GENEL BİYOLOJİ

LABORATUVARI

DENEYLERİ 1

ERZURUM TEKNİK ÜNİVERSİTESİ

MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK BÖLÜMÜ

Hazırlayan

Arş. Gör. Mehmet Enes ARSLAN

Erzurum, 2014

1. HAFTA: LABORATUVAR GÜVENLİĞİ

Laboratuvar dersinden önce: Hocalarınız

Sizi sorumluluklarınız hakkında bilgilendireceklerdir.

Size kimyasalları ve diğer maddeleri nereye atmanız gerektiğini göstereceklerdir.

M.S.D.S (malzeme güvenlik bilgi formu) belgelerinin nerede olduğunu göstereceklerdir.

Ve herhangi bir kaza yada olay hakkında hocalarınızı bilgilendirmeniz gerekmektedir.

Güvenlik ekipmanlarının yerini ve nasıl kullanmanız gerektiğini göstereceklerdir.

Bunlar:

Güvenlik banyosu ve göz yıkama

İlk yardım çantası

Acil durum gaz kapama mandalı

Yangın söndürme tüpü

Lab telefonu

Bunun Yanında

İlk yardım maddelerinin kullanılması.

Planlanmış çıkışlar ve rotalar.

Laboratuvar terketme prosedürü.

Laboratuvar da Çalışırken: Aşşağıdaki kurallar, kimyasal hijyen planında yer alır:

Cam / Cam tüpler/ Termometreler. Cam malzemeleri dizayn edildiği amaç doğrultusunda

kullanınız. Cam malzemeleri sabitleyicilere yerleştirirken “güvenli tutacaklar” kullanınız ki

kırılmalar gerçekleşmesin. Cam tüpleri kesmeniz gerekiyorsa gözlük giyiniz ve uygun araçlarla

kesimi yapınız.

Sigara içmek yasaktır. Bu kanun bütün üniverstelerde ve laboratuvarlarda geçerlidir.

Yerleşim. Cihazlar, kimyasallar veya mobilyalar, geçişleri ,kapıları ya da çıkışları

kapamamalıdırlar.

Yemekler, içecekler ve kozmetik ürünler. Yemek, içmek ve ya kozmetik ürünlerini

kullanmak laboratuvarda kesinlikle yasaktır (Zararlı kimyasaların buludunduğu ortamlar).

Kimyasal maddelerin bulunduğu dolaplara yiyecek maddelerini saklamayınız.

Eşek şakası. Laboratuvar içerisinde şakalaşmak veya profesyonel olamayan davranışlarda

bulunmak yasaktır. Deneylerine devam eden öğrencilerin dikkatini dağıtmaktan veya işlerinden

alıkoymaktan kaçınınız.

Ekipman. Sadece iyi durumda olan ekipmanları kullanmaya özen gösteriniz. Kırılmış yada

çatlamış cam malzemeleri kullanmak tehlikeli olabilir bu yüzden görevli araştırma görevlilerine

bildiriniz. Basınç veya vakum araçlarını dikkatli kullanınız ve kaynama malzemelerini

gereğinden fazla ısıtmaktan kaçınınız. Güvenlik malzemelerini elinizden geldiğince kullanınız.

Kimyasalların kullanımı. Kimyasal maddeleri tatmayınız veya koklamayınız. Kimyasalları

uygun yerlerde (çeker ocağı vb.) kullanınız, gerekiyorsa malzeme güvenlik bilgi formunu

okuyunuz

Zararlı materyaller. Zararlı maddeler açık bir şekilde bençlerde kullanılmamalıdır ve yanlız

başınıza bu maddeleri kullanmayınız. Kullandığınız zararlı maddenin kimyasal hijyen

prosedürünü öğreniniz.

Ağızla pipetleme. Kesinlikle yasaktır.

Uygun giyinme: Göz koruyucu gözlüklerinizi ve yüz korumalarınız yanınızda bulundurunuz.

Laboratuvarda bulunduğunuz süre boyunca lab önlüğünüzü ve eldivenlerinizi giyiniz. Yarı açık

ayakabılar veya sandaletler kesinlikle yasaktır. Açık bırakılan uzun saçlar veya uzun tırnaklar

laboratuvar güvenliği açısından tehlike oluşrurur.

Bireysel hijyen: Lab da çalışırken elinizi gözünüze veya ağzınıza götürmeyiniz Ve laboratuvarı

terkederken kesinlikle ellerinizi yıkayınız.

Atıkların çöpe atılamsı. Atıkların ayrılması sağlık açısından önemlidir. Atıkların

sınıflandırılması ve depolanması uygun prosedürlere göre uygulanmalıdır.

Biyolojik tehlike içeren maddelerin atıldıkları bölgeler ve keskin uçlu materyallerin atıldığı

yerler bilinmelidir

Göz Koruma

-Gözler fırlayabilcek objelere, toz parcalarına ve kimyasal maddelerin sıçrama tehlikesine veya

UV ışınlarına karşı korunmalıdır.

-Ultra viyole ışınlarından koruyan gözlükler temin edilmelidir

Güvenlik Gözlükleri

-Kırılmaz plastik veya cam malzemeden üretilmiş olmalıdır.

-Kullanımı kolay olmalıdır

-Tıbbi lensler içermelidir

-Kontak lens kullananların görüşünü etkilememelidir

-Sıçrama tehlikesi olan maddelerle çalışırken giyilmelidir

-Reçeteli gözlükler üzerine giyilebilirler

Yüz Korumaları

-Patlama veya sıçrama tehlikesi olan maddelerle çalışırken yüzü koruma amacı ile kullanılırlar.

-Yüz korumaları gözleri çok etkili biçimde korumaz sadece yüzü koruma amacı ile

üretilmişlerdir.

Ellerin Korunması

-Ellerinizi kesilmelere, yanmalara ve kimyasal maddelerle temasa karşı korumanız

gerekmektedir.

-Çalıştığınız kimyasallara uygun olan spesifik dayanıklı eldiven türlerini seçiniz

Laboratuvarda çalışırken:

-Şüphelenilen biyolojik tehlikelere karşı uluslararası güvenlik noktalarını takip ediniz.

-Bilinmeyen kimyasal maddeleri tehlikeli madde sınıfındaymış gibi ele alınız

-Uçucu kimyasalları çeker ocaklarında kulllanınız

-Biyolojik canlılık içeren maddeleri özel kabinlerde muhafaza ediniz

-Etrafınızda yetkili kişiler olmadan cihazları ve kimyasalları kullanmayınız.

-HER ŞEYİ tanımlayın! TÜM kaplar açıkça içeriği ile etiketlenmelidir.

Hocalarınızı bilgilendirin:

-Kazalar

-Yaralanmalar

-Yanmalar

-Dökülmeler

-Kararsız kaldığınız durumlarda

Laboratuvardan Ayrılmadan Önce:

-Kapatınız!

-Gaz

-Su

-Güç kaynakları

-Vakum cihazlarını

-Sıkıştırma cihazlarını

-Isıtma aletlerini

-Çöpleri ve atılacak materyalleri belirleyip uygun bir şekilde paketleyiniz

-Arızalı cihazları belirleyip işaretleyiniz

-Kontamine olmuş bölgeleri ve cihazları temizleyiniz

-Kullandığınız cihazları ve kimyasal maddeleri yerlerine koyunuz

-Ellerinizi yıkayınız

-Laboratuvarı kapatıp kitleyiniz

LAB DEFTERLERİ YAZIM KLAVUZU Spiral defter kullanmayınız çünkü sayfaları kolaylıkla kopabilmektedir. Beyaz düz veya kareli

defter kullanabilirsiniz. En az 200 sayfa yeterli olacaktır.

