasižymi geromis fermentinės koaguliacijos savybėmis lyginant

su holšteinizuotų galvijų pienu. Tyrimo metu daugiausia pieno mėginių (42,75 %) su trumpa (iki

20 min) fermentinės koaguliacijos trukme ir stipria fermentine sutrauka nustatyta senojo

genotipo juodmargių karvių grupėje; šioje grupėje aptiktas tik 1 nekoaguliavęs pieno mėginys.

6. Apskaičiavus koreliacijos koeficientus tarp juodmargių karvių pieno sudėties ir

technologinių savybių, nustatytos koreliacijos tarp: κ–kazeino kiekio ir rūgštinės sutraukos

susidarymo trukmės (0,57, P<0,001); kalcio kiekio ir rūgštinės sutraukos susidarymo trukmės

(0,51, P<0,01); κ-kazeino ir rūgštinės sutraukos stiprumo (-0,78, P<0,01); kalcio kiekio ir

rūgštinės sutraukos stiprumo (-0,67, P<0,01); κ–kazeino kiekio ir fermentinės sutraukos

susidarymo trukmės (-0,26, P<0,01), κ-kazeino ir fermentinės sutraukos stiprumo (0,33,

P<0,01); kalcio kiekio ir fermentinės sutraukos stiprumo (0,20, P<0,01).

7. Vidutiniškai daugiausia vitaminų D3 (1,27 µg/100g) ir A (108,89 µg/100g) buvo trečios

grupės karvių, kurių holšteinizacijos laipsnis nuo 70 iki 79 proc., piene. Senojo genotipo karvių,

73

kurių holšteinizacijos laipsnis iki 50 proc., piene vidutinis vitamino D3 kiekis buvo 1,13

µg/100g, A - 78,51 µg/100g. Vertinant sezoniškumo įtaką vitaminų kiekiui piene nustatyta, kad

daugiausia vitamino D3 piene buvo vasaros mėnesiais (1,56 µg/100g), vitamino A kiekis visus

metus kito plačiose ribose (26,14–216,19 µg/100g) ir nepriklausė nuo sezono.

8. Palyginus Lietuvos senojo genotipo juodmargių karvių pieno bei Holšteino veislės karvių

pieno fermentinės ir rūgštinės sutraukų virškinimą in vitro sąlygomis, nustatyta, kad Lietuvos

senojo genotipo juodmargės karvės pieno fermentinei sutraukai būdingas didžiausias skirtingų

peptidų kiekis – identifikuoti 109 peptidai. Nustatyta, kad peptidai pradeda formuotis dar

sutraukų technologinio proceso metu (sutraukose identifikuotas kartusis peptidas – β–kazeino

grandinės 176–182 fragmentas KAVPYPQ). Iš viso identifikuota 317 skirtingų peptidų. 30 iš jų

pasižymi biologinėmis savybėmis (daugiausiai ACE inhibitorinėmis).

9. Lietuvos senojo genotipo juodmargių karvių pieno baltymų biologinę vertę įvertinus baltymų

virškinamumu in vitro sąlygomis, nustatyta, kad rūgštinės sutraukos baltymų hidrolizė vyko

greičiau nei fermentinės sutraukos baltymų. Po 4 val. virškinimo imitavimo fermentinės baltymų

sutraukos bandiniuose laisvų aminorūgščių kiekis išreikštas mMol Leu ekvivalentais padidėjo

nuo 8 iki 400 mMol Leu ekvivalentų, o rūgštinės sutraukos – nuo 2 iki 500 mMol Leu

ekvivalentų. Taigi, galima numanyti, kad vartotojo organizme baltymai iš rūgštinės sutraukos

pasisavins greičiau nei baltymai iš fermentinės sutraukos.

10. Senojo genotipo karvių pienas yra tinkamas raugintų pieno gėrimų ir puskiečio sūrio

gamybai:

Pagaminus rūgpienį iš senojo genotipo karvių pieno, nustatyta, kad tik 14 % rūgpienio

mėginių pasižymėjo mažu klampumu ir intensyviu išrūgų išsiskyrimu iš produkto, ką

galima vertinti kaip prastą produkto kokybę, o analizuojant rūgpienį iš holšteinizuotų

karvių pieno, nustatyta, kad prasta kokybe pasižymėjo 60 % tirtų mėginių.

Pagaminus jogurtą iš senojo genotipo karvių pieno, nustatyta, kad tik 14 % jogurto

mėginių pasižymėjo mažu klampumu (konsistencijos koeficientas – 4,09) ir intensyviu

išrūgų išsiskyrimu iš produkto (46,88 %), ką galima vertinti kaip prastą produkto kokybę.

Analizuojant jogurtą iš holšteinizuotų karvių pieno, nustatyta, kad prasta kokybe

pasižymėjo 60 % tirtų mėginių

Pagaminus Goudos tipo sūrius sąlygomis artimomis gamybinėms, nustatyta, kad sūrio

išeiga didesnė, gaminant jį iš senojo genotipo juodmargių karvių pieno: 1 kg puskiečio

sūrio pagaminti reikia 5,263 kg senojo genotipo juodmargių karvių pieno ir 6,289 kg

Holšteino juodmargių karvių pieno.

74

Rekomendacijos pieno gamintojams bei perdirbėjams dėl senojo genotipo Lietuvos

juodmargių karvių pieno tinkamumo sūrio ir raugintų pieno produktų gamybai

Siūloma žalio pieno atranka sūrio bei raugintų pieno gėrimų gamybai. Tinkamas žalio pieno

parinkimas leidžia padidinti sūrių gamybos išeigą ir pagerinti raugintų pieno gėrimų kokybę.

1. Tyrimais įrodyta, kad senojo genotipo Lietuvos juodmargių karvių pienas pasižymi

geromis fermentinės koaguliacijos savybėmis - 42,75 % pieno būdinga trumpa (iki 20 min)

fermentinės koaguliacijos trukmė ir stipri fermentinė sutrauka (> 10 Pa). Šioje Lietuvos

juodmargių karvių grupėje nenustatyta pieno, kuris nesudaro fermentinės sutraukos. Tuo tarpu

holšteinizuotų Lietuvos juodmargių karvių grupėje nustatyta 5 % pieno fermentu

nesutraukinamo pieno.

Puskiečio sūrio gamybai rekomenduojama naudoti tik senojo genotipo Lietuvos juodmargių

karvių pieną, nemaišant jo su holšteinizuotų Lietuvos juodmargių karvių pienu. Pieno

fermentinio sūrio gamybai atranką reikia atlikti pagal šiuos rodiklius:

fermentinės koaguliacijos trukmė < 20 min,

fermentinės sutraukos stiprumas po 40 min traukinimo > 10 Pa,

baltymų kiekis - 3,3 %, o kazeino kiekis 2,5 %.

Nustatyta, kad 1 kg puskiečio sūrio pagaminti reikia 5,26 kg tokių rodiklių senojo genotipo

juodmargių karvių pieno.

2. Tyrimais įrodyta, kad senojo genotipo Lietuvos juodmargių karvių pienas pasižymi

geromis rūgštinės koaguliacijos savybėmis – 78,5 % pieno būdinga trumpa (iki 30 min) rūgštinės

koaguliacijos trukmė ir stipri rūgštinė sutrauka (> 50 Pa). Šioje Lietuvos juodmargių karvių

grupėje nenustatyta pieno, kuris nesudaro fermentinės sutraukos.

Gaminant raugintus pieno gėrimus: jogurtą ir raugintą pieną, rekomenduojama jų gamybai

naudoti senojo genotipo Lietuvos juodmargių karvių pieną, kurio atranką reikia atlikti pagal

šiuos rodiklius:

rūgštinės koaguliacijos trukmė < 30 min,

rūgštinės sutraukos stiprumas po 40 min traukinimo > 50 Pa,

Nustatyta, kad iš tokiomis savybėmis pasižyminčio senojo genotipo Lietuvos juodmargių

karvių pieno pagaminto rauginto pieno konsistencijos koeficientas buvo 6,22 – 6,42, o

centrifuguojant išsiskyrusių išrūgų kiekis – 21,38-23,44 %. Taip pat gauti duomenys kad iš

tokiomis savybėmis pasižyminčio senojo genotipo Lietuvos juodmargių karvių pieno pagaminto

jogurto konsistencijos koeficientas buvo 9,24-9,81, o centrifuguojant išsiskyrusių išrūgų kiekis –

31,25 – 39,38%.

75

PROJEKTO REZULTATŲ POPULIARINIMAS

2016 m. gegužės 11d. KTU Maisto mokslo ir technologijos kompetencijos centre vyko

seminaras Lietuvos pieno gamintojams ir perdirbėjams, kuriame D. Leskauskaitė darė pranešimą

apie karvių pieno baltymų sudėties tyrimus ir jų svarbą technologinių pieno savybių

prognozavimui (Priedas 1)

Straipsniai ūkininkams skirtame leidinyje apie pieno baltymų sudėtį ir reikšmę pieno kokybei

(Priedas 2):

Dzūkams pienas lyg lašiniai. Ūkininko patarėjas, 2016 m. birželio 9 d. Nr. 67

Dzūkams pienas lyg lašiniai. Kaimo laikraštis, 2016 m. birželio 11-17 d. Nr. 23

Pranešimas tarptautiniame kongrese NEEFOOD 2017. M. Kubiliūtė, I. Jasutienė, M. Keršienė,

D. Leskauskaitė. Composition, technological properties and digestibility of milk proteins from

native breed - Lithuanian black and white, cows. 2017 September 11-13, Kaunas

Pranešimas seminare „Senojo genotipo Lietuvos juodmargių karvių pieno technologinių savybių

išskirtinumai“ ir apvaliojo stalo diskusijoje „ Kompleksinis požiūris į Lietuvos gyvulininkystės

ir pieno ūkio ateitį iki ir po 2020 m.“, Panevėžio raj., 2017 m. rugsėjo 15 d. (Priedas 3)

Straipsnis ūkininkams skirtame leidinyje apie projekto rezultatus – D.Leskauskaitė, M.Keršienė.

