Gentechnik - Klonieren und Analysieren von Gentechnik

Gentechnik - Klonieren und Analysieren vonGenen

In den letzten Jahren wurden zahlreiche Methoden entwickelt,die es erlauben, das genetische Material nahezu beliebig zuverändern und gezielt neu zu kombinieren, und Gene,Erbkrankheiten, Verwandtschaften durch Analyse desgenetischen Materials zu bestimmen.

Gentechnik - Restriktionsenzyme

Das alles wäre nicht möglich gewesen ohne ein „Geschenk derNatur“, den Restriktionsendonucleasen, meist einfachRestriktionsenzyme genannt. Erst durch sie ist einreproduzierbares Zerlegen des Erbmaterials und dadurch auchein gezieltes Neukombinieren möglich.


Eigentlich sind die Restriktionsendonucleasen als Teil desRestriktionssystems Bestandteile der Virusabwehr beiBakterien. Der andere Teil des Systems sind DNA-modifizierende Enzyme, meist Methylasen. Diese veränderndie bakterieneigene DNA (ohne die genetische Information zuändern!). Fremd-DNA (z.B. Phagen-DNA) fehlt dieseModifizierung, die Endonuclease „erkennt sie als fremd“ undzerschneidet sie. Jedes Restriktionssystem ist für einebestimmte DNA-Sequenz spezifisch.


Wird eine Phagen-DNA „versehentlich“ methyliert, kann derPhage diesen Stamm ab jetzt ungestört infizieren. Stämme mitanderem Restriktionssystemen sind gegen ihn resistent (ihreKennsequenz ist nicht methyliert), es besteht also eine„Wirtsrestriktion“.

Gentechnik - RestriktionsenzymeDie meisten Restriktionsenzyme erkennen kurze palindromeSequenzen (also Sequenzen, die von vorn und hinten gleichlauten, bei DNA: beide Stränge tragen die gleiche Sequenz,z.B. 5‘-GATC-3‘). Sie schneiden beide DNA-Strange derSequenz selbst oder in der Nähe. Dabei können die beidenSchnitte versetzt liegen, das führt zu überhängenden(„protruding ends“) Enden (5‘ oder 3‘-Überhänge), oder derDoppelstrang ist „glatt“ durchgeschnitten („blunt ends“). Dieüberhängenden Enden können miteinander paaren, sie sindalso „klebrig“ („sticky ends“).

NETTE PIPETTEN


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Die Länge der Kennsequenz ist meist 4 oder 6 Basenpaare. Jelänger die Sequenz, desto weniger Schnittstellen kommendurchschnittlich vor: eine 4er-Sequenz (44 =28) kommt ca. alle256 Bp vor (bei DNA mit 50% GC-Gehalt), eine 6er-Sequenzca. alle 4096 Bp. NotI mit einer 8er-Kennsequenz schneidetselbst im menschlichen Genom nur wenige Male, produziertalso sehr große Fragmente.

Gentechnik - Restriktionsanalyse

Trennt man die DNA-Bruchstücke nach Restriktionsverdaunach ihrer Größe auf (durch Elektrophorese im Agarose-Gel)und macht sie sichtbar (nach Anfärben mit Ethidiumbromid,das in die DNA interkaliert = sich zwischen die gestapeltenBasen schiebt, durch Fluoreszenz im UV-Licht, der UV-Lichtkasten wird Transilluminator genannt), sieht man einBandenmuster, das für das DNA-Stück ähnlichcharakteristisch ist wie ein Fingerabdruck für den Menschen.


Zur Gelherstellung kocht man Agarose, ein Polysaccharid ausMeeresalgen, mit Puffer (Wasser und Salze), beim Abkühlenerstarrt die Masse. Durch einen „Kamm“ erzeugt man„Taschen“, in die man die Proben (gelöste DNA-Fragmentemit Bromphenolblau) einfüllt.


Im elektrischen Feld wandern DNA (unsichtbar) und dasBromphenolblau, das anzeigt, wie weit die Trennungfortgeschritten ist.

Restriktionsanalyse- Bandenmuster im

AgarosegelGroße Fragmentewandern langsamerdurch das Netzwerk ausAgarosesträngen undbleiben so nahe derAuftragstasche (hier:oben).Größe und Mengelassen sich durch„Standarts“ (bekannteProben) ermitteln.

