Genética de Microrganismos

Mutações

Definição:

Alterações na seqüência de pares de bases de DNA que são hereditárias.

Classes de mutações

Microlesões

Deleção de G ↑ Frameshift A T G C C T T A G G G T C A T C A...

Met Pro Stop

Locus Selvagem A T G C C G T A T G C G T A A T C ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓Mutações G C A T T A C G

Transições Transversões

Codon 1 2 3 4 5 6 Locus Selvagem A T G C C G T T A G G G T C A T C A...

Met Pro Leu Gly Ser Ser ...

Classes de mutações

MacrolesõesLocus Selvagem      Mutação

Deleções

ATGCCATACCGC ATGCCGC TACGGTATGGCG TACGGCG

Duplicações

ATGCCATACCGC ATGCCATACCATACCGC TACGGTATGGCG TACGGTATGGTATGGCG

Inserções

ATGCCATACCGC ATGCCGACCATATACCGC TACGGTATGGCG TACGGCTGGTATATGGCG

Inversões

ATGCCATACCGC ATGCCCCATAGC TACGGTATGGCG TACGGGGTATCG

Translocações

ATGCCATACCGC ATACCGC TACGGTATGGCG ATAGGCG

Mutações Polares

x

x

Teoria Neutra de Evolução Molecular (Motoo Kimura):

Mutações Maléficas >>> Mutações Neutras > Mutações Benéficas

● A Evolução molecular ocorre essencialmente através de mutações neutras (deriva genética)

● A Teoria Neutra da Evolução é a base do cronômetro evolutivo

Símbolos usados para descrever genótipos e mutações em bactérias

Nome do gene (em itálico). Ex: lacZ

Δ= Deleção. Ex: ΔphoA; Δ(phoA-proC)

:: = Inserção. Ex: phoA::Tn10

ts = mutante sensível a temperatura. Ex: phoA(ts)

Cepa auxotrófica: mutante que tem uma ou mais deficiências nutricionais

Cepa prototrófica: cepa selvagem da qual o mutante auxotrófico derivou-se

Mutações espontâneas ou induzidas?

Max Delbruck (1906-1981) Salvador Luria (1912-1991)

Teste de Flutuação

Média = m/nm = mutantes por culturan = no. de culturas

Variância = Σ (m-média) 2 ( n-1)

Cálculo da frequência de mutações:

f = m N

m = número de mutantesN = número total de células na população

Cálculo da taxa de mutações:a = h

N

h =no. de mutações/ cultura= -ln (no. de culturas sem mutação) (no. total de culturas)

N = número de divisões celulares

Pergunta: Um cientista conduziu um teste de flutuação para determinar se mutações no gene rpoS são espontâneas ou induzidas. De 50 tubos contendo 107 bactérias cada, em 40 foram observados mutantes rpoS. A) Calcule a taxa de mutação em rpoS. B) O que pode concluir a respeito da indução de mutações em rpoS?

h = -ln (10/50) = 1.6a = h/N = 1.6/ 107 = 1.6 x 10-7 mutações/geração

Taxa de mutações espontâneas:

● 0.0025 mutações por genoma por geração

Duplicação diária de E. coli em cada indivíduo:

● 20 bilhões de bactérias/dia

Portanto, 50 milhões de mutações/dia

Por que ocorrem mutações?

I) Erros Espontâneos

II) Agentes Mutagênicos

A) Agentes Físicos

B) Agentes Químicos

C) Agentes Biológicos

Mecanismo de Ocorrência de Mutações

Mutações Espontâneas:

1- Erro na incorporação de nucleotídeos da DNA Pol III

10-4 erros/par de bases/célula/geração

Com edição da própria DNA polimerase III:10-6-10-7 erros/par de bases/célula/geração

Com mecanismos de reparo de DNA:10-9-10-10 erros/par de bases/célula/geração

Mecanismo de Ocorrência de Mutações

Indução de mutações- Agentes Físicos

I- Radiação Ionizante:

A) Radioatividade (raios alfa, beta e gama)

