Korszerű vizsgáló eljárások és potenciális terápiás lehető…semmelweis.hu/wp-content/phd/phd_live/vedes/export/... · 2012-05-15 · folyamatoknak és specifikus xantofill-kötő

Korszerű vizsgáló eljárások és terápiás

lehetőségek Stargardt macula-dystrophiában

Doktori értekezés

Dr. Hargitai János

Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Farkas Ágnes

Hivatalos bírálók: Dr. Kőhidai László

Dr. Kerényi Ágnes

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Szende Béla Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Radó Gábor Dr. Lukáts Ákos

Budapest 2008

2

Tartalom

1. Rövidítések jegyzéke 4

2. Bevezetés 5

3. Célkitűzések 15

4. Módszerek 16

4.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt 16

macula-dystrophiában optikai koherencia tomográfiával

4.2. A maculapigment változásának vizsgálta Stargardt macula-dystrophiában

scanning laser ophthalmoscop segítségével. 17

4.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar Stargardt macula-dystrophiás 18

betegcsoportban, és annak összehasonlítása a betegek fenotípusával

4.4. A GFP gén bejuttatásának lehetőségei a retinális pigmenthámba és a 20

retina szöveteibe in vitro és in vivo körülmények között

4.4.1. A vírusvektor létrehozása 20

4.4.2. Retina pigmenthám sejttenyészet 21

4.4.3. In vitro transzdukció 22

4.4.4. In vivo transzdukció 22

4.4.4.1. In vivo transzdukció immunszupprimálás nélkül 23

4.4.4.2. In vivo transzdukció immunszupprimálással 24

4.4.5. ELISA vizsgálat 24

4.4.6. A retina in vivo vizsgálata 25

4.4.7. Szövettani vizsgálatok 26

5. Eredmények 27



5.2. A maculapigment változásának vizsgálta Stargardt 33

macula-dystrophiában scaning laser ophthalmoscop segítségével




retina szöveteibe, in vitro és in vivo körülmények között

3

5.4.1. In vitro transzdukció 40

5.4.1. In vivo transzdukció 42

5.5. A GFP fehérje által kiváltott immunválasz áthidalására alkalmas 47

módszerek vizsgálata

6. Megbeszélés 53



6.2. A maculapigment változásának vizsgálta Stargardt 55

macula-dystrophiában scanning laser ophthalmoscop segítslgével




retina szöveteibe, in vitro és in vivo körülmények között

6.5. A GFP fehérje által kiváltott immunválasz áthidalására alkalmas 61

módszerek vizsgálata

7. Új eredmények és klinikai jelentőségük 64

8. Köszönetnyilvánítás 65

9. Irodalomjegyzék 66

10. Összefoglalás 89

11. Summary 90

12. Publikációk jegyzéke 91

12.1. Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények 91

12.2. Egyéb közlemények 91

12.3. Idézhető absztaktok az értekezés témájában 92

12.4. Az értekezés témájában elhangzott előadások 95

13. Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények másolatai 95

4

1. Rövidítések jegyzéke

ABCR: ATP-ase binding casette reporter

AMD: időskori macula degeneráció

ATP: adenozin trifoszfát

A2E: N-retinilidin-N-retinil-etanolamin

CMV promoter: cytomegalovírus promoter

CRD: csap-pálcika dystrophia

DMEM: Dulbecco’s modified Eagle’s medium

EGPF: enhanced green fluorescent protein

ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay

EPON: szövettani beágyazó anyag

ERG: elektroretinográfia

FACS: fluorescent cell sorter

FT: foveola vastagság (foveolar thickness)

GFP: green fluoresceint protein

HRP: torma-peroxidáz (horseradish-peroxidase)

HSV: herpes siplex vírus

MV: macula térfogat (macular volume)

OCT: optikai koherencia tomográfia (optical coherence tomography)

OCT-compound: alacsony hőmérsékleten haszálható szövettani beágyazó anyag

(fagyasztott metszethez)

PBS: phosphate buffered saline

RAL-PE: retina foszatidil-entanolamin

RmP: „rim” fehérje

RP: retinitis pigmentosa

SLO: scanning laser ophthalmoscop (scanning laser ophthalmoscope)

STGD: Stargardt macula-dystrophia (Stargardt macular dystrophy)

TBS: trishydroxymethylaminomethane buffer solution

UV: ultraibolya

5

2. Bevezetés

A leggyakrabban előforduló öröklött, fiatal korban tüneteket okozó macula-dystrophiát

Karl Stargardt írta le 1907-ben (Stargardt 1909, 1918).

A betegség jellegzetes tünete a centrális látás csökkenése, amely általában a huszadik

életév előtt jelentkezik. A távoli látóélesség a betegség végállapotában általában 2-3

méter ujjolvasásás és 0,1 között stabilizálódik (Markham et al. 1998). Súlyosan

károsodik az olvasóképesség, amelyet azonban nem kísér a színlátás zavara. A betegek

Ganzfeld ERG válaszaiban jellemző a fotópikus funkció károsodásának dominanciája,

de gyakori panasz a sötétadaptáció megnyúlása is. A korai stádiumban a szemfenéki kép

nem mindig patognomikus, a klinikai diagnózis gyakran csak a betegség előrehaladtával

állítható fel a jellegzetes sárgásfehér foltozottság „snail slime” vagy/és az atrófiás

„beaten bronze” macula elváltozások alapján. (1. ábra)

1. ábra „Snail slime” és „beaten bronze” macula-dystrophiák (Hargitai et al.

2005)

A betegség előforulását 1:10000–re becsülik; túlnyomóan autoszomális recesszív, ritkán

autoszomális domináns módon öröklődik. (2.ábra)

Előfordulás gyakoriságaStargardt macula-dystrophia 1:10000Progresszív csap-dystrophia 1:10000-1:15000Best-féle vitelliform macula-dystophia nincs adat X kromoszómához kötött retinoschisis 1:5000-1:25000

1. táblázat A leggyakrabban előforduló öröklött macula-dystrophiák

6

Allikmets és munkatársai 1997-ben találták meg azt a gént, amelynek hibája a betegség

autoszomális recesszív módon öröklődő formájának (STGD vagy arSTGD)

kialakulásához vezethet (Kaplan et al. 1993; Allikmets 1997 et al.).

Az ABCR gén az 1. kromoszómán helyezkedik el és egy transzmembrán fehérje, a

„rim” fehérje (RmP) kódolásáért felelős, amely az adenozin-trifoszfát (ATP)-kötő

kazetta transzporter család egyik tagja (Azarian et al. 1997). Az RmP fehérjét először

béka csap-sejtek külső tagjában írtak le (Papermaster et al. 1978). Ez a fehérje a

fotoreceptorok és a retina pigmenthámja között zajló energiaigényes

transzportfolyamatokban vesz részt (Weng et al. 1999).

2. ábra Az RmP fehérje működése (rho: rodopszin; ops: opszin; PE: foszfatidil-

enatolamin; atRAL: csupa-transz retinál; arROL: csupa-transz retinol; N-RPE:

N-retinidil- foszfatidil-enatolamin; DM: lemezkék membránja; PM: plazma

membrán) Weng et al. 1999.

Fény hatására a rodopszinból csupa-transz retinál szabadul fel a külső tagok

lemezkéiben. A csupa-transz-retinál a lemezkék membránjában található foszfatidil-

etanolaminhoz (PE) kapcsolodik. Az így keletkezett termék a N-retinilidin-PE (N-ret-

PE). Az RmP egészséges működése estén az N-ret-PE-t kiüríti a lemezkékből, majd a

csupa-transz retinal csupal-transz retinollá (atROL) alakul, amit a pigmenthám sejtek

alakítanak ismét 11-cis-retinallá. (2. ábra)

Amennyiben az RmP fehérje hiányzik vagy működése nem megfelelő, N-ret-PE

halmozódik fel a lemezkék közötti térben. A felhalmozódás egyik következménye az

lesz, hogy az opszint a lemezkékben lévő nagy mennyiségű felesleges csupa-transz

retinál aktiválja, melynek során opszin-csupa-transz retinál (ops/atRAL) keletkezik. Ez

7

az aktiváció jelenlegi ismereteink szerint a „zajos” fotoreceptorok kialakulásához vezet,

amely a sötétadaptáció megnyúlásában nyilvánul meg (Fishman et al. 1991).

A kóros anyagcsere további következménye lehet az N-retinilidin-N-retinil-PE (A2PE-

H2) képződése, ami akkor alakul ki, ha az N-ret-PE-hez egy második csupa-transz

retinál molekula kapcsolódik. A pigmenthám sejtekben - amelyek egészséges

anyagcsere esetén a lemezék fagocitózisában vesznek részt – az A2PE-H2 molekula N-

retinilidin-N-retinil-etanolaminná (A2E) hidrolizál. Az A2E lipofuszcin formájában

halmozódik fel a pigmenthám sejtekben, és a macula lutea „túlterhelt” pigmenthám

sejtjei a sejtmembrán károsodásának következtében elpusztulnak (Mata et al. 2001).

Az ABCA4 gén hibája előfordul még csap-pálcika dystrophiában (CRD), retinitis

pigmentosában (RP) és időskori macula degenerációban (AMD) is (Cremers et al. 1998;

Martinez-Mir et al. 1998; Maugeri et al. 2000; Surya et al. 1995, Allikmets et al. 2000).

A betegség súlyossága jelenlegi ismereteink alapján a megmaradt „rim” fehérje funkció

függvénye (Martinez-Mir et al. 1998). Ha a beteg heterozigóta formában hordozza a

hibás ABCA4 allélt, időskori macula degeneráció kialakulása valószínűsíthető.

Amennyiben két enyhe vagy mérsékelt allélt hordoz, STGD kialakulása várható. Két

súlyos allélt hordozó betegeken nagy a valószínűséggel CRD vagy RP fog kialakulni.

A patogenezis fenti, részben egyszerűsített elmélete alól több kivétel is ismert (Birch et

al. 2000). Kimutatták, hogy CRD és STGD is kialakulhat azonos genotípus mellett.

Különböző munkacsoportok a klinikailag bizonyított esetek körülbelül 30-70

százalékában találtak kóros genetikai eltérését, és eddig több mint 500 betegség-okozó

genetikai variánst fedeztek fel (Lewis et al. 1999; Papaionnau et al. 2000; Rivera et al.

2000; Simonelli et al. 2000; Heckenlively et al. 2001; Fukui et al. 2002). (Az ABCR

gén hibája gyakran kimutatható heterozigóta formában időskori macula degeneráció

esetén.)

A Stargardt betegség autoszomális dominánsan öröklődő formájának kialakulásáért

jelenlegi ismereteink szerint az ELOVA4 gén felelős, ami hosszúláncú zsírsavak

anyagcseréjében játszik szerepet (Zhang et al. 2001).

A szemészeti diagnosztika új módszerei a kórkép pontosabb morfológiai megértését

tették lehetővé. Az 1990-es évek elején Huang és munkatársai számoltak be egy új

vizsgálati módszerről, az alacsony koherenciájú interferometria elvén működő optikai

koherencia tomográfiáról, mely a biológiai rendszerek nagy felbontású leképezését tette

lehetővé. A berendezés egy szuperlumineszcens diódalézer segítségével speciális,

8

alacsony koherenciájú fénynyalábot generál, melynek hullámhossza az infravörös

tartományban van. A szemgolyón keresztülhaladó fény a szem különböző struktúráiról,

azok optikai denzitásának függvényében verődik vissza. Az optikai koherencia

tomográfia (OCT) segítségével az ideghártyában lezajló változásokat sejtréteg – illetve

a legújabb készülékek segítségével már - sejtszinten lehet vizsgálni, és így a betegség

progressziójáról is pontosabb képet kaphatunk. Az OCT vizsgálat gyors és könnyen

kivitelezhető, a leképezés időtartama hozzávetőleg 1 másodperc (Huang et al. 1991;

Hee et al. 1995; Jaffe et al. 2004).

A klinikai használatban alkalmazott berendezések közül az első és második generációs

készülékek axiális és transzverzális felbontása 10-20 μm közötti, a harmadik generációs

OCT felbontása 10 μm alatti.

Egy másik vizsgáló eljárás, a scanning laser ophthalmoscopia (SLO), amely nagy

felbontású tomográfiás felvételek készítésére alkalmas a szemfenékről, non-invazív

módon. A készülék voltaképpen egy monokromatikus funduskamera, melyben azonban

a képalkotás nem a hagyományos funduskamerához hasonló módon - ahol a képalkotás

időtartama alatt a szemfenék egész felszíne egy időben van megvilágítva - hanem a

fundusnak lézerfénnyel pontról-pontra való "letapogatásával" történik.

A készülék vizsgáló fényének megválasztásával (infravörös: 780 nm, hélium-neon 630

nm, argon-kék és -zöld 514, illetve 488 nm) a retina rétegeinek és a látóidegfőnek a

morfológiai vagy metabolikus változásait akár sejtszinten tudjuk vizsgálni (Németh et

al. 1999; Seres et al. 1999).

A macula lutea sárgás színéről először Buzzi írt 1782-ben (Buzzi et al. 1782). Wald

1945-ben megjelent munkájából ismerjük a macula területében található sárgás

pigmentek abszorpciós spektrumát (430-490 nanométer) (Wald et al. 1945). Humán

retinából kimutatta a xantofilleket, amelyek fényelnyelés maximuma 465 nanométer.

A xantofillek a karotinoidok egy alcsoportját képezik, amelyek többek között a

zöldségek, a gyümölcsök, a lazacok, a kanári madarak és a flamingók élénk színéért

felelősek.

A xantofillek az egyenes láncú szénhidrogén karotinoidok oxigenizált formái (Goodwin

et al. 1980).

Bone az 1980-as években írta le a luteint és annak szerkezeti izomerjét a zeaxantint,

mint a retina specifikus xantofilljeit (Bone et al. 1980).

A lutein és a zeaxatint csupán kettő a több mint 600 eddig ismert karotinoid közül.

9

Szerkezeti felépítése alapján a lutein az α-karotinoidok, míg a zeaxantin a β-

karotinoidok közé tartozik. Mindkettő vegyjele azonos (C40H56O2), de eltérő

szerkezetük miatt kötődnek eltérő módon, különböző membránokhoz (Bone et al.

1980).

Táplakozásunkban a karotinoidok legfőbb forrásai a növényi táplálékok (hüvelyesek és

a zöldpaprika) valamint a tojás sárgája, a tej és a baromfihús (Müller et al. 1996).