Lietuvos juodmargių karvių pienas tinka sūrių gamybai. Ūkininko patarėjas, 2017 m. lapkričio

07 d. Nr. 125 (3687) (Priedas 4)

2017 m. lapkričio 17d. KTU Maisto mokslo ir technologijos kompetencijos centre vyks

seminaras Lietuvos pieno gamintojams, kuriame D. Leskauskaitė darys pranešimą apie projekto

rezultatus.

76

Literatūros sąrašas

Aaltonen, M.-L., and V. Antila. 1987. Milk renneting properties and the genetic variants of

proteins. Milchwissenschaft 42:490–492

Adt I., Dupas C., Boutrou R., Oulahal N., Noel C. D. Mollé, Jouvet, Thierry Degraeve P.

Identification of caseinophosphopeptides generatedt hrough in vitro gastro-intestinal digestion of

Beaufort cheese. International Dairy Journal. 2011, 21, 129-134.

Albaaj A., Foucras G. and Raboisson D. Changes in milk urea around insemination are

negatively associated with conceptionsuccess in dairy cows. Journal of Dairy Science. 2017,

100, 3257-3265.

Alipanah, M., and L. A. Kalashnikova. 2007. Influence of κ-casein genetic variant on cheese

making ability. J. Anim. Vet. Adv. 6:855–857.

Allmere, T., Andrén, A., Lindersson, M. & Björck, L. 1998a. Studies on rheological properties

of stirred milk gels made from milk with defined genetic variants of κ-casein and β-

lactoglobulin. International Dairy Journal 8(10-11), 899-905.

Allmere, T., Andrén, A., Lundén, A. & Björck, L. 1998b. Interactions in heated skim milk

between genetic variants of β-lactoglobulin and κ-casein. Journal of Agricultural and Food

Chemistry 46(8)

Andrén, A. (2002). Rennets and coagulants. In: Roginski, H., et al. (Eds.) Encyclopaedia of

Dairy Sciences. London: Academic Press. p. 281-286

Annan, W.D. & Manson, W. 1969. A fractionation of the αs-casein complex of bovine milk.

Journal of Dairy Research 36, 259

Annibaldi, S., F. Ferri, and R. Morra. 1977. Nuovi orientamenti nella valutazione tecnica del

latte: Tipizzazione lattodinamografica. Sci. Tecn. Latt. Cas. 28:115–126.

Apyskaita Nr. 78. Kontroliuojamųjų karvių bandų produktyvumo 2014–2015 metų. Parengė

Valstybės įmonė Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centras, 2016

Aschaffenburg, R. & Drewry, J. 1955. Occurence of different β-lactoglobulins in cows milk.

Nature 176, 218-219.

Aschaffenburg, R. 1961. Inherited casein variants in cows milk. Nature 192(480), 431-432.

Ataskaita. Gerinančiųjų veislių įtakos lietuvos juodmargių ir lietuvos žalųjų kontroliuojamų

karvių produktyvumui, eksterjerui ir ilgaamžiškumui tyrimai. Žemės ūkio, maisto ūkio ir

žuvininkystės moksliniai tyrimai ir taikomoji veikla. 2014

Auldist, M. J., C. Mullins, B. O’Brien, B. T. O’Kennedy, and T. Guinee. 2002. Effect of cow

breed on milk coagulation properties. Milchwissenschaft 57:140–143

Auldist, M., Johnston, K.A., White, N.J. & Fitzsimons, W.P. 2004. A comparison of the

composition, coagulation characteristics and cheesemaking capacity of milk from Friesian and

Jersey dairy cows. Journal of Dairy Research 71, 51-57.

Barbano, D.M., Rasmussen, R.R. & Lynch, J.M. 1991. Influence of milk somatic-cell count and

milk age on cheese yield. Journal of Dairy Science 74(2), 369-388.

Barbé F., Menardo I., Gouari. Y., Buffière C., Famelart M. H., Laroche B., Feunteun S.L.,

Rémond D., Dupont D. Acid and rennet gels exhibit strong differences in the kinetics of milk

protein digestion and amino acid bioavailability. Food Chemistry, 2014, 143, 1-8.

Barber, D. G., A. V. Houlthan, F. C. Lynch, and D. P. Poppt. 2005. The influence of nutrition,

genotype and stage of lactation on milk casein composition. Pages 203–216 in Indicators of Milk

77

and Beef Quality. J. F. Hocquette and S. Gigli, ed. EAAP publication 112. Wageningen

Academic Publishers, Wageningen, the Netherlands

Bittante, G., Penasa, M. & Cecchinato, A. 2012. Genetics and modeling of milk coagulation

properties. Journal of Dairy Science 95 6843–6870

Blumber, B.S. & Tombs, M.P. 1958. Possible polymorphism of bovine α−lactalbumin. Nature

181, 376.

Bobe, G., Beitz, D.C., Freeman, A.E. & Lindberg, G.L. 1999. Effect of milk protein genotypes

on milk protein composition and its genetic parameter estimates. Journal of Dairy Science

82(12), 2797-2804

Boettcher, P. J., A. Caroli, A. Stella, S. Chessa, E. Budelli, F. Canavesi, S. Ghiroldi, and G.

Pagnacco. 2004. Effects of casein haplotypes on milk production traits in Italian Holstein and

Brown Swiss cattle. J. Dairy Sci. 87:4311–4317.

Bonfatti V., Grigoletto L., Cecchinato A., Gallo L., Carnier P. Validation of a new reversed-

phase high –performance liquid chromatography method for separation and quantification of

bovine milk protein genetic variants. Journal of Chromatography A, 2008, 1195, 101 – 106

Bonfatti, V., G. Di Martino, A. Cecchinato, L. Degano, and P. Carnier. 2010. Effects of β-κ-

casein (CSN2–CSN3) haplotypes, β-lactoglobulin (BLG) genotypes, and detailed protein

composition on coagulation properties of individual milk of Simmental cows. J. Dairy Sci.

93:3809–3817.

Bonfatti, V., A. Cecchinato, L. Gallo, A. Blasco, and P. Carnier. 2011. Genetic analysis of

detailed milk protein composition and coagulation properties in Simmental cattle. J. Dairy Sci.

94:5183–5193.

Bonizzi I., Buffoni J.N., Feligni M. Quantification of bovine fractions by direct chromatographic

analysis of milk. Approaching the application to a real product context. Journal of

Chromatography A. 2009, 1216, 165 – 168

Braunschweig, M.H. & Leeb, T. 2006. Aberrant low expression level of bovine β- lactoglobulin

is associated with a C to A transversion in the BLG promoter region. Journal of Dairy Science

89(11), 4414-4419

Buchberger, J., and P. Dove. 2000. Lactoprotein genetic variants in cattle and cheese making

ability. Food Technol. Biotechnol. 38:91–98

Caroli, A., Bolla, P., Budelli, E., Barbieri, G. & Leone, P. 2000. Effect of κ-casein E allele on

clotting aptitude of Italian Friesian milk. Zootecnica e Nutrizione Animale 26(3), 127-130.

Caroli M., Chessa S., Erhardt G. J. Invited review: Milk protein polymorphisms in cattle:Effect

on animal breeding and human nutrition. J. Dairy Sci. 2009, 92, 5335–5352.

Cassandro, M., Comin, A., Ojala, M., Dal Zotto, R., De Marchi, M., Gallo, L., Carnier, P. &

Bittante, G. 2008. Genetic parameters of milk coagulation properties and their relationships with

milk yield and quality traits in Italian Holstein cows. Journal of Dairy Science 91(1), 371-376.

Chen, B. Y., Grandison, A. S., & Lewis, M. J. 2012. Comparison of heat stability of goat milk

subjected to ultra-high temperature and in-container sterilization. Journal of Dairy Science, 95,

1057–1063

Chen B., Lewis M. J., Grandison A.S. Effect of seasonal variation on the composition and

properties of raw milk destined for processing in the UK. Food Chemistry. 2014, 158, 216-223.

Chiofalo, V., Maldonato, R., Martin, B., Dupont, D. & Coulon, J.B. 2000. Chemical composition

and coagulation properties of Modicana and Holstein cows' milk. Annales de Zootechnie 49(6),

497-503

78

Christian, M.P., Grainger, C., Kefford, B. & Pearce, R.J. 1995. Effect of cow diet and stage of

lactation on casein and mineral composition of milk for cheese manufacture. Journal of Dairy

Science 78(Suppl. 1), 1) 133.

Claesson, O. 1965. Studies on the variation of the rennin coagulation time of milk.

Lantbrukshögskolans annaler 31, 237-332.

Comin, A., Cassandro, M., Chessa, S., Ojala, M., Dal Zotto, R., De Marchi, M., Carnier, P.,

Gallo, L., Pagnacco, G. & Bittante, G. (2008). Effects of composite β- and κ−casein genotypes

on milk coagulation, quality, and yield traits in Italian Holstein cows. Journal of Dairy Science

91(10), 4022-4027

Contreras M., Carron R, Montero M.J., Ramos M., Recio I. Novel casein-derived peptides with

antihypertensive activity. International Dairy Journal. 2009, 19, 566–573.

Coulon, J.B., Dupont, D., Pochet, S., Pradel, P. & Duployer, H. 2001. Effect of genetic potential

and level of feeding on milk protein composition. Journal of Dairy Research 68(4), 569-577.

