Kapitel 3: Flüssigchromatographie (LC) .Analytische Chemie Teil chromatographische und (für Biol

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Kapitel 3: Flssigchromatographie (LC) Aus dem Bereich der Flssigchromatographie (liquid chromatography = LC) haben wir bereits die Papierchromatographie und die Sulenchromatographie (Experiment von Tswett) kennen gelernt. Die heute am hufigsten eingesetzte instrumentelle Variante der LC ist die Hochleistungsflssigchromatographie (high performance liquid chromatography = HPLC). Die Abkrzung HPLC leitete sich ursprnglich von high pressure liquid chroma-tography ab, da die wesentliche Neuerung bei Einfhrung der HPLC in der Verwen-dung von Hochdruckpumpen bestand, die einen konstanten Druck von 300400 bar aufrecht erhalten knnen. Dadurch konnten gepackte Sulen mit kleineren und damit dichter gepackten Partikeln (m-Bereich) verwendet werden, was die Trennung we-sentlich verbesserte. Heute hat die HPLC einen sehr weiten Anwendungsbereich, der von kleinen anorganischen oder organischen Ionen, neutralen organischen Moleklen und Organometallkomplexen bis zu grossen Biomoleklen (z.B. Proteine) reicht. Da Trenneffizienz und weiter Anwendungsbereich nicht alleine auf den Hochdruck-betrieb zurckzufhren sind, meint man heute high performance liquid chroma-tography, wenn man von HPLC spricht.

3.1 Trennprinzipien Heutzutage existieren sehr viele Varianten der LC, die zum Teil sehr spezifisch auf Trennprobleme (z.B. Ionentrennung) zugeschnitten sind. Die wichtigsten Varianten sind die HPLC mit Normal- und Umkehrphasen, wobei die Umkehrphasen etwa 70% aller Anwendungen ausmachen. Tabelle 3 fhrt Trennmethoden und zugrunde liegende Trennprinzipien auf. Tab. 3: Trennmethoden und prinzipien in der LC.

Trennmethode Trennprinzip Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung) Umkehrphasen-HPLC Verteilung (und Adsorption) Grssenausschlusschromatographie Grssenausschluss Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung Affinittschromatographie Bindungsaffinitt (nicht-kovalente Bindungen) Komplexierungschromatographie Komplexierung von Metallionen mit Liganden Chirale Chromatographie Bildung und Trennung von Diastereomeren Im Folgenden werden die Trennprinzipien kurz vorgestellt, die Trennmethoden und zugehrigen stationren Phasen (also z.B. Normalphasen und Umkehrphasen) werden wir im Anschluss bei der Beschreibung der einzelnen Techniken kennen lernen.

3.1.1 Adsorptionschromatographie Von Adsorptionschromatographie spricht man, wenn die Trennung auf der unterschiedlich starken Adsorption der Analytmolekle an die Oberflche einer festen stationren Phase beruht. Dies ist das wesentliche Trennprinzip der Normalphasen-LC (normal phase liquid chromatography = NPLC), wo meist Kieselgelpartikel als stationre Phase eingesetzt werden, an welche Analytmolekle aufgrund ihrer

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Polaritt unterschiedlich stark adsorbieren. Die Trennung erfolgt also gemss der Polaritt der Molekle.

3.1.2 Verteilungschromatographie In der Verteilungschromatographie beruht die Trennung auf der Verteilung zwischen zwei fluiden Phasen. Die Flssig-flssig-Chromatographie (liquid liquid chromatography = LLC) mit immobilisierten flssigen stationren Phasen spielt heute keine Rolle mehr. In der Umkehrphasen-LC (reversed phase liquid chromato-graphy = RPLC) werden aber an Kieselgelpartikel chemisch gebundene stationre Phasen verwendet (z.B. Alkylketten), weshalb man von keiner reinen Adsorp-tionschromatographie mehr sprechen kann. Im Gegensatz zur NPLC ist hier die stationre Phase apolar bzw. hydrophob, weshalb die Molekle in umgekehrter Elutionsreihenfolge nach Polaritt bzw. nach ihrer Hydrophobizitt getrennt werden.

3.1.3 Grssenausschlusschromatographie In der Grssenausschlusschromatographie (size exclusion chromatography = SEC), wozu die Gelpermeationschromatographie (gel permeation chromato-graphy = GPC) und die Gelfiltration zhlen, arbeitet man mit porsen Partikeln als stationre Phase. Kleine Molekle knnen in die Poren eindrigen und werden deshalb retendiert, wogegen sehr grosse Molekle nicht in die Poren eindrigen und mit der Lineargeschwindigkeit die Sule durchstrmen. Die Trennung erfolgt also nach der Moleklgrsse, wobei grosse Molekle zuerst und kleine Molekle spter die Sule verlassen.

3.1.4 Ionenchromatographie In der Ionenchromatographie (ion chromatography = IC) beruht die Trennung auf der ionischen Wechselwirkung zwischen den Analyten (anorganische oder organische Ionen) und positiv oder negativ geladenen Ionenaustauscherharzen als stationre Phase. Die Trennung erfolgt im Wesentlichen nach Ladung und Grsse der Ionen.