A táplálékok felszívódását követően a vér karotinoid szintjét több tényező is

befolyásolja: a szervezet zsírtartalma, a stressz, a nem, a táplálék zsírtartalma és több

még nem ismert tényező (Erdman et al. 1993; Broekmans et al. 2002; Hammond et al.

1997; Zaripheh et al. 2002; Khachik et al. 1997).

Az egyes karotinoidok eloszlása a szervezetben nagy különbséget mutat, amely alapján

arra következtetnek, hogy az egyes molekuláknak más ás más szervspecifikus feladata

lehet.

A retinának van a legmagasabb xantofill tartalma – a szérumban mért érték 10000-

szerese – és szinte kizárólagosan csak luteint és zeaxantint tartalmaz (Bhosale et al.

2004). A magas koncentráció kialakításában nagy szerepe lehet az aktív transzport

folyamatoknak és specifikus xantofill-kötő fehérjéknek, mint pl. a tubulin (Bernstein et

al. 1997; Yemelyanov et al. 2001). A lutein és a zeaxantin koncentrációja a foveolában

a legmagasabb és attól a periféria felé haladva egyre csökken (Bone et al. 1988, 1993,

1997). A retinában megtalálható még a zeaxantin királis izomerje az ún. mezo-

zeaxantin, amely luteinből keletkezik és a vérben nem mutatható ki (Bone et al. 1993,

1997).

A lutein és a zeaxantin a fovea területében a csapok axonjában helyezkednek el,

amelyek a Henle köteget alkotják (Segal et al. 1950; Snodderly et al. 1984 A, B;

Wolbarsht et al. 1976), de megtalálhatóak még a külső magvas rétegben (Rapp et al.)

2000 és a pálcikák külső tagjában is (Snodderly et al. 1984 A). Hasonlóan kimutatták a

pigmentek jelenlétét a fovea Müller sejtjeiben is, amelyek hálózatot képeznek a csapok

axonjaival, ezzel is biztosítva a fovea integritását (Gass et al. 1992,1999; Ezra et al.

2001).

A macula lutein és zeaxantin tartalmának in vivo, nem invazív mérésére több módszert

dolgoztak ki, amelyek közül a legismertebbek: a heterokromatikus flikker fotometria

(Snodderly et al. 2004) és a Raman-spectroscopia (Bernstein et al. 1998).

A macula xantofill tartalmának legfontosabb meghatározója a táplálkozás. Ha magas

lutein és zeaxantin tartalmú táplálkozást folytatunk, több mint három hónapon keresztül,

10

akkor mind a vérben, mind a retinában megemelkedik a fentiek koncentrációja (Johnson

et al. 2001; Koh et al. 2004).

Bizonyítékok vannak arra, hogy a férfiak retinájában a lutein felhalmozódás gyorsabb,

és a maculapigement mennyiség magasabb (Broekmans et al. 2002, Hammond et al.

1996 A).

Az örökletes tényezők is meghatározói lehetnek a maculapigment mennyiségének: kék-

szürke szivárványhártya esetén alacsonyabb koncentrációkat mértek, mint sötét színű

iris esetén (Hammond et al. 1996 B).

A dohányzás szintén csökkentheti a maculapigment mennyiségét (Hammond et al.

2000).

Az életkor előrehaladtával a xanthofillek csökkenését írták le, amely meghatározó lehet

az időskori macula degeneráció kialakulásában (Beatty et al. 2001; Eye Disease

CaseControl Study Group 1992).

A maculapigement élettani funkciója még nem teljesen ismert. Feltételezhető funkcióit

a már ismert biológiai, optikai és fotokémiai tulajdonságaiból vezették le. Szerepet

játszhatnak a kék fény megszűrésében (Howarth et al. 1986), a káprázás csökkentésében

(Sujak et al. 2000), a kontrasztérzékenységben (Wooten et al. 2002) és a reaktív oxigén-

gyökök semlegesítésében (Conn et al. 1991).

A pigmentek megfelelő elrendeződésben -amelyet a membrán fehérjékhez történő

kötődésük biztosít – a fotoreceptorok előtt elhelyezkedő fényszűrő rétegként működnek

(Ezra et al. 2001; Naylor et al. 1954; Stanworth et al. 1950; Yemelyanov et al. 2001).

Az éleslátás fenntartásában elengedhetetlen szerepe van a pigmentek jelenlétének és

azok megfelelő elrendeződésének.

Idős korban, albinismusban és retinitis pigmentosa esetén – amikor a maculapigment

mennyisége csökkent – igen gyakori panasz a szemkáprázás (Hammond et al. 1998).

A maculapigment zsírban oldódó antioxidánsok tagjaként, fontos szerepet játszik a

szervezet antioxidáns rendszerében az enzimek (kataláz, glutation-peroxidáz,

szuperoxid-dizmutáz) és a vízoldékony antioxidánsok (glutation, C-vitamin) mellett

(Conn et al. 1993, De La Paz et al. 1992).

A retina kifejezetten érzékeny az oxidatív streszre, mert igen magas az oxigén

koncentrációja és folyamatos nagy energiájú kék fény behatásának van kitéve.

A reaktív oxigén gyökök keletkezésében kiemelt szerepe van az UV és a kék fényt

nagyfokban elnyelő molekuláknak, mint pl. lipofuszcinnak. Ezek az oxigén gyökök a

hosszúláncú telítetlen zsírsavak károsításán keresztül lipid-peroxidációt okoznak, amely

11

DNS károsodáshoz, fehérjék és transzmembrán glikoproteinek oxidációjához

vezethetnek (Winkler et al. 1999).

A karotinoidok a szabad gyökök eltávolításában játszanak kiemelt szerepet (Stahl et al.

1997; Leibler et al. 1997; Sundelin et al. 2001). Lipidoldékonyságuknak köszönhetően

sejtmembránokhoz kötődve, a fotoreceptorok külső tagjában lévő magas telítetlen

zsírsav tartalmú membránok védelmének alappilléreit képezik (Winkler et al. 1999; De

La Paz et al.1992; Leibler et al. 1997).

A korral előrehaladó pigementhámsejt pusztulás, a maculapigment mennyiségének

csökkenése, és lipofuszcin felhalmozódása a retina oxidatív károsodásához és

következményes látóélesség csökkenéshez vezet (Boulton et al. 1991; Curcio et al.

1993).

Kísérletes körülmények között, ha a pigmentsejt kultúrákat luteinnel és zeaxantinnal

kezelték, csökkenthető volt a lipofuszcin képződés és a kék fény által előidézett

apoptosis (Boulton et al. 1993).

A lutein és zeaxantin tartalmú étrend-kiegészítők folyamatos szedése a vér, majd később

a retina xantofill tartalmának emelkedéséhez vezet. Néhány tanulmányban kimutatták,

hogy magasabb szérum xantofill koncentráció esetén alacsonyabb arányban alakul ki

időskori macula-degeneráció (Seddon et al. 1995, Snellen et al. 2002; Gale et al. 2003).

A maculapigment bevitel optimális mennyiségének meghatározására további

tanulmányok vannak folyamatban.

Jelenleg a Stargardt betegség a többi macula-dystrophiával együtt a gyógyíthatatlan

betegségek közé tartozik. Ezek a kórképek a betegre, családjára és a társadalom

egészére komoly terheket rónak. A korai diagnózis elősegítheti azt, hogy az érintettek

megfelelő pályaválasztással könnyebben tudjanak beilleszkedni a társadalomba, és

teljes életet élhessenek. A mai napig az egyetlen javasolt terápia STGD esetén olyan

multivitamin készítmények alkalmazása, amelyek megfelelő összetételben tartalmazzák

a retina és a fotoreceptorok korai öregedését hátráltató vitaminokat, nyomelemeket,

antioxidánsokat és fotopigmenteket. A leggyakrabban használt optikai rehabilitációs

lehetőségeinket jelenleg az alábbi segédeszközök képezik: távcsőszemüveg, nagyító TV

és színszűrős szemüveg (Fonda et al. 1985; Zrenner et al. 2002).

A retina betegségek diagnosztikus lehetőségeinek kibővülésével párhuzamosan egyre

több kísérlet kezdődött, amely a betegségek gyógyítását tűzte ki céljául (Rattner et al.

1999) Ezekben a kísérletekben a szövetátültetés, az őssejt beültetés és a retina

12

protézisek mellett egyre nagyobb számban jelentek meg olyan próbálkozások, amelyek

a betegséget sejt és/vagy gén szinten próbálják kezelni.

A génterápia az öröklött és szerzett betegségek gyógyításában ígéretes módszernek

tűnik. A génterápiás vizsgálatok első lépcsőben egy nyomjelző fehérje termelődéséért

felelős gén sejtekbe történő bejuttatásának lehetőségeit vizsgálták. Ezen kísérletek

sikere lehetővé tette, hogy a további kutatások egy adott betegségben meghibásodott

gén vagy génszakasz, és ezen keresztül a fehérjetermék korrigálásának irányában

folytatódjanak (Naldini et al. 1996 A,B; Miyoshi et al. 1997; Bennett et al. 1999).

Jelenleg a génterápiás kísérletek túlnyomó része valamely vírus-vektort használ a

transzgén bejuttatásához (Relph et al. 2004). Több olyan vírus-vektort sikerült

kifejleszteni, amely képes a terápiás transzgén hosszú távú és biztonságos

expresszálódásának elindítására az adott célsejtekben. A génterápiának különös

jelentősége van a központi idegrendszer betegségeiben, mivel az idegi eredetű sejtek

nem osztódnak és kifejezett védelmi rendszer veszi őket körül.

Az adenovírus-vektor képes –az elérhető magas vírus-koncentrációknak köszönhetően –

a célsejtek széles spektrumának eredményes transzdukciójára, de alkalmazásakor

kifejezett immunválasz várható (Cao et al. 2004; Volpers et al. 2004; Thomas et al.

2001; Schagen et al. 2004). A vektor toxicitására hívta fel a figyelmet az a fatális

kimenetelű humán kísérlet, amelyben az ornitin-traszkarbamiláz hiányát próbálták

kezelni első-generációs adenovírus-vektor segítségével (Lehrman et al. 1999). A

továbbfejlesztett „gutless” (tehetetlen) adenovírus-vektorból kiiktatták az összes a

transzdukcióhoz nélkülözhető vírus alkotórészt, de a vírus kapszid fehérje továbbra is

immunválaszt vált ki (Sakhukja et al. 2003; Kochanek et al. 2001, McKelvey et al.

2004). Az adenovírus-vektor másik hátránya, hogy a transzgén episzomálisan

integrálódik, így krónikus betegségek kezeléséhez szükséges folyamatos gén-expresszió

nem érhető el, de a célsejt genomja nem módosul a terápia következtében.

Az adeno-szatellita vírus (AAV) a célsejtek széles spektrumának kezelésére nyújt

lehetőséget (Kaplitt et al. 1994; Lu et al. 2004). A „beültethető” transzgén mérete kicsi

(4-5kb) és a vektor immunválaszt nem vált ki. Amennyiben nagyobb méretű transzgén

bejuttatására van szükség, akkor eredmény csak a gént feldarabolásával, két AAV

vektor egyidejű transzdukciójával érhető el (Nakai et al. 2000; Duan et al. 2000; Sun et

al. 2000).

13

A vektor másik hibája, hogy több esetben elégtelennek bizonyult a transzgén

expressziója, ami valószínűleg abból adódott, hogy a transzgén a célsejt nem kódoló

régiójába integrálódott (Nakai et al. 2003).

Jelenleg két klinikai kísérlet van folyamatban Parkinson betegség kezelésére AAV

vektor alkalmazásával (During et al.2001; Luo et al. 2002).

A herpes simplex vírus (HSV) alapú vektorok eredményesen képesek az idegi sejtek

transzdukciójára, köszönhetően a vírus ismert neurotrofizmusának. A hordozható

transzgén mérete itt jóval nagyobb lehet (akár 50kb), és az integráció ebben az esetben

is episzómális (Glorioso et al. 2004).

A HSV vektor esetén is kifejezett immunreakcióra számíthatunk, és az expresszió is

csak átmeneti jellegű, ezért a vektort jelenleg csak a daganatok kezelésére irányuló

kísérletekben használják (Post et al. 2004).

Hosszú távú transzgén expresszió elérésére - jelenlegi ismereteink alapján – leginkább a

retrovírus és lentivírus alapú vektorok alkalmasak. Ezekben az esetekben a transzgén

stabilan integrálódik a célsejt genomjába (Naldini et al. 1996A). A lentivírus-vektor

képes nem osztódó, idegi eredetű sejtek nagyobb méretű (8-10kb) transzgénnel történő

transzdukciójára, immunreakció kiváltása nélkül (Lever et al. 2004; Martin-Rendon et

al. 2001; Azzouz et al. 2004).

A vektor egyedüli kockázata az, hogy a genomba történő beépülés mutációk

kialakulásához, vitális gének sérüléséhez és nyugvó „promoter” vagy „enhancer” régiók

aktiválásához vezethet. Ez a mellékhatás jelentkezett azokban a gyerekekben, akiket az

X-kromoszómához kötött kombinált immundeficiencia (CID) miatt kezeltek lentivírust

alkalmazva. Három betegen a kezelés mellékhatásaként leukémia alakult ki, ami

részben LIM-only2 (LMO2) onkogén aktiválódására vezethető vissza (Hacein-Bey-

Abina et al. 2003).

A lentivírus-vektorokat két nagy csoportba oszthatjuk: főemlős eredetű vektorok és nem

főemlős eredetű vektorok. Az előbbibe a humán immundeficiencia vírus (HIV) és a

majom immundeficiencia vírus (SIV) tartozik. Az utóbbiba a lófertőző vérszegénység

vírus (EIAV), a macska immundeficiencia vírus (FIV) és a szarvasmarha

immundeficiencia vírus (BIV) vektorok tartoznak.

Az első generációs lentivírusokat olyan vektorok követték, amelyből eltávolítottak

minden olyan vírusrészt, amely immunválaszt okozhat a célszövetben. A vírusok

pszeudotipizálása lehetővé tette, hogy a vírus-vektor retrográd transzportját kihasználva

14

távoli vagy elzárt idegsejt csoportokat lehessen kezelni (Dull et al. 1998; Kim et al.

1998; Poeschala et al.1998; Rohll et al. 2002).

A legújabb lentivírus-vektok képesek a transzgén expresszálódásának „ki és

bekapcsolására” a Tet (tetracyclin) szabályozó rendszer segítségével (Pluta et al. 2005).

Ez a tulajdonság kifejezetten fontos lehet abban az esetben, ha akut betegséget kívánunk

kezelni.