Ex: Tinta de Rádio

B) Raios X

Mecanismo de Ocorrência de Mutações

Indução de mutações­ Agentes Físicos

II- Radiação não-ionizante

Mecanismo de Ocorrência de Mutações

Indução de mutações­ Agentes Químicos

Análogos de bases nitrogenadas

Mecanismo de Ocorrência de Mutações

Indução de mutações­ Agentes Químicos

Modificadores de bases: Nitrosoguanidina

Mecanismo de Ocorrência de Mutações

Indução de mutações­ Agentes Biológicos

vírus transposons

Reversão de mutações

ATG CAT CTT CTA Locus selvagemMet-His-Leu-Leu

ATG CAT TTT CTA MutaçãoMet-His-Phe-Leu

Revertante verdadeiro

ATG CAT CTT CTA Met-His-Leu-Leu

Pseudorevertante

ATG CAT TTA CTA Met-His-Leu-Leu

Mutações supressoras

Teste de Ames

O operon pst é formado por 5 genes transcritos na seguinte ordem: pstS-pstC-pstA-pstB-

phoU. Os genes de pst codificam à proteínas responsáveis pelo transporte de fosfato

inorgânico, importantes para permitir o crescimento da bactéria em meio limitante em

fosfato. Foram isolados dois mutantes denominados 1 e 2. O mutante 1 não produz

somente a proteína PstC e o mutante 2 além de não produzir PstC, também não é capaz

de sintetizar as proteínas PstA, PstB e PhoU.

Qual a provável natureza de cada uma das mutações 1 e 2? Explique.

Pergunta de Prova

Troca de Informação Genética entre Bactérias ou Sexo

(1) Transformação

(3) Conjugação(2) Transdução

Definição: Transferência de Informação Genética através de DNA livre

Descobriu em 1928 a transformação em bactérias iniciando a era da genética

molecular

Descobriu em 1944 que a transformação de Streptococcus pneumoniae não-virulento em uma cepa virulenta observada por Griffith foi causada pela transferência de DNA

Alguns consideram esta a descoberta mais importante da biologia no século XX

Poucas bactérias possuem a capacidade de captar DNA livre do meio. Estas são conhecidas como bactérias naturalmente competentes.

Algumas espécies naturalmente competentes:

* Streptococcus pneumoniae

*Bacillus subtilis

*Neisseria gonorrhoeae

*Haemophilus spp.

Bactérias podem ser artificialmente induzidas a captar DNA livre através de várias técnicas:- CaCl2- PEG-DMSO- Eletroporação

A eficiência de eletroporação é 10-100 vezes maior que os demais métodos e pode ser utilizada para transformar praticamente todos os tipos de microrganismos

Moléculas de DNA geralmente (mas não sempre) circulares que contém genes que geralmente (mas não sempre) codificam proteínas não-essenciais para a sobrevivência da bactéria

Os plasmídios possuem uma origem de replicação (replicon) própria tal que uma única célula pode comportar de 1 a 700 cópias do mesmo plasmídio

Se o plasmídio transformado possuir uma origem de replicação reconhecida pela DNA polimerase da célula

ele será replicado de forma independente. Caso contrário, ele poderá ser...

OU

Transformação de PlasmídiosTransformação de Plasmídios

Transformação de PlasmídiosTransformação de Plasmídios

Plasmídios R

São plasmídios encontrados em bactérias entéricas que conferem resistência a um amplo espectro de compostos antimicrobianos como antibióticos, metais pesados, formaldeído etc.

Plasmídio R100

oriV- origem de replicação

repA- função de replicação

mer- resistência a mercúrio

sul- resistência a sulfonamida

str- resistência a streptomicina

cat- resistência a cloranfenicol

tet- resistência a tetraciclina

oriT- origem de transferência

Tipos de PlasmídiosTipos de Plasmídios

Plasmídios de Virulência – Plasmídios que carregam genes codificadores de fatores de virulência como endotoxinas, enterotoxinas, adesinas, hemolisina, coagulase etc.