Defterlerinize not alırken silinmez kalemler kullanınız (tükenmez kalem olabilir)

Bütün sayfaları numaralandırınız, böylelikle işlerinizi takip edebiliriz.

Defterin ilk iki sayfasını boş bırakınız. Boş sayfalar içerikleri yazarken kullanılacaktır.

Lab dersi başladığında bulunduğu sayfayı içerik kısmına ve hangi sayfada yer aldığını yazınız.

Farklı dersleri aynı sayfaya yazmayınız.

Bilgiler lab defterine olduğu gibi yazılmalıdır.

Laboratuvarda yapılan işleri tarihlerle de etiketleyiniz. Gün-Ay-Yıl formatında ve sağ üst

köşeye yazınız.

Yazılan yanlışlar sadece bir çizgiyle üzerinden geçilmelidir. Yapılan bütün hatalar görünebilir

olmalıdır ve silinmemelidir.

Belgeler deftere yapıştırılabilir. Örneğin bilgisayar çıktıları, resimler, grafikler vb.

Laboratuvar çalışması başlığı mutlaka yazılmalıdır, bir sonraki sayfaya geçildiyse devamı

şeklinde tekrar yazılmalıdır.

Aşşağıdaki bilgiler lab defterinde yer almalıdır.

o Lab partnerlerinizin isimleri

o Konu ve amaç

o Hipotez ve nasıl test edildiği

o Prosedür

Her adım defterinize kaydedilmelidir, böylelikle aynı prosedür tekrar defterdeki metoda gore

yapılabilmelidir.

Deneyi etkileyebilecek çevresel faktörler (sıcaklık, nem, kirlilik vs.)yazılmalıdı.

o Sonuçlar. Birimleri ile birlikte kaydedilmelidir (kg, cm, litre vs.). cihazlarla ölçülen ve elde

edilen bilgiler deftere yapıştırılabilir, beklenmeyen veya hatalı bilgiler de defterlerinize

yazılmalıdır.

o Eğer bilgiler bilgisayarda kayıtlıysa ve deftere yazılmadıysa, hangi dosyada ve bilgisayarda

olduğu yazılmalıdır.

o Grafikler, tablolar, çizimler veya fotoğraflar defterinizde yer alabilir.

o Hesaplamalar defter üzerinde yapılmalıdır. Kullanılan formüller belirtilmelidir. Birden fazla

aynı hesaplama varsa, bir tanesi örnek olarak bulundurulması yeterli olacaktır.

o Çıkarımlar defterde belirtilmelidir. Laboratuvarda yapılan deneyde neler beklendi ve başarıldı.

Her deney bittiğinde yazınızın sonuna “SON” yazılmalıdır ve imza atılmalıdır.

Laboratuvarda yapılan bütün deneysel bilgiler deftere o ders içerisinde yazılmalıdır.

RAPOR YAZIM NOKTALARI:

Adınız Soyadınız

Numaranız

Bölümünüz ve Sınıfınız

BAŞLIK

1- ÖZET-AMAÇ

2-GİRİŞ

3-MATERYAL-METHOD

4-SONUÇLAR

5-TARTIŞMA

6-REFERANSLAR

RAPOR ÖRNEĞİ:

İsim Soyisim

Numara

MBG-1 Ö.Ö.

COMPETITIVE ELISA ASSAY AND SPECTROPHOTOMETRIC

MEASUREMENTS

1-ABSTRACT

In this experiment our main purpose was learning background information about

ELISA, types of ELISA assay and calculating the concentration of unknown solutions by

performing competitive ELISA assay and spectrophotometric measurements.

2-INTRODUCTION

Before getting into the ELISA, we should first look to definitions of antibody, antigen

and immunoassay. Antibodies or immunoglobulins are gamma globulin proteins. They are

present in our blood and it is used for foreign molecules or organisms identification and

neutralization. Here are the structure of antibody that shows binding sites on antibody. Antigen

is a molecule that can cause production of antibodies when they are introduced into bodies. And

the last definition, immunoassay, it is a kind of assay for detecting and quantifing specific

antigen or antibody in samples by using interaction between antigen and antibody. Epitope is

a part of the antihen that is bound by antibody. And the epitope region of antigen is composed

of sugars, lipids or aminoacids(1).

Figure 1: Interaction between antigen and antibody

(www.scizmic.net/downloads/vaccinations/3_vaccinedef.pdf)

Enzyme-linked immunosorbent assay is a type of assay that depends on the reaction

between antigen and antibody in vitro. It is possible to detect and quantify antigens or antibodies

with the aid of this method. This test was firstly used for HIV screening test. Today, this test is

used to[2]

for measuring antibody level for allergy and vaccines cases

for detecting viruses such as hepatitis and HIV

for detecting hormonal changes such as in pregnancy,

for detecting circulatory inflammatory markers such as cytokines.

Generally ELISA is consisted of five main steps. In the first step, plate is coated with

antibody. In the second step, blocking solution is used for blocking all unbound sites. With the

aid of using blocking solution, we decrease the possibility of seeing false positive results. After

blocking all unbound sites with blocking solution, antigen is added to wells. Then anti-mouse

antibody(IgG) which is conjugated with an enzyme is added to wells. At the end of ELISA,

with the activity of enzyme, it is possible to see a colored product[3].

There are three types of ELISA which are Competitive ELISA, Sandwich ELISA and

Indirect ELISA. In this laboratory section, competitive ELISA was performed. In competitive

assay, specific antibody is used to coat the plate. Then test antigen and labelled antigen are

added to wells and these compete for binding to antibodies. If the amount of the test antigen is

greater than labelled antigen, less amount of labelled antigen can bind to antibodies. If our

sample is consisted of more antigens then, less labeled antigen is remained in the well.

Therefore weak signal can be detected. The following figure shows us the competitive ELISA.

The main steps are the same for all competitive ELISA assays, only the names of sample,

primary and secondary antibodies are different[4].

Figure 2: Example of Competitive ELISA

(www.scizmic.net/downloads/vaccinations/4_vaccinedef.pdf)

Competitive ELISA has several advantages. It does not require sample processing. It

also less sensitive to sample dilutions and sample matrix effects. Therefore with the use of this

technique, it is possible to get lower deviation or variability between repeated samples and

repeated assays. Briefly, it can be said that it has high precision, accuracy and reproducibility.

The disadvantages of this method according to sandwich assay are

lower sensitivity

lower specificity[5].

The main steps of our competitive ELISA: In this experiment, BIOXYTECH 8-OHdG-

EIA Kit was used. This is used for quantitative measurment of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine

(8-OHdG) in tissue. In addition 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine is one of the important

biomarker for oxidative stress and carcinogenesis. In this kind of ELISA, 8-0HdG is used to

coat plate wells. And these ones and the other 8-0HdG in our sample compete for primary

antibody binding sites. As the concentration of 8-0HdG in sample increases, there will be

reduction in the binding of antibodies. After binding antibodies that bound to 8-OhdG in the

sample are washed out of the well and only the ones that are bound to the plate will remain in

the plate after this washing step. After that enzyme-labelled secondary antibody is added to well

and in these well, it will bind to the primary antibody. To remove unbounded ones, washing

step is performed and unbounded secondary antibodies are eliminated from the

sample.Chromogen is added in to wells and with the aid of enzyme that is conjugated to

secondary antibodies give reaction and turns the color of the solution into yellow. After that to

stop the reaction stop solution is added and the absorbance values are read with the aid of the

spectrophotometer. Here is the flow chart of this procedure[6]:

Figure 3: The main steps of our competitive ELISA

(www.scizmic.net/downloads/vaccinations/5_vaccinedef.pdf)

There are also differences in antibodies: Polyclonal and monoclonal. Polyclonal antibodies

are the ones that:

Their production is not so expensive.