Jelenleg -többek között- a következő neurodegeneratív betegségekben történnek

génterápiás kísérletek lentivírus-vektor alkalmazásával: Alzheimer betegség (Marr et al.

2003), Parkinson betegség (Kirik et al. 2004), Huntington betegség (Kells et al. 2004) és

amyotrophiás lateralsclerosis (Kaspar et al. 2003).

A szem több szempontból is ideális célszerve lehet a génterápiának: sebészileg könnyen

megközelíthető és a terápia in vivo könnyen nyomon követhető.

Több öröklött retina betegségben sikerült már állatkísérletes modellben részleges

anatómia és funkcionális rehabilitációt elérni az utóbbi években (Leber-féle congenitális

amaurosis, retinitis pigmetosa, Stargardt macula-dystrophia) (Takahashi et al. 1999;

Acland et al. 2001; Bemelmans et al. 2006; Kong et al. 2007).

A Stargardt betegség kisérletes állatmodelje az abcr -/- „knock out” egér, amelyben az

RmP fehérje génjét törölték. Ezekben az egerekben lipofuszcin felhalmozódást és a

sötétadaptáció megnyúlását írták le (Weng et al. 1999).

A abcr-/- egér vizsgálatai során kimutatták, hogy az A2E felhalmozódás csökkent,

abban az esetben, ha az állatokat sötétben tartották (Weng et al. 1999). Ennek alapján

javasolhatjuk a betegnek, hogy az erős fényt a lehető legnagyobb mértékben kerüljék.

Kísérletek indultak olyan gyógyszerek kifejlesztésére, amelyek az A2E felhalmozódást

gátolják a pigmenthám sejtekben. Az abcr-/- egérben izotretinoinnak ilyen hatását

mutatták ki (Radu et al. 2003).

15

3. Célkitűzések

Kutatásunk célja a Stargardt betegség klinikai morfológiai vizsgálata és

progressziójának megítélése új szemészeti diagnosztikus eszközökkel, valamint a

betegség genetikai hátterének feltérképezése, és egy nyomjelző fehérje génterápiás

módszerrel történő bejutásának in vitro és in vivo vizsgálata volt.

Vizsgálatainkban a következő kérdésekre kerestünk választ:

1. Alkalmas módszer-e az OCT a retina morfológiai változásainak vizsgálatára

Stargardt macula-dystrophiában?

2. Nyomonkövethető-e SLO segítségével a maculapigment mennyiségének változása

Stargardt macula-dystrophiában?

3. Az ABCA4 gén melyik mutációi fordulnak leggyakrabban elő a magyar Stargardt

macula-dystrophiás betegcsoportban, és azok hogyan befolyásolják a betegek

fenotípusát?

4. Képes-e a lentivírus-vektor a GFP nyomjelző fehérje (green fluorescent protein)

génjének a retina pigmenthámjába és egyéb rétegeibe történő bejuttatására in vitro

és in vivo körülmények között?

5. Milyen módszer alkalmas a GFP fehérje által kiváltott immunválasz áthidalására?

16

4. Módszerek

Stargardt macula-dystrophiásnak (STGD) diagnosztizált betegeken és hasonló korú

kontroll személyeken a következő klinikai vizsgálatokat végeztük:

4.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt macula-dystrophiában

OCT segítségével

A Semmelweis Egyetem II.sz. Szemészeti Klinikáján harmincöt 15-55 éves

(átlag: 28,3±7,6 év) hagyományos klinikai módszerekkel STGD-ának ítélt beteg 70

szemét és 25 hasonló korú (14-51 év; átlag: 27,6±8,7 év) egészséges kontrollszemély 50

szemét vizsgáltuk. A vizsgálatok mindegyike az intézet szabályzatának és a Helsinki

Nyilatkozatnak megfelelően történt. Az összes résztvevő személy a vizsgálatok részletes

ismertetését követően beleegyező nyilatkozatot írt alá. A betegek beválogatása a

korábban ismertetett kritériumok alapján történt (Allikmets et al. 1997; Lewis et al.

1999). A kontroll csoportban egyik személynek sem volt szemészeti betegsége.

A betegek között 19 nő és 16 férfi, míg az egészségesek között 13 nő és 12 férfi

szerepelt. A betegség jelentkezésének idejét és a betegség fennállást minden beteg

esetén rögzítettünk. A betegség kezdetének vagy a látásromlás észlelésének az idejét

vagy a diagnózis felállításának időpontját tekintettük. A páciensek rutin szemészeti

ellenőrzése a következőket tartalmazta: távoli korrigált látóélesség (Snellen tábla), az

elülső és hátsó szegmentum biomikroszkópos vizsgálata, szemfenéki fénykép készítése.

Pupillatágítást követően optikai koherencia tomográfiát végeztünk második generációs

OCT berendezéssel (OCT2, Hunphrey-Zeiss Instruments, San Leonardo, CA, USA).

Minden szem vizsgálata során hat, a vizsgáló személy által manuálisan a foveára

centrált, 6 mm-es letapogatást végeztünk. A manuális centrálásra a betegek rossz

fixációs képessége miatt volt szükség. A foveoláris vastagságot (FT) és a macula

térfogatot (MV) -3500μm átmérőnek megfelelően- a készülék beépített szoftverének

segítségével határoztuk meg.

Az így kapott eredményeket összehasonlítottuk a betegek legjobb korrigált távoli

látóélességével.

17

A statisztikai feldolgozáshoz, lineáris regressziót alkalmazva a Statistica 6.0 szoftvert

használtuk (Statsoft Inc. Tusla, USA), és szignifikancia szintjének a p< 0,05 értéket

tekintettük.

4.2. A maculapigment változásának vizsgálta STGD-ában SLO segítségével

A Columbia Egyetem (New York, NY, USA) Szemészet Tanszékén tizenhat (11-63

éves; 11 nő és 5 férfi) STGD-ás beteg 32 szemét vizsgáltuk. A maculapigment jelenlétét

scanning laser ophthalmoscop (SLO; Rodenstock, Munich, Germany) segítségével

állapítottuk meg. A SLO vizsgálat előtt, meghatároztuk az összes vizsgált szem legjobb

korrigált látóélességét Snellen tábla segítségével. A vizsgálatokat az intézet etikai

bizottságának előzetes jóváhagyásával, a Helsinki Nyilatkozat elveinek betartása mellett

végeztük. Minden vizsgált személy belegyező nyilatozatot írt alá a vizsgálatokat

megelőzően.

Négy különböző hullámhosszú fényforrást használva és azok eredményeit

összehasonlítva (kék argon-lézer: 488 nm; zöld neon-lézer: 514 nm; vörös hélium neon-

lézer: 633; infravörös dióda-lézer: 780nm) határoztuk meg a maculapigment jelenlétét

vagy annak hiányát a foveában.

A kapott eredményeket 3 csoportba osztottuk:

1. Normál mennyiségű pigment a foveában: ha egyenletes eloszlású, körkörös

elrendezésű, a foveára centrált sötét pigment volt megfigyelhető, amely a kék fényt

teljes mértékben, a zöld és vörös fényt csökkenő mértékben nyelte el, míg az infravörös

fény számára teljesen áttetsző volt. (Ezt az eredményt kaptuk mind a huszonöt

egészséges kontroll személy esetén.)

2. Csökkent mennyiségű pigment a foveában: ha a pigment mennyiségében vagy

eloszlásában a normál állapothoz képest eltérést találtunk, a normál pigment mennyiség

mellett leírt fényelnyelési tulajdonságokkal.

18

3. A maculapigment teljes hiánya a foveában: ha a kék fénnyel történő megvilágítás

során sötét színű pigment nem volt látható, vagy ha a kék fény mellett észlelt sötét

pigment hasonló képet mutatott az infravörös megvilágításnál is.

A betegek maculapigment mennyiségét összehasonlítottuk a legjobb korrigált

látóélességgel.

A látóélesség és a pigmenttartalom összefüggését 3x3-as Chi-négyzet teszttel vizsgáltuk

az alábbi csoportok szerint: 0,1- és annál rosszabb, 0,1-0,5 közötti, 0,5 és annál jobb

látóélesség, valamint normál mennyiségű pigment, csökkent mennyiségű pigment és a

maculapigment teljes hiánya.

15 beteg ABCA4 genotípusát viszgáltuk az ABCR 350 gén-chippel (Allikmets et al.

2001).

4.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar STGD-ás betegcsoportban, és annak

összehasonlítása a betegek fenotípusával

A Semmelweis Egyetem II.sz. Szemészeti Klinikájánának harmincöt 8-45 éves (átlag:

28 év) STGD-ás betegét vizsgáltunk a Columbia Egyetem Szemészeti Tanszékével

együttműködésben (New York, NY, USA) a genetikai háttér feltérképezésének céljából.

Minden betegtől előzetes beleegyezés után 6 ml friss vénás vért vettük, amelyből a

DNS-t QAIGEN DNA Maxi Preparációs csomag (QIAGEN Inc., valencia, CA, USA)

segítségével izoláltuk.

A betegek genetikai hátterének feltérképezését ABCR400 microchip segítségével

végeztük, majd az eredményeket szekvenálással ellenőriztük. Az ABCR400 microchip

képes az összes ABCA4 variáns (jelenleg ismert több mint 450 génhiba) egyidejű

vizsgálatára (Allikmets et al. 2001; Jaakson et al. 2003). A microchip az „arrayed

primer extension” (APEX) elvét alkalmazza és az összes ismert ABCA4 allél

szekvencia-specifikus oligonukleotidjának szintézisével, és azok felhasználásával

működik.

A minták (templátok) előállításához, az ABCA4 gén összes exonját PCR módszerrel

sokszorosítjuk, a korábban ismertetett módszerrel (Kurg et al. 2000).

Az amplifikációs oldatban a dTTP 20 százalékát dUTP-vel helyettesítettük. A

sokszorosított mintákat koncentrálása és tisztítása tisztító oszlopon történt (MIPSpin

19

PCR kit; Genotein Inc., Szöul, Dél-Korea). A minták fragmentációjához hőkezelést

követően hőlabilis uracil-N-glikozilázt használtunk (Epicentre Biothechnologies,

Madison, WI, USA).

Az APEX módszerrel végzet genotipizáláshoz az amplifikált minták egyharmadát

használtuk a primer extenziós reakcióban. Az APEX reakció oldata minden esetben a

következőket tartalmazta: a fragmentált és denaturált PCR mintát, 4 U DNS-polimerázt

(ThermoSequenase; GE Healthcare, Amersham, Nagy-Britannia), egyszeres reakció

puffert és 1,4 µM koncentrációban fluorescensen jelzett ddNTP-ket: Texas-vörös

ddATP, fluoreszcein-ddGTP (GE Healthcare), Cy3-ddCTP és Cy5-ddUTP (NEN,

Boston, MA, USA).

A reakciós oldatot 58˚C-on 15 percen keresztül inkubáltuk a ABCR400 microchip

felületén. Az inkubációt a tárgylemez 95˚C-os desztillált vízzel (Milli-Q; Millipore,

Bedford, MA, USA) történő öblítésével állítottuk le.

A tárgylemezeket Genorama QuattroImagerrel (Asper Biotech Ltd., Tartu, Észtország)

vizsgáltuk, és az ABCA4 szekvencia-variánsokat a műszer szoftverének (Genorama

Genotyping Software, Asper Biotech Ltd., Tartu, Észtország) segítségével azonosítottuk

(Tonisson et al. 2002).

Az azonosított variásokat direkt szekvenálással, (Taq Dyedeoxy Terminator cycle

Sequencing; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ABI 377 (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA) automata szekvenálón ellenőriztük.

A genotípus-fenotípus összehasonlítás során a betegeket a funduskép alapján a

Fischman által javasolt csoportokba (Fischman et al. 1999) :

• Fenotípus I: apró atrófiás terület a foveában, finom pigmentzavarral és

perifoveális sárgás-fehér foltozottsággal.

• Fenotípus II: számos sárgás-fehér folt a macula területében.

• Fenotípus III: kifejezett atrófiás elváltozás a fovea területében.

A betegek genetika adatait a legjobb korrigált látóélességgel és az OCT vizsgálat

eredményeivel hasonlítottuk össze lineáris regresszió módszerével.

A statisztikai számításokat a Statistica 6.0 szoftverrel (Statsoft Inc. Tusla, USA)

végeztük és szignifikáns eltérésnek a p< 0,05 értéket tekintettük.

20

Elemeztük egy adott genetikai hiba lehetséges hatását a betegség progressziójára a

vizsgálati csoportban.

Alapkutatásainkat humán pigmenthám tenyészeteken és kísérleti nyulakon végeztük:

4.4. A GFP gén bejuttatásának lehetőségei a retinális pigmenthámba és a retina

szöveteibe in vitro és in vivo körülmények között

4.4.1. A vírus-vektor létrehozása

A vírusokat a humán vese eredetű 293T sejtvonal három plazmiddal történő egyidejű

transzfekciójával nyertük, a kálcium-foszfát módszer alkalmazásával (Chen et al. 1987;

Naldini et al. 1996A,B). Az első plazmid (pCMVΔR8.2) tartalmazza a cytomegalovírus

promotert és az inzulin poladenilációs jelet, amely az összes vírusfehérje –a köpeny-

fehérje (envelope) és a Vpu kivételével- „transz” formában történő expresszálódásához

szükséges. A második plazmid (pHR’-CMV-GFP) tartalmazza az összes „cisz”

állapotban lévő fehérje kódolásáért felelős szekvenciát, amely a vírus sejtbe jutásához és

génjeinek a célsejt genomjába történő integrációjához szükséges. Ebben a plazmidban

az expressziós kazetta a Rev (vírus replikációját szabályozó fehérje) kötőhelyekkel és

CMV promoterrel együttesen felelős az EGFP expresszálódásáért. A harmadik plazmid

(pMD.G) a vesicularis stomatitis vírus köpeny-fehérjéjének termeléséért felelős, amely

a vírus stabilitását és a lehetséges célsejtek számát határozza meg.

40 darab 10 cm átmérőjű petricsészébe egyenként 1,5x106 293T sejtet helyeztünk egy

éjszakára, majd a tápoldatot a transzfekció előtt két órával friss médiumra cseréltük.