Plasmídios produtores de antibióticos e bacteriocinas

Plasmídios artificiais – Plasmídios construídos através de técnicas de engenharia genética

Tipos de PlasmídiosTipos de Plasmídios

Plasmídios Artificiais

Plasmídios Artificiais

Conjugação

Joshua Lederberg

Edward Tatum

oriV- origem de replicação

repA- função de replicação

mer- resistência a mercúrio

sul- resistência a sulfonamida

str- resistência a streptomicina

cat- resistência a cloranfenicol

tet- resistência a tetraciclina

oriT- origem de transferência

Exemplo de plasmídio conjugativo

Conjugação

FATOR F­ classificação

Formação de Hfr

Transferência de Hfr

Formaçãode F'

Transferênciade F'

Nome Estado do fator F PropriedadesF - Não há Receptor de fator FF + Fator F livre no citoplasma Transfere eficientemente o fator F

para a célula receptoraF ’ Fator F carrega segmentos de DNA

cromossômico. Ex.: F’ lacTransfere o fator F e segmentoscromossômicos; pode haver(geralmente não) recombinaçãohomóloga com regiões docromossomo

Hfr Fator F integrado no cromossomoda bactéria

Transfere regiões cromossomicas comalta eficiência a partir de um pontofixo (de acordo com a posição do Hfr)

Resumo – Fator F

Sexo no liquidificador... ou como construir um mapa 

cromossomal

O mapa cromossomal de E. coli

EXEMPLO:

Doador: StrS Pro+ (F' lac proA-B) X Receptor: StrR Pro- (F-)

Recombinante: StrR Pro+ (F' lac proA-B)

Seleção: placas com estreptomicina, sem prolina

Fago T2

Ciclo de Vida de um Fago Temperado

Transdução é a transferência de material genético de uma bactéria à outra via infecção viral

Descoberta em 1952 por Joshua Lederberg e Norton Zinder

Transferência de qualquer segmento do cromossomo de 

uma bactéria à outra através de 

fagos

Fagos P1 infectaram e lisaram uma cultura de E. coli selvagem para o gene B (B+). Três em cada 1000 fagos empacota acidentalmente 2% de alguma porção do cromossomo de E.coli, ou seja, 100 Kb.

2) Sabendo que somente 2% do DNA injetado sofre recombinação, qual a porcentagem real de fagos transdutores (em relação a quantidade inicial de fagos)?

3/1000 X 1/50 = 3/50000

3/50000 X 1/50 = 3/2.500.000

1) Qual a probabilidade de um fago empacotar o gene B+?

Alguns cálculosAlguns cálculos

Transferência de um determinado segmento de genes de uma bactéria a outra através de fagos

Antibióticos naturais (??)

Isolamento de fago especifico para a bactéria Enterocouccus

faecalis e sua utilização na eliminação de bactérias em túbulos dentários

Clonagem de genes (geração de bibliotecas genômicas ou de cDNA)

Inserção de mutações

e mapeamento

Mapeamento genético

Fenótipos das colôniasTcR

No. decolônias

Arg- RifR 16

Arg- RifS 40

Arg+ RifS 44

Arg+ RifR 0

56 Kb

16 Kb

argE rpoB thiA::Tn10

Pergunta de Prova

Foi realizado um experimento de transdução com o fago P1 para determinar a ordem dos genes phoA

(que codifica a enzima fosfatase alcalina), lacZ ( que codifica a enzima β-galactosidade) e proC (que

codifica enzima envolvida na biossíntese de prolina). A cepa doadora era phoA+ lacZ- proC+ e a

receptora phoA- lacZ+ proC-. A seleção foi feita para transductantes proC+ . As 180 colônias obtidas

foram também testadas em relação aos genótipos de phoA e lacZ, e o resultado está descrito na

tabela abaixo:

phoA lacZ no. de

colônias

- + 98

+ + 44

+ - 29

- - 9

a) Qual a ordem dos genes no cromossomo?

b) Sabendo que P1 empacota 100 kb de DNA da bactéria doadora, qual a distância aproximada entre

os três genes?