Not so much technology or technique requiring assay,

Its time scale is short.

During production of polyclonal antibodies, large amounts of nonspecific antibodies are

produced.

These polyclonal antibodies are able to recognizes multiple epitopes that provides robust

detection.

And with the aid of this property, it can give better results in IP/ChIP.

There can be seen variability due to batches.

They belongs to IgG subclass.

Monoclonal antibodies are the ones that

Expensive to produce

It requires more technology and technique.

Its time scale is longer if we consider hybridomas.

It can produce large amounts of specific antibodies but when we compare them polyclonal ones,

these are so specific. And this kind of specificity decreases the possibility of cross-reaction with

other proteins.

It can recognize only one epitope of antigen[7].

3-MATERIALS AND METHODS

MATERIALS

1-Spectrophotometer

2-Plate Shaker

3-Spectrophotometer

4-Water bath

5-pNPL

6-Reagent A

7-Lipase

8-OHdG Microtiter Plate-Precoated With 8-OHdG (8×12 wells, Split Type)

9-Primary Antibody Monoclonal Antibody Specific For 8-OHdG

10-Primary Antibody Dilution Buffer Phosphate Buffered Saline

11-Secondary Antibody HRP-Conjugated Antibody

12-Secondary Antibody Dilution Buffer Phosphate Buffered Saline

13-Chromogen 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine

14-Chromogen Dilution Buffer Hydrogen Peroxide/Citrate-Phosphate Buffered Saline

15-Washing Buffer (5x) Concentrated Phosphate Buffered Saline

16-Stop Solution 1M Phosphoric Acid

17-Standards 1-6 0.5, 2.0, 8.0, 20.0, 80.0, 200.0 ng/mL 8-OHdG (1 vial Each) 1 mL each

18-Plate Seal Adhesive sheet for covering plate

METHODS

Each sample had three replicates.

1. Firstly primary antibody with the primary antibody dilution buffer was reconstituted.

2. Then 50 ul of sample was added to each well. After that 50 ul of reconstituted primary antibody

was added to all wells expect blank.

3. Plate was covered with a kind of cover and plate was shaked to mix fully and it was incubated

for 1 h at 37 C.

4. At the end of incubation time, contents in plate was poured off. Then 250 ul diluted washing

buffer was added to each well. It was washed thoroughly by agitation. After that plate was

inverted and blot against clean paper towel to remove any remaining washing buffer. This step

was repeated twice.

5. Secondary antibody with secondary antibody dilution buffer was reconstituted. 100 ul of

reconstituted secondary antibody was added to each well.

6. Plate was covered with cover and after that plate was shaked from side to side to mix fully.

After shaking, it was incubated at 37C for 1 hour.

7. Chromogen was diluted and 100 ul diluted chromagen added to each well. After chromogen

addition, plate was mixed and incubated at room temperature for 15 minutes.

8. At last 100 ul stop solution was added and after 3 minutes, its absorbance was read at 450 nm.

4-RESULTS

Absorbance Concentration

(ng/ml)

Blank 1,271

Sample 1 1,217 0,5

Sample 2 1,066 2

Sample 3 0,882 8

Sample 4 0,869 20

Sample 5 0,404 80

Sample 6 0,348 200

Equation y=-0,151ln(x) + 1,1701

R2 0,938

Figure 4: Absorbance vs Log Scale of Concentration

Figure 5: Absorbance vs Log Scale of Concentration

1,217

1,066

0,882 0,869

0,4040,348

y = -0,151ln(x) + 1,1701R² = 0,938

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0,1 1 10 100 1000

Absorbance Absorbance-

1,1701=a

b=a/(-0,151) Conc.(ng/ml)

Unknown1 0,85 -0,3201 2,11986755 8,330034

Unknown2 0,7 -0,4701 3,113245033 22,49392

Unknown3 1,207 0,0369 -0,244370861 0,783197

Figure 6: Absorbance and Standart Deviation Calculations

1-For unknown 1 y=-0,151ln(x) + 1,1701

(0,85-1,1701)/(-0,151)=2,12

ln(x)=2,12 Concentration of Unknown 1: x= 8.33 ng/ml

2-For unknown 2 y=-0,151ln(x) + 1,1701

(0,7-1,1701)/(-0,151)=3,11

ln(x)=3,11 Concentration of Unknown 2: x= 22,49 ng/ml

3-For unknown 3 y=-0,151ln(x) + 1,1701

(1,207-1,1701)/(-0,151)=-0,24

ln(x)=-0,24 Concentration of Unknown 3: x= 0,78 ng/ml

5-DISCUSSION:

When we look the graph and after seeing the R2 value, it can be said that our data fits

the curve and the R2 is 0,938. This value should be more closer to 1 but even 0,938 can be

accepted as good one. In this experiment because of fluctuations between reading, the median

values were taken while drawind the graph. Also while drawing the graph, x axis was taken in

log scale and the logaritmic trendline was added to our graph. Thus we got an formula which

contains logarithm function. Our experiment proved that higher concentrations of 8-OhdG in

the sample solution lead to a reduced binding of the antibody to the 8-OhdG on the plate. When

the concentration of standard increased, the absorbance values decreased. When I calculated

the concentration of the unknowns, then I saw that there is a huge difference between our

results. For example the concentrations of unknowns are 8.33, 22.49 and 0.78 ng/ml. And the

expected/real concentration is the 8 ng/ml. So it can be concluded that there are some reasons

that cause such a kind of difference. The source or sources of such a kind of difference can be

because of various things:

Incomplete washing of wells

Contamination

Inadequate aspiration of wells: After pouring washing buffer from the plate, it was

placed/blotted to paper towel to get rid of all the remaining liquid. If these liquid were not

completely eliminated, or if the wells overdried, waiting without doing anything after removing

washing buffer, that could cause problems.

Errors due to experimenter or calibration of pipettes: During experiment, we faced a problem

that caused by the calibration of pipettes. These could cause problems.

The other reason could be reading beyond suggested reading window. Not reading the

absorbance values within time recommended in kit could cause problems but this step was done

by our assistants. Probably there could not be such a kind of error.

Also, in these kind of experiments, regression analysis of the results are recommended by

companies such as R&D Systems. Not using such a kind of data reduction method may cause

less precise fit of the standard curve. Doing such a kind of assay could be better but I do not

think not performing such an analysis could not explain this kind of difference. But if we did

this assay, maybe there will be some small differences between our data.

Not followind incubation times and temperatures: During the experiment, we tried to follows

things written in the kits but there can be some little differences in

And the last possibility can be inadequate sealing of plate cover which can cause leading to

evaporation.

8-OHdG Microtiter Plate-Precoated With 8-OHdG was used to see the effect of

concentrationand absorbance values. To do this samples containing 8-OHdG was used. Primary

antibody monoclonal antibody is specific to 8-OHdG because plate is precoated with 8-OHdG.

Secondary antibody which is HPR-conjugated were used and with the aid of this enzyme,

chromogen was cleaved and this reaction gave yellow color.