Creamer, L.K., Bienvenue, A., Nilsson, H., Paulsson, M., van Wanroij, M., Lowe, E.K., Anema,

S.G., Boland, M.J. & Jimenez-Flores, R. 2004. Heat-induced redistribution of disulfide bonds in

milk proteins. 1. Bovine β-lactoglobulin. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52(25),

7660-7668

Cruz-Huerta E., Garcķa-Nebot M.J., Miralles B., Recio I., Amigo L. Caseinophosphopeptides

released after tryptic hydrolysis versussimulated gastrointestinal digestion of a casein-derived

by-product . Food Chemistry. 2015, 168, 648–655

Dalgleish, D.G., Horne, D.S. & Law, A.J.R. 1989. Size-related differences in bovine casein

micelles. Biochimica et Biophysica Acta 991(3), 383-387.

Dalgleish, D.G., Spagnuolo, P.A. & Goff, H.D. 2004. A possible structure of the casein micelle

based on high-resolution field-emission scanning electron microscopy. International Dairy

Journal 14(12), 1025-1031

Dannenberg, F. & Kessler, H.G. 1988a. Effect of denaturation of β-lactoglobulin on texture

properties of set-style nonfat yoghurt. II. Firmness and flow properties. Milchwissenschaft

43(11), 700-704.

Dannenberg, F. & Kessler, H.G. 1988b. Reaction kinetics of the denaturation of whey proteins in

milk. Journal of Food Science 53(1), 258-263

Davoli, R., Dall'Olio, S. & Russo, V. 1990. Effect of κ−casein genotype on the coagulation

properties of milk. Journal of Animal Breeding and Genetics 107, 458-464.

De Marchi, M., G. Bittante, R. Dal Zotto, C. Dalvit, and M. Cassandro. 2008. Effect of Holstein

Friesian and Brown Swiss breeds on quality of milk and cheese. J. Dairy Sci. 91:4092–4102

De Noni I, Stuknyte M., Cattaneo S. Identification of β-casomorphins 3 to 7 in cheeses and in

their in vitro gastro intestinal digestates. Food Science and Technology. 2015, 63, 550-555.

Devle H., Naess-Andersen C.F., Rukke E.O., Veguard G.E., Ekeberg D., Barfod S. Rheological

characterization of milk during digestion with human gastric and duodenal enzymes.

Annualtransactions of thenordicrheologysociety. 2012, 20, 271-276

DeWit, J.N. & Klarenbeek, G. (1984). Effects of various heat treatments on structure and

solubility of whey proteins. Journal of Dairy Science 67(11), 2701-2710

Donato, L., and F. Guyomarc’h. 2009. Formation and properties of the whey protein/κ-casein

complexes in heated skim milk—A review. Dairy Sci. Technol. 89:3–29

79

Donnelly, W.J., McNeill, G.P., Buchheim, W. & McGann, T.C.A. 1984. A Comprehensive study

of the relationship between size and protein-composition in natural bovine casein micelles.

Biochimica et Biophysica Acta 789(2), 136-143

Ehrmann, S., Bartenschlager, H. & Geldermann, H. 1997. Quantification of gene effects on

single milk proteins in selected groups of dairy cows. Journal of Animal Breeding and Genetics

114(2), 121-132

Faka, M., Lewis, M. J., Grandison, A. S., & Deeth, H. 2009. The effect of free Ca2+ on the heat

stability and other characteristics of low-heat skim milk powder. International Dairy Journal, 19,

386–392

Farrell H. M., Jimenez-Flores JR.R., Bleck G. T., Brown E. M., Butler J. E., Creamer L. K.,

Hicks C. L., Hollar C. M., Ng-Kwai-Hang K. F., Swaisgood H. E. Nomenclature of the Proteins

of Cows’ Milk—Sixth Revision. J Dairy Sci. 2004, 87, 1641–1674

Farrell, H.M., Malin, E.L., Brown, E.M. & Qi, P.X. 2006. Casein micelle structure: What can be

learned from milk synthesis and structural biology? Current Opinion in Colloid & Interface

Science 11(2-3), 135-147

Flüeler, O. 1978. Research on slow-renneting milk. I. Composition of the milk. Schweizerische

Milchwirtschaftliche Forschung 7(3), 45-54

Ford, C.A., Connett, M.B. & Wilkins, R.J. 1993. β−lactoglobulin expression in bovine mammary

tissue. Proceedings of the New Zealand Society of Animal Protection 53, 167-169

Fox, P.F. Heat-induced changes in milk preceding coagulation. 1981 J. Dairy Sci.(64) p. 2127–

137

Fox, P.F. & McSweeney, P.L.H. 1998. Dairy chemistry and biochemistry Springer - Verlag

Fox, P.F. & Brodkorb, A. 2008. The casein micelle: Historical aspects, current concepts and

significance. International Dairy Journal 18(7), 677-684.

Frederiksen P. D., Andersen K. K., Hammershøj M., Poulsen H. D., Sørensen J., Bakman M.,

Qvist K. B. and Larsen L. B. Composition and effect of blending of noncoagulating, poorly

coagulating,and well-coagulating bovine milk from individual Danish Holstein cows. J. Dairy

Sci. 2011, 94, 4787–4799.

Gaucheron F. 2005. The minerals of milk. Reproduction Nutrition Development. 45 473–483

Glantz, M., T. G. Devold, G. E. Vegarud, H. Lindmark Mansson, H. Stalhammar, and M.

Paulsson. 2010. Importance of casein mi celle size and milk composition for milk gelation. J.

Dairy Sci. 93:1444–1451

Glantz M., Gustavsson F., Bertelsen H.P., Stalhammar H., Lindmark-Mansson H., Poulson M.,

Bendixen C. and Gregersen V.R. Bovine chromosomalr egions affecting rheological traits in

acid-induced skim milk gels. J. Dairy Sci. 2015, 98, 1273-1285.

Graml, R. & Pirchner, F. 2003. Effects of milk protein loci on content of their proteins. Archiv

für Tierzucht 46(4), 331-340

Grandison, A.S. & Ford, G.D. 1986. Effects of variations in somatic-cell count on the rennet

coagulation properties of milk and on the yield, composition and quality of Cheddar cheese.

Journal of Dairy Research 53(4), 645-655

Green, M.L. & Grandison, A.S. 1993. Secondary (non-enzymatic) phase of rennet coagulation

and post-coagulation phenomena. In Cheese: chemistry, physics and microbiology, Vol. 1, pp.

101–140 (Ed. PF Fox). London: Chapman & Hall

Grosclaude, F., Mahe, M.F., Mercier, J.C., Bonnemaire, J. & Teissier, J.H. 1976. Lactoprotein

polymorphism in Nepalese bovinae. Part 2. Polymorphism of minor αS caseins. Is locus αS2-cn

80

linked to loci αS1-cn, β−cn and κ−cn? Annales de Genetique et de Selection Animale 8(4), 481-

492

Groves, M.L. 1969. Some minor components of casein and other phosphoproteins in milk. A

review. Journal of Dairy Science 52(8), 1155

Guyomarc'h, F., Law, A.J.R. & Dalgleish, D.G. 2003. Formation of soluble and micellebound

protein aggregates in heated milk. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51(16), 4652-

4660

Gustavsson F., Glantz M., Buitenhuis A.J., Lindmark-Månsson H., Stålhammar H., Andren A.

and Paulsson M. Factors influencing chymosin-induced gelation of milk from individual dairy

cows: Major effects of casein micelle size and calcium. International Dairy Journal. 2014, 39,

201-208.

Ha M., A. Bekhitel-Din, Mc‘Connell M., Mason S. and Carne A. Fractionation of whey proteins

from red deer (Cervus elaphus) milk and comparison with whey proteins from cow, sheep and

goat milks. Small Ruminant Research.2014, 120, 125–134.

Hallen, E., T. Allmere, J. Naslund, A. Andren, and A. Lunden. 2007. Effect of genetic

polymorphism of milk proteins on rheology of chymosin-induced milk gels. Int. Dairy J.

17:791–799

Haque, Z. & Kinsella, J.E. 1988. Interaction between heated κ-casein and β-lactoglobulin:

predominance of hydrophobic interactions in the initial stages of complex formation. Journal of

Dairy Research 55(1), 67-80.

Harris, A., Tong, P., Vinkl, S., Izeol, J., & Jimenez-Flores, R. J. 2002. Effects of seasonal and

regional variations in milk components on the buffering capacity of milk in California. Journal of

Dairy Science, 85, 289

Heck, J. M. L., A. Schennink, H. J. F. van Valenberg, H. Bovenhuis, M. H. P. W. Visker, J. A.

M. van Arendonk, and A. C. M. van Hooijdonk. 2009. Effects of milk protein variants on the

protein composition of bovine milk. J. Dairy Sci. 92:1192–1202

Holt, C. & Horne, D.S. 1996. The hairy casein micelle: evolution of the concept and its

implications for dairy technology. Netherlands Milk and Dairy Journal 50, 85-111

Horne, D.S.; Muir, D.D. Alcohol and heat stability of milk protein. 1990 J. Dairy Sci. (73) p.

3613– 626

Horne, D.S. 1998. Casein interactions: casting light on the black boxes, the structure in dairy

products. International Dairy Journal 8(3), 171-177.