Restriktionsanalyse

Mit Größenstandardsund kombiniertenVerdaus mit mehrerenRestriktionsenzymen läßtsich eineRestriktionskarte derDNA erstellen. Ist dieSequenz bekannt, kanndie Karte leicht errechnetund die Bandenmustervorhergesagt werden.

Hybridisierungstechniken

Große DNAs (ganze Genome) geben so viele Restriktions-banden, daß sie fast wie ein Schmier erscheinen und einedirekte Analyse nicht möglich ist.Durch Doppelstrangbindung von markierten DNAs (Sonden,Proben, „probes“) lassen sich einzelne Banden der DNAsichtbar machen: Hybridisierung der beiden DNAs.

Southern-Blot

Meist wird dazu die geschnittene (Restriktionsenzym) DNAelektrophoretisch aufgetrennt und die DNA mit Hilfe vonPapierhandtüchern oder elektrophoretisch auf einNitrozellulosefilter übertragen (blot heißt saugen):„Southern-Blot“, nach dem Erfinder der Methode, EdwinM. Southern.

Southern-Blot

ElektrophoretischeTrennung

Southern-BlotTransfer (Blot),Hybridisierung undDetektion

Southern-Blot

Bei Verwendung radioaktiverProben (32P, 35S) erfolgt dieFilmschwärzung in derAutoradiographie durchradioaktiven Zerfall. Neuerdingssind nicht-radioaktive Verfahrenim Zunehmen, bei denen über einEnzym eine Chemoluminiszenz(Licht durch chemische Reaktion)entsteht, die den Film schwärzt.

Southern-Blot

Southern-Blot

Am besten hybridisieren genau passende DNA-Stränge.Durch Erniedrigen der Hybridisierungtemperatur kann manaber auch „ähnliche“ Sequenzen detektieren. Das wird z.B.bei „Zoo-Blots“ gemacht, bei denen man nach verwandtenSequenzen in den unterschiedlichsten Organismen sucht.

Northern-Blot

Durch Hybridisierung läßt sich auch die Transkriptionsratevon Genen und damit deren Regulation ermitteln. Dabeiwird isolierte RNA oder auch mRNA (angereichert über diePoly-A-Schwänze) elektrophoretisch aufgetrennt, geblottetund mit einer DNA-Probe hybridisiert. Als „Gegenstück“zum Southern-Blot heißt das Northern-Blot (und dieHybridisierung von Proteinen mit Antikörpern Western-Blot).RNA ist viel labiler als DNA, daher erfordert ein Northernsorgfältiges und sauberes Arbeiten.

Genom-Arrays

Die Expression vieler oder sogar aller Gene einesOrganismus lassen sich mit Genom-Arrays oder „Gen-Chips“ ermitteln. Dabei sind auf einem nur briefmarken-großen Träger tausende von DNA-Proben aufgebracht, dievon den verschiedenen Genen stammen.

Genom-Arrays

Die zu untersuchende mRNA (z.B. aus hitzegeschockterHefe) wird in DNA revers umgeschrieben, mit einemFluoreszenzfarbstoff (z.B. rot, Cy5) markiert und zurHybridisierung eingesetzt. Gleichzeitig wird eineKontrollpräparation (hier: mRNA aus nicht-hitzebehandelterHefe) mit einem anderen Farbstoff (z.B. grün, Cy3) markiertund gleichzeitig hybridisiert. Mit Lasern werden diewinzigen Hybridisierungs-“spots“ abgetastet und gemessen.Wichtig ist das Verhältnis der Fluoreszenzen: unveränderteExpression bewirkt Farbmischung (gelb), angeschalteteGene erscheinen rot, abgeschaltete grün.

Genom-Arrays Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus(RFLM)

Bei Erbkrankheiten sind häufig Restriktionsstellen im odernahe dem mutierten Gen verändert. Eine Restriktionsanalysedes Bereichs (Schnitt, Trennung, Blot, Analyse mitGensonde) zeigt dann über die veränderte Größe desRestriktionsfragments das Vorhandensein der Erbkrankheit.

Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus(RFLM)

RFLP weist Sichelzellanämie nach:

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)Durch die PCR lassen sich winzigste DNA-Mengen fastbeliebig vervielfältigen. Dadurch kann man auch mit kleinenProbenmengen (Speicheltropfen, wenige Zellen einerAbschürfung...) genaue Analysen anfertigen oder Genedaraus isolieren.Die PCR wurde von Mullis (Chemie-Nobelpreis 1993)entwickelt. Sie besteht in der Wiederholung von dreiTeilschritten, die zusammen zu einer Verdopplung einesDNA-Abschnitts führen:

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

-Denaturierung: bei 95°C trennen sich die beiden Stränge der DNA-Duplex- Annealing: durch schnelles Abkühlen auf ca. 55°C wird eine Renaturierung ver- hindert, kleine Oligonucleotide (Primer) lagern sich an komplementäre Abschnitte der Einzelstränge an- Extension: bei 72°C werden von hitze- stabiler DNA-Polymerase (Taq- Polymerase) die Einzelstränge ausgehend von den Primern zu Doppelsträngen ergänzt


Der Abschnitt zwischen den beiden Primern wird in jederRunde verdoppelt, nach 20 Runden also theoretischum 220 ≈ 106x vermehrt, nach 40 Runden ca. 1012x (diewirklichen Werte liegen bei hoher Zyklenzahl deutlichtiefer).Der Prozeß findet automatisch in einem programierbarenHeizblock (Thermocycler) statt, der die verschiedenenTemperaturen ansteuert. Die Polymerase aus Thermusaquaticus denaturiert selbst bei 95°C nicht, muß also nichtneu zugegeben werden.


Bei der PCR lassen sich auch Restriktionsschnitte um denvermehrten Bereich anhängen, so dass das Stückanschließend leicht herausgeschnitten und kloniert werdenkann.


PCR läßt sich auch dafür verwenden, gezielte Mutationen(„site directed mutagenesis“) in die vermehrte DNAeinzubauen. Dabei verwendet man Primer mit „kleinenFehlern“ (Punktmutationen, Deletionen oder Insertionengegenüber der Hybridisierungsstelle).


Bei der DNA-Vermehrung durch PCR liegt die Fehlerrateetwas höher als bei der natürlichen Replikation. Besondersniedrig wird sie durch Verwendung von (besonders teurer)„proof reading DNA-Polymerase“.Andererseits läßt sich die Fehlerquote absichtlich erhöhen,indem man z.B. Manganionen in den PCR-Ansatz gibt(PCR-Mutagenese). Dadurch kann man schnell eine großeAnzahl von Mutantenallelen (mit zufälligen Mutationen) auseinem klonierten Gen herstellen.

PCR zur PersonenidentifizierungDie PCR ist ideal zur Identifizierung von Personen, z.B. beider Feststellung einer Vaterschaft (50% der DNA von Vaterund Kind sind identisch), oder der Überführung einesVerbrechers anhand von Speichel, Blut oder Sperma bzw.Identifizierung eines Opfers mit Knochenresten.Dabei verwendet man mehrere Primerpaare (die also jeweilszu zweit ein Fragment vermehren), die um Abschnitteherumliegen, die sich bei unterschiedlichen Menschen in derLänge unterscheiden (DNA-Polymorphismen). Das sindbesonders die „Mikrosatelliten“, bei denen kurzeSequenzen (z.B. GA, GAG, CAA) häufig wiederholt sind.Die Zahl der Wiederholungen variiert und gibt daherverschieden lange Fragmente.

PCR zur Personenidentifizierung

Das Bandenmuster inder Elektrophorese istfür jeden Menschen(außer eineiigenMehrlingen undneuerdings geklontenIndividuen)charakteristisch:„genetischerFingerabdruck“

PCR zur Personenidentifizierung

Die Auswertung diesesBandenmusters hätte vor Gericht alsVaterschaftsbeweis eher keinenBestand

DNA-Sequenzierung

Die eigentliche genetische Information, die Basenabfolgeeiner DNA, wird durch Sequenzierung bestimmt. DasVerfahren ist unterdessen so weit automatisiert, dass ganzeGenome in kurzer Zeit aufgeklärt werden können.

DNA-Sequenzierung

Die verwendete Strategie beruht auf der Sequenziermethodevon Sanger: Ausgehend von einem radioaktiv markiertenPrimer wurde die DNA in vier separaten Ansätzen zumDoppelstrang ergänzt (mit DNA-Polymerase und dATP,dCTP, dGTP, dTTP). Die Ansätze enthielten je ein Didesoxy-Trinucleotid (ddATP, ddCTP...) in kleinen Mengen. Wenndas eingebaut wurde (>kein 3‘-OH vorhanden), konnte derStrang nicht weiter verlängert werden. In einem der Ansätzeendeten alle Fragmente daher bei einem A, im zweiten bei C...Die vier Ansätze wurden nebeneinander elektrophoretischgetrennt und über Autoradiographie ausgewertet.