6-REFERENCES

1. www.scizmic.net/downloads/vaccinations/3_vaccinedef.pdf

2. http://www-saps.plantsci.cam.ac.uk/summer/2007/elisa.ppt

3. http://www.scribd.com/doc/3305370/ELISA-1

4. http://www.testkappa.com/Inglese/Immagini/How%20to%20use%20it_ING_GRN.jpg

5. http://www.apcbiomaterials.com/FAQ.html

6. http://www.oxisresearch.com/pub/PDF/inserts/76680404.pdf

7. http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11269&pid=11287

2. HAFTA: METRİK SİSTEM VE ÖLÇÜMLER

Dünya standardında ölçüler, metrik sistem kulanılarak yapılır. Dünya çapında bilim

insanlarının kullanmasının yanında, neredeyse bütün ülkeler metrik sistemi standart ölçü

birimleri olarak kullanırlar. Bu dersimizdeki tüm ölçümler metrik sistem kullanılarak

yapılacaktır.

Aşağıda ki tabloda standart metrik sisteminde olan; uzunluk, ağırlık, hacim ve sıcaklık

birimleri gösterilmektedir.

Metrik

Uzunluk metre

Ağırlık gram

Hacim litre

Sıcaklık derece (santigrat)

Tablo 1: Metrik sistem birimleri Metre, gram ve litre büyüyüp küçüldükçe başlarına aşşağıdaki gibi kısaltmalar eklenir.

Kilo = 1000

Desi = 1/10

Santi = 1/100

Mili = 1/1,000

Mikro = 1/1,000,000

Nano = 1/1,000,000,000

Aşağıdaki tabloda ise metrenin diğer beş farklı uzunlukla olan ilişkisi gösterilmektedir.

Birim Uzunluk

kilometre (km) 1,000 m (1 X 103 m)

metre (m) 1 m

santimetre (cm) 0.01 m (1 X 10-2 m)

milimetre (mm) 0.001 m (1 X 10-3 m)

Mikrometre (um) 0.000001 m (1 X 10-6 m)

Nanometre (nm) 0.000000001 m (1 X 10-9 m)

Tablo 2: Metrenin uzunlukla olan ilişkisi

Dikkat ederseniz tabloda ki her birim metreye 10 un katları şeklinde ilişkilendirilir.

Aşağıdaki resimde bir cetvelin son kısmı gösterilmektedir. 90 cm işareti resmin orta kısmında

görünmektedir. Bir metre=100 cm ve her santimetre 10 mmlik birimlere bölünmüştür.

Figür 1: Bir cetvelin bölümleri

(http://faculty.clintoncc.suny.edu/faculty/michael.gregory/files/bio%20101/Bio%20101%20L

aboratory/metric%20system/meter_stick.gif)

Aşağıdaki tablolar aynı birimlerin gram(ağırlık) ve litre(hacim) cinsinden değerlerini

göstermektedir.

Birim Ağırlık

Metrik ton (t) 1,000 kg or 1,000,000 g (1 X 106 g)

Kilogram (kg) 1,000 g (1 X 103 g)

gram (g) 1 gram

miligram (mg) 0.001 g (1 X 10-3 g)

mikrogram (ug) 0.000001 g (1 X 10-6 g)

nanogram (ng) 0.000000001 g (1 X 10-9 g)

Tablo 3: Gramın ağırlıkla olan ilişkisi

Birim Hacim

kilolitre (kl) 1,000 litre (1 X 103 l)

litre (l) 1 litre

mililitre (ml) 0.001 litre (1 X 10-3 l), 1cm3

mikrolitre (ul) 0.000001 litre (1 X 10-6 l)

Tablo 4: Litrenin hacimle olan ilişkisi

Yukardaki tabloda dikkat ederseniz 1 ml(mililitre), 1 cm3 (santimetre küp)’e eşittir.

METRİK ÇEVİRMELER

Kuvvetleri: Aşşağıda ki örneklerde sayıların kuvvetleri şeklinde nasıl yazılacağı

gösterilmektedir.

100 = 1

100 = 1 X 102

1000 = 1 X 103

10,000 = 1 X 104

0.01 = 1 X 10-2

0.001 = 1 X 10-3

Örnekler:

256 = 2.56 X 102

3287 = 3.287 X 103

0.055 = 5.5 X 10-2

Kuvvetleri şeklinde yazmak çok büyük veya çok küçük rakamların gösterilmesinde

kolaylık sağlar. Örneğin; 1,930,000,000,000,000,000 rakamının kuvvetler şeklinde yazımı 1.93

X 1018 dır ve bize işlemlerin not edilmesinde kolaylık sağlar.

Ondalık Ayrıcı: Metrik dönüşümler, ondalık ayrıcın hareket ettirilmesiyle yapılır. Büyük

birimler daha küçük birimlere dönüştürülürken ( örneğin metreden milimetreye) ondalık ayrıç

sağa doğru hareket ettirilir ve tam tersi dönüşümler için ise sağa doğru hareket ettirilir.

Büyür (Ayrıç sola doğru hareket ederse)

103m

100m

10-2

10-3

10-6

10-9

kilometre (km), kilogram (kg), kilolitre (kl)

metre (m),gram (g), litre (l)

santimetre (cm)

milimetre (mm), miligram (mg), mililitre (ml)

mikrometre (um), mikrogram (ug), mikrolitre (ul)

nanometre (nm)

Küçülür (Ayrıç sağa doğru hareket ederse)

Örnek: 2.6 cm’yi um’ye çevirelim;

Santimetre için üs -2’dir ve mikrometre için -6. İki rakamı birbirinden çıkarırsak;

= (-2 - (-6) = 4).

Santimetreyi mikrometreye dönüştürmek için ondalk ayrıcı 4 birim sağa kaydırmak gerekir.

2.6 cm =2600 um

LABORATUVAR HESAPLAMALARI:

Uzunluk Hesaplamaları:

Cetvel kullanarak defterinizin genişliğini hesaplayınız ve hesaplamaları;

1-Milimetre

2-Santimetre

3-Metre cinsinden yazınız.

Aynı şekilde sıranızın genişliğini hesaplayınız ve

4- Milimetre

5- Santimetre

6- Metre cinsinen yazınız.

Figür 2: Laboratuvar masasının genişliği

(http://faculty.clintoncc.suny.edu/faculty/michael.gregory/files/bio%20101/Bio%20101%20L

aboratory/Metric%20System/lab_bench.jpg)

7- Laboratuvarın genişliğini ölçmek için hangi ölçüm birimi (kilometre, metre, santimetre,

milimetre, mikrometre veya nanometre) daha uygun olur? Neden?

Aşağıda ki uzunluk çevirimlerini hesaplayınız ve defterinize kaydediniz.

8) 1 m = _____ cm.

9) 1 cm = _____ m.

10) 3.57 mm = _____ um.

11) 452 cm = _____ mm.

12) 0.04 um = _____ mm

13) 37.6 nm = _____ mm

14) 52 nm = _____ um

15) 0.05 um = _____ nm.

16) 4.3 m = _____ um

17) 4206 mm = _____ cm

18) 0.046 mm = _____ nm

19) 4.8 cm = _____ um

Ağırlık Hesaplamaları:

Laboratuvarda kulandığımız ‘Hassas Terazi’’nin hassasiyeti 0.001’dir, bu yüzden hava

sirkülasyonu bile hesaplamaları değiştirebilir bu yüzeden Terazinin etrafı cam kabinle

kapalıdır. Tartım yaparken kullandığınız tartma kabının darasını almanız gerekmektedir,

böylelikle darası alınmış tartım kabı tartacağınız kimyasalın yada maddenin ağırlığından ayırt

edilmiş olur.