Horne, D.S. 2002. Caseins, micellar structure. In: Roginski, H., et al. (Eds.) Encyclopaedia of

Dairy Sciences. London: Academic Press.3). p. 1902-1909

Ikonen, T., Ojala, M. & Syväoja, E.L. 1997. Effects of composite casein and β- lactoglobulin

genotypes on renneting properties and composition of bovine milk by assuming an animal

model. Agricultural and Food Science in Finland 6, 283-294

Ikonen, T., Ahlfors, K., Kempe, R., Ojala, M. & Ruottinen, O. 1999. Genetic parameters for the

milk coagulation properties and prevalence of noncoagulating milk in Finnish dairy cows.

Journal of Dairy Science 82(1), 205-214

Ikonen, T., H. Bovenhuis, M. Ojala, O. Ruottinen, and M. Georges. 2001. Associations between

casein haplotypes and first lactation milk production traits in Finnish Ayrshire cows. J. Dairy

Sci. 84:507–514

81

Ikonen, T., Morri, S., Tyrisevä, A.M., Ruottinen, O. & Ojala, M. 2004. Genetic and phenotypic

correlations between milk coagulation properties, milk production traits, somatic cell count,

casein content, and pH of milk. Journal of Dairy Science 87(2), 458-467

International Dairy Federation. 2011. The world dairy situation. Bulletin 451/2011. International

Dairy Federation, Brussels, Belgium

Jakob, E., and Z. Puhan. 1992. Technological properties of milk as influenced by genetic

polymorphism of milk proteins—A review. Int. Dairy J. 2:157–178.

Jakob, E. & Puhan, Z. 1994. Genetic polymorphism of milk proteins. Mljekarstvo 44(3), 197-

217

Jakob, M., D. Jaros, and H. Rohm. 2011. Recent advances in milk clotting enzymes. Int. J. Dairy

Technol. 64:14–33

Jensen R.G. Handbook of milk composition. Academic Press, California 92101-4495. 1995, pp.

2-3.

Jensen, H. B., J. W. Holland, N. A. Poulsen, and L. B. Larsen. 2012. Milk protein variants and

isoforms identified in bovine milk representing extremes in coagulation properties. J. Dairy Sci.

95:2891–2903

Jin Y., Yu Y., Qi Y., Wang F., Yan J., Zou H., Peptide profiling and the bioactivity of yogurt in

the simluated gastrointestinal digestion. Journal of Proteomics. 2016, 141, 24-46.

Joudu, I., M. Henno, S. Varv, T. Kaart, and O. Kart. 2007. Milk protein genotypes and milk

coagulation properties of Estonian Native cattle. Agric. Food Sci. 16:222–231.

Joudu, I., M. Henno, T. Kaart, T. Pussa, and O. Kart. 2008. The effect of milk protein contents

on the rennet coagulation properties of milk from individual dairy cows. Int. Dairy J. 18:964–

967.

Joudu, I., M. Henno, S. Varv, H. Viinalass, T. Pussa, T. Kaart, D. Arney, and O. Kart. 2009. The

effect of milk proteins on milk coagulation properties in Estonian dairy breeds. Vet. Zootec.

46:14–19

Jukna, Č. Galvijininkystė. Vilnius, 1998. P. 123-124

Juozaitienė V., Anskienė L., Japertienė R., Juozaitis A., Stankevičius R., Černauskienė J.,

Žymantienė J., Žilaitis V. Dependence of dairy cows milk ability traits on genotype. Veterinarija

ir zootechnka. 2016, 73(95), 32-36.

Kačinskaitė-Žuvaitienė, D. 2007. Holšteino veislės įtaka Lietuvos juodmargių karvių

produktyvumui ir pieno sudėčiai. LSMU Magistro darbas. Prieiga per internetą:

http://vddb.laba.lt/fedora/get/LT-eLABa-0001:E.02~2013~D_20130618_094622-

60025/DS.005.0.02.ETD

Koestler, A.G. 1925. Different types of milk, their relation to rennet, and their importance in

cheesemaking. Journal of Dairy Science 8(1), 28-36

Kopf-Bolanz K.A., Schwander F., Gijs M., Vergères G., Portmann R., Egger L. Impact of milk

processing on the generation of peptides during digestion. International Dairy Journal. 2014,

35, 130-138.

Larsen L.B., Rasmussen M.D., Bjerring M., Nielsen J.H. Proteasees and protein degradation in

milk from cows infected with Streptococcus uberis. International Dairy Journal. 2004, 14, 899-

907

Le T.T., Nielsen, S. D., Villumsen, N.S., Kristiansen, G. H., Nielsen, L.R., Nielsen, S.B.,

Hammershoj, M. and Larsen, L.B., Using proteomics to characterise storage-induced aggregates

in acidic whey protein isolate drinks. Int. Dairy J. 2016, 60, 39-46.

82

Leitner, G., Krifucks, O., Merin, U., Lavi, Y. & Silanikove, N. 2006. Interactions between

bacteria type, proteolysis of casein and physico-chemical properties of bovine milk. International

Dairy Journal 16(6), 648-654.

Lemieux L., Simard R. Bitter flavour in dairy products. II. A review of bitter peptides from

caseins: their formation, isolation and identification, structure masking and inhibition. Le Lait,

INRA Editions. 1992, 72 (4), 335-385. Prieiga per: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-

00929300/document

Lien, S., Kantanen, J., Olsaker, I., Holm, L.-E., Eytorsdottir, E., Sandberg, K., Dalsgard, B. &

Adalsteinsson, S. 1999. Comparison of milk protein allele frequencies in Nordic cattle breeds.

Animal Genetics 30, 85-91.

Lietuvos ūkinių gyvūnų genetinių išteklių išsaugojimo programa. Veislių, įtrauktų į Lietuvos

ūkinių gyvūnų genetinių išteklių išsaugojimo programą, apibūdinimai 5 priedas, [žiūrėta 2017-

01-05]. Prieiga per: https://zum.lrv.lt/lt/naujienos/patvirtinta-nauja-lietuvos-ukiniu-gyvunu-

genetiniu-istekliu-issaugojimo-programa

Lin Y., Kelly, A.L., O‘Mohony J., and Guinee T.P. Fortification of milk protein content with

different protein powders alters its compositional, rennet gelation, heat stability and ethanol

stability characteristics. Internatonal Dairy Journal. 2016, 61, 220-227.

Lindmark-Månsson, H., Fondén, R. & Pettersson, H.E. 2003. Composition of Swedish dairy

milk. International Dairy Journal 13(6), 409-425

Lodes, A., Buchberger, J., Krause, I., Aumann, J. & Klostermeyer, H. 1996. The influence of

genetic variants of milk proteins on the compositional and technological properties of milk. 2.

Rennet coagulation time and firmness of the rennet curd. Milchwissenschaft 51(10), 543-548.

Lodes, A., Buchberger, J., Krause, I., Aumann, J. & Klostermeyer, H. 1997. The influence of

genetic variants of milk proteins on the compositional and technological properties of milk. 3.

Content of protein, casein, whey protein, and casein number. Milchwissenschaft 52(1), 3-8

Losi, G., Castagnetti, G.B., Morini, D., Resmini, P., Volonterio, G. & Mariani, P. 1982. Milk

with abnormal coagulation: chemical and physico-chemical factors. Industria del Latte 18(1), 13-

33.

Lowe, E.K., Anema, S.G., Bienvenue, A., Boland, M.J., Creamer, L.K. & Jimenez-Flores, R.

2004. Heat-induced redistribution of disulfide bonds in milk proteins. 2. Disulfide bonding

patterns between bovine β-lactoglobulin and κ-casein. Journal of Agricultural and Food

Chemistry 52(25), 7669-7680.

Lucey, J.A. & Singh, H. 1997. Formation and physical properties of acid milk gels: A review.

Food Research International 30(7), 529-542

Lucey, J. A. 2009. Milk protein gels. Pages 449–471 in Milk Proteins— From Expression to

Food. Vol. 1. A. Thompson, M. Boland, and H. Singh, ed. Elsevier Inc., Burlington, MA

Lundén, A., Nilsson, M. & Janson, L. 1997. Marked effect of β-lactoglobulin polymorphism on

the ratio of casein to total protein in milk. Journal of Dairy Science 80(11), 2996-3005

Macheboeuf, D., Coulon, J.B. & D'Hour, P. 1993. Effect of breed, protein genetic variants and

feeding on cows' mik coagultating properties. Journal of Dairy Research 60, 43-54.

Maeno M., Yamamoto N., Takan T. Identification of an Antihypertensive Peptide from Casein

Hydrolysate Produced by a Proteinase from Lactobacillus helveticus CP790. Journal of Dairy

Science. 1996, 79(8), 1316-1321.

Mayer, H.K., Ortner, M., Tschager, E. & Ginzinger, W. 1997. Composite milk protein

phenotypes in relation to composition and cheesemaking properties of milk. International Dairy

Journal 7(5), 305-310

83

Malacarne, M., A. Summer, E. Fossa, P. Formaggioni, P. Franceschi, M. Pecorari, and P.

Mariani. 2006. Composition, coagulation properties and Parmigiano-Reggiano cheese yield of

Italian Brown and Italian Friesian herd milks. J. Dairy Res. 73:171–177

Malinauskytė E., Ramanauskaitė J., Leskauskaitė D., Devold T. G., Schüller R. B. and Vegarud

G. E. Effect of human and simulated gastric juices on the digestion of whey proteins and

carboxymethylcellulose-st abilised O/W emulsions. Food Chemistry. 2014, 165, 104-112

Malossini, F., S. Bovolenta, C. Piras, M. Dalla Rosa, and W. Ventura. 1996. Effect of diet and

breed on milk composition and rennet coagulation properties. Ann. Zootech. 45:29–40

Manderson, G.A., Hardman, M.J. & Creamer, L.K. 1998. Effect of heat treatment on the

conformation and aggregation of β-lactoglobulin A, B, and C. Journal of Agricultural and Food

Chemistry 46(12), 5052-5061

Manderson, G.A., Creamer, L.K. & Hardman, M.J. 1999. Effect of heat treatment on the circular

dichroism spectra of bovine β-lactoglobulin A, B, and C. Journal of Agricultural and Food

Chemistry 47(11), 4557-4567.

