*INSTRUMENTASI HPLC

*HPLC High Performance Liquid Chromatography Aplikasi luas, untuk berbagai jenis senyawa Polar, non polar, asam, basa, netral Senyawa yang tak stabil terhadap temperatur Senyawa makromolekul : polimer/plastik, protein, nukleotida, karbohidrat Banyak pilihan dalam pengembangan metode Banyak pilihan kolom Banyak pilihan fasa gerak Analisis kualitatif dan kuantitatif Ketepatan dan ketelitian tinggi Dapat untuk analisis dan pemurnian/isolasi

*Kromatografi Cairan KinerjaTinggi/ Kromatografi CairanTekanan Tinggi Kromatografi cairan tekanan tinggi adalah: jenis kromatografi dimana komponen yang dipisahkan dilewatkan melalui fasa diam yang disusun dalam bentuk kolom dan fasa geraknya berupa cairan yang dialirkan dengan menggunakan tekanan.

*Diagram alat dan komponen HPLC

*Fungsi dari Masing-masing Komponen HPLC1. Fasa Gerak /Pelarut: Sebagai media pembawa standard atau sample yang diinjeksikan ke dalam injektor dan berperan dalam pemisahaan yang terjadi di dalam kolom. Sistim pemompaan pelarut dengan cara elusi bergradient dan elusi isokratik.

*TEKNIK ELUSI - Elusi isokratik : kekuatan pelarut sama selama proses pemisahan. - Elusi bergradient : mengubah komposisi fasa gerak pada waktu analisa kromatografi sedang berlangsung.

*Keuntungan Elusi BergradientWaktu total analisa sangat diperpendekResolusi keseluruhan dari campuran dipertinggiBentuk puncak menjadi lebih baik/Tailing berkurangKepekaan efektif bertambah baik, karena bentuk puncak tidak bervariasi.

*Tujuan Elusi Bergradient

Untuk memisahkan campuran komponen yang komplek yang mempunyai keragaman KD yang luas.Mencari perbandingan kombinasi pelarut yang sesuai didalam upaya mencari kondisi pemisahan.

* SISTEM ELUSI ISOKRATIK

*ELUSI ISOKRATIKWaktu lamaPemisahan buruk MeOH / H2O = 6 / 4MeOH / H2O = 8 / 2( kolom : ODS type )

*Elusi Gradien95%30%konsentrasi MeOH

*2. Pump- Mengapa diperlukan pompa pada HPLC ?Karena partikel yang digunakan didalam HPLC bentuk partikel mikro, apabila disusun dalam kolom, partikel membentuk susunan yang kompak sehingga sukar mengelusi larutan tanpa tekanan.Tujuan penggunaan pompa :1. Mendapatkan aliran pelarut yang tetap2. Mendapatkan aliran pelarut yang reproducible3. Mendapatkan aliran dengan tekanan tinggi, sebab larutan harus melewati sela partikel yang cukup kecil. Pompa berguna :Untuk menarik fasa gerak dari reservoir dan mendorongnya melalui injektor, kolom, detektor dan terakhir ke buangan.

*3. Injektor/ Autosampler

Untuk memasukkan standard atau sample sesuai dengan volume injeksi yang diinginkan

*4. Kolom

Untuk memisahkan komponen komponen yang ada di dalam standard atau sample berdasarkan perbedaan sifat sifat kimianya ( perbedaan polaritasnya )

*5. DetectorUntuk mendeteksi senyawa-senyawa yang sudah terpisahkan oleh kolom sesuai dengan sifat kimianya.

*6. Integrator / Software data System

Integrator:Sebagai pencetak hasil akhir dari Software data system:dapat berfungsi juga sebagai :- Pengontrol system- Processing Data- Reporting Data

*KromatogramIlustrasi pemisahan pada kolom

*Mode Pemisahan HPLCfase normalfase terbalikfase terbalik + pasangan ionpenukar ionSEC ( GPC / GFC )

*Fase NormalPetroleum etherCaCO3Chlorophyll'sChromatograph Color

*Fase NormalKromatografi pertama kolom pemisahan: CaCO3 fase gerak : Petroleum etherKombinasi ini dikenal fase normal Kolom :polar propertyFase gerak: non polar property

*Kolom HPLC fase normalSilica gel : pemakaian umumCyano : pemakaian umumAmino : analisa gulaDiol : analisa proteinSilica gelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)Modifikasi Si

*Interaksi?Silica gel (polar)Ikatan hidrogenNon-polar

* Ikatan HidrogenJika sampel memiliki gugus-COOH : gugus karboksil-NH2 : gugus amino-OH : gugus hidroksilIkatan Hidrogen menjadi lebih kuat.