A kálcium-foszfátos precipitációhoz 15μg pCMVΔR8., 20μg pHR’-CMV-GFP és 5 μg

pMD.G DNS keverékét használtuk. A tápoldatot a transzfekciót követően 18 órával

friss médumra cseréltük. Újabb 48 óra elteltével a vírust tartalmazó tápoldatot

összegyűjtöttük a negyven 10 cm-es petricsészéből. A sejttörmeléket lassú

centrifugálással távolítottuk el. Ezt követően az oldatot 0,45μm pórus-méretű filteren

szűrtük keresztül, majd ultracentrifugálást végeztünk 50000g-n 90 percig. Az így kapott

vírusmasszát feloldottuk 600 μl vírus inkubációs oldatban (50mM Tris-HCL, pH 7.8,

21

130mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCL2, 0,1 dezoxinukleotid-trifoszfát [dNTPs],

3mM spermin, 0,3mM spermidin), majd 37˚C-on 2 órán át inkubáltuk. Az oldatot ezt

követően TBS-sel hígítottuk (50mM Tris-HCL, pH 7,8, 130mM NaCl, 1mM KCl, 5mM

MgCl2), amelyet 50000g-n 90 percig tartó újabb ultracentrifugálás követett. A végső

vírusmasszát 100μl 8μg/ml Polybrene (kationos polymer, mely a retrovírus fertőzés

hatékonyságát emeli a sejtkulturában) tartalmú TBS-ben oldottunk fel újra.

A lentivírus-vektor titerét a 293 sejtek infekciójával határoztuk meg. 1x105 sejtet

helyeztünk el petricsészénként, majd a 4 μg/ml Polybrene tartalmú vírusoldat különböző

hígításait helyeztük a tápoldatokba. Egy éjszakán át tartó inkubációt követően a

tápoldatot frissre cseréltük, és a sejteket további 48 óráig inkubáltuk. A GFP

fluoreszcenciát áramlási citométerrel (FACS) határoztuk meg. A vírus-titer

meghatározásához azokat a sejttenyészeteket használtuk, amelyekben a GFP

fluoreszcenciát mutató sejtek száma megközelítőleg 5% volt. A koncentrációt az

aktuális sejt-floureszcencia százalék és a hígítás mértékének arányából számoltuk ki. Az

így nyert vírusoldatok fertőző egység (IU) koncentrációja 106 – 1010 IU/ml között

változott.

4.4.2. Retina pigmenthám sejttenyészet

A humán pigmentepithel sejteket 18-22 hetes magzatok szeméből nyertük az Albert

Einstein Orvosi Egyetemről (New York, NY, USA). A terhesség megszakítást

megelőzően az anya minden esetben beleegyező nyilatkozatot írt alá a szerv

felhasználásáról. A szerveket az Albert Einstein Orvosi Egyetem és a Columbia

Egyetem (New York, USA) közötti megállapodás alapján használtuk fel. A szemeket

először 70%-os alkoholban, majd PBS oldatban tisztítottuk meg. A pigmenthám

eltávolítása a korábban már ismertetett módszerrel történt (Gouras et al. 1994). A

pigmenthám darabokat 37˚C-on inkubáltuk 95% páratartalom és 5% CO2 koncentráció

mellett. A 20% fötális bovin szérum tartalmú Dulbecco modifikált Eagle tápoldatot

(DMEM) 3 naponta cseréltük a sejttenyészeten.

22

4.4.3. In vitro transzdukció

Annak érdekében, hogy az osztódó és a nyugalomban lévő sejtek transzdukciójának

arányát össze tudjuk hasonlítani, a vírusoldatot az elsődleges pigmenthám tenyészet

tápoldatába juttattuk. Ezáltal megfigyelhettük mind az eredeti erősen pigmentált

sejtcsoport, mind az ebből kirajzó, már csökkent pigmenttartalmú osztódó sejtek

viselkedését.

A transzdukció előtt a tápoldatot friss, 20% fötális bovin szérum tartalmú DMEM

oldatra cseréltük, amely 4 μg/ml koncentrációban Polybrent és a vírusoldat különböző

koncentrációit (107 – 109 IU/ml) tartalmazta. A sejteket 14 órán keresztül inkubáltuk a

vírusoldatban, majd annak kimosását követően a közeget friss tápoldatra cseréltük.

Mind a fluoreszkáló, mind a nem fluoreszkáló sejteket egy meghatározott (0,4 x 0,8

mm) területen összeszámoltuk a tenyésztőedény alábbi három részén:

1. az eredeti pigmenthám lemez közepének megfelelően

2. az eredeti lemez szélének megfelelően, ahol az osztódó sejtek vonala indult

3. a sejttenyészet széli részének megfelelően, ahol nagy mennyiségű osztódó

sejt volt megfigyelhető.

A fenti vizsgálatokat hetente, tizenöt különböző tenyésztőedényben végeztük el, három

héten keresztül.

Öt sejttenyészetben 6 hétig, míg egy tenyészetben három hónapig folytattuk a

vizsgálatot.

4.4.4. In vivo transzdukció

Kísérleteinkben holland öves nyulakat használtunk az ARVO irányelveinek

megfelelően (ARVO 2002). A nyulakat intramuszkulársian 20mg/kg ketamin és

10mg/kg xylazin keverékével altattuk el. Az állat egyik pupilláját 2 %-os cyclopentolat

és phenilephrin hydrochlorid keverékével kitágítottuk, és a kísérleteket a tágított

pupillájú szemeken végeztük, fénymikroszkópos ellenőrzés mellett. (3. ábra)

23

3. ábra A szubretinális és az intravitreális injekció bejuttatásának módja (Ralph et. al

2006)

A kötőhártya sebet és a sclerotomiás nyílást a limbus mögött 3 mm-rel készítettük. A

vizsgálathoz a nyulak szemére kontaktlencsét helyeztünk hialuronsav (Healon, Santa

Ana, CA, USA) segítségével. A scleraseben keresztül egy 50µm átmérőjű üveg

mikropipettát juttattunk az üvegtesti térbe. A pipetta végét a retina felszínére óvatosan

rányomva, a vírus oldatot a neuroretinán keresztül a szubretinális térbe juttattuk.

Minden esetben arra törekedtünk, hogy kb. 1-2 mm átmérőjű, kerek neuroretina leválást

képezzünk. Ezek után a pipettát eltávolítottuk,a sclera és kötőhártya sebeket 9-0 nylon

varrattal zártuk.

4.4.4.1. In vivo transzdukció immunszupprimálás nélkül

A kísérleteket 27 nyúl egyik szemén végeztük különböző vírusoldatokat juttatva a

szubretinális térbe:

• A oldat: CMV promóterrel ellátott GFP gént tartalmazó lentivírus 106-109 IU/ml

koncentrációjú oldatát használtuk 16 szemben

• B oldat: CMV promótert tartalmazó lentivírust jutattunk be, amely nem

tartalmazta a GFP génjét három szembe

24

• C oldat: csak Polybrene oldatot injektálunk két szembe

• D oldat: rodopszin promótert tartalmazó lentvírus-GFP-t jutattunk be két

szembe

• Az A oldatot használtuk, azt lehetőség szerint a neuroretina rétegei közé adtuk

négy szemben.

4.4.4.2. In vivo transzdukció immunszupprimálással

A kísérleteket 9 nyúl 12 szemén végeztük. Az előzőekben leírt A oldatot injektáltuk a

nyulak szubretinális terébe.

• Négy nyúl a műtét napjától kezdődően a következő immunszuppressziós

terápiában részesült: intramuszkuláris metylprednisolon sodium-succinat (Solu-

Medrol; 6,25mg/nap), azathioprin (8mg/nap) és orális cyclosporin (Neoral oldat

50mg/nap) egy hónapon keresztül. Az immunszuppressziót egy hónap elteltével

leállítottuk.

• Két immunszupprimált és két nem immunszupprimált nyúl fülvénájából három

naponként vért vettünk az esetleges GFP ellenanyag ELISA módszerrel történő

kimutatására.

• Két immunszupprimált és egy nem immunszupprimált nyúl az első operáció

után 6 hónappal újabb szubretinális vírusinjekciót kapott a másik szembe.

Ezekben az esetekben újabb immunszuppressziót nem alkalmaztunk.

4.4.5. ELISA vizsgálat

Maxicorp 96 osztatú tenyésztőedények alját (Nalge Nucl International, Rochester, NY,

USA) 1μg rEGFP (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA USA) 100μl 50mM

koncentrációjú nátriumkarbonát oldattal (pH 9,8) vontunk be. A fluoreszcencia

blokkolására a tenyésztőedényt 0.05% Tween és 3% bovin szérum albumin tartalmú

PBS oldattal kezeltük. A nyulak vérét a fenti oldattal hígítottuk és az oldatból

lyukanként 100 μl-t helyeztünk el. Kilencven percig tartó 37˚C-os inkubáció után, a

25

lyukakat PBS-sel kimosva 100 μl másodlagos anti-nyúl immunglobulin G-t adtunk

hozzá, amely 0,1μg/ml torma-peroxidáz (HRP) konjugátumot tartalmazott. A HRP

kimutatására 3,3’, 3,5’ tetrametilbenzidin szubsztrátot (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,

USA) használtunk, amelyet kolorimetriás analízis követett a Multiscan RC plate reader

(Labsystemsm, Helsinki, Finnország) segítségével.

4.4.6. A retina in vivo vizsgálata

A nyulak retináját hetente vizsgáltuk scanning laser ophthalmoscoppal (SLO), indirekt

ophthalmoscoppal és réslámpával. A GFP gén expresszálódásának vizsgálatához 488

nm hullámhosszúságú argon lézer gerjesztő-fényt és olyan filtert használtunk, mely csak

az 500 nm-t meghaladó hullámhosszú fényeket engedi át.

A fluoreszcens módban használt SLO képek alapján a GFP gén expresszálódásának

mértékét (relatív fluoreszcencia) 0-3-ig osztályoztuk az injektált területnek megjelenő

különálló fluoreszkáló pontok száma szerint:

• Ha az SLO képen legalább 50 különálló fluoreszkáló pontot láttunk az injektált

területen, akkor az expresszálódás mértéke: 3;

• 10-50 fluoreszkáló pontot esetén: 2;

• 10 pontnál kevesebb esetén: 1;

• a fluoreszencia hiánya esetén a gén expesszió mértéke: 0.

Az ideghártyán az injektált területnek megfelelően kialakult károsodás (relatív retina

pigmenthám károsodás) mértékét szintén a 488nm hullámhosszú fény használata mellett

állapítottuk meg, az alábbiak szerint:

• IV fokozat: 10 vagy annál több pigmentált (sötét) pont és ezek körül több

atrófiás terület;

• III fokozat: 5-10 pigmentált pont és ezek körül néhány atrófiás terület;

• II fokozat: 2-5 pigmentált pont;

• I fokozat: 1 pigmentált pont;

• 0 fokozat: a szubretinális injekció helyén pigmentáció változás nem látható.

26

4.4.7. Szövettani vizsgálatok

A nyulak szemének szövettani vizsgálatára a fluoreszcencia megszűnését követően a

kilökődési reakció jeleinek megjelenése után került sor. Ennek időpontja a nem

immunszupprimált esetekben az injekciót követő 1-8. hónapra esett. Az

immunszupprimált nyulak szövettani feldolgozása 12 hónap után történt.

A szemek nagy részét 3%-os glutáraldehidet tartalmazó PBS oldatban fixáltuk, úgy,

hogy a bulbust a limbusnak megfelelően 3 nyíláson keresztül töltöttük fel.

A szemeket 2 napon keresztül + 4˚C-on tartottuk a fixáló oldatban. A lencsét és az

üvegtestet puffer-oldatos öblítés után eltávolítottuk. Ezt követően a kezelt területet

fénymikroszkóp ellenőrzése mellett kivágtuk, majd újabb öblítést követően dehidráltuk,

majd Epon-ba ágyaztuk és fénymikroszkópos metszeteket készítettünk.

Azokban az esetekben, amikor fagyasztott metszeteket készítettünk, a szövetdarabokat

4%-os paraformaldehid tartalmú PBS oldatban fixáltuk, majd OCT-kompanddal

feltöltve száraz jéggel fagyasztottuk meg. A Leica 1850 cryotommal (Leica

Microsystems GmbH, Wetzlar, Németország) készített metszeteket zselatinnal kezelt

tárgylemezeken rögzítettük fluoromount-G fedőanyagot használva, majd a

fluoreszcenciát epifluoreszcens mikroszkóppal (Zeiss Axiovert S100; Carl Zeiss

MicroImaging GmbH, Göttingen, Németország) vizsgáltuk. Az excitációhoz 480 ± 20

nm hullámhosszú fényforrást használtunk, a barrier-filter csak az 535 ± 25 nm

hullámhosszú fényeket engedte át.

Az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz poliklonális GFP ellenanyag (Clontech

Laboratories, Palo Alto, CA, USA) 1:1000 hígítását alkalmaztuk. Negatív kontrollként

lentivírus-GFP oldattal nem kezelt retina pigmenthám sejttenyészeteket használtunk.

27

5. Eredmények 5.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt macula-dystrophiában

OCT segítségével

Az átlagos legjobb korrigált látóélesség a vizsgált Stargardt betegcsoportban 0,16 volt

(0,08-0,63) míg az egészséges kontroll csoportban 1,0.

Minden beteg elülső szegentuma ép volt.

A szemfenéki elváltozások az alábbi megoszlást mutatták:

• Fischman I.: 3 beteg

• Fischman II.: 21 beteg

• Fischman III.: 11 beteg

Fischman III. csoportba tartozó betegek látóélessége volt a legrosszabb, hasonlóan a

korábbi vizsgálatokhoz.

A STGD-ás betegek foveolája nagyfokban elvékonyodott (71,86±32,85 μm) az

egészséges személyekhez képest (161,26±15,90 μm; p<0,001). A macula térfogat

szintén szignifikáns módon csökkent a betegcsoportban a kontrollokhoz viszonyítva

(169±0,32 mm3 vs. 2.45±0,13 mm3; p< 0,001).

Egy 25 éves egészséges kontroll személy macula OCT vizsgálatának eredményét

mutatja a 4. ábra, amelyen látható, hogy sem a neuroretina sem a pigmenthám nem

mutat kóros eltérést. A foveoláris vastagság 186 μm, a macula térfogat 2,66 mm3.

4. ábra 25 éves egészséges kontrollszemély macula luteájának OCT felvétele (Hargitai

et al. 2005)

28

A 5. ábra egy szintén 25 éves, de STGD-beteg maculájának OCT képét mutatja.

Látható, hogy a foveoláris behúzottság kiszélesedett. A legjobb korrigált látóélesség

0,63, foveoláris vastagság 81 μm, macula térfogat 1,94 mm3.

5. ábra 25 éves STGD-beteg bal macula luteájának OCT felvétele (21. beteg) A zöld

nyíl a kiszélesedett foveoláris behúzottságra és az elvékonyodott neuroretinára mutat.