Martin, P., Szymanowska, M., Zwierzchowski, L. & Leroux, C. 2002. The impact of genetic

polymorphisms on the protein composition of ruminant milks. Reproduction Nutrition

Development 42(5), 433-459.

Marziali, A.S. & Ng-Kwai-Hang, K.F. 1986. Relationships between milk protein polymorphisms

and cheese yielding capacity. Journal of Dairy Science 86(5), 1193-1201

McKenzie, G.H., Norton, R.S., Sawyer, W.H., Marziali, A.S. & Ng-Kwai-Hang, K.F. 1971.

Heat-induced interaction of β-lactoglobulin and κ-casein. Journal of Dairy Research 38(3), 343-

351.

McLean, D.M., Graham, E.R.B., Ponzoni, R.W. & McKenzie, H.A. 1984. Effects of milk protein

genetic variants on milk yield and composition. Journal of Dairy Research 51(4), 531-546.

McLean, D.M. 1986. Influence of milk protein genetic variants on milk composition, yield and

cheese making properties. Animal Genetics 18(suppl 1), 100-102.

McMahon, D. J., and R. J. Brown. 1982. Evaluation of Formagraph for comparing rennet

solutions. J. Dairy Sci. 65:1639–1642.

McMahon, D. J., and R. J. Brown. 1984. Enzymatic coagulation of casein micelles: A review. J.

Dairy Sci. 67:919–929

Ming-Fang X., Jin-Feng D., Ming-Xia X., Xi-Fei C., Xiao-Cong Z., Cong-Qing W. and Wei-Jun

Z. Study on Differences of Milk Proteins by Liquid Chromatography-Mass Spectrometer. Chin

J Anal Chem. 2014, 42(4), 501–506.

Mohanty D.P., Mohapatra S., Misra S., Sahu Saudi P.S. Milk derived bioactive peptides and

their impact on human health – A review. Journal of Biological Sciences. 2016, 23, 577–583.

Neelin, J.M. 1964. Variants of κ−casein revealed by improved starch gel electrophoresis. Journal

of Dairy Science 47(5), 506-509

Ng-Kwai-Hang, K. F., J. F. Hayes, J. E. Moxley, and H. G. Monardes. 1987. Variation in milk

protein concentrations associated with genetic polymorphism and environmental factors. J. Dairy

Sci. 70:563–570.

Ng-Kwai-Hang, K. F., I. Politis, R. I. Cue, and A. S. Marziali. 1989. Correlations between

coagulation properties of milk and cheese yielding capacity and cheese composition. Can. Inst.

Food Sci. Technol. 22:291–294

Ng-Kwai-Hang, K.F. & Kim, S. 1996. Different amounts of β-lactoglobulin A and B in milk

from heterozygous AB cows. International Dairy Journal 6(7), 689-695.

84

Ng-Kwai-Hang, K.F., Dodds, C., Boland, M.J. & Auldist, M.J. 2002. The influence of genetic

variants of β-lactoglobulin on gelation speed and firmness of rennet curd. Milchwissenschaft

57(5), 267-269.

Nongonierma A. B., Fitzgerald R. J. The scientific evidence fort he role of milk protein-derived

bioactive peptides in humans: A Review. Journal of FunctionalFoods. 2015, 17, 640–656.

O’Connell, J.E., Fox, P.F. Heat-induced coagulation of milk. in: P.F. Fox, P.L.H. McSweeney

(Eds.) Advanced Dairy Chemistry. I. Proteins. 3rd ed. Kluwer Academic, London, UK;

2003:879–930

Okigbo, L. M., G. H. Richardson, R. J. Brown, and C. A. Ernstrom. 1985a. Variation in

coagulation properties of milk from individual cows. J. Dairy Sci. 68:822–828.

Okigbo, L. M., G. H. Richardson, R. J. Brown, and C. A. Ernstrom. 1985b. Effects of pH,

calcium chloride, and chymosin concentration on coagulation properties of abnormal and normal

milk. J. Dairy Sci. 68:2527–2533;

Oloffs, K., Schulte-Coerne, H., Pabst, K. & Gravert, H.O. 1992. The relevance of protein

variants to genetic differences in cheese making properties in milk. Züchtungskunde 64(1), 20-

26.

Ondetti M.A., Rubin B., Cushman D.W. Design of specific inhibitors of angiotensin-converting

enzyme: new class of orally active antihypertensive agents. Science. 1977, 196(4288), 441-444.

Ostersen, S., Foldager, J. & Hermansen, J.E. 1997. Effects of stage of lactation, milk protein

genotype and body condition at calving on protein composition and renneting properties of

bovine milk. Journal of Dairy Research 64(2), 207-219.

Pagnacco, G. & Caroli, A. 1987. Effect of casein and β-lactoglobulin genotypes on renneting

properties of milks. Journal of Dairy Research 54(4), 479-485

Paleckaitis,M., Masiulienė, A. 2002. Lietuvos juodmargių galvijų populiacijos genealoginės

struktūros dinamika. Veterinarija ir zootechnika. 20(42). P.92

Pauliukas K., Šidiškis A. R., Urbonavičius A., Šerėnas K. 2005. Veterinarija ir zootechnika. T.

30 (52). P. 67 – 68

Pepe G., Carlo G., Tenore V., Mastrocinque, Stusio P., & CAMPIGLIA P. Potential

Anticarcinogenic Peptides from Bovine Milk. Journal of Amino Acids. 2013, 1-7. Article ID

939804.

Petrat-Melin B., Andersen P., Rasmussen J. T., Poulsen N. A., Larsen L. B., Young J. F. In vitro

digestion of purified beta-casein variants A1, A2, B, and I: Effects on antioxidant and

angiotensin-converting enzyme inhibitory capacity. Journal of Dairy Science. Accepted for

publication, 2014.

Petrauskas D. Virškinamojo trakto anatomija ir fiziologija. Farmacija ir laikas. 2005, 8, 30-35.

Phelan M., Aherne A., Fitzgerald R., and O‘Brien N. Casein-derived bioactive peptides:

Biological effects, idustrial uses, safety aspects and regulatory status. International Dairy

Journal. 2009, 19, 643-654

Pinto M.S., Leonil J., Henry G., Cauty C., Carvahlo A.F. and Bouhallab S. Heating and glycation

of beta-lactoglobulin and beta-casein: Aggregation and in vitro digestion. Food res. Int. 2014,

55, 70-76.

Politis, I., and K. F. Ng-Kwai-Hang. 1988. Effects of somatic cell counts and milk composition

on the coagulating properties of milk. J. Dairy Sci. 71:1740–1746

Rahali, V. & Ménard, J.L. 1991. Influence of genetic variants of β-lactoglobulin and κ- casein on

milk composition and cheese-making capacity. Lait 71(3), 275-297

85

Rinaldi LL., Gauthier F., BRITTEN M., TURGEON S.L. In vitro gastrointestinal digestion of

liquid and semi-liquid dairy matrixes. Food Science and Technology. 2014, Acceptedmanuscript.

Rioux L.E., Turgeon S.L. The ratio of casein to whey protein impacts yogurt digestion in vitro.

Food dig. 2012, 3, 25-35.

Risso, P.H., Relling, V.M., Armesto, M.S., Pires, M.S. & Gatti, C.A. 2007. Effect of size, proteic

composition, and heat treatment on the colloidal stability of proteolyzed bovine casein micelles.

Colloid and Polymer Science 285(7), 809-817.

Salaun, F., Mietton, B., & Gaucheron, F. 2005. Buffering capacity of dairy products.

International Dairy Journal, 15, 95–109

Sawyer, W.H. 1969. Complex between β−lactoglobulin and κ−casein. A review. Journal of

Dairy Science 52(9), 1347-1355

Schaar, J. 1984. Effects of κ-casein genetic variants and lactation number on the renneting

properties of individual milks. J. Dairy Res. 51:397–406.

Schaar, J., Hansson, B. & Pettersson, H.E. 1985. Effects of genetic variants of κ-casein and β-

lactoglobulin on cheesemaking. Journal of Dairy Research 52(3), 429-437.

Schmelzer C.E.H., Schops R., Reynell L., Ulbrich-Hofmann R., Neubert R.H.H., Raith K.

Pepticdigestion of β-casein. Time course and fate of possible bioactive peptides. Journal of

Chromatography A. 2007, 1166, 108-115

Senge, B., Schulz, D. & Krenkel, K. 1997. Structure formation in milk during rennet

coagulation. Applied Rheology 7(4), 153-160

Singh H. Heat stability of milk International. Journal of Dairy technology. 2004, 57, 111-119.

Sofia V. Silva, Xavier Malcata F. Caseins as source of bioactive peptides. International Dairy

Journal. 2005, 15, 1–15.

Stuknyte M., Cattaneo S., Masotti F., De Noni I. Ocurence and fate of ACE-inhibitor peptides in

cheeses and their digestates following in vitro static gastrointestinal digestion. Food Chemistry.

2015, 168, 27-33.

