Prinsip imunologi pada pemeriksaan

laboratorium klinik

Dewi K Paramita

Deparment of Histology and Cell Biology Faculty of Medicine UGM

Prinsip imunologi pada pemeriksaanlaboratorium klinik

1. Prinsip pengenalan antigen oleh antibodi padabeberapa teknik pemeriksaan imunologi

2.Berbagai macam labeling dan deteksi padapemeriksaan dengan teknik imunologi

3. Contoh deteksi dengan imunohistokimia danimmunofluorescence assay

Teknik Imunologi (immunoassay)

Metode deteksi antigen / protein dalam sel, jaringan atauprotein terlarut oleh antibodi sebagai reagen spesifik(interaksi antigen-antibodi) yang divisualisasi denganmarker yang dilabel pada antibodi, misalnya pewarnafluorescent, enzim atau partikel emas, dll.

Prinsip teknik imunologi

Deteksi antigen/protein:antigen dikenali olehantibodi (Ab) spesifiksebagai probe

Molekul antibodi tidaknampak divisualisasidengan label

Antibodi

Daerah pengenalan spesifikterhadap antigen

Species specific

Sumber antigen/protein yang akan dideteksi

Sel

Jaringan

Protein terlarut (dalam darah blood, serum, cairantubuh)

Macam teknik pemeriksaan imunologi & sumber antigen

Sumber antigen Teknik imunodeteksi

Jaringan Imunohistochemistry (IHC)

Protein terlarut ELISA

Immunoblotting

immunoprecipitation

Sel FACS

IFA

Komponen penting pada teknikimunologi

antigen

Antibodi primer

Antibodi sekunder (jika perlu)

Label : Enzim, fluorescence, dll

Larutan pewarna (kromogen) and substrat

Metode dasar pada teknik imunologi

Direct

Indirect

Sandwich

Direct method (metode langsung)

Label pada antibodiprimer

Keuntungan:

Cepat

Spesifik

Kerugian:

Perlu antobodi primer dalam jumlah banyak

antigen

Indirect method (metode tidak langsung)

Label pada antibodi sekunder

Keuntungan

Lebih sensitif

Antibodi sekunder dapatdigunakan untuk bermacam-macam immunoassay (jikaantibodi primer dari spesiesyang sama)

Kerugian:

Reaksi silang antibodi sekunderdengan Ig endogenous padaspesimen

antigen

Capture atau Sandwich (ELISA)

Untuk mendeteksi substansiyang jumlahnya sangat kecil, contoh: sitokin

Antibodi primer spesifik yang mengenali antigen dilekatkanpada plate

Faktor penting pada teknik imunologi

Pengenceran antibodi (konsentrasi antibodi)

Inkubasi antibodi

Waktu

Suhu

Enzim & substrat, fluorochrom & filter

Kontrol positif

Kontrol negatif

Label pada immunoassay

Label

Radioaktif

Coloidal gold

Virus particle

Ferritin

Fluorescent

Enzyme

Label pada immunoassay

Immunoassay Label

Westernblotting Enzim (HRP atau alkalinephosphatase)

ELISA Enzim, biotin/streptavidine

Immunofluorescence Fluorescence dyes

Immunohistochemistry Enzim, biotin/streptavidine

Flowcytometri Fluorescence, dyes, tandem dyes

Pemilihan deteksi antibodi:direct atau indirect

Pemilihan deteksi antibodi:direct atau indirect

Direct:label pada antibodi primer

Aplikasi : flow cytometri

Keuntungan:

Lebih spesifikbackground staining lebihsedikit

Indirect: Label pada antibodi sekunder

Aplikasi : imunostaining

Keuntungan:

Lebih sensitif amplifikasi sinyalsignifikan

Aplikasi lebih felksibel label dapat bermacam-macam

Label dapat berupa fluorescence, biotin, atau enzim yang dikonjugasi pada antibodisekunder.

Kerugian:

Background lebih tingginonspecific binding dari antibodiprimer dan sekunder

Keuntungan & kerugianDirect v.s. Indirect

Bagian dari antibodi yang di label

Gugus amin primer (-NH2) pada residulisin di daerah N terminus.

Gugus sulfuhydril (-SH) pada residusistein terbentuk secara selektif padaikatan bisulfid di daerah hinge region

Residu karbohidrat yang mengandung cis-diol dapat dioksidasi (-CHO) menjadialdehid aktif terlokalisasi padadaerah Fc banyak ditemukan padaantibodi poliklonal

Pemilihan tipe sinyal untuk deteksi:substrat kolorimetrik atau fluorescence

Labeling dengan enzim

Keuntungan : shelf life yang panjang Sensitivitas tinggi Visualisasi langsung tidak membutuhkan alat yang canggih (contoh alat:

spektrofotometer) Dibanding label radioaktif tidak berbahaya Label enzim yang kecil dapat melewati membranmemungkinkan untuk

deteksi intraseluler Visualisasi enzim dengan substrat dapat bertahan lama hingga bertahun-

tahun Kerugian :

Melibatkan multiple assay steps Kadang menggunakan sustrat yang berbahaya Memungkinakan adanya gangguan dari enzim endogenus Enzim memberikan resolusi yang buruk pada

Rekomendasi aplikasi : imunohistokimia, imunoblot dan immunoassay kuantitatif dankualitatif.