Figür 3: Hassas terazi

(http://faculty.clintoncc.suny.edu/faculty/michael.gregory/files/bio%20101/Bio%20101%20L

aboratory/Metric%20System/scale.jpg)

Hassas terazinin içerisine beher koyarak darasını alınız ve sonra bir adet bozuk parayı

behere yerleştirerek tartımını yapınız. Beher kullanmadan bozuk paranın tartımını yapınız ve

defterinize kaydediniz. Tarımlar arasıda fark oluştu mu?

Aşağıda ki hesaplamaları yaparak defterinize kaydediniz.

20) 37 g = _____ mg

21) 0.047 mg = _____ g

22) 45.36 g = _____ kg

Hacim Hesaplamaları:

23- 10 ml lik dereceli silindir alınız ve yarısına kadar su doldurunuz. Silindiri dik bir şekilde

tutarak ölçü alınız ve defterinize kaydediniz. Ölçüyü alırken su kavisinin alt kısmına dikkat

ediniz.

Figür 4: Dereceli silindir.

(http://faculty.clintoncc.suny.edu/faculty/michael.gregory/files/bio%20101/Bio%20101%20L

aboratory/Metric%20System/meniscus.jpg)

Aşağıda ki hesaplamaları yapınız.

24) 42 ml = _____ liters

25) 27 ul = _____ liters

26) 3.6 l = _____ ml

27) 1 ml = _____ ul

Bazen 1 ml hesaplamalarda 1 cm3 olarak kullanılır.

28- 27 liters = _____ cm3

3. HAFTA: MİKROSKOP VE MİKROSKOBİK ÖLÇÜMLER

1.1 Giriş

Biyolojik sistemlerin çoğu çıplak göz ile görülemeyecek kadar küçüktür. Bu nedenle biyolojik

sistemlerin olduğundan daha büyük görünmesini ve incelenmesini sağlayan sistemlere ihtiyaç

duyulmuştur. Mikroskop gözle görülemeyecek kadar küçük biyolojik sistemlerin

incelenmesinde kullanılan optik bir araçtır. Zaman içerisinde gelişen teknoloji ile paralel olarak

mikroskop ve mikroskobik yöntemlerde büyük ilerleme kaydedilmiştir [1].

1.1.1 Basit Mikroskop

Yaklaşık 500 yıl önce keşfedilen cam mercekler mikroskopların temelini oluşturur. bu

mercekler konveks şeklindeydi.Gözle ile nesnenin arasına konulan konveks şeklindeki bu

mercekler incelenen örneğin büyütülmesini sağlar[2].

1.1.2.Bileşik (Karmaşık ) Mikroskop

1600'lerin başında Hollandalı Hans-Zacharios Janssen tarafından ilk karmaşık yapılı mikroskop

geliştirilmiştir. Bugünkü mikroskobun ana prensiplerini ise 17. asırda Hollandalı Auton van

Leeuwenhoek ve İngiliz Robert Hook bulmuşlardır. Bileşik mikroskop iki adet konveks lensten

oluşur. Örneğe yakın olan lense objektif, gözlem yapan kişinin gözüne yakın olan lense ise

oküler denir. Bileşik mikroskop iki kademeli büyütme sağlar. Objektif büyütülmüş resmi

mikroskop tüpüne yansıtır, oküler ise resmi bir kez daha büyüterek yansıtır. 10X objektif ve

15X oküler kullanılarak toplamda 150X büyütme sağlanır.

(http://www.microscopyu.com/galleries/)

Şekil 1. Basit Mikroskop

Örneği tek kademede büyütmek için

tek bir lens kullanılır.

Şekil 2. Anton Van Leeuwenhoek

mikroskobu

Şekil 3. Bileşik Mikroskop

Objektif ve tüp lens tarafından

büyütülen görüntü oküler tarafından

tekrar büyütülür.

Şekil 4. İlk Bileşik mikroskop

Şekil 1.

Şekil 2.

Şekil 3.

Şekil 4.

Mikroskoplar temelde iki kategoride incelenirler;

1.Işık Mikroskopları : Aydınlatma ışık dalgaları ile sağlanır. (ışık mikroskobu, karanlık alan

mikroskobu, faz-kontrast mikroskobu, Ultraviyole mikroskobu).

2. Elektron Mikroskobu: Aydınlatmanın elektronlarca gerçekleştirilir. (Transmission elektron

mikroskobu "TEM" ve Scanning elektron mikroskobu "SEM") [4].

IŞIK MİKROSKOPLARININ BAŞLICA KISIMLARI

Mikroskop iki ana kısımdan oluşur: 1. Mekanik Kısımlar

2. Optik Kısımlar

Şekil 5. Mikroskobun başlıca kısımları

(http://www.microscopyu.com/galleries/)

1.Mekanik kısımlar

a. Mikroskop tüpü:

Mikroskop tüpü mikroskobun göz ile baktığımızda görüntünün oluşması için gerekli olan

mercek sistemini taşıyan uzatıcı bir tüptür. Tüpün her iki ucunda iki grup büyütücü mercek

sistemi bulunur. Bunlar; incelenen örneğe yakın konumda olan objektif mercekleri

ile mikroskobun üst kısmında bulunan göze yakın olan oküler mercekleridir. Bu mercekler

hareketlidir. Objektiflerde farklı büyütmelerde olabilir.

b. Mikroskop kolu:

Kol kısmı mikroskop tüpüne desteklik eder. Mikroskop taşınmasında kol kısmı kullanılır. Kol

kısmıyla mikroskop dik olarak tutulur ve taban kısmı diğer el ile desteklenir.

c.Revolver:

Üzerinde objektiflerin bulunduğu döner sistemdir. Bu sistem sayesinde objeye uygun objektif,

el ile hareket ettirilerek seçilir.

d. Maşa:

Objenin mikroskop tablasına tutturulmasını sağlamaya metal yapıdır.

e. Mikroskop tablası:

Örneklerin yerleştirildiği tabladır.

f. Kondansör:

Tablanın hemen altında bulunur. Bu kısım aynadan ya da lambadan gelen ışığın örnek üzerine

yoğunlaşmasına yarar.

g. Diyafram:

Örnekten geçen ışık ışınları göze ulaşarak retina üzerinde görüntünün oluşmasını sağlarlar.

Burada ışığın yeterli olması da çok önemlidir. Işığın şiddeti diyafram ile ayarlanır. Fotoğraf

makinelerindeki diyafram gibi burada da ışığın geçebileceği alanın küçültülüp, büyültülmesi

söz konusudur.

h. Makro ve Mikrovida:

Büyütme sırasında cismin görülebilmesi için mercek ile aralarında belli bir uzaklık

bulunmalıdır, buna çalışma uzaklığı denir. Çalışma uzaklığının ayarlanmasıyla da çalıştığınız

objenin net görünmesini sağlarsınız. Çalışma uzaklığının ayarlanması gövde üzerinde bulunan

makro ve mikrovida ile yapılır. Çalışma uzaklığı ayarlamada makrovida kaba, mikrovida ise

ince ayar sağlar. Bu ayarlama sırasında objektif ile preperatın arasındaki çalışma uzaklığına çok

dikkat edilmeli, preperatın ve objektifin zarar görmemesine özen gösterilmelidir.

i. Mikroskop ayağı:

Mikroskobun zemine oturmasını sağlayan kaide kısmıdır. Sağlıklı bir çalışma için lütfen

mikroskobunuzu sabit bir alana yerleştiriniz ve kaymasını engelleyiniz.

2. Optik Kısımlar

a. Oküler:

Oküler mikroskobun göz ile bakılan kısımlarında yer alan mercekler dizisidir. Oküler sayısına

göre iki mikroskop çeşidi vardır.