Jika sampel memiliki gugus yang besar, karena hambatan stereo (ruang)Ikatan Hidrogen menjadi lebih lemah.

*Waktu retensi dan Ikatan HidrogenOHHOSiOHSiOHkuatlemah

*Peningkatan polaritas solven0 % 2 % 5% / MeOH 1 : Dioctyl phthalate2 : Dibutyl phthalate3 : Diethyl phthalate4 : Dimethyl phthalate Solven : Hexane

*HPLC fase TerbalikC18 (ODS) C8 (octyl)C4 (butyl) PhenylTMSCyano-Si-C18H35SiSolven: Polar propertyair / metanol / asetonitrilKolom: Non polar property

*Bagaimana interaksi?InteraksihidrofobikNon-polarSolven polar

* HidrofobisitasJika sampel memilikiCH3CH2CH2--- : rantai karbon : gugus aromatis

Jika sampel memiliki-COOH : gugus karboksil-NH2 : gugus amino-OH : gugus hidroksil

HidrofobisitasJadi lebih kuat.Hidrofobisitas jadi lebih lemah.

*Waktu retensi dan HidrofobisitasOHOHC18 (ODS) kuatlemah

*Peningkatan polaritas solven 20 % 30 % 40% / H2O1 : p-Hydoxymethylbenzoate2 : p-Hydoxyethylbenzoate3 : p-Hydoxypropylbenzoate4 : p-Hydoxybutylbenzoatesolven : MeOH

*Pengaruh fase diamC18 (ODS) kuatC8sampelsampelsampelC4Mediumlemah

*Pengaruh fase diamKondisi analisaKolom : Shim-pack CLC-ODSFase gerak : MeOH : H2O = 7 :3 Kec. alir : 1.0 mL/minTemperatur : 40 CVol. suntik : 10 uLDeteksi : UV-254 nmPuncak1. Methyl benzoate2. Ethyl benzoate3. n-Propyl benzoate4. n- Butyl benzoateODS C8 TMS

*Fase Normal vs Terbalik

Sheet: Sheet1

Sheet: Sheet2

Sheet: Sheet3

Sheet: Sheet4

Sheet: Sheet5

Sheet: Sheet6

Sheet: Sheet7

Sheet: Sheet8

Sheet: Sheet9

Sheet: Sheet10

Sheet: Sheet11

Sheet: Sheet12

Sheet: Sheet13

Sheet: Sheet14

Sheet: Sheet15

Sheet: Sheet16

Parameter

Normal Phase

Reverse Phase

Polarity of Column

High

Low

Polarity of Solvent

Low

High

Elution Sequence

Low Polarity First

High Polarity First

Increase Solvent Polarity

Faster Elution

Slower Elution

*Kromatografi Pasangan Ion

Pada kromatografi fasa terbalik dengan pasangan ion caranya : ion organik dirubah menjadi molekul yang tak bermuatan. Ini dapat dilakukan dengan mereaksikan ion organik tsb dengan ion organik lain yang berlawanan muatan sehingga membentuk pasangan ion.

*Kromatografi Fase Terbalik dengan pasangan ionIon-Pair Reagent

*Reagen Ion-PairAnion Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)CationButanesulfonic acid sodium salt (C4)Pentanesulfonic acid sodium salt (C5)Hexanesulfonic acid sodium salt (C6)Heptanesulfonic acid sodium salt (C7)Octanesulfonic acid sodium salt (C8)Decanesulfonic acid sodium salt (C10)

*Ion PairingSeparation of Carboxylic Acids

Column: Bonded C18

Mobile Phase: H2O/MeOH

1:1 with Tetrabutyl-

Ammonium Hydroxide

*Ion-pair Hal yang penting diperhatikanTipe reagen Ion-PairKonsentrasi reagen Ion-PairpH solven

*Tipe reagen ion-pairHexane Sulfonate Pentane Sulfonate

Mobile Phase: H2O/MeOH

1:1,with 0.005M ion pairing

reagent and 1% HOAc

1 Maleic Acid

2 Phenylephrine

3 Phenylpropanolamine

4 Naphazoline

5 Phenacetin

6 Pyrilamine

*Konsentrasi reagen ion-pair

*Apakah SEC ?Size Exclusion Chromatography(SEC)GPC (Gel Permeation Chromatography)terutama untuk lingkungan polimerGFC (Gel Filtration Chromatography)terutama untuk lingkungan biologi

*Prinsip SEC Tidak ada kekuatan interaksiPerbedaan waktu tempuh

*Hubungan antara MW dan RTBerat molekul (LogMW)KolomGPC

Batas eksklusiBatas permeasiWaktu

*******************************************