Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan ElektroforeseDr.Ozar Sanuddin, SpPK(K)Bagian Patologi Klinik Fakultas kedokteran USU/UISUMedan

Prinsip pemeriksaan ImunologisUmumnya berdasarkan pada interaksi antigen(Ag) dan antibodi(Ab).Interaksi antigen dan antibodi tba :-Tingkat primer.-Tingkat sekunder.-Tingkat tertier.

Tingkat primer

Merupakan awal reaksi ikatan molekuler antara Ag dan Ab Reaksi tidak terlihat dengan mata telanjang(biasa)Perlu indikator

indikator : -Radioisotop - Enzim atau - zat warna flouresen.

Indikator dilengketkan ke Ag atau Ab.

Nama metode pemeriksaan, untuk menentukan interaksi antara Ag dan Ab disesuaikan dengan nama indikator diatas.Ilmu yang mempelajari tentang reaksi Ag dan Ab serologi

Radioisotop Radio Immuno Assay (RIA).Enzim Enzyme Immuno Assay (EIA) ElisaFlouresen Immunoflouresensi Metode ini untuk menentukan kadar Ag atau Ab yang rendah ng

Tingkat sekunderPresipitasi Aglutinasi.

Tingkat tertierInteraksi antara Ag dan Ab terjadi dalam tubuh manusia/ invivo.

Teknik ELISAUntuk menentukan kadar Ag atau Ab.Indikator berupa enzim dilenketkan pada Ag atau Ab. Ada beberapa metode.

Prinsip Metode Elisa

Bila kita mau menditeksi antigen(Ag): Ag(serum) + AbE Ag- AbE komplek cuci Inkubasi dengan substrat kromogenik (semula tak berwarna) berwarna,bila dihidrolisis oleh enzim intensitas warna yang terjadidiukur dengan fotometer/ spektrofotometer kadar antigen.

Prinsip Metode Elisa[Sambungan]Hidrolisis oleh enzim berlangsung dalam waktu ttt.Reaksi berhenti bila ditambahkan asam atau basa kuat.Reaksi harus berlangsung dalam keaadan optimal dimana - kadar reaktan- temperatur- masa inkubasi yang telah ditentukan secara eksperimental setiap reagen dari fabrik ber beda prosedur berbeda.

Reaksi optimal sudah ditentukan secara eksperimental,dengan penetapan - kadar reaktan- temperatur- masa inkubasi setiap reagen dari fabrik berbeda prosedur berbeda.

Metode Elisa Metode kompotitif Non kompotitif [Langsung] Indirek atau sandwich

Metode kompotitif Umumnya untuk menentukan Ag. Ab spesifik [dilekatkan pada partikel /sumur ] dicampur bersama sama Ag * tambahkan serum [Ag] yang akan bersaing dengan Ag*untuk mengikat Ab diatas kompleks Ag*-Ab-Ag

Metode Elisa[sambungan]Non kompotitif[ menentukan Ab atau AgIndirek/sandwich menentukan Ab dan Ag- Ag-Ab-AntiAb* antibodi yang dicari- Abs Ag Ab*Ag yang dicari

ElektroforeseDikenalkan oleh Tiselius,1930 berkembang menentukan protein serum dan urinElektroforese merupakan teknik pemeriksaan yang berguna untuk pemisahan dan mengukur kadar makromolekul (protein)

Komponen komponen ElektroforeseDapar/BufferMedia pendukung.- Media gel agarosa- Media selulosa asetat Power suply unitPewarna Protein Densitometer

Power suply unit

Menghasilkan energi pada kedua elektroda pergerakan dan pemisahan molekul protein.Tegangan dan besar arus dapat dikendalikan.

Pewarna ProteinPanceou redamino black Coomassie blue

Densitometer

Alat pengukur kuantitas berdasarkan intensitas warna pita pada elektroforese, saat media pendukung melalui sistem optik yang bekerja seperti fotometer

Prinsip Dasar ElektroforeseTergantung pada :A. Muatan partikelB. Kecepatan migrasi.

A. Muatan :Partkel bermuatan, dalam media pendukung nya, bila terpapar dengan medan listrik, akan bergerak kearah elektroda yang berlawanan.Molokul protein bersifat ampoter. Bila protein berada pada lingkungan pH dibawah titik iso elektrisnyaprotein akan bermuatan neto positip dan sebaliknyaPada pH isoelektrik protein tidak bermuatan listrik atau muatannya nol

B. Kecepatan Migrasi.Kecepatan migrasi protein tergantung pada :1.Kekuatan medan listrik. Makin besar perbedaan muatan neto makin cepat gerakan.2.Ukuran molekul : Makin kecil mol makin cepat gerakan

3.Media pendukung : Pori pori media bersifat filter.4.Viscositas mediaMakin tinggi viscositas makin lambat gerakan5.Kekuatan medan listrik : tegangan listrik besarmigrasi cepat.6.Endoosmosis yaitu gerakan berlawanan arah dalam media pendukung.7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion rendah migrasi cepat8.Suhu: suhu tinggi migrasi cepat.

6.Endoosmosis:yaitu gerakan berlawanan arah dalam media pendukung.7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion rendah migrasi cepat8.Suhu: suhu tinggi migrasi cepat.

Fraksi fraksi Serum Protein ElektroforesisDengan gel agarosa :- Prealbumin- Albumin- Alfa 1 globulin- Alfa 2 globulin- Beta globulin- Gama globulinFraksi fraksi protein terlihat berupa pita pita yang spesifik letaknya dan digambarkan densitometer berupa kurva

Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita pita yang spesifik letaknya. Densitometer menghasilkan fraksi protein berupa kurva

Berdasarkan Pergerakan SPEPrealbumin -Fraksi protein yang bermigrasi paling dekat ke anoda.Albumin, -Fraksi protein terbanyak. -Fungsi mempertahankan tekanan osmotik

Alfa1 globulinAlfa 2 globulin.Beta1globulin.Beta 2 globulin.Gamma globulin migrasi terdekat ke katoda.

Polymerase Chain Reaction(PCR).Metode yang cepat dan sederhana, untuk mengkopi dan memperbanyak urutan DNA spesifik yang dinginkan dan divisualisasikan sebagai pita yang jelas pada agarose gel.

Scara mendasar sebenarnya PCR mengulangi siklus :-Denaturasi-Hibridasi dari DNA yang dinginkan dengan bantuan DNA primer-Extensi regio DNA tsb oleh enzim DNA polymerase.

Pada PCR konvensional -Target amplifikasi adalah asam nukleat harus dilakukan terlebih dahulu sampai selesai-Baru diditeksi.Pada PCR yang baru amplifikasi dilakukan terhadap sinyal sedangkan target asam nukleat tidak diamplifikasi.

Pada PCR yang baru Amplifikasi dilakukan terhadap sinyal.Target asam nukleat tidak di amplifikasi.

Prinsip PCR1. Ekstraksi DNA 2. Alat PCR a. Target DNAb. Persiapan larutan reaksi PCR (d NTP,,bufer,primer DNA danTaq DNA polymerasec. Denaturasi DNA Initial denaturation : 5 menit,t 94 C Denaturation :1 menit 94 C Primer annealing :1 menit 50 C Copying of DNA by DNA polymerase final elongation 10 menit ,72 C

Program alat PCR bisa dilakukan 25 -30 siklus