(Hargitai et al. 2005)

Egy 28 éves STGD-ában szenvedő beteg macula OCT lelete látható a 6. ábrán.

Az érintett szem látóélessége 0,25. A fovea területének elvékonyodása és a behúzottság

jelentős kiszélesedése ábrázolódik (zöld nyíl). A foveola vastagsága 49 μm, a macula

térfogata 1,83 mm3 .

6. ábra 28 éves STGD-beteg jobb macula luteájának OCT képe (18. beteg)


29

A 7. ábra egy 15 éves beteg OCT eredményét szemlélteti. A bemutatott szem

legjobb korrigált látóélessége 0,1. Az előző beteghez képest a fovea további

elvékonyodása és kimélyülése figyelhető meg (zöld nyíl). A foveola vastagsága 38 μm,

a macula térfogat 1,3 mm3.

7. ábra 15 éves STGD-beteg jobb macula luteájának OCT képe (28. beteg).


30

A betegcsoport vizsgálati eredményeit az II. táblázat foglalja össze.

Beteg Kor (év) Nem

Betegség fenállása

(év)Látóéleség (jobb szem)

Látóélesség (bal szem)

Fenotípus (Fischmann)

FT jobb szem (µm)

FT bal szem (µm)

MV jobb szem (mm3)

MV bal szem (mm3) Allél 1 Allél 2

1 18 M 10 0.42 0.50 I 90.00 76.00 1,7 1,67 ND ND2 27 F 15 0.06 0.08 III 43.00 58.00 1,27 1,28 L541P/A1038V ND3 29 F 8 0.17 0.17 II 54.00 20.00 1,38 1,35 5917delG 5917delG4 42 F 14 0.10 0.10 III 91.00 71.00 1,6 1,59 ND ND5 22 F 5 0.20 0.33 II 28.00 77.00 1,64 1,68 V2050L ND6 17 F 2 1.00 0.71 II 156.00 141.00 2,55 2,6 ND ND7 28 M 13 0.10 0.06 III 71.00 92.00 1,61 1,61 IVS40+5G>A ND8 37 M 15 0.10 0.10 II 87.00 97.00 1,95 1,95 L541P/A1038V G1961E9 32 M 7 0.08 0.08 II 51.00 32.00 1,59 1,66 106delT G1961E

10 55 F 17 0.25 0.56 I 160.00 170.00 1,72 1,82 ND ND11 15 F 3 0.25 0.33 II 67.00 68.00 1,78 1,76 L541P/A1038V G863A12 15 M 6 0.20 0.20 III 107.00 117.00 1,93 1,92 IVS40+5G>A 5917delG13 27 M 2 0.38 0.33 I 56.00 86.00 2,01 1,97 ND ND14 37 F 9 0.12 0.16 II 92.00 46.00 1,55 1,59 G1886E G1961E15 20 F 5 0.30 0.20 III 49.00 34.00 1,43 1,53 G1961E ND16 28 M 14 0.32 0.08 II 52.00 60.00 1,46 1,52 ND ND17 27 M 5 0.10 0.10 III 97.00 92.00 1,76 1,71 IVS40+5G>A 5917delG18 28 M 12 0.25 0.10 III 49.00 46.00 1,83 1,86 L541P/A1038V D1532N19 31 F 11 0.10 0.13 II 67.00 72.00 1,55 1,49 ND ND20 15 F 5 0.10 0.10 II 28.00 34.00 1,63 1,65 L541P L541P/A1038V21 25 F 2 0.20 0.62 II 94.00 81.00 1,92 1,94 L541P/A1038V G863A22 18 M 9 0.08 0.10 II 63.00 72.00 1,4 1,43 L541P/A1038V ND23 34 F 9 0.16 0.16 III 16.00 23.00 1,31 1,56 G1961E ND24 52 F 14 0.16 0.16 II 122.00 113.00 1,9 1,99 ND ND25 37 M 22 0.10 0.12 III 40.00 40.00 1,41 1,42 P68L L541P/A1038V26 18 F 11 0.20 0.25 II 59.00 72.00 1,42 1,47 ND ND27 24 F 7 0.18 0.18 II 83.00 100.00 1,72 1,77 L541P/A1038V G1961E28 15 M 7 0.10 0.16 III 38.00 46.00 1,3 1,41 IVS40+5G>A 5917delG29 31 M 14 0.10 0.10 II 41.00 44.00 1,95 1,96 R1108C R1108C30 28 M 6 0.33 0.56 II 91.00 129.00 1,98 2,04 G1961E ND31 28 F 11 0.08 0.10 II 55.00 63.00 1,52 1,59 ND ND32 32 M 15 0.20 0.20 II 92.00 86.00 1,8 1,75 L541P/A1038V G863A33 27 F 4 0.25 0.20 II 66.00 75.00 1,72 1,76 ND ND34 36 F 8 0.12 0.10 II 58.00 69.00 1,59 1,56 ND ND35 19 F 6 0.10 0.10 III 62.00 53.00 1,67 1,65 IVS40+5G>A IVS40+5G>A

II. táblázat F: nő; M: férfi; I,II, III: szemfenéki elváltozások értékelése Fischmann

beosztása szerint; FT: foveola vastagság; MV: macula térfogat;

ND: genetikai eltérést nem detektáltunk. (Hargitai 2005)

A legjobb korrigált látóélesség mind a foveoláris vastagsággal (8. ábra), mind a

macula térfogattal (9. ábra) szignifikáns összefüggést (p< 0,05) mutatott a

betegcsoportban (többszörös regresszió analízis). Az egyes fenotípus csoportokban a

fenti értékek között hasonló összefüggést nem tudtunk kimutatni.

31

8. ábra A legjobb korrigált látóélesség és a foveoláris vastagság kapcsolata a STGD

betegcsoportban. (Hargitai 2005)

9. ábra A legjobb korrigált látóélesség és a macula térfogat kapcsolata a STGD

betegcsoportban. (Hargitai 2005)

32

Hasonlóan szignifikáns eltérést találtunk a vizsgált betegcsoportban a betegség

fennállása és a legjobb korrigált látóélesség között (p=0,0019). A betegek életkora a

tünetek észlelésekor és a legjobb korrigált látóélesség között nem volt szignifikáns

összefüggés (p=0,884).

33


Egy egészséges kontroll személy szemfenéki képét mutatja a 10. ábra.

10. ábra. Egészséges felnőtt maculáinak SLO képei: jobb szem (A, B); bal szem (C, D)

kék fényben (A, C); infravörös megvilágításban (B, D). (Zhang X. et al. 2002)

A kék fénnyel készített SLO képen látható a fovea körül a koncentrikus szimmetriájú

sötét terület, amely az infravörös felvételen nem figyelhető meg. A kék fényben végzett

vizsgálat a fovea területét ábrázolja legsötétebben. A pigment fényelnyelésének

következtében látható sötétség progresszív módon csökken, minél magasabb

hullámhosszú vizsgálófényt használunk. A sötét területek az infravörös megvilágítás

esetén teljesen eltűnnek. Ezek alapján arra következtetünk, hogy ezt a koncentrikusan

elhelyezkedő sötét reflexet, amely legjobban kék fénnyel látható és az infravörös fény

számára áttetsző, túlnyomóan a maculapigment okozza. Ez a pigment indirekt

biomikroszkópiával a fehér megvilágítás mellett sárgának, míg kék megvilágítás mellett

sötét színűnek tűnik.

34

54 éves STGD-ás nőbeteg szemfenéki képét mutatjuk a 11. ábra.

11.ábra. 54 éves Stargardt-beteg (3. beteg) normál mennyiségű pigmentet tartalmazó

maculáinak SLO képei: jobb szem (A, B); bal szem (C, D); kék fényben (A, C);

infravörös megvilágításban (B, D). (Zhang X. et al. 2002)

A kék fénnyel végzett vizsgálat a jobb szemen az előbbiekben leírt normál viszonyokat

találta, azonban a bal foveola körül világos foltokat mutatott. Az infravörös fénnyel

történt vizsgálat mindkét szemen a fény nagyfokú elnyelődését mutatta, amely alapján a

retina pigmenthámjának károsodása volt valószínűsíthető. Ennek az elnyelődésnek a

maximuma a foveola körüli részekre esett, magát a foveolát nem érintette. Ezek alapján

feltételezhető, hogy ezen betegen a maculapigment mennyisége a foveolában normális

volt, amivel összhangban van a beteg látóélességének kisfokú csökkenése (Vod: 0,625;

Vosin: 0,5).

35

Egy 47 éves STGD-ás férfibeteg szemfenéki képét mutatja a 12. ábra.

12. ábra. 47 éves Stargardt-beteg (7. beteg) csökkent mennyiségű pigmentet tartalmazó



A kék fénnyel történt vizsgálat több eltérést is mutat: a fovea területében nagy világos

folt látható, amely a pigmenthám atrófiájának felel meg, míg paracentálisan sötét

pigment figyelhető meg.

Az infravörös ábrán a macula pigmenthámjának károsodása látható (sötét területek), de

a fovea paracentrális területében a sötét pigment nem látható, amely alapján arra

következtethetünk, hogy a kék fényben látott sötét pigment a macula normál

pigmenttartalmának felelt meg a fovea területében. A látóélesség a jobb szemen 0,4 a

bal szemen 0,5. Ebben az esetben a maculapigment mennyiségét csökkentnek ítéltük.

36

Egy 30 éves nőbeteg SLO eredményeit mutatja a 13. ábra.

13. ábra 30 éves Stargardt beteg (13. beteg) a maculapigment teljes hiányát mutató



A pigment hiánya mutatható ki kék megvilágításban. A fovea területében továbbra is

látható egy sötéten pigmentált rész, azonban ez hasonló képet ad az infravörös

megvilágítás mellett is. Ezek alapján valószínűsíthető, hogy ez a struktúra nem a

maculapigmentnek felel meg. Ebben az esetben a maculapigment teljes hiánya áll fenn,

a beteg látóélessége mindkét szemen 0,1.

37

Végül egy 29 éves nőbeteg maculái láthatóak a 14. ábrán.

14. ábra 29 éves Stargardt-beteg (12. beteg) a maculapigment teljes hiányát mutató



Mindkét szemen mind a kék fénnyel, mind az infravörös fénnyel történő vizsgálat

hasonlóan kifejezett eltéréseket mutat a fovea területében. A kék fény alkalmzásakor

egyik szemen sem volt megfigyelhető a maculapigmentre jellemző kép, ami annak teljes

hiányára utal.

38

A III. táblázat tartalmazza vizsgált betegcsoport eredményeit.

Beteg Kor (év) NemLátóélesség (jobb szem)

Látóélesség (bal szem)

Maculapigment (jobb szem)

Maculapigment (bal szem) Exon Allél 1 Exon Allél 2

1 33 N 0.67 0.38 + + ND ND2 36 N 1 0.5 + + ND ND3 54 N 0.625 0.5 + + G1961E G1061E4 11 F 0.8 1 + + NS NS5 33 N 0.67 0.4 +- + 20 V989A ND6 12 N 0.5 0.2 +- +- 30 C1490Y 40 GIVS+5A7 47 F 0.4 0.5 +- +- 17 G863A/R943Q R2077W8 53 F 0.1 1 +- +- 14 W663X ND9 29 N 0.1 0.1 +- +- 26 3819insT ND

10 43 F 0.005 0.005 - - 17 G863A/R943Q ND11 32 N 0.1 0.1 - - 19 N965S ND12 29 N 0.005 0.005 - - 23 R1129H ND13 30 N 0.1 0.1 - - 5 R152Q ND14 63 N 0.1 0.1 - - 42 G1961E ND15 36 F 0.07 0.1 - +- 13 Q636H G1961E16 41 N 0.005 0.005 - - 12 L514P/A1038V ND

4242

45

42 III. táblázat

N: nő; F: férfi; +: Normál mennyiségű pigment a foveában; +-: csökkent mennyiségű

pigment a foveában; -: a maculapigment teljes hiánya a foveában;

ND: eltérést nem detektáltunk; NS: vérminta nem állt rendelkezésre. (Zhang X. 2002)

A 15. ábra a 16 vizsgált Stargardt macula-dystrophiás beteg 32 szemének látóélességét

hasonlítja össze a fovea területében megfigyelhető maculapigment mennyiségével.

15. ábra

Stargardt-betegség: látóélesség, életkor, maculapigment. (Zhang X. et al. 2002)

39

Azokban a szemekben, amelyekben normál mennyiségű maculapigment igazolódott, a

látóélesség 0,5 vagy a fölött volt két szem kivételével. Azokban az esetekben, ahol a

maculapigment teljes hiánya volt megfigyelhető, a látóélesség 0,1 vagy annál rosszabb

volt. Csökkent mennyiségű maculapigment esetén a látóélesség a két előbbi csoport

között helyezkedett el két szem kivételével (8. beteg).

A látóélesség és a pigmenttartalom összefüggését vizsgálva a Chi-négyzet teszttel

szignifikáns kapcsolatot mutattunk ki (p<0.001).

5.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar STGD-ás betegcsoportban és annak


A betegség kialakulásához kapcsolt mutációt 23 betegen sikerült kimutatni (65,7%).

48,5 százalékban mindkét allél mutálódott, míg 17 százalékban csak az egyik allélban

találtunk eltérést. A leggyakrabban talált ABCA4 mutáció a magyar Stargardt-

betegcsoportban a L541P/A1038V komplex allél volt, amely az esetek 14,3

százalékában volt megfigyelhető (a vizsgált betegek 28%-ában fordult elő legalább az

egyik allél esetén a hiba). Egyéb gyakori eltérések közé tartozott a G1961E mutáció

(10%), az IVS40+5G→A „splice site variant” (10%) és az 5917del G nonszensz

mutáció (7%).

Több egymással rokoni kapcsolatban álló betegen az IVS40+5G→A és

5917delG compound heterozigóta mutáció volt kimutatható. Érdekessége ezeknek az

eseteknek, hogy jelentős részük roma származású volt. A fenti mutáció és néhány egyéb

allél magas előfordulási aránya valószínűsíti, hogy a mutáció közös felmenőtől

öröklődött.

Mind az öt betegen, akik vagy homozigóta vagy compound heterozigóta formában

hordozták az IVS40+5G→A mutációt, a szemfenéki kép alapján a Fischman III.

csoportba tartozott. Minden esetben kifejezett eltérések voltak a macula területében. A

látóélesség a teljes STGD betegcsoport átlagértékéhez képest rosszabb (0,12 vs. 0,21)

volt. Amennyiben ehhez a mutációhoz az 5917delG eltérés kapcsolódott, a fenotípus

eltérése sokkal kifejezettebb volt.