Labeling dengan enzim

Labeling dengan enzim:HRP v.s AP

HRP AP

Ukuran 40 kDa 140 kDa

Harga Relatif murah Relatif mahal

Stabilitas(penyimpanan)

Stabil pada suhu< 0C

Tidak stabil padasuhu < 0C

Macam substrat Banyak Sedikit/terbatas

Kinetika Cepat lambat

pH 5-7 8-10

Horseradish peroxidase (HRP) v.s Alkaline phosphatase (AP)

Labeling dengan biotin

Biotin adalah vitamin dengan berat 244 dalton

Banyak ditemukan di jaringan dan darah

Mempunyai afinitas yang besar dengan protein avidin, streptavidin ikatan terjadi cepat dan tidakterganggu dengan perubahan pH extrem, pelarutorganik dan agen denaturasi lain.

Molekul kecil dapat dikonjugasi dengan banyakprotein tanpa mengganggu aktivitas protein tersebut

Labeling dengan biotin:IHC Avidin-biotin method

ABC method LSAB method

Labeling dengan fluorescent

Molekul antibodi dapatdilabel dengan berbagaimacam probe flourecent

Setiap probe fluorescent mempunyai spektrumsinyal eksitasi dan emisi

Contoh labeling dengan fluoresceinisothiocyanate (FITC)

Fluorescenct probes

The maximum excitation and emission wavelength of

commonly used fluorescent probes

Contoh metode imunohistokimia danimmunofluorescence assay

EBNA1-IHC (OT1x Mab)

LMP1-IHC (OT21C Mab)

VCA-p18-IHC (OT15E Mab)

Contoh Prosedur imunohistokimiaLABELED STREPTAVIDIN-BIOTIN Method

I. Deparafinisation

Xylene (2 x 10 mins)

Ethanol absolute (2 x 5 mins)

95% ethanol (2 x 5 mins)

II. H2O2/ methanol (15 mins)

RINSE with DISTILLED WATER

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

III. Antigen Retrieval

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

IV. Blocking solution (10 min)

(Normal non-immune serum)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

V. IHC staining proper

Primary Antibody (variable)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

Biotinylated Link Antibody (30 mins)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

Streptavidine-Peroxidase (30 mins)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

DAB/AEC - Chromogens (5-10 mins)

Rinse with water

Hematoxyline

Rinse with water (dan/ atau dehidrasi)

Mounting

Meminimalisir background staining

Bloking aktivitas endogenous peroxidase

peroxidase dan pseudo-peroxidase pada jaringan normal dan tumor

Contoh Prosedur imunohistokimiaLABELED STREPTAVIDIN-BIOTIN Method

I. Deparafinisation

Xylene (2 x 10 mins)

Ethanol absolute (2 x 5 mins)

95% ethanol (2 x 5 mins)

II. H2O2/ methanol (15 mins)

RINSE with DISTILLED WATER

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

III. Antigen Retrieval

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

IV. Blocking solution (10 min)

(Normal non-immune serum)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

V. IHC staining proper

Primary Antibody (variable)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

Biotinylated Link Antibody (30 mins)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

Streptavidine-Peroxidase (30 mins)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

DAB/AEC - Chromogens (5-10 mins)

Rinse with water

Hematoxyline

Rinse with water (dan/ atau dehidrasi)

Mounting

Meminimalisir background staining

Bloking non-specific background staining

Paling sering terjadi: Protein melekat pada kolagen & jaringan ikat diatasi denga pemberian non-immune serum

Sebab lain : pengenceran antibodi yang tidak tepat(terlalu pekat), langkah pencucian yang tidak tepat, langkah deparafinisasi yang tidak tepat.

U

Immunoassay with fluorescence labeled

Immunofluorescence assay (IFA): teknik imunostainingdengan label fluorescence pengamatan denganmikroskop fluorescence

Floocytometri

Immunofluorescence Assay

Labeled antibody with a fluorescence visible marker: i.e. Fluorescein isothianate

(FITC)

Disadvantage: Limited to frozen sections

Requires special microscopy

Poor morphologic resolution

Fluorescence is ephemeral, result have to be photographed

TERI MA KASIH

deardesay@yahoo.com