Summer, A., P. Franceschi, A. Bollini, P. Formaggioni, F. Tosi, and P. Mariani. 2003. Seasonal

variations of milk characteristics and cheesemaking losses in the manufacture of Parmigiano-

Reggiano cheese. Vet. Res. Commun. 27(Suppl. 1):663–666

Tervala, H.L. & Antila, V. 1985. Milk with anomalous renneting properties. Meijeritieteellinen

Aikakauskirja 43(1), 26-32

The convention on biological diversity. UnitedNations. 1992, [žiūrėta 2017-03-15]. Priega per:

http://www.un.org/en/events/biodiversityday/convention.shtml

Thompson, M.P., Pepper, L., Zittle, C.A. & Kiddy, C.A. 1962. Variations in αs-casein fraction of

individual cows milk. Nature 195(4845), 1001

Tyriseva, A.-M., T. Ikonen, and M. Ojala. 2003. Repeatability estimates for milk coagulation

traits and non-coagulation of milk in Finnish Ayrshire cows. J. Dairy Res. 70:91–98

Tyrisevä, A.M. 2008. Options for selecting dairy cattle for milk coagulation ability. Diss.

University of Helsinki. Helsinki

van den Berg, G., J. T. M. Escher, P. J. de Koning, and H. Bovenhuis. 1992. Genetic

polymorphism of κ-casein and β-lactoglobulin in relation to milk composition and processing

properties. Neth. Milk Dairy J. 46:145–168

van Eenennaam, A.L. & Medrano, J.F. 1991. Differences in allelic protein expression in the milk

of heterozygous κ-casein cows. Journal of Dairy Science 74(5), 1491-1496.

86

van Hooydonk, A.C.M., Hagedoorn, H.G. & Boerrigter, I.J. 1986. The effect of various cations

on the renneting of milk. Netherlands Milk and Dairy Journal 40(4), 369-390.

Vercruysse L. Camp J. & Smagghe G. ACE inhibitory peptides derived from enzymatic

hydrolysates of animal muscle protein:  A Review. Journal of agricultural and foodchemistry.

2005, 53(21), 8106-8115.

Walsh, C.D., Guinee, T., Harrington, D., Mehra, R., Murphy, J., Connolly, J.F. & Fitzgerald,

R.J. 1995. Cheddar cheese-making and rennet coagulation characteristics of bovine milks

containing κ−casein AA or BB genetic variants. Milchwissenschaft 50(9), 492- 496.

Walsh, C.D., Guinee, T.P., Reville, W.D., Harrington, D., Murphy, J.J., O'Kennedy, B.T. &

Fitzgerald, R.J. 1998. Influence of κ-casein genetic variant on rennet gel microstructure, cheddar

cheesemaking properties and casein micelle size. International Dairy Journal 8(8), 707-714.

Walstra, P. 1999. Casein sub-micelles: do they exist? International Dairy Journal 9(3-9), 189-

192.

Waugh, D.F. & von Hippel, P.H. 1956. κ−casein and the stabilisation of casein micelles. Journal

of the American Chemical Society 78, 4576-5582.

Wedholm, A., Hallén, E., Larsen, L.B., Lindmark-Månsson, H., Karlsson, A.H. & Allmere, T.

2006a. Comparison of milk protein composition in a Swedish and a Danish dairy herd using

reversed phase HPLC. Acta Agriculturae Scandinavica Section A - Animal Science 56(1), 8-15.

Wedholm A., Larsen L. B., Lindmark-Mansson H., Karlsson A. H., Andre´A. Effect of Protein

Composition on the Cheese-Making Properties of Milk from Individual Dairy Cows. J. Dairy

Sc. 2006b, 89, 3296–3305.

Wedholm, A., Larsen, L.B., Lindmark-Månsson, H., Karlsson, A.H. & Andrén, A. 2006b. Effect

of protein composition on the cheese-making properties of milk from individual dairy cows.

Journal of Dairy Science 89(9), 3296-3305

Zhao D., Le T., Nielsen S.D & Larsen L.B. Proteolysis and diestibilitychange of β-lactoglobulin

and β-caseinduringstorage of post-hydrolyzedmilk: A study of a model system with commercial

lactases. Journal of Agriculture and Food Shemistry. Accepted for publication. 2017.

Žalio pieno pirminių kokybės rodiklių įvertinimo instrukcija. Patvirtintą Lietuvos Respublikos

žemės ūkio ministro 2006 m. liepos 25 d. įsakymu Nr. 3D-303

Žilinskaitė, G. 2013. Veislės įtaka karvių pieno sudėčiai ir kokybei. LSMU. Magistro

baigiamasis darbas. Prieiga per internetą: http://vddb.library.lt/fedora/get/LT-eLABa-

0001:E.02~2013~D_20130618_095050-69037/DS.005.0.02.ETD

87

PRIEDAS 1

FOSS DAIRY SEMINAR 2016 dalyvių skaičius: 45 įvairių pieno pramonės įmonių atstovai.

88

PRIEDAS 2

89

90

PRIEDAS 3

91

92

PRIEDAS 4

93

PRIEDAS 5

Priede pateiktos lentelės, kuriose pavaizduotas peptidų, atskeltų nuo tam tikros kazeino

frakcijos iš Lietuvos senojo genotipo juodmargės veislės karvės pieno (LV) arba Holšteino

veislės karvės pieno (HV) fermentinių (F) arba rūgštinių (R) sutraukų, profilio kitimas prieš

virškinimą (VTE) ir virškinimo metu (po 2 val. virškinimo skrandyje S3 ir 2 val. virškinimo

žarnyne Ž3). Peptidai pateikti aminorūgščių grandinės ilgėjimo tvarka ir išdėstyti pagal padėtį

grandinėje. Paryškintu šriftu pateikti bioaktyviomis savybėmis pasižymintys peptidai.

1 lentelė. β–kazeino hidrolizės produktai

Aminorūgščių

skaičius

Padėtis

grandinėje Aminorūgščių seka

Prieš

virškinimą

(VTE)

Po 2 val

virškinimo

skrandyje

(S3)

Po 2 val

virškinimo

žarnyne (Ž3)

LV HV LV HV LV HV

F R F R F R F R F R F R

A b c d e f g h j k l m n o p

5 171-175 LPVPQ + +

5 178-182 VPYPQ + +

5 203-207 GPFPI + +

5 205-09 FPIIV + +

6 01-06 RELEEL + +

6 22-27 SITRIN + +

6 23-28 ITRINK 2: Ph (ST) +

6 47-52 DKIHPF + + + +

6 53-58 AQTQSL +

6 120-125 TESQSL + +

6 126-131 TLTDVE + +

6 161-166 SVLSLS + + +

6 170-175 VLPVPQ + +

6 183-188 RDMPIQ +

6 184-189

DMPIQA 2: Oxid.