40

Az L541P/A1038V komplex allélt hordozó betegek fenotípusukat tekintve két

csoportba voltak sorolhatóak: 70% Fischman II. (7/10) és 30% Fischman III. (3/10). Ez

a mérsékelt fokú fenotípus eltérés, valószínűsíthetően a csökkent, de nem teljesen

kioltott ATP-áz aktivitásnak volt köszönhető (Sun et al. 2000). A három Fischman III.

fenotípusú betegen, ez a súlyosabb eltérés nem volt összefüggésbe hozható sem egy

társmutációval, sem a betegség korai kezdetével, vagy a betegség fennállásának

idejével. A tíz beteg közül a Fischman III. csoportba tartozó betegek látóélessége,

macula térfogata, foveoláris vastagsága kifejezettebben csökkent, mint a Fischman II.

csoportba tartózóké.

A L541P/A1038V és G863A compound heterozigóta genotípusú beteg alcsoportban a

betegség fennállása és a látóélesség csökkenése között összefüggés volt megfigyelhető.

A G1961E compound heterozygota betegek (n=7) a Fischman II. és Fischman

III. csoportba voltak sorolhatóak.

L541P/A1038V IVS40+5G→A G1961E 5917delG

Fischman I. 0 0 0 0

Fischman II. 7 0 5 1

Fischmann III. 3 5 2 3

IV. táblázat. A legyakrabban előforduló mutációk és a fenotípus (Fishman)

összefüggése.



5.4.1. In vitro transzdukció

A GFP fluoreszcencia a lentivírusnak a tápoldatba juttatását követően 36-60 órával volt

megfigyelhető. Amennyiben az alkalmazott vírus koncentráció 109 IU/ml volt, a

fluoreszkáló sejtek aránya elérte a száz százalékot. A fluoreszcencia erőssége nagy

41

különbségeket mutatott a sejtek között. Az 16.A ábra nyugalomban lévő

pigmenthámsejteket mutat a szövetdarab közepén fehér fénnyel megvilágítva. A 16.B

ábra ugyanezen sejtek fluoreszenciáját mutatja, ahol a sejtek nagy része expresszálja a

GFP fehérjét. Az 16.C ábra egy másodlagos sejtkultúrát mutat, amelyben a sejtek már

többszörös osztódáson mentek keresztül. A sejtek nagy része ebben az esetben is

fluoreszkál, és a fénymikroszkópos morfológia alapján a GFP fehérje termelése a

sejteket nem károsította. A pigmenthám tenyészeteket három hónapon keresztül fent

lehetett tartani, látható károsodás nélkül. Ez idő alatt a fluoreszcencia mértékében

változás nem volt megfigyelhető. Immunhisztokémiai vizsgálattal a GFP fehérje

jelenléte kimutatható volt.

16. ábra

A: az elsődleges humán fötális pigmenthám sejtkultúra fénymikroszkópos képe; B: az

elsődleges humán fötális pigmenthám sejtkultúra fluoreszcens mikroszkóppal vizsgálva,

transzdukciót követően; C: másodlagos pigmenthám sejtkultúra fluoreszcens

mikroszkópos képe. (Doi et al. 2002)

42

5.4.2. In vivo transzdukció

A lentivírus-vektornak a szubretinális térbe történő juttatását követően három napon

belül minden esetben megfigyelhető volt a GFP expresszálódása. Az 17.A ábran látható

a szubretinális injekció helye négy nappal az injekciót követően, amely a környező

retina területeknél nagyobb reflektivitású. Az injekció okozta ideghártya leválás széle

jól látható. Ugyanennek a területnek a zöld filterrel történő vizsgálata során nagyfokú

GFP fluoreszcencia figyelhető meg (17.B ábra). Az injekció beadása után két héttel a

vizsgált terület jelentősen megváltozott. A leválás helyén nagy pigmentrögök és atrófiás

területek váltják egymást, és a fluoreszcencia teljesen megszűnt. (17.C-D ábra)

17. ábra A nyúl-ideghártya kezelt részének SLO felvétele. A: kék fényben készült

felvételen a leválásnak megfelelő körülbelül 1,5 milliméteres terület látható négy nappal

az injekció adását követően; B: fluoreszcens módban láthatóak az önállóan fluoreszkáló

pigmenthám sejtek és sejtcsoportok négy nappal az injekció adását követően; C: a

pigmenthám károsodása látható kék fényben az injekciót követően 15 nappal; D: a

fluoreszcencia megszűnik az injekciót követően 15 nappal. (Doi et al.2002)

43

Az 18. ábra egy másik példát mutat a GFP fluoreszcencia megjelenésére, majd

eltűnésére.

18. ábra

A: kék fényben látható az ideghártya leválásának halvány határa öt nappal az injekció

beadását követően, a kép felső szélén láthatóak a myelinizált látóidegrostok; B: a

fluoreszcens üzemmódban különálló fluoreszkáló sejtek láthatóak; C: kék fényben

látható a pigmenthám torzulása 21 nappal az injekció beadását követően; D: a

fluoreszcencia megszűnt 21 nap után.

D/1: a nyúl ideghártyájának szövettani feldolgozása. A nyilak az egymásra rétegződött

pigmenthámsejteket mutatják, amelyek az in vivo SLO felvételeken sötét

pigmentrögökként jelennek meg. A két pigmentrög között csökkent pigmenttartalmú

terület az SLO képen a halvány területtel azonos. (Doi et al. 2002)

44

Öt nappal az injekció beadását követően az ideghártya-leválás szélét egy halvány vonal

jelzi, a retina szerkezete egyebekben épnek tűnik. Ebben az időpontban a

pigmenthámsejtek méretével azonos nagyságú fluoreszkáló pontok figyelhetőek meg.

Három héttel az injekció adását követően ugyanennek a területnek a kifejezett

károsodása figyelhető meg, párhuzamosan a fluoreszcencia eltűnésével.

Annak eldöntésére, hogy a vírus-vektor vagy a GFP fehérje felelős-e az ideghártya

károsodásáért, olyan, magas koncentrációjú lentivírus (109 IU/ml) oldatot juttattunk a

szubretinális térbe, amely nem tartalmazta a GFP gént. (19. ábra)

19. ábra

Két nyúl kék fényben készült SLO retina képei láthatóak 5 nappal (A, C) és 21 nappal

(B, D) a GFP gént nem tartalmazó lentivírus injekció adását követően. Pigmenthám

károsodás nem figyelhető meg. (Doi et al. 2002)

Ebben az esetben ideghártya károsodás nem volt megfigyelhető sem az SLO vizsgálat,

sem a későbbi szövettani feldolgozás során.

Abban az esetben, ha a vírusvektor expesszálódását a CMV promoter helyett a

rodopszin promoter irányította, csak gyenge fluoreszcencia alakult ki, azonban a

kilökődési reakció elmaradt.

45

Amikor az eredeti vírusvektort az üvegtesti térbe juttattuk, fluoreszcencia nem alakult

ki.

Az ideghártyák szövettani feldolgozása során a kilökődési reakciót követően az érintett

területeknek megfelelően monocyták beáramlása és a pigmenthám súlyos torzulása volt

megfigyelhető, amely immunrejekcióra jellemző.

A GFP fluoreszcencia mértékét az SLO kép alapján 3 csoportba osztottuk. Az 20.a ábra

a bejuttatott vírus koncentrációjának és a fluoreszcencia mértéknek, valamint az utóbbi

megjelenésének és megszűnésének összefüggését mutatja.

A legmagasabb koncentrációjú vírusoldatok (109 IU/ml) gyorsan megjelenő, kifejezett,

azonban három héten belül megszűnő fluoreszcenciát okoztak.

46

20. ábra (Doi et al. 2002)

Alacsonyabb koncentrációjú oldatok (107-108 IU/ml) esetén a fluoreszcencia mértéke

kisebb volt, ám a kilökődés is később jelentkezett. Két nyúlon a fluoreszkálás két

hónapon keresztül követhető volt.

Alacsonyabb koncentrációjú oldatok alkalmazásakor fluoreszcencia nem volt

megfigyelhető.

Hasonlóan vizsgáltuk az ideghártya károsodásának mértékét a víruskoncentráció

függvényében. (20.b ábra)

47

Magasabb koncentráció esetén a vizsgált retinaterület kifejezett károsodása volt

megfigyelhető. A legalacsonyabb koncentrációjú oldatok (106 IU/ml) nem okoztak

ideghártya károsodást.

5.5. A GFP fehérje által okozott immunválasz áthidalására alkalmas módszerek

vizsgálata

Az 21. ábrán a vizsgált ideghártya terület kék fényű és fluoreszcens módú vizsgálata

látszik az injekció adását követően különböző időpontokban.


48

14 nappal az injekciót követően a behatolás helye a látóidegrostok alatt látható halvány

foltként. (21.a)

A GFP fluoreszcencia a terület felső harmadában és az ideghártya leválás széli részein

figyelhető meg. (21.b)

17 nappal az injekciót követően a kezelt területnek megfelelően kifejezett ödéma

látható, és a fluoreszcencia megszűnik. (21.c-d)

20 nappal a műtét után a pigmenthám dezorganizációja látható, amely a kilökődés

karakterisztikus jele. A sötét foltok az egymásra rétegződő, migráló

pigmenthámsejteknek felelnek meg. (21.e-f)

Mind az öt nyúl esetében, ahol immunszuppressziót nem alkalmaztunk, hasonló kép

volt megfigyelhető két-három héttel az injekció adását követően.

Az immunszupresszióban részesült kísérleti nyúlak egyikén sem voltak

megfigyelhetőek a kilöködés jelei, és az EGFP gén folyamatos expresszálódása volt

kimutatható.

Az 22. ábrán az egyik ilyen immunszuppresszióban részesült nyúl kezelt retinája látható

a 32., 53., 60. és a 73. napon.

A kék fénnyel történt megvilágítás során közel normális morfológiájú ideghártya

figyelhető meg, míg a fluoreszcens képeken látható, hogy az expesszió a vizsgálat

végéig fennállt.

49


50

Az 23. ábrán egy másik immunszupprimált nyúl retinájának részlete látható

fluoreszcens üzemmódban egy (23.a), három (23.b), hat (23.c) és tizenkét (23.d)

hónappal az injekció után.


Jól látható, hogy a fluoreszcencia változatlan maradt a vizsgált időszakban. A

fluoreszkáló pontok nagysága hasonló, méretük megegyezik egy átlagos

pigmenthámsejt méretével, a fluoreszcencia erőssége a génexpresszió mértékével

arányos.

51

Az 24. ábrán a vizsgált immunszupprimált és ilyen kezelésben nem részesült nyulakon

megfigyelhető fluoreszcencia átlagos mértéke látható az idő függvényében.


A realtív GFP fluoreszcencia mértéke (üres gyűrű: immunszuppresszióban részesült

nyulak; tele gyűrű: immunszuppresszióban nem részesült nyulak).

Látható, hogy a nem immunszupprimált nyulakon az első két hétben erős fluoreszcencia

jelentkezik, amely ezt követően – a kilökődési reakcióval – párhuzamosan teljesen

megszűnik. Mind a négy nyúlon, melyek egy hónapon keresztül immunszuppresszív

kezelésben részesültek, több hónapon keresztül tartó nagy intenzitású fluoreszcencia

volt megfigyelhető.

Az egyik immunszupprimált nyúl két és fél hónappal az első vírusinjekciót követően

újabb injekciót kapott a másik szemébe, ezúttal az immunrendszer modulálása nélkül.

Az injekció után hasonlóan erős GFP expersszió volt megfigyelhető ezen a szemen is,

azonban két hét elteltével a fluoreszcencia megszűnt mindkét szemen, amelyet a már

ismertetett kilökődési reakció jelei kísértek.

52

Az 25. ábra a vérben kimutatható EGFP ellenanyag mennyiségét mutatja

immunszupprimált és nem immunszupprimált nyulakon.


ELISA módszerrel meghatározott GFP-antitest mennyisége a vérben az injekció adását

követően. Az üres gyűrűk mutatják a nem immunszupprimált nyúl antitest mennyiségét,

a nyíl a második injekció beadásának időponját. Két immunszupprimált nyúl vérében

talált antitest mennység alakulását mutatják a tele gyűrűk. Mindhárom nyúl a 0. napon

kapta az első szubretinális vírusinjekciót.

A kezelt nyulak vérében az ellenanyag nem volt kimutatható. A kezeletlen nyúlon az

ellenanyag az ötödik napon volt először kimutatható, majd mennyisége a tizenkettedik

napon tetőzött, amely időpontban a kilökődési reakció jelei megjelentek. A kilökődést

követően az ellenanyag mennyisége lecsökkent és csak a másik szembe beadott

vírusinjekció után emelkedett meg ismét.

A szemek szövettani feldolgozása során az előzőekben már leírt kilökődési reakció jelei

voltak láthatóak. Az immunszuprimált nyulakon hasonló elváltozások nem alakultak ki.

53

6. Megbeszélés

6.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt macula-dystrophiában

OCT segítségével

Tanulmányunkban a foveola vastagsága és a macula térfogata kivétel nélkül csökkent

minden STGD-ás betegen a kontrollokhoz viszonyítva. Ezek alapján elmondható, hogy

a szemfenéki képeket a retina elvékonyodása és térfogatának nagyfokú csökkenése

jellemzi. Vizsgálatainkkal párhuzamosan, hasonló eredményeket közöltek más

munkacsoportok is (Sodi et al. 2003; Ergun et al. 2005).

A látóélesség minden szemen nagyfokban csökkent a betegség fennállásától és az

életkortól függetlenül.

A látóélességet – mint a funkciót jelző szubjektív paramétert – összehasonlítottuk a

retina két morfológiai jellemzőjével, a foveoláris vastagsággal és a macula térfogattal

STGD-ában szenvedő betegeken.

Vizsgálataink alapján a betegek legjobb korrigált látóélessége és macula térfogata

között lineáris összefüggés volt kimutatható. Hasonló összefüggést találtunk a visus és a

foveoláris vastagság között.