· Monoküler mikroskop: Bir adet okülere sahip mikroskop

· Binoküler mikroskop: İki adet okülere sahip mikroskop

Birçok binoküler mikroskopta gözler arasındaki mesafeyi ayarlamak mümkündür. Okülerlerin

içeri ya da dışarı doğru hareket etmelerini sağlayacak mekanizmaları vardır. Farklı

mikroskopların, okülerleri farklı büyütmeye sahip olabilir. Oküler mikroskop yuvasındaki

yerinden çıkarılarak büyütme gücü okunabilir. İncelenen nesneyi ölçmeye uygun mikrometrik

oküler veya nesneyi belirtmeye yarayan oklu okülerler de vardır.

b. Objektif:

Dönebilir bir başlık (revolver) üzerine monte edilmiş mikroskop tüpü üzerinde üç ya da dört

adet objektif bulunur. Her bir objektif çalışma sırasına göre “klik” sesi duyulana kadar çevrilir.

Objektiflerin üzerinde büyütme güçleri yazılmıştır. Objektifler üzerlerinde yazılı olan büyütme

gücüne göre isim alırlar ve her mikroskopta farklı büyütme gücüne sahip olabilirler.

Taramalı güç ....... 4X

Düşük güç ............10X

Yüksek güç ........... 40X

İmmersiyon .............. 100X

c. Işık Kaynağı:

İki değişik ışık kullanılabilir.

· Ayna ile ışık doğal olarak ya da bir lambadan objeye yansıtılır. Işık yoğunluğundaki

değişmeler nedeniyle doğal ışık fazla tercih edilmez.

· Doğrudan mikroskoba monte edilmiş bir ışık kaynağı kullanılır.

Rezolüsyon Bir merceğin rezolüsyon gücü, en yakın mesafede bulunan iki cismin hayallerini ayırt etme

yeteneğidir. Bu güç merceğin açıklık sayısı ve ışığın dalga boyuna bağlıdır. Görünen ışığın

dalga boyu 4000-7000 Aº’dür. Adi ışık mikroskobunun rezolüsyon gücü beyaz ışığın dalga

boyunun 1/3'ü kadar olup yaklaşık 2000 Aº = 0,2 mikron'dur. Bundan daha küçük cisimler adi

ışık mikroskobunda görülemezler. Dalga boyu daha küçük olan UV ışınlan ile 2-3 kez, dalga

boyu çok daha kısa olan elektronların kullanıldığı elektron mikroskoplarında ise 100 kez daha

fazla rezolüsyon elde edilir [3].

Mikroskop Çeşitleri

Faz-Kontrast Mikroskobu

stereoskop

Elektron Mikroskobu

Scanning Elektron Mikroskobu

Transmission Elektron Mikroskobu

floresan Mikroskobu

-Mikroskobun Kullanılması: Mikroskop, mikroskop kolu kendimize doğru olmak üzere konarak yerinden oynatılmamasına

özen gösterilir. Döner tabla (revolver) çevrilerek en küçük objektif mikroskop tablası deliğinin

üzerine getirilir.Mikroskoba monte edilmiş ışık kaynağı açılır. Preparat, mikroskop tablası

açıklığının ortasına gelecek şekilde tablanın üzerine konur. Mikroskop tüpü, makrovidayı

çevirerek objektif ile preparat arasında çok küçük bir uzaklık kalıncaya kadar aşağıya indirilir.

Göz tekrar okülere getirilerek ve makrovida çevrilerek görüntüyü görene dek tüp yukarı doğru

kaldırılır. Eğer görüntü elde edilemez ise o zaman objenin görüntü alanının dışına çıktığı

düşünülmelidir. Bu durumda preparat hareket ettirilerek cismin objektif alanının içine girmesi

sağlanır. Büyük objektife geçildikten sonra sadece mikrovida kullanılır, makrovida kesinlikle

kullanılmaz[3].

-Mikroskobun bakımı:

Okülerde, objektiflerde veya ışık kaynağında görüntünün netliği çevreden gelen tozlarla ve

temas ile bozulabilir. Bu nedenle çalışmaya başlamadan önce mutlaka mikroskobun mercekleri

yumuşak bir bez ile temizlenir. En ideal temizleyici lens paper veya ksilola batırılmış gazlı

bezdir.

- Mikroskop Kullanırken Kesinlikle Uyulması Gereken Kurallar:

1. Mikroskop her zaman iki elle tutulmalıdır.

2. Kullanılacağı zaman dikkatlice kutusundan çıkarılarak dengeli durup durmadığı kontrol

edilmelidir.

3. Mercekler hiçbir zaman ellenmemelidir.

4. Mercekler, kullanılmadan önce ve sonra temiz ve yumuşak bir bezle temizlenmelidir.

5. Mesafe doğru algılanamayacağı için preparat ve objektif arasındaki mesafeyi ayarlarken

hiçbir zaman mikroskobun üzerinden bakılmamalıdır. Yandan bakarak ayar yapılması,

mercekler ve preparatın zarar görmesini önler.

6. İmmersiyon objektifi kullanıldıysa inceleme sonunda mercekler silinerek immersiyon yağı

temizlenmelidir. Özellikle kuruduğunda temizlenmesi oldukça güç olan immersiyon yağı ile

kirlenmiş mercekler 1 damla ksilol veya kloroform damlatılmış yumuşak bir bezle

temizlenmelidir.

7. Preperatlar her zaman mikroskop küçük objektifteyken konulup çıkarılmalıdır.

8. Mikroskobun hiçbir parçası gereksiz kurcalanmamalıdır.

9. Mikroskop; inceleme ve temizleme bittiğinde, kutusuna kaldırılırken en küçük büyütmeli

objektifin revolver üzerinde ayarlanmış ve mikroskop tablasında obje bırakılmamış olmasına

dikkat edilmelidir[3].

-Mikroskop kullanımından sonra dikkat edilmesi gereken hususlar:

1. Mikroskop sadece gövde kolu üzerinden tutulmalı ve taşınmalıdır.

2. Objektifi tüpteki oküler ile birlikte en düşük büyütme seviyesine getirip bırakınız.

3. Aydınlatma sistemini kapatmayı unutmayınız.

4. Toz, mikroskop ve optik aksamın en kötü düşmanıdır. Bu nedenle mikroskobun hassas iç

bölümlerine tozun girmesini engellemek için herhangi bir objektifi veya oküleri kesinlikle

mikroskop üzerinden çıkartmayınız.

5. Eğer mikroskobun gövdesi ve tablası tozlu ise, tozun silinmesi için yumuşak pamuklu bez

parçası kulanınız.

6. Tüm bu işlemlerden sonra artık mikroskobu koruma örtüsüyle örtebilirsiniz (veya çantasına

yerleştirebilirsiniz) [4].

4. HAFTA: SOĞAN ZARININ İNCELENMESİ

Deneyin Amacı:

Soğan zarını inceleyerek bitki hücresinin kısımlarının gözlenmesi.

Teorik Bilgi: Hücre zarından maddeye, hücreye giriş:

• Hücre zarı seçici geçirgen özelliğinden dolayı bütün maddelerin girmesini engeller.

• Küçük moleküller büyüklerden daha kolay geçer.

• Nötr moleküller iyonlardan daha kolay geçer.

• Yağı çözen maddeler kolay geçer.

• Yağda çözünen maddeler de kolay geçer.