(M) +

+ + + + +

6 187-192 IQAFLL +

6 193-198 YQEPVL + + + + +

7 46-52 QDKIHPF +

7 47-53 DKIHPFA +

7 169-175 KVLPVPQ + + +

7 176-182 KAVPYPQ + + + + +

7 183-189 RDMPIQA + + +

7 184-190 DMPIQAF + +

8 7-14 NVPGEIVE + +

8 120-127 TESQSLTL +

8 161-168 SVLSLSQS + +

8 168-175 SKVLPVPQ + +

94

1 lentelė. Tęsinys

a B c d e f g h j k l m n o p

8 197-204 VLGPVRGP + +

8 199-206 GPVRGPFP +

9 29-37 KIEKFQSEE 7:Ph(ST) + +

9 38-46 QQQTEDELQ + + +

9 44-52 ELQDKIHPF + +

9 69-77 SLPQNIPPL + +

9 93-101 MGVSKVKEA +

9 120-128 TESQSLTLT + +

9 167-175 QSKVLPVPQ + +

10 92-101 VMGVSKVKEA +

10 166-175 SQSKVLPVPQ + + + +

10 183-192 RDMPIQAFLL + +

10 193-202 YQEPVLGPVR + + + + + +

10 19-206 VLGPVRGPFP + +

11 194-204 QEPVLGPVRGP + +

11 197-207 VLGPVRGPFPI + +

12 57-68 SLVYPFPGPIHN +

12 94-105 GVSKVKEAMAPK + + + +

12 164-175 SLSQSKVLPVPQ + + +

12 193-204 YQEPVLGPVRGP + +

13 170-182 VLPVPQKAVPYPQ + +

13 194-206 QEPVLGPVRGPFP + +

14 75-88 PPLTQTPVVVPPFL +

14 169-182 KVLPVPQKAVPYPQ + + +

14 193-206 YQEPVLGPVRGPFP + +

15 16 -182 SKVLPVPQKAVPYPQ + +

17 166-182 SQSKVLPVPQKAVPYPQ + +

5 125-129 LTLTD + + + + + + + +

5 185-189 MPIQA + +

5 191-195 LLYQE +

6 06-11 LNVPGE + + + + + + + +

6 122-127 SQSLTL + + + +

6 124-129 SLTLTD +

7 157-163 FPPQSVL + + + + + + + +

7 192-198 LYQEPVL + + + +

7 193-199 YQEPVLG + + + + + + + +

8 81-88 PVVVPPFL + + +

8 133-140 LHLPLPLL + +

9 81-89 PVVVPPFLQ + + + + +

9 132-140 NLHLPLPLL + + + +

10 46-55 QDKIHPFAQT +

10 49-58 IHPFAQTQSL + + + +

10 115-124 PVEPFTESQS +

10 133-142 LHLPLPLLQS +

10 199-208 GPVRGPFPII +

95

1 lentelė. Tęsnys

a b c d e f g h j k l m n o p

10 200-209 PVRGPFPIIV + + + + + + + +

11 45-55 LQDKIHPFAQT + + + +

11 130-140 VENLHLPLPLL + + + + + +

11 132-142 NLHLPLPLLQS + + +

11 199-209 GPVRGPFPIIV + + + +

12 59-70 VYPFPGPIPNSL + + + +

12 81-92 PVVVPPFLQPEV + + + + + + + +

12 129-140 DVENLHLPLPLL + + + + +

12 164-175 SLSQSKVLPVPQ + +

13 45-57 LQDKIHPFAQTQS + + + +

13 58-70 LVYPFPGPIPNSL + +

13 81-93 PVVVPPFLQPEVM + + + + + + + +

13 81-93 PVVVPPFLQPEVM13:Ox + + + +

13 128-140 TDVENLHLPLPLL + + + + + +

13 164-176 SLSQSKVLPVPQK +

13 177-189 AVPYPQRDMPIQA + + +

13 193-205 YQEPVLGPVRGPF + + + + +

14 45-58 LQDKIHPFAQTQSL + + + +

14 81-94 PVVVPPFLQPEVMG + + + + +

14 127-140 LTDVENLHLPLPLL + +

14 129-142 DVENLHLPLPLLQS + + +

14 143-156 WMHQPHQPLPPTVM + + + +

14 193-206 YQEPVLGPVRGPFP + + +

14 196-209 PVLGPVRGPFPIIV + + + + + + + +

15 128-142 TDVENLHLPLPLLQS + + + +

16 193-208 YQEPVLGPVRGPFPII + + + + + + +

16 194-209 QEPVLGPVRGPFPIIV +

17 166-182 SQSKVLPVPQKAVPYPQ +

17 193-209 YQEPVLGPVRGPFPIIV + + + + + + + +

18 192-209 LYQEPVLGPVRGPFPIIV + + +

19 75-93

PPLTQTPVVVPPFLQPEVM 4:

Phospho (ST) 6: Phospho (ST) 19:

Oxidation (M)

+ + + +

22 59-80 VYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQT + + + + +

26 164-189 SLSQSKVLPPQKAVPYPQRDMPIQA +

5 184-188 DMPIQ +

5 193-197 YQEPV + +

6 53-58 AQTQSL + + + +

6 108-113 EMPFPK + + + +

6 114-119 YPVEPF + + + +

6 120-125 TESQSL + + + +

6 128-133 TDVENL + + + +

6 134-139 HLPLPL + +

6 157-162 FPPQSV + + + +

6 170-175 VLPVPQ + + + +

96

1 lentelė. Tęsinys

a b c d e f g h j k l m n o p

6 177-182 AVPYPQ + + + +

6 196-201 PVLGPV +

6 203-208 GPFPII + + + +

7 120-126 TESQSLT +

7 170-176 VLPVPQK + + + +

7 177-183 AVPYPQR + + +

7 184-190 DMPIQAF + + +

8 45-52 LQDKIHPF + + + +

8 49-56 IHPFAQTQ +

8 59-66 VYPFPGPI + +

8 106-113 HKEMPFPK + + + +

9 58-66 LVYPFPGPI +

9 193-201 YQEPVLGPV + + + +

9 199-207 GPVRGPFPI + +

10 59-68 VYPFPGPIPN + +

10 114-123 YPVEPFTESQ + + + +

10 130-139 VENLHLPLPL + + + +

10 192-201 LYQEPVLGPV +

11 58-68 LVYPFPGPIPN +

11 81-91 PVVVPPFLQPE + + + +

11 114-124 YPVEPFTESQS + +

11 129-139 DVENLHLPLPL + + + +

12 69-80 SLPQNIPPLTQT +

12 108-119 EMPFPKYPVEPF + + + +

12 128-139 TDVENLHLPLPL + + + +

12 196-207 PVLGPVRGPFPI + + +

13 127-139 LTDVENLHLPLPL + + + +

13 128-140 TDVENLHLPLPLL + + +

14 67-80 HNSLPQNIPPLTQT + +

14 106-119 HKEMPFPKYPVEPF +

14 126-139 TLTDVENLHLPLPL + + + +

15 193-207 YQEPVLGPVRGPFPI + + + +

16 194-209 QEPVLGPVRGPFPIIV + +

20 33-52

FQSEEQQQTEDELQDKIHPF 3:

Phospho (ST)

+ + + +

97

2 lentelė. αs1–kazeino hidrolizės produktai

Aminorūgščių

skaičius

Padėtis

grandinėje Aminorūgščių seka

Prieš

virškinimą

(VTE)

Po 2 val

virškinimo

skrandyje

(S3)

Po 2 val

virškinimo

žarnyne (Ž3)

LV HV LV HV LV HV

F R F R F R F R F R F R

a b c d e f g h j k l m n o p

5 17-21 NENLL +

5 19-23 NLLRF + +

6 14-19 EVLNEN +

6 15-20 VLNENL + +

6 18-23 ENLLRF + + +

6 25-30 VAPFPE + + + + +

6 56-61 DIKQME + +

7 10-16 GLPQEVL + +

7 14-20 EVLNENL + +

7 17-23 NENLLRF + + + +

7 24-30 FVAPFPE + + +

8 16-23 LNENLLRF + +

9 15-23 VLNENLLRF + +

9 51-59 DQAMEDIKQ +

9 71-79 IVPNSVEQK 5:Phsopho (ST) +

9 115-123 SAEERLHSM 5:Phsopho (ST) + +

9 131-139 QKEPMIGVN + + + +

10 12-21 PQEVLNENLL + +

10 14-23 EVLNENLLRF + +

13 01-13 RPKHPIKHQGLPQ + +

16 01-16 RPKHPIKHQGLPQEVL + +

5 149-153 LFRQF +

6 144-149 YFYPEL + + + + + + +

6 159-164 YPSGAW + +

6 174-179 TDAPSF + + + +

7 25-31 VAPFPEV + + + +

7 143-149 AYFYPEL + + + + + + + +

7 157-163 DAYPSGA +

7 166-172 YVPLGTQ + +

7 173-179 YTDAPSF + + + + + + + +

8 24-31 FVAPFPEV + + + + + + + +

8 25-32 VAPFPEVF + + + + + +

8 142-149 LAYFYPEL + + + +

8 157-164 DAYPSGAW + + + + + + + +

8 165-172 YYVPLGTQ + + + + + +

8 166-173 YVPLGTQY + + +

9 24-32 FVAPFPEVF + + + + +

9 165-173 YYVPLGTQY + +

98

2 lentelė. Tęsinys

a b c d e f g h j k l m n o p

9 165-173 YYVPLGTQY + + + +

10 180-189 SDIPNPIGSE + +

10 190-199 NSEKTTMPLW + +

11 25-35 VAPFPEVFGKE + + + + + + + +

11 81-91 IQKEDVPSERY + +

11 99-109 LRLKKYKVPQL + + + +

11 110-120 EIVPNSAEERL 6: Phospho (ST) + + + +

11 154-164 YQLDAYPSGAW + +

12 24-35 FVAPFPEVFGKE + + + + +

12 165-176 YYVPLGTQYTDA + + +

14 166-179 YVPLGTQYTDAPSF + +

15 25-39 VAPFPEVFGKEKVNE + + +

15 165-179 YYVPLGTQYTDAPSF + + + +

16 24-39 FVAPFPEVFGKEKVNE + + + +

17 180-196 SDIPNPIGSENSEKTTM + + + +

20 180-199 SDIPNPIGSENSEKTTMPLW + + + +

5 95-99 LEQLL + + + +

5 104-108 YKVPQ + + +

5 194-198 TTMPL + + + +

5 195-199 TMPLW + +

6 104-109 YKVPQL + + +

6 173-178 YTDAPS +

7 165-171 YYVPLGT + +

7 166-172 YVPLGTQ +

7 180-186 SDIPNPI + + + +

8 08-15 HQGLPQEV +

8 84-91 EDVPSERY + + + +

8 165-172 YYVPLGTQ + + +

8 166-173 YVPLGTQY + +

9 08-16 HQGLPQEVL + + +

9 24-32 FVAPFPEVF + + + +

9 25-33 VAPFPEVFG + +

9 165-173 YYVPLGTQY + + +

10 24-33 FVAPFPEVFG + + + +

10 25-34 VAPFPEVFGK + + +

10 110-119 EIVPNSAEER 6: Phospho (ST) + + + +

10 133-142 EPMIGVNQEL +

11 24-34 FVAPFPEVFGK + + + +

11 25-35 VAPFPEVFGKE + + +

11 80-90 HIQKEDVPSER + + + +

12 80-91 HIQKEDVPSERY + + + +

14 180-193 SDIPNPIGSENSGK + + + +

18 125-142 EGIHAQQKEPMIGVNQEL + + + +

99

3 lentelė. αs2–kazeino hidrolizės produktai

Aminorūgšči

ų skaičius

Padėtis

grandinėj

e

Aminorūgščių seka

Prieš

virškinimą

(VTE)

Po 2 val

virškinimo

skrandyje

(S3)

Po 2 val

virškinimo

žarnyne (Ž3)

LV HV LV HV LV HV

F R F R F R F R F R F R

5 166-170 ALPQY + +

6 168-173 PQYLKT + +

7 189-195 TKVIPYV + +

10 166-175 ALPQYLKTVY + +

7 80-86 YQKFPQY + + + +

16 91-106 YQGPIVLNPWDQVKRN + +

21 91-111 YQGPIVLNPWDQVKRNAVPIT + + + +

24 91-114

YQGPIVLNPWDQVKRNAVPITP

TL

+ +

5 189-193 AMKPW + + + +

6 89-94 YQKFPQ + + + +

6 115-120 NAVPIT + + + +

6 198-203 TKVIPY + + +

7 89-95 YQKFPQY + + + +

7 107-113 NPWDQVK + +

7 198- 04 TKVIPYV + + +

8 81-88 ALNEINQF + + + +

8 115-122 NAVPITPT + +

9 81-89 ALNEINQFI +

9 115-123 NAVPITPTL + + +

9 153-161 LTEEEKNRL + +

10 71-80 ITVDDKHYQK +

13 100-112 YQGPIVLNPWDQV + + + +

14 99-112 LYQGPIVLNPWDQV + +

14 100-113 YQGPIVLNPWDQVK + + + +

15 99-113 LYQGPIVLNPWDQVK + +

100

4 lentelė. κ–kazeino hidrolizės produktai

Aminorūgščių

skaičius

Padėtis

grandinėje Aminorūgščių seka

Prieš

virškinimą

(VTE)