STGD-ában a retina degeneráció alapvető következménye a lipofuszcin felhalmozódása

a retina pigmenthámjában (Holz et al. 2001). A lipofuszcin felhalmozódását eddigi

ismereteink szerint az ABCR transzportfehérje hibás vagy hiányos működése okozza,

amely a retinális zsírsavanyagcserében és/vagy a fotoreceptorok E-vitamin felvételében

játszik fontos szerepet. Ezek alapján a lipofuszcin lerakódását a pigmenthámban, majd a

betgség végstádiumában a látóélesség nagyokú csökkenésével járó macula atrófiát a

következő tényezők okozhatják:

1. felgyorsult fotoreceptor pusztulás,

2. a fotoreceptorok külső tagjának fokozott fagocitózisa,

3. olyan fotoreceptor részletek felhalmozódása, amelyeket a pigmenthám nem tud

lebontani,

4. a lebontó enzimek mennyiségének vagy funkciójának csökkent volta,

5. a pigmenthám működészavara, amely a lipofuszcin citoplazmából történő

kiválasztását nem teszi lehetővé.

54

A tünetek jelentkezésének ideje (életkor), a betegségtartam és a látásromlás között eddig

egyértelmű összefüggést nem sikerült kimutatni (Fischman et al. 1999). A progressziót

valószínűleg az határozza meg, hogy az ABCR gén mely régióját érintette a genetikai

hiba. Az eddig megismert mutációk közül, az N-terminális kódoló régióinak hibája

esetén figyelték meg a betegség gyorsabb kialakulását és súlyosabb progresszióját

(Lewis et al. 1999; Heckenlively et al.2001).

A macula térfogat csökkenése vizsgálataink alapján a látásvesztés mértékével mutatott

összefüggést. A fovea, és azon belül a foveola pusztulása – ahol a csapok sűrűsége jóval

nagyobb, mint a retina egyéb területein – jól magyarázza az általunk tapasztalt

látóélesség csökkenést. A foveola sejtjeinek pusztulásával a fixáció helye egyre inkább

a macula periférás részei felé tolódik, ahol a retina felépítése – a csapok sűrűségének

nagyfokú csökkenése – nem teszi lehetővé a finom, kontrasztos látást.

Betegeinkben közel hasonló macula térfogat esetén gyakran különböző látóélességet

találtunk. Ennek okai következők lehetnek:

1. a macula térfogatának csökkenése a fovea olyan centrális részét érintette, amely

az éleslátáshoz nagyobb részben járul hozzá;

2. az OCT-val mért térfogat nem minden esetben tartalmaz működő sejteket, de

ezeknek a sejteknek a térfogata többé-kevésbé még megegyezik az

egészségesekével.

A macula térfogat csökkenését az OCT vizsgálat szerint a retina diffúz, minden rétegére

kiterjedő pusztulása okozza. Eszerint minél nagyobb a térfogatveszteség, annál több

csap elvesztésével jár a betegség, így csökkentve a látóélességet.

A funduskép és a látóélesség között nem tudtunk szoros összefüggést kimutatni.

Néhány esetben kifejezetten atrófiás szemfenéki kép mellett jobb látóélességet találtunk,

mint enyhébb szemfenéki elváltozások esetén. Ezt a jelenséget azzal tudjuk magyarázni,

hogy ha a retinasorvadás fiatalabb életkorban alakult ki, a beteg még képes egy jobb

látóélességgel járó excentrikus fixáció megtanulására, de ha az elváltozások serdülőkor

után jelentkeznek, ez a mechanizmus már nem tud érvényesülni.

A Stargardt betegség a lassan progrediáló, az orvostudomány mai állása szerint a nem

gyógyítható öröklött macula-dystrophiák közé tartozik. Gyógyítására a jövőben a

genetikai információ átvitelén vagy a szövetátültetésen alapuló terápia látszik a

55

legvalószínűbbnek. Minden olyan új adat, amely a betegség progressziójára vonatkozik,

komoly segítséget nyújthat majd a terápiára alkalmas betegek kiválasztásában.


Vizsgálatunkban a maculapigment jelenlétének vagy hiányának kimutatására egy

kvalitatív módszert alkalmaztunk, az SLO két lézeres fényforrásának felhasználásával.

Ez a módszer más vizsgálók megfigyelése alapján is hatékonyabb eljárás a

maculapigment kimutatására, mint a reflexiós denzitometria (Berendschot et al. 2000).

Eredményeink arra utalnak, hogy a kék és az infravörös képek összehasonlításával

kaphatjuk a legpontosabb eredményeket. A maculapigment csak a kék fényt nyeli el

szinte teljesen. A kék és az infravörös fénnyel történő vizsgálatok eredményét

összehasonlítva következtethetünk a maculapigment jelenlétére, részleges jelenlétére

vagy teljes hiányára. A maculapigmentnek nemcsak a fényelnyelési tulajdonsága

egyedi, hanem a foveában megfigyelhető körkörös elhelyezkedése is. Ezért a pigment

mennyiségének megítélését nemcsak a kék fény elnyelésének mértéke, hanem a kapott

kép geometriája is segítette.

Normális mennyiségű maculapigmentnek azt tekintetük, ha kék fényben a fovea

közepén egy körkörös elhelyezkedésű sötét gyűrű volt megfigyelhető, amely az

infravörös fény számára áttetsző volt. Miután egyéb pigmentekre nem jellemző egy

ennyire egyedi elrendeződés, az álnegatív eredmény gyakorlatilag kizárhatóvá vált.

A maculapigmentet csökkent mennyiségűnek ítéltük, ha a pigment szimmetrikus

elrendeződése megváltozott, vagy a normál állapothoz hasonló reflektivitás mellett a

pigment körkörös elrendeződése hiányzott.

A maculapigment teljes hiányát azokban az esetekben állapítottuk meg, amelyekben a

kék fényben történő vizsgálattal nem volt kimutatható a sötét pigment, vagy a pigment

kimutatható volt, de hasonló képet kaptunk infravörös fényforrás használatakor is, és

emellett a leírt normál szimmetrikus elhelyezkedés is megbomlott. A

hiperpigmentációért valószínüleg a melanin jelenléte volt a felelős, amelyben az összes

vizsgált fény elnyelődik, az infravörös fényt is beleértve.

Ezek a pigmentált területek betegeinken is a Stargardt betegségben jellemző lipofuszcin

lerakódásnak felelhettek meg (Lois et al. 2001). Előfordulhatott olyan eset is, amelyben

még jelen volt a maculapigment, de azt az előzőekben ismertetett hiperpigmentció

elfedte.

56

Vizsgálataink alapján a látóélesség és a maculapigment mennyisége között szoros

összefüggés volt kimutatható. Amennyiben a látóélesség 0,1 vagy annál rosszabb volt,

minden esetben a maculapigment kifejezett csökkenését vagy teljes hiányát találtuk.

0,4-nél jobb látóélesség esetén a maculapigment jelenléte mindig kimutatható volt. Ezek

alapján arra következtethetünk, hogy a maculapigment mennyisége kapcsolatba hozható

a fovea csapjainak működésével. A maculapigment jelenléte a fovea normál

morfológiájának egyik jellemzője, utal a csapok jelenlétére és azok egészséges

működésére.

Érdekesnek tartjuk, hogy korai Stargardt betegségben, ahol kék fény mellett a

maculapigment eloszlása normális volt, az infravörös fény már kifejezett eltéréseket

mutatott.

Az infravörös fényt leginkább a retina pigmenthámja nyeli el, illetve veri vissza, a

neuroretina rétegein azonban kifejezett gyengülés nélkül halad át. A betegség korai

szakaszában a pigmenthámban figyelhetőek meg az első károsodások. Mivel a kék fény

jelentős része elnyelődik a neuroretina elemeiben, ilyen hullámhosszú fény

használatakor a pigmenthám szintjén bekövetkező változások rejtve maradhatnak.

Ugyancsak leírták, hogy az infravörös fény alkalmas lehet retina pigmenthám

károsodásainak kimutatásában (Manivannan et al. 1995; Elsner et al. 1996).

Ezek az eredmények értékesek lehetnek a betegség gyógyítási stratégiájában.

Amennyiben a csapok súlyosan károsodtak, vagy elpusztultak, csak a sejt- vagy

szövetátültetés illetve protézis beültetése segíthet a betegeken. Azokban az esetekben

ahol a csapsejtek működőképességét jelező maculapigment jelen van, szóba jöhet a

terápiás transzgén vektor segítségével történő bejuttatása. Így a genetikai hibát

csökkentve vagy megszüntetve szinten tartható vagy visszaállítható az éleslátás.

A maculapigment mennyiség és a csapfunkció (látóélesség) összehasonlításával a foveát

érintő más betegségek (időskori macula degeneráció, maculalyuk) esetén is értékes

adatokat nyerhetünk. A maculalyukak esetében, ahol a vitreoretinális trakció

megszűn(tet)ését a látóélesség javulása is kísérheti, ez kifejezetten fontos lehet.

Összefoglalva: Vizsgálatunkban a neuroretina és a pigmenthám progresszív károsodását

mutattuk ki Stargardt betegségben. Ez a károsodás a maculapigmentet tartalmazó

struktúrákat, a csapokat, a pálcikákat és a Müller sejteket érinti.

57

6.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar STGD-ás betegcsoportban, és annak


A betegség kialakulásához kapcsolt mutációt 23 betegen sikerült kimutatni (65,7%).

48,5 százalékban mindkét allél mutálódott, míg 17 százalékban csak az egyik allélban

találtunk eltérést.

Vizsgálataink alapján az alábbi következtetéseket vonhatjuk le:

1. Bár a G1961E mutációt hordozó betegek mind a Fischman II. és III. csoportba

tartoztak, a betegség progressziója – a maculatérfogat vesztése – ebben a

csoportban volt a leglassabb. Ezek alapján arra következtetünk, hogy a G1961E

mutációt hordozó STGD-ás betegek prognózisa az átlag betegcsoporthoz képest

jobb. Ezt a feltételezést két korábbi tanulmány is alátámasztja (Fischmann et al. ;

Gerth et al. 2002), amelyek leírták, hogy a G1961E mutáció nagyfokban

csökkenti az ATP-áz enzim aktivitását, de az még mindig közel azonos az

egészséges enzim működésével (Sun et al. 2000).

2. Azok a betegek, akik a L541P/A1038V komplex allélt hordozzák, a

betegcsoport átlagához hasonló, mérsékelt progressziót mutatnak. In vitro

vizsgálatokkal kimutatták, hogy ez a komplex allél az ATP-áz aktivitást

csökkenti, de nem oltja ki teljesen (Gerth et al. 2002). Az az alcsoport, amelyben

a betegek a L541P/A1038V komplex allél mellett a G863A allélt is hordozták,

jobb prognózisúnak bizonyult, mint a csoport átlaga. Ezt a hipotézist más

tanulmányok is megerősítették (Fischman et al. 1999; Sun et al. 2000).

3. A IVS 40+5G→A allélt heterozigóta formában hordozó betegek a teljes

betegcsoport átlagához képest rosszabb prognózist mutattak. Ez részben

ellentmond azoknak az eredményeknek, amelyek szerint ez a mutáció a

„splicing”-ot nem változtatja meg teljesen, és ezért részben működőképes

ABCA4 fehérje keletkezik (Klevering et al. 1999; Rivera et al. 2000). Más

tanulmányok, amelyek a betegség prognózisának meghatározására más

vizsgálatokat végeztek (multifokális ERG, fundus autofluoreszcencia) csak

részben támasztják alá következtetésünket (Klevering et al. 1999; Gerth et al.

2002). Ebbe az alcsoprtba nagyrészt magyar roma származású betegek

tartoztak. Esetükben az átlag betegcsoportéhoz képest gyorsabb maculatérfogat

58

pusztulást találtunk, mely egyéb - egyelőre ismeretlen tényezők mellett -

feltételezésünk szerint összefüggésbe hozható azzal az eredménnyel, hogy ebben

a csoportban gyakori előfordulást mutatott az IVS 40+5G→A – 5917delC

compound heterozigóta mutáció.

4. Az 5917delC variánst hordozó betegeken figyeltük meg a legrosszabb

prognózist. Ez a működésképtelen fehérje képződéséhez vezető „frameshift”

mutáció magyarázza azt is, hogy a mutációt homozigóta formában hordozó

betegek prognózisa rosszabb volt azokénál, akik egy másik allélel képzett

compound heterozigóta mutációt hordoztak.

A Fischman I. fenotípus csoportba tartozó betegek egyikén sem sikerült olyan

mutációt kimutatni, amely jelenlegi ismereteink szerint a betegség kialakulásához

vezet. Bár a betegek száma ebben a fenotípus csoportban meglehetősen alacsony

(n=3), más munkacsoportok nagyobb betegszámra vonatkozó eredményei is arra

utalnak, hogy a lassan progrediáló vagy késői életkorban jelentkező STGD esetén az

átlagnál ritkábban mutatható ki a betegséget okozó genetikai eltérést (Fischman et

al. 1999; Gerth et al. 2002). Amennyiben a téves diagnózis lehetőségét kizárjuk és

elfogadjuk, hogy a betegség kialakulásához az ABCA4 gén hibája vezet, akkor a

fenti esetek kialakulásáért a gén kódoló régióin kívül eső mutáció lehet felelős.

59



Az utóbbi évtizedben több kutatócsoportnak sikerült a GFP transzgént eredményesen

bejuttatni a retina különböző sejtjeibe, kilökődési reakció nélkül (Miyoshi et al. 1997;

Bennett et al. 1999; Takahashi et al. 1999; Auricchio et al. 2001; Surace et al. 2003).

Hasonló sikeres génterápiáról számoltak be mások is a LacZ nyomjelző gén

alklamazása esetén is (Galileo et al. 1999; Derksen et al. 2002; Lotery et al. 2002).

Kísérleteinkben lentivírus-vektor segítségével próbáltuk a GFP transzgént bejuttatni

humán pigmenthám tenyészetbe és nyulak retinájába. Azért választottuk ezeket a

célszöveteket, mert a Columbia Egyetem a humán pigmenthám kutatás területén

komoly tapasztalattal rendelkezik (Gouras et al. 1994) és a nyúl retinával addig még

nem történt hasonló kísérlet. Választásunkat még az a tény is befolyásolta, hogy a

pigmenthám allográf átültetéseinket kilökődési reakció követte, így a génterápia

módszerétől reméltük a pigmenthám öröklött betegségeinek jövőbeli gyógyítását.