3.1.5 Affinittschromatographie In der Affinittschromatographie macht man sich sehr spezifische Bindungsaffinitten zwischen den Analyten und darauf zugeschnittenen Liganden zunutze. Hufig handelt es sich dabei um biochemische nicht-kovalente Wechselwirkungen. Ein bekanntes Beispiel sind auf Sulenmaterial immobilisierte Antikrper, welche zur Trennung der entsprechenden Antigene eingesetzt werden knnen. Solche Immunoaffinittssulen werden auch in der Probenaufarbeitung in Form der Festphasenextraktion eingesetzt, um einen Analyten oder eine Gruppe von chemisch hnlichen Analyten spezifisch aus einer Probe abzutrennen und so fr die weitere Analyse vorzubereiten.

3.1.6 Komplexierungschromatographie Die eher selten angewandte Komplexierungschromatographie beruht auf der unterschiedlich starken und unterschiedlich schnellen Komplexbildung zwischen Metallionen und organischen Liganden (Organometallkomplexe). Hierbei sind zwei Varianten mglich. In der ersten sind hnlich der Affinittschromatographie organische Komplexbildner (Liganden) auf Kieselgelpartikeln oder einem Polymer

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immobilisiert. Mittels dieser stationren Phase werden dann Metallionen getrennt, welche mit den Liganden Komplexe bilden knnen. In der zweiten Variante trennt man organische Liganden auf einer stationren Phase, auf der Metallionen an immobilisierte Liganden gebunden sind. Hierbei bleiben Koordinationsstellen frei, an welche die zu trennenden Liganden aus der mobilen Phase binden knnen. Die Komplexbildung luft aber sehr langsam ab, weshalb breite Peaks oft typisch fr diese Varianten der LC sind.

3.1.7 Chirale Chromatographie Sollen chirale Molekle in die beiden Enantiomere (also R- und S-Form) getrennt werden, muss man sich eines Tricks behelfen. Enantiomere haben nmlich annhernd die gleichen physikalisch-chemischen Eigenschaften, da sie sich praktisch nur in ihrer Wechselwirkung mit polarisiertem Licht unterscheiden. Aus diesem Grund lassen sich Enantiomere als solche nicht trennen. Enantiomere liegen vor, wenn ein Molekl ein chirales Zentrum besitzt. Im Fall organischer Molekle ist das ein Kohlen-stoffatom, welches an vier unterschiedliche Reste gebunden ist. Hier sind zwei ver-schiedene rumliche Anordnungen der Reste mglich, die sich wie Bild und Spiegel-bild verhalten. Das sind die beiden Enantiomere des Molekls. Liegen zwei oder mehrere chirale Zentren vor, knnen auch Diastereomere gebildet werden, welche sich in ihren Eigenschaften unterscheiden und mittels Chromatographie getrennt werden knnen. Die Trennung von Enantiomeren beruht daher auf der Bildung von Diastereomeren und deren Trennung. Dies wird meist durch chirale stationre Phasen erreicht (z.B. auf Kieselgel immobilisierte enantiomerenreine Aminosuren, wie Leucin oder Phenylglycin), wobei sich bei Wechselwirkung mit den Analyten Diastereomere ergeben, auch wenn hier keine kovalente Bindung zugrunde liegt. Alternativ knnen der Probe auch chirale Hilfsreagenzien zugegeben werden, welche in der mobilen Phase mit den Analyten Diastereomere bilden.

3.2 Die van-Deemter-Gleichung in der LC In Abschnitt 2.2.7 haben wir die van-Deemter-Gleichung (siehe Gleichung 2.20) kennen gelernt, welche die Bodenhhe H als Mass fr die Trenneffizienz in Ab-hngigkeit von der Lineargeschwindigkeit u beschreibt. Einfluss auf die Bodenhhe und damit auf die Peakbreite haben Eddy-Diffusion (A-Term), Longitudinaldiffusion (B-Term) und Massentransporteffekte (C-Term). Wir sind bereits dort auf Unterschie-de zwischen LC und GC eingegangen und wollen hier nur kurz einige Besonderheiten der LC herausarbeiten. Die Eddy-Diffusion ist ein typischer Effekt in der LC, weil hier mit gepackten Sulen gearbeitet wird. Der Partikeldurchmesser der stationren Phase hat einen wesentlichen Einfluss auf den A-Term: Je kleiner und dichter gepackt, umso geringer werden die Weglngenunterschiede, die zur Eddy-Verbreiterung fhren. Die Longitudinaldiffusion ist abhngig von der Diffusionsgeschwindigkeit in der mobilen Phase. Aufgrund der kleinen Diffusionskoeffizienten von Moleklen in Flssigkeiten (etwa vier Grssenordnungen kleiner als in Gasen) hat der B-Term in der LC kaum einen Einfluss auf den Verlauf der van-Deemter-Funktion.

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Bei den Massentransporteffekten kann man meist den Anteil der stationren Phase vernachlssigen, da Adsorptions- und Desorptionsvorgnge an der Oberflche von festen stationren Phasen schnell ablaufen. Der C-Term hngt also im Wesentlichen von Eigenschaften der mobilen Phase ab. Er ist umso grsser, je langsamer die Diffusion in der mobilen Phase abluft und ist deshalb indirekt proportional zum Diffusionskoe