Difüzyon: Maddelerin yoğun oldukları ortamdan az yoğun oldukları ortama doğru

yayılmalarıdır. (Şekerin çay içinde çözülmesi,kolonyanın havada dağılması)

Bitki ve Hayvan Hücresinin Karşılaştırılması:

Bitki Hücresi Hayvan Hücresi -Hücre duvarı bulunur -Hücre duvarı bulunmaz

-Sentriol bulunmaz -Sentriol bulunur

-Kloroplast, lökoplast, kromoplast bulunur -Kloroplast, lökoplast, kromoplast bulunmaz

-Kofullar büyüktür -Kofullar küçüktür

-Nişasta ve selüloz bulunur -Glikojen bulunur

-Hücreler sürekli birbirlerine -Hücreler bağımsızdır

hücre duvarıyla bağlıdır

Kullanılan Araç ve Gereçler:

• Mikroskop

• Damlalık

• Pens

• Lam ve Lamel

• Jilet

• Kuru soğan

• Bıçak

Deneyin Yapılışı:

Bıçak yardımıyla soğanı birkaç parçaya bölünüz. Soğan parçalarından birinden kare bir kesit

alın. İç kısmındaki ince zarı pens yardımıyla ayırınız. Soğan zarından jiletle küçük bir kesit

alarak lamın üzerine koyunuz. Damlalık ile bir damla su damlatın. Lamel ile hava almayacak

şekilde üzerini kapatınız.

Hazırladığımız preparatı önce küçük sonra büyük objektifle mikroskopta inceleyiniz.

Deneyin Sonucu:

Deneyde su yerine iyot çözeltisi damlatılırsa hücre çekirdekleri yukarıdaki gibi net olarak

gözlemlenir.

Biz yaptığımız deneyde sadece su kullandığımızda bu kadar ayrıntılı bir şekil elde edemeyiz.

5. HAFTA: KARBONHİDRATLAR VE PROTEİNLER

KARBOHİDRATLAR: Karbonhidratların genel formülleri (CH2O)n’dir.

Monosakkaritler basit şekerlerdir ve 3’den 7’ye kadar karbon atomu bulundurabilirler. Bir

araya gelerek polisakkaritleri oluştururlar. Genellikle şekelerin sonuna oz eki getirilerek

isimlendirilirler. Örneğin: Glukoz, fruktoz ve galaktoz. Monosakkaritlerin yapısal formulleri

C6H12O6 ‘dir.

Glikoz ve diğer şekerler düz yapıda moleküllerdir ama sıvı solusyonlar içerisinde çember

formlar oluştururlar.

.

Figür 1: Glikozun yapıları

Glikozun iki farklı isomeri vardır ve bu isomerler OH gurubunun yerleşimine göre

isimlendirilirler.

Figür 2: Glikozun isomer yapıları

Basit şekerler hücrelerde enerji saklama amacıyla toplanırlar ve hücre respirasyonunda

enerjiye çevrilirler. Bunların yanında, hücrelere basit şekerleri başka organik moleküllere

dönüştürmede kullanabilirler

Disakkaritler iki monosakkaritin bir araya gelmesiyle oluşturulurlar.

Örneğin:

Sukroz (çay şekeri şekeri) oluşturak için bir adet glikoz ve bir adet fruktoz gerekldir.

Figür 3: Sukroz oluşturma reaksiyonu

Glikoz gibi sukroz da enerji depolar ve bitkiler sukrozu fotosente yapmayan organlarına

enerji göndermek için kullanır. Laktoz sütün içeriğinde bulunur ve glikoz ve galaktozun

birleşmesi sonucu oluşur. Polisakkaritler gibi kompeks moleküllerin sindirimi hidroliz

mekanizmasıyla gerçekleşir ve moleküller maltoz disakkaritlerine parçalanır. Maltoz

disakkaritleri daha sonra iki glikoz molekülüne dönüşütürülür.

Polisakkaritler monosakkaritlerin bir araya gelerek oluşturdukları zincir yapılarıdır.

Nişasta ve Glikojen enerji depolamak için kullanlan polisakkaritlerdir. Glikoz moleküllerinin

bir araya gelerek oluşturdukları uzun zincir yapılarıdır.

Hayvanlar ekstra karbonhidrat olarak glikojeni karaciğer ve kaslarda depolarlar. Öğün

aralarında karaciğer glikojeni glikoza parçalayarak kandaki glikoz konsantrasyonunu sabit

tutmaya çalışır. Yemeklerden sonra glikoz yine glikojene dönüştürülerek kandaki glikoz

seviyesinin yükselmesi engellenir.

Bitkiler karbonhidratları nişastaya dönüştürerek depolama işlemini gerçekleştirirler.

Amylopectin bir tür nişasta türevidir ve glikojene çok benzer. Dallanma yapıları gözükür fakat

glikojene göre daha az dallanmalar vardır. Amylose da bir nişasta türüdür fakat dallanmalar bu

türevde bulunmaz.

Figür 4: Bir nişasta türevi olan Amylose

Selüloz ve kitin molekülleri de birer polisakkarit türüdür ve organizmaların yapılarını

korumasında ve desteklemesinde kullanılır. Bitkilerdeki hücre duvarı selülozdan oluşur.

Fungilerin hücred duvarlarının yapısında ise kitin yapıları yer alır.

Selülozun yapısında beta glikoz monomerleri bulunur fakat nişasta ve glikojen alfa

glikozlardan oluşurlar. Nişasta ve glikojenin yapısında bulunan glikoz altbirimleri daha

kompakt spiral yapıları oluşturmaya neden olur. Selüloz ve kitinin yapısında bulunan glikoz

altbirimleri ise düz bir yapı oluştururlar.

Figür 5: Selülozun yapısal formülü

Pamuk ve odunun yapısı genel olarak selülozdan meydana gelmektedir. Bu yapılar bitki

hücre duvarının kalıntılarıdır. İnsanlar ve hayvanlar selüloz ve kitin yapısını sindirebilecek

enzim türlerine sahip değillerdir. Fakat bazı ayvanlar (otçul hayvanlar) mikro organizmalar

yardımıyla selüloz ve kitini sindirebilmektedirler.

PROTEİNLER

Proteinlerin önemi:

Proteinlerin öneli fonksiyonalrı aşşağıda listelenmiştir.

1. Enzim (kimyasal reaksiyonlar)

2. Hormonlar

3. depolama (kuşlar ve kertenkeleler için yumurta akı, bitkiler için tohumlar)

4. Taşıma (hemoglobin)

5. Hareket (kaslar)

6. Koruma (antikorlar)

7. Hücre zarı proteinleri ( reseptörler, taşıma proteinleri ve antijenler)

8. Yapısal görevler

Enzimler protein yapılarıdırve reaksiyonların gerçekleşme hızını arttırırlar. Proteinler sahip

oldukları şekillerden dolayı enzim görevi görebilmektedirler. Örneğin reaktant şeklindeki bir

protein molekülü enzim yapısının reaktantlarla yakın bir şekilde bağlanmasında rol alırlar.

Aşşağıdaki şemada enzimin substurat molekülüyle şekilsel uyumu sonucunda bağlanmaları

gösterilmektedir. Enzimin substuratı doğru oryantasyonda tutması reaksiyonun gerçekleşmesi

için büyük öneme sahiptir. Enzimler reaksiyon sonucu harcanmazlar ve olduğu gibi reaksiyon

sonucunda tekrar kullanılabilirler.

Figür 6: Enzim ve substurat molekülünün doğru oryantasyonda bağlanması

TEMİZLİK

Laboratuvara geldiğinizde oturduğunuz yerlerin ve bençlerin temiz olması çok önemlidir.

Bu yüzden deneyleri bitirdiğimizde oturduğunuz yerleri temizleyiniz ve kullandığınız cam

malzemeleri sudan geçirerek bulaşıklığa yerleştiriniz.