Po 2 val

virškinimo

skrandyje (S3)

Po 2 val

virškinimo

žarnyne (Ž3)

LV HV LV HV LV HV

F R F R F R F R F R F R

a b c d e f g h j k l m n o p

5 75-79 QWQVL +

5 161-165 TVQVT + +

6 18-23 FSDKIA +

6 80-85 SNTVPA + + +

7 161-167 TVQVTST + + + +

8 21-28 KIAKYIPI + +

8 153-160 IESPPEIN + +

9 33-41 SRYPSYGLN + + + + + + + + + +

9 42- 50 YYQQKPVAL +

9 45-53 QKPVALINN + +

9 66-74 AVRSPAQIL +

9 132-140 STPTIEAVE +

9 138-146 AVESTVATL +

9 143-151 VATLEDSPE 9: Phospho (ST) +

9 152-160 VIESPPEIN + + + +

9 161-169 TVQVTSTAV + + + +

10 96-105 ARHPHPHLSF + + + + + +

11 42-52 YYQQKPVALIN +

11 43-53 YQQKPVALINN +

11 61-71 YAKPAAVRSPA + +

11 141-151

STVATLEDSPE 9: Phospho

(ST)

+

12 42-53 YYQQKPVALINN +

5 51-55 INNQF + +

6 33-38 SRYPSY + + + +

8 22-29 IAKYIPIQ +

8 31-38 VLSRYPSY + + + +

8 42-49 YYQQKPVA + + + + + +

8 43-50 YQQKPVAL + + + +

8 162-169 VQVTSTAV + + + +

9 22-30 IAKYIPIQY + + + +

9 42-50 YYQQKPVAL + + + +

9 67-75 VRSPAQILQ + + + + + + + +

9 161-169 TVQVTSTAV +

10 33-42 SRYPSYGLNY + + + +

10 51-60 INNQFLPYPY + + + + + + + +

10 67-76 VRSPAQILQW +

10 67-76 VRSPAQILQW + + +

11 31-41 VLSRYPSYGLN +

101

4 lentelė. Tęsinys

a b c d e f g h j k l m n o p

11 56-66 LPYPYYAKPAA + + + +

12 18-29 FSDKIAKYIPIQ + + + +

13 18-30 FSDKIAKYIPIQY + + + +

13 125-137 IASGEPTSTPTTE + +

16 51-66 INNQFLPYPYYAKPAA + + + +

5 25-29 YIPIQ + +

5 56-60 LPYPY + + + +

6 25-30 YIPIQY +

6 61-66 YAKPAA + + + +

6 162-167 VQVTST + +

7 17-23 FFSDKIA +

7 18-24 FSDKIAK + + +

7 42-48 YYQQKPV + + + +

8 17-24 FFSDKIAK + +

10 77-86 QVLSNTVPAK +

11 76-86 WQVLSNTVPAK + +

12 113-124 NQDKTEIPTINT + +

6 PRIEDAS

Priede pateiktos lentelės, kuriose nurodyti peptidai pasižymintys bioaktyviomis savybėmis gauti iš kazeino frakcijų. 1, 2, 3, 4 – mėginiai

vandeniniai ekstraktai (VTE) atitinkamai senojo genotipo Lietuvos juodmragės veislės karvės pieno fermentinės (F) ir rūgštinės (R) sutraukos bei

Holšteino veislės karvės pieno fermentinės (F) ir rūgštinės (R) sutraukos, –2, –4 mėginiai atitinkamai po 2 val. virškinimo skrandyje imitavimo in

vitro sistemoje (S3) ir po 2 val. virškinimo žarnyne imitavimo in vitro sistemoje (Ž3). Lentelėse taip pat nurodytas bendras boaktyvių peptidų

skaičius mėginyje ir jų biofunkcijos.

1 lentelė. Bioaktyvūs peptidai atskelti nuo β–kazeino grandinės

β–kazeinas

Nr. Id. masė Teor.

masė Peptido seka

Padėtis

grandinėje

Mėginiai

Biofunkcija Nuoroda 1

1

-

2

1

-

4

2

2

-

2

2

-

4

3

3

-

2

3

-

4

4

4

-

2

4

-

4

a b c d e f g h j k l m n o p r s t u

1 829,344 829,445 AVPYPQR 177–183 + + + ACE inhibitorius [102]

2 1156,607 1156,624 YQEPVLGPVR 193–202 + + + + + + ACE inhibitorius [102]

3 747,378 747,363 EMPFPK 108–113 + + + + ACE inhibitorius [94, 102]

4 747,339 747,380 YQEPVL 193–198 + + + + + + ACE inhibitorius [102]

5 1880,132 1880,056 YQEPVLGPVRGPFPIIV

193–209 + + + + + + + + Imunomoduliatori

ai, antimikrobiniai [102]

6 755,411 755,397 DKIHPF 47–52 + + + + β-kazoksinas [124]

7 628.330 627.264 LNVPGE 6–11 + + + + + + + + ACE inhibitorius [103]

8 787.435 786.314 FPPQSVL 157–163 + + + + + + + + ACE inhibitorius [103]

9 2390.275 2390.196 VYPFPGPIPNSLPQNIPP

LTQT 59–80 + + + + + + ACE inhibitorius [103]

10 1151.694 1150.628 GPVRGPFPIIV 199–209 + + + + ACE inhibitorius [103]

11 1094.672 1093.698 PVRGPFPIIV 200–2009 + + + + + + + + ACE inhibitorius [103]

12 995.592 994.648 PVVVPPFLQ 81–89 + + + + ACE inhibitorius [103]

103

1 lentelė. Tęsinys

a b c d e f g h j k l m n o p r s t u

13 1300.694 1299.738 VYPFPGPIPNSL 59–70 + + + + ACE inhibitorius [103]

14 530.284 530.297 GPFPI 203–207 + + Katepsino B

inhibitorius [111]

Bendras bioaktyvių peptidų skaičius mėginyje 3 9 7 2 9 9 2 8 8 2 9 7

2 lentelė. Bioaktyvūs peptidai atskelti nuo αs1–kazeino grandinės

αs1–kazeinas

Mėginiai

Nr. Id. masė Teor. masė Peptido seka Padėtis

grandinėje 1

1

-

2

1

-

4

2

2

-

2

2

-

4

3

3

-

2

3

-

4

4

4

-

2

4

-

4

Biofunkcija Nuoroda

1 865,358 865,361 DAYPSGAW 157–164

+ + + + + + + + ACE inhibitorius [102]

2 763.365 762.363 DIKQME 56–61 + + ACE inhibitorius [103]

3 1001.520 1000.569 FRQFYQL 150–156 + ACE inhibitorius [103]

4 662.398 661.392 NLLRF 19–23 + + + + + ACE inhibitorius [103]

5 831.392 830.298 YFYPEL 144–149 + + + + + + + ACE inhibitorius [103]

6 1219.636 1218.654 VAPFPEVFGKE 25–35 + + + + + + + + ACE inhibitorius [103]

7 902.429 901.373 AYFYPEL 143–149 + + + + + + + ACE inhibitorius [103]

8 905.477 904.364 FVAPFPEV 24–31 + + + + + + + + ACE inhibitorius [103]

9 1836.953 1835.749 FVAPFPEVFGKE

KVNE 24–39 + + + + ACE inhibitorius [103]

10 905.477 904.479 VAPFPEVF 25–32 + + + + + + ACE inhibitorius [103]

11 1015.513 1014.427 LAYFYPEL 142–149 + + + + ACE inhibitorius [103]

Bendras bioaktyvių peptidų skaičius mėginyje 1 8 6 1 9 5 1 1

0 4 1 9 5

104

3 lentelė. Bioaktyvūs peptidai atskelti nuo αs2–kazeino grandinės

αs2–kazeinas

Nr. Id. masė Teor. masė Peptido seka Padėtis

grandinėje

Virškinimo mėginiai

Biofunkcija Nuorodas 1

1

-

2

1

-

4

2

2

-

2

2

-

4

3

3

-

2

3

-

4

4

4

-

2

4

-

4

1 631,281 631,315 AMKPW 189–193 + + + + ACE inhibitorius [102]

Bendras bioaktyvių peptidų skaičius mėginyje 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1

4 lentelė. Bioaktyvūs peptidai atskelti nuo κ–kazeino grandinės

κ–kazeinas

Nr. Id. masė Teor. masė Peptido seka Padėtis

grandinėje

Virškinimo mėginiai

Biofunkcija Nuoroda 1

1

-

2

1

-

4

2

2

-

2

2

-

4

3

3

-

2

3

-

4

4

4

-

2

4

-

4

1 711.944 1422.799 FSDKIAKYIPIQ 18–29 + + + + ACE inhibitorius [103]

2 400.205 1198.623 ARHPHPHLSF 96–105 + + + + + ACE inhibitorius [103]

3 890.400 890.483 AVESTVATL 138–146 + ACE inhibitorius [103]

4 804.404 804.446 VQVTSTAV 162–169 + + + + ACE inhibitorius [103]

Bendras bioaktyvių peptidų skaičius mėginyje 1 3 0 1 3 0 0 3 0 0 3 0