DNA-Sequenzierung

Strangsynthese mit Abbruch durch Didesoxynucleotide nachSanger

DNA-Sequenzierung

Klassisches Sequenziergel:

DNA-Sequenzierung

Für Sequenzier-automaten erfolgt dieMarkierung durch vierverschiedeneFluoreszenzfarbstoffe,die Auswertung wirdbeim Vorbeilaufen derFragmente (in derElektrophorese) aneinem Fluoreszenz-detektor vorgenommen.

DNA-Sequenzierung

Das Ergebnis wird als Emissionsmuster dargestellt, aberzugleich auch schon als Basenreihenfolge ausgewertet.

DNA-KlonierungZum Isolieren von Genen und zur Neukombination vongenetischem Material wird zunächst das Ausgangsmaterialisoliert. Bei kleinen Probenmengen wird das gesuchte Gen mitPCR vermehrt. (Dabei lassen sich auch neue Restriktions-schnittstellen um das Gen herum anfügen.) Ist dasAusgangsmaterial RNA (dadurch fallen die Introns weg),muss es durch Reverse Transkriptase erst in DNAumgeschrieben werden.

DNA-Klonierung

Durch Restriktionsenzymewird das Gen herausge-schnitten und in ein gleichaufgeschnittenes* Plasmid,den „Vektor“ durchLigation (DNA-Ligase)eingebaut.

*bei „sticky ends“ müssendie Überhange paarenkönnen, „blunt ends“passen immer zu anderenglatten Enden (ligierenaber schlechter).

DNA-Klonierung

Das neuproduzierte Plasmid wird in kompetente (durchVorbehandlung zur DNA-Aufnahme befähigte) E. colitransformiert. Auf dem Vektor ist meist ein Resistenzgen(beliebt ist bla - β-Lactamase, Resistenz gegen Ampicillin).Transformanten wachsen daher auf Platten mit Ampicillin.Die Plasmide werden wieder isoliert. Durch Restriktions-analyse wird der Einbau des richtigen Fragmentsnachgewiesen.Alle Zellen einer E. coli-Kolonie nach der Transformationstammen aus einer Ausgangszelle (sind also ein Klon) tragendasselbe Plasmid. Daher spricht man davon, dass das Gen aufdem Plasmid „kloniert“ wurde.

DNA-Klonierung

Der Vektor enthält neben dem Selektionsmarker (z.B. bla)auch einen Replikationsursprung (Origin), damit dasPlasmid in der Zelle vermehrt wird.

Zur Klonierung in andere Organismen (Hefe, Säugerzellen,Pflanzen) enthalten die Vektoren neben dem Teil für E. coliSelektionsmarker und Origin für den jeweiligenZielorganismus. Vektoren für mehrere Organismen werden„Shuttle-Vektoren“ genannt, da sie „Pendelverkehr“zwischen den Organismen ermöglichen.

DNA-KlonierungDamit man möglichst viel Auswahl an Restriktionsschnitt-stellen zum Klonieren hat, enthalten die meisten Vektoren eine„Multicloningsite“, MCS, einen kurzen Abschnitt, der vieleverschiedene Restriktionsstellen enthält. Zugleich dürfen dieentsprechenden Restriktionsendonukleasen den Vektor ankeiner weiteren Stelle schneiden, sonst würde er sich nichteinfach (zur Aufnahme des anderen DNA-Fragments öffnen,sondern würde in zwei Teile zerfallen. Die Restriktionsstellender MCS müssen also im Vektor einmalig sein, „uniquesites“.

pUC18-MCS

Vektorkarte von pUC18 und pUC19

YEp24 - Hefe/E. coli-Shuttlevektor

Genexpression

Um gezielt Proteine zu produzieren, werden dieentsprechenden Gene in einen „Expressionsvektor“ hintereinen starken, regulierten Promotor kloniert, z.B. den lac-Promotor (induzierbar mit IPTG). Zur Proteinproduktionwerden die Zellen erst vermehrt, dann erst das Genangeschaltet. So wird vermieden, daß das Fremdprotein in derZelle mit der Zeit proteolytisch abgebaut wird.Durch die hohe Expression können die Chaperone der Zelleoft ein Verklumpen nicht verhindern. Dann entstehen„inclusion bodies“, Einschlußkörper aus denaturiertemProtein.