MONOSAKKARİTLER

Bir solusyon içerisinde ki monosakkaritleri yada belirli disakkaritleri bulmak için Benedik

Testi kullanılır. Eğer kullanılan solusyon şeker içeriyorsa, Benedikt maddesi konulur ve

ısıtılarak Benedikt maddesinde renk değişikliği gözlenir. Bu renk sarıdan yeşile ve koyu

kırmızıya kadar değişiklik gösterir. Bu değişiklik seker miktarına göre renk verir.

6 tane test tüpü işaretlenir. İlk işaret 1 cm ve ikinci işaret 3 cm ye konulur.

İlk 4 tüp 1 cm ye kadar aşağıdaki solusyonlar konulur.

1. Tüp 1: Su

2. Tüp 2: glikoz solusyonu

3. Tüp 3: sukroz solusyonu

4. Tüp 4: nişasta solusyonu

Bir parça soğan ezilerek parçalanır. Parçalama sırasında bir kaç damla su damlatılır. Tüp 5’e 2-

3 damla soğan suyu eklenir ve 1 cm çizgisine kadar su ile tamamlanır.

Bir parça patates parçalanır ve aynı şekiğlde parçalanırken birkaç damla su eklenir. Tüp 6’ya

2-3 damla patates suyu eklenerek 1 cm çizgisine kadar su ile tamamlanır.

Her tüp 3 cm çizgisine kadar Benedikt çözeltisi eklenerek tamamlanır ve 5 dakika boyunca su

banyosunda kaynatılır.

Sonuçkar laboratuvar defterine not alınır. Renk değişimi şeker varlığına işaret eder.

Figür 7: 1 den 6 ya kadar numaralandırılmış tüpler kaynarken

Figür 8: Kaynadıktan sonra renk değişimi

PROTEİNLER

Biuret Test

Biuret solusyonunda ki (CuSO4 ve KOH) bakır atomları peptid bağlarıyla reaksiyona

girerler ve renk değişimine neden olurlar. Koyu mor renk protein varlığına ve açık pembe renk

ise peptid varlığına işaret eder. Açık mavirenk ise protein olmamasını gösterir.

Bruiet testini yumurta albumin proteinine uygulayacağız.

3 tane tüp 2 cm ye kadar işaretlenecektir

Bir tüpü 2 cm çizgisine kadar su ile doldurun, ikinci tüpü 2 cm çizgisine kadar albumin

solusyonu ile doldurun ve son olarak da 3. tüpü nişasta solusyonu ile 2 cm çizgisine kadar

doldurun.

5 damla %3 lük bakır sülfat (CuSO4) solusyonunu her tüpe ekleyin

10 damla %10 lük potasyum hidroksit (KOH) solusyonunu da hertüpe ekleyin

Renk değişimini laboratuvar defterinize kaydediniz.

Figür 9: Su, Abumin ve nişasta bulunan test tüpleri

6. HAFTA: PREPARAT HAZIRLAMA

Preparat hazırlama aşamaları aşağıdaki gibidir:

-Temiz bir lam alınır.

-İncelenecek örnek sıvı ise lama damlatılmadan önce iyice çalkalanır. Steril bir

pipet yardımıyla bir damla damlatılır.

-Katı ise lama bir damla saf su konur.

-Öze yakılıp soğutulur.

-Örnek alınıp damlanın bir kenarında ezilir.

-Sonra su damlası ile azar azar karıştırılarak lamın üzerine ince bir tabaka

hâlinde yayılır (smear yapma).

-Öze tekrar yakılıp soğutulur.

-Lamın havada kuruması beklenir.

-Mikroorganizmaların lam üzerine tesbiti (fiksasyon) yapılır.

-Hazırlanan preparatlar ışık mikroskobunda incelenir.

-Preparatların Tesbit Edilmesi (Fiksasyon)

Tesbit, numunelerdeki mikroorganizmaların lama tutunmasını sağlamaktır. Böylece

daha sonraki işlem aşamalarında lamdan akıp gitmeleri önlenir. Fiksasyon iki şekilde yapılır:

Alevle fiksasyon: Mikrobiyolojide en çok kullanılan yöntemdir. Preparat havada kurutulduktan

sonra lam kenarından tutularak materyalin olmadığı alt kısmı bek alevinin mavi kısmından 2-3

kez hızlıca geçirilir.

Preparat uzun süre alevde tutulursa numune yanabilir. Tesbitten sonra lamın soğuması

beklenmelidir.

Kimyasal maddelerle fiksasyon: Kimyasal maddelerle tesbit etil alkol, metil alkol veya

asetonla yapılabilir.

-Etil alkolle tesbitte preparat düz bir yere konur. Üzerine saf alkol dökülür. 8-10 dakika sonra

saf su ile yıkanır.

-Saf metil alkolle tesbitte preparat düz bir yere konur. Üzerine metil alkol dökülür ve 3 dakika

tutulur.

-Aseton ile tesbitte preparat asetonda 5 dakika tutulur. Aseton ile tesbit, özellikle floresans

mikroskopisi için hazırlanan preperatlara uygulanır.

Preparat hazırlamada dikkat edilecek bazı önemli noktalar şunlardır:

-Lamlar çok temiz, yağsız ve çiziksiz olmalıdır.

-Lamlardan yağın uzaklaştırılması için % 50’lik alkol kullanılmalıdır. Alkolü

uzaklaştırmak için lamlar saf sudan geçirilmeli ya da yakıldıktan sonra

kurutulmalıdır.

-Lamların temizlenmesi için potasyum bikromatlı çözeltide bir gece tutulmaları

sonra sırası ile çeşme suyu ve damıtık sudan geçirilmeleri gerekir. En iyisi her

defasında yeni lam kullanılmasıdır.

-Preparatların hazırlanmasında kullanılan öze, iğne ve pastör pipetleri de temiz

ve steril olmalıdır.

-Preparatlar, lamın ortası ile bir ucu arasındaki bölgede hazırlanırsa diğer

uçlarından tehlikesizce tutulabilir.

Tüm preparatlar; işleri bitince % 4’lük formol, % 5’lik fenol veya % 3’lük

hipokloritli suya bırakılarak dezenfekte edilmelidir.

Şekil: Katı kültürden preparat hazırlama

(http://hbogm.meb.gov.tr/modulerprogramlar/kursprogramlari/gida/moduller/mikroskopik_inceleme.pdf)

7. HAFTA: PREPARAT İNCELEME

Bu hafta her grubun üyeler 5’er adet hazır preparat inceleyecektir. Önce küçük

objektifte bulup sonra büyük objektiflerde netleştirecektir. 40x objektifinde görüntüyü

netleştirdikten sonra bulunan 5 adet görüntü defterlere çizilecektir.

Şekil: Daha önceden hazırlanmış bir preparatın incelenmesi

(http://hbogm.meb.gov.tr/modulerprogramlar/kursprogramlari/gida/moduller/mikroskopik_inceleme.pdf)

Referanslar 1-Mortimer Abramowitz Volume 1, Revised 2003 Basics and Beyond Series

2-http://www.microscopyu.com/galleries/

3-The Principles of Microscopy Purdue University Department of Basic Medical Sciences Scghool of Veterinary

Medicine J.Paul Robinson 2005

4-http://www.nobelprize.org/educational/physics/microscopes/phase/index.html

5-http://www.bilimtey.com/deneyler.php?dy=dnm&deney=SOGANZARININ&dm=.html

6-http://hbogm.meb.gov.tr/modulerprogramlar/kursprogramlari/gida/moduller/mikroskopik_inceleme.pdf