Genexpression

Die Proteine können auch gezielt verändert werden, z.B.können einzelne Aminosäuren durch Änderung des Gensverändert werden (site directed mutagenesis, gezielteMutagenese). Oder das Gen wird mit einem kurzen Stückverbunden, das eine Extradomaine an das entstehende Plasmidhängt (das Protein ist dann „getagged“). So ein Tag kann alsIsolierungshilfe dienen (His6-Tag, Anhängen von 6Histidinresten, ermöglicht das Binden des Proteins angebundene Nickel, Zink oder Kupferionen), oder dasunsichtbare Protein sichtbar machen: durch Anhängen vonGFP, green fluorescent protein, kann man das nun grünfluoreszierende Protein in der lebenden Zelle verfolgen.

Genbanken

Genbanken (= Genbibliotheken) repräsentieren ganzeGenome in klonierten Einzelstücken. Dazu werden dieGenome durch Restriktionsschnitte oder mechanisch(Scherung) fragmentiert und in einen Vektor eingebaut.Daraus lassen sich dann einzelne Gene isolieren, z.B. durchfunktionelle Komplementation von Mutanten.Beispiel: temperatursensitive S. cerevisiae Mutante derZellzyklus-Proteinkinase CDC28 stirbt bei 37°C. NachTransformation mit einer Hefe-Genbank überleben Zellen bei37°C, die ein Fragment mit CDC28 tragen. Auch beiTransformation mit einer menschlichen Genbank lassen sichÜberlebende bei 37°C isolieren. Hier enthalten die Plasmidedie menschlichen Homologen der Proteinkinasegene.

Selektion von Transformanten Genbanken

Ob ein DNA-Abschnitt in einer Genbank wirklich vorhanden(„repräsentiert“) ist, liegt an der Größe des Ausgangsgenoms,der Anzahl der unterschiedlichen Plasmide in der Genbank,und dem Zufall.Damit ein menschliches Gen mit 99%iger Wahrscheinlichkeitin einer Genbank vorkommt, muß diese Bank 690.000verschiedene Fragmente des menschlichen Genoms vondurchschnittlich 20 kBp Länge enthalten.(Achtung: wenn bei 1.000 Fragmenten ein Gen mit 50%Wahrscheinlichkeit enthalten ist, ist es bei 2.000 Fragmentennicht mit 100% dabei, sondern mit 75%!! 100% Sicherheitsind so nie zu erreichen).

Genbanken

Außer durch Schneiden der genomischen DNA (GenomischeBank) kann eine Genbank auch durch reverses Transkribierenvon mRNA in cDNA und deren Ligation in Vektoren erzeugtwerden (cDNA-Bank).Ein Vorteil der cDNA-Bank für die Suche nach Genen ist es,dass die Introns wegfallen. Außerdem werden bei genomi-schen Banken Gene oft zerschnitten. Dafür sind bei genomi-schen Bänken alle Stücke etwa gleich wahrscheinlich,während bei cDNA-Banken einige Gene sehr häufig vor-kommen, andere gar nicht. Bei cDNA-Banken kommt esdarauf an, aus welcher Wachstumsphase (Hefe: auf Glucosegezogen, stationär, unter Sauerstoffstreß) bzw. aus welchemGewebe die mRNA stammt (Mensch: Leber, Tumor,embryonale Nervenzelle gegen erwachsene Nervenzelle).

Gene in der lebenden Zelle gezielt ver �ndern:Genome-Editing mit dem CRISPR/Cas-System

Das CRISPR/Cas-System entstammteinem adaptiven antiviralenAbwehrmechanismus aus Bakterien, demCRISPR. Eine Endonuklease (Cas9) wirdmit einer RNA (crRNA spacer) zurkomplementären DNA-Sequenz geleitet undschneidet da basengenau. In die Lücke kannzugegebene DNA eingebaut werden.Die Methode, entdeckt von EmmanuelleCharpentier und Jennifer Doudna, dürftein Zukunft in der menschlichen Gentherapieeine zentrale Rolle spielen.

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