Kísérleteinkben kimutattuk, hogy a lentvírus vektor képes a GFP gén sikeres

bejuttatására a retina pigmenthámsejtjeibe mind in vitro, mind in vivo körülmények

között. In vitro körülmények között stabil génexpressziót figyeltünk meg, amely a sejtek

osztódása után is hónapokon keresztül folyamatosan tartott. Ezek alapján

valószínűsíthető, hogy a gén kromoszómálisan integrálódik, ahogy azt más

munkacsoportok is kimutatták (Naldni et al. 1996 A). Bár a génexperesszió mértékében

– így a fluoreszcencia erősségében – a sejtek között különbség volt, de ugyanazon

sejtben a fluoreszcencia mértéke az idő során nem változott. Az osztódó sejtekben

ennek meghatározására nem volt lehetőségünk. Kísérleteinkben a lentivírus képes volt

az eredeti pigmenthám lemez sejtjeinek transzdukciójára. Mivel ezek a sejtek nyugalmi

állapotban vannak és az osztódásuk csak később indul el a lemez széleinél (Gouras et al.

1994), a vírusvektor alkalmas lehet más, nem osztódó (idegi eredetű) sejtekbe történő

génbevitelre is.

In vivo körülmények között szintén gyorsan kialakuló génátvitelt figyeltünk meg

a pigmenthámsejtekben. Ebben az esetben azonban a génexpresszió nem volt

folyamatos, hanem gyulladásos kilökődési reakció kíséretében néhány hét elteltével

megszűnt. A kilökődési reakció kizárólag a kezelt területre korlátozódott, és a gyulladás

60

elsősorban az érhártya és a pigmenthám szintjén volt kimutatható, az üvegtestben

gyulladás jeleit nem láthattuk. A szövettani vizsgálat limfociták beáramlását mutatta a

fenti területen, amelyhez a fotoreceptor réteg károsodása is társult. A kilökődési reakció

jól nyomonkövethető volt in vivo is; SLO szerint a leginkább karakterisztikus jel a

fluoreszcencia megszűnésén kívül a pigmenthám réteg torzulása, feltöredezése volt.

Eredményeinket más kutatócsoportok vizsgálatai is alátámasztják (Stripecke et al. 1999;

Gambotto et al. 2000).

A kilökődési reakció erőssége arányos volt a GFP gén expressziójának mértékével.

Alacsony koncentrációjú vírusoldat esetén, ahol fluoreszcencia nem vagy csak igen kis

mértékben volt megfigyelhető, gyulladásos reakció és következményes retinakárosodás

nem alakult ki. Amennyiben olyan vírusvektort juttattunk a szubretinális térbe, amely

nem tartalmazta a GFP génjét, kilökődési reakciót nem kaptunk. Ezek alapján arra a

következtetésre jutottunk, hogy nyulakon az immunreakciót a GFP fehérje termelődése

váltja ki. A reakció annak ellenére kialakult, hogy a szubretinális tér relatív

immunprivilegizált helyként ismert (Gregerson et al. 1999).

Egyértelmű bizonyítékot nem kaptunk arra a kérdésre, hogy a kilökődés sejtspecifikus-

e, és abban az esetben is kialakul-e, ha a génexpresszió a pigmenthámsejtek helyett

inkább a fotoreceptrokban történik. Immunreakció nem volt kimutatható azokban az

esetekben, amelyekben a vírusvektorunk a fotreceptorokba irányított integrációért

felelős rodopszin promotert tartalmazta. Kilökődési reakció akkor sem fordult elő,

amikor az injekciót a szubretinális tér helyett a neuroretina rétegei közé juttattuk be.

Ezekben a kísérletekben sokkal gyengébb génexpresszió volt kimutatható, mint amikor

a CMV promotert használtuk, és a fluoreszcencia a pigmenthámsejtekben volt

megfigyelhető.

A gyenge expressziót nem követte kilökődési reakció, amely alapján arra

következtetünk, hogy az állat immunrendszerének felismerőképességét az idegen

fehérje mennyisége határozza meg.

Eredményeink több helyen is különböznek más munkacsoportok eredményeitől, akik

hasonlóan, a GFP génjét hordozó vírusvektort juttatták be a szubretinális térbe.

Majmokon hosszantartó génexpessziót figyeltek meg a fotoreceptorokban

adenoszatellita vírusvektort használva (Bennett et al. 2000). Esetükben kilökődési

reakció nem volt megfigyelhető, bár a pigmenthámréteg atrófiáját kimutatták.

Kísérleteikben a génexpresszió szinte kizárólagosan a fotoeceptor rétegre korlátozódott,

míg saját vizsgálatunkban dominánsan a pigmenthámsejtekben volt megfigyelhető.

61

Ezek a különbségek részben a vizsgált faj, részben az alkalmazott vírusvektor miatt

alakulhattak ki. Több kutatócsoport is kimutatta, hogy a pigmenthám sejtek antigén

prezentáló sejtként is működnek (Silbert et al. 1994; Rezai et al. 1997; Dafgard Kopp et

al. 1997; Liverisidge et al. 1998), míg a fotoreceptoroknak ilyen tulajdonsága nincsKaplan

1995. Egy másik munkacsoport azt találta, hogy a lentivírus vektor, amely a LacZ

nyomjelző gént hordozza, képes legalább két hónapig fennálló expressziót kiváltani

egér pigmenthámsejtekben a kilökődési reakció jelei nélkül (Galileo et al. 1999). Ebben

az esetben azonban mind a vizsgált faj, mind a vizsgált nyomjelző fehérje különbözik a

saját kísérleteinkben használtaktól.

Takahashi és mtsai sikerrel végeztek kísérleteket a hibás gén bejuttatására lentivírus-

vektorral az rd egérben. Esetükben szintén nem alakult ki immunrejekció, de ebben a

kísérletben is a transzgén a fotoreceptorokban expreszálódott (Takahashi et al. 1999).

Ferrer és mtsai vizsgálataiban, Duchenne izomdystrophiában a kísérletes géntranszfer

immunreakciót váltott ki a dystrophin termelődésének megindulását követően. Ebben az

esetben azonban a transzgén termelődése nem egy immunprivilégizált területen történt

(Ferrer et al. 2000).

6.5. A GFP fehérje által okozott immunválasz kivédésére alkalmas módszerek

vizsgálata

Kimutattuk, hogy a GFP gén expressziója a nyúl pigmenthámsejtekben immun-

rejekciót vált ki, annak ellenére, hogy a retina immunprivilegizált helyként ismert

(Gregson et al. 2003). A GFP ellenes antitestek jelenléte, és kilökődési reakció idején

azok koncentrációjának tetőzése arra utalt, hogy a GFP fehérjét az immunrendszer

idegen fehérjeként ismerte fel. Az, hogy a GFP az egyedüli célpontja az

immunreakciónak, vagy más idegen fehérjék (pl. vírusfehérjék) is szerepet játszanak a

kilökődésben, jelenleg még nem tisztázott, habár a GFP transzgént nem tartalmazó vírus

nem váltott ki reakciót (Doi et al. 2000, 2001, 2002).

Auricchio és mtsai lentivírus-vektor szubretinális bejuttatása esetén humorális

immunválaszt, IgG2b és IgG1 antitestek megjelenését figyelték meg (Auricchio et al.

2001).

62

Immunszuppressziót alkalmazva megelőzhettük a GFP expresszió megszűnését

és a következményes szöveti károsodást, amelyek alapján arra következtethetünk, hogy

az immunrendszer felelős az előbbi változásokért. Eredményeink alapján

valószínűsíthető, hogy bármely idegen, a pigmenthámsejtekben expresszálódó fehérjét

az immunrendszer felismer, és kilökődési reakciót indít el. Azokban az esetekben,

amikor a génátvitelnek célsejtje a pigmenthám, az immunrendszer befolyásolása nélkül

csak átmeneti eredményekre számíthatunk. A kilökődési reakciót azonban

befolyásolhatja a kísérletben alkalmazott vírusvektor. Kimutatták, hogy adeno-

asszociált vírusvektort alkalmazva a GFP expresszió később kezdődik, mint lentivírus

esetében. Ez csökkenti az egy időben termelt idegen fehérje mennyiségét a felismerési

időszakban, így a kilökődés elkerülhető lehet.

Az immunszuppressziót egy hónapon keresztül alkalmazva sikerült elérnünk, hogy

kifejezett génexpresszió – és következményes fluoreszcencia – mellett sem jelentkeztek

a kilökődés jelei, és ez a kezelés abbahagyása után sem változott. Feltételezésünk

szerint, egy új idegen fehérje csak átmenetileg vált ki immunválaszt, és ha ezt a kritikus

időszakot sikerül áthidalni, kilökődési reakció már nem várható. Ennek a felismerési

periódusnak a kezdete vagy a szubretinális injekció beadásának időpontja, vagy a GFP

expresszió kezdete lehet.

Hasonló eredményeket találtak, akik limfocitás choriomeningitis vírussal fertőztek meg

egereket immunszuppresziót követően (Cole et al. 1972). Ebben az esetben

cyclophosphamide egyszeri adását követően az immunreakció által előidézett

agyszövetkárosodás kivédhető volt, míg azokon az egereken, amelyeken

immunszuppresszió nem történt, a vírusra jellemző súlyos agykárosodás alakult ki. Ez a

kísérlet is alátámasztja azt a feltevésünket, hogy létezik az előbb említett felismerési

periódus, amely alatt immunszuppressziót alkalmazva elkerülhetjük a kilökődést és a

szövetkárosodást. Ebben a rövid időszakban a szervezet védekező rendszere sokkal

„éberebben” működik.

A szubretinális injekció, amely a vírusvektor bejuttatásához szükséges, beindítja a

szervezet immunválaszát, de később, ahogy a beavatkozás hatásai csökkennek, úgy az

immunválasz is megszűnik. Az injekció adását kísérő enyhe gyulladásos reakció során

olyan sejtek jelennek meg az injekció helyének megfelelően, amelyek képesek az

antigén felismerésre. A pigmenthámsejteknek is ismert hasonló tulajdonsága, amely

akkor válik kifejezetté, ha a sejteket gyulladásos cytokinek aktiválják (Liversidge et al.

1992; Silbert et al. 1994; Rezai et al. 1997; Dafgard Kopp et al. 1997). A chorioideában

63

megtalálható dendritikus sejtek is képesek a szubretinális térbe történő áramlásra

valamely gyulladásos reakció következtében (Jiang et al. 1994). Ismert az is, hogy a

dendritikus sejtek képesek bejutni a központi idegrendszer más immunprivilegizált

helyeire is gyulladás esetén (Serafini et al. 2000). Az idő, amelyet ezek a sejtek a

gyulladás helyén töltenek, meghatározhatja a felismerési periódus hosszát.

A fentiek alapján a kísérleteink további pontosítást igényelnek annak érdekében, hogy a

felismerési periódus hosszát jobban meg tudjuk határozni, és el tudjuk dönteni azt, hogy

az általunk használt összes immunszuppressszív gyógyszer használata szükséges-e a

fenti időszak áthidalásához. Ezek alapján talán azt is el lehetne dönteni, hogy a

pigmenthám allograft beültetésnél észlelt kilökődési reakció kivédhető-e hasonló

immuszuppressziót alkalmazva (Ye et al. 1993; Jiang et al. 1994; Algvere et al. 1999).

Kísérleteinkben a génexpresszió kizárólag az injekció okozta ideghártya leválás helyére

korlátozódott. Más kutatók által vizsgált egereken (Takahashi et al. 1999) és

patkányokon (Miyoshi et al. 1997) lentivírus-vektort használva, az expresszió az egész

retina területén megfigyelhető volt, ami azt valószínűsíti, hogy a vírusrészecskék

szabadon áramoltak a szubretinális térben. Ezek a különbségek adódhatnak a fajok

anatómiai sajátosságaiból, az eltérő sebészi technika vagy az ideghártya leválásának

majd visszatapadásának különbözőségeiből. Ezeket a megfigyeléseket ajánlatos

megfontolni a génterápia tervezésekor, annak megfelelően, hogy egy adott faj

retinájának egészét, vagy csak meghatározott részét kívánjuk kezelni.

64

7. Új eredmények és klinikai jelentőségük

1.a Elsőként írtuk le, hogy az OCT vizsgálat alkalmas lehet a Stargardt-betegség

korai non-invazív diagnosztizálására és annak nyomonkövetésére.

1.b A morfológiai vizsgálatok paraméterei alapján a beteg látóélessége

megbecsülhető, amely főleg gyermekkorban nagyon hasznos.

2.a Megállapítottuk, hogy Stargardt macula-dystrophiában SLO vizsgálattal

kimutatható a maculapigment jelenléte vagy annak hiánya.

2.b A maculapigment a látóélesség meghatározó tényezője.

3. Magyarországon elsőként vizsgáltuk a STGD-ás betegek genetikai hátterét. A

betegek homogén genetikai spektruma alapján lehetőségünk nyílt az egyes

mutációs alcsoportok progressziójának pontosabb megítélésére és annak

előrejelzésére.

4. A világon az elsők között végeztünk sikeres géntranszfert lentivírus segítségével

a retina pigmenthámjába mind in vivo, mind in vitro körülmények között.

5. Bebizonyítottuk, hogy a GFP transzgén használatával végzett in vivo génterápia

eredményessége hosszú távon csak immunszuppresszió mellett várható.

65

8. Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondok mindazoknak, akik doktori értekezésem elkészítéséhez

lehetőséget és támogatást nyújtottak:

Prof. Bitó Lászlónak, aki nélkül a kutatás rögös útján nem tudtam volna elindulni.

Prof. Peter Gouras-nak, akinek megérkezésemkor az első mondata a következő volt:

„Science is fun. We had a couple of talented Hungarians here at Columbia. So have

fun.”

Prof. Rando Allikments-nek, akiben nemcsak jó kutatási igazgatóra, de jó barátra is

találtam.

Dr. Kentaro Doi-nak és Dr. Björn Ekesten-nek akiktől az alapkutatási módszereket

tanultam.

Professzoraimnak: Prof. Salacz Györgynek és Prof. Németh Jánosnak, hogy támogattak

kutatásaim és doktori disszertációm elkészítése során.

Témavezetőmnek Dr. Farkas Ágnesnek, hogy a vizsgált betegség klinikumába

bevezetett és tanácsokért bármikor fordulhattam hozzá.

Köszönöm a Klinika munkatársinak, hogy munkám során hasznos tanácsokkal láttak el.

Köszönöm a Doktori Iskola dolgozóinak segítőkészségüket.

Végül családomnak, hogy nagy türelemmel és folyamatos támogatással segítik

munkámat.

66

9. Irodalomjegyzék

Acland GM, Aguirre GD, Ray J, Zhang Q, Aleman TS, Cideciyan AV, Pearce-

Kelling SE, Anand V, Zeng Y, Maguire AM, Jacobson SG, Hauswirth WW,

Bennett J. Gene therapy restores vision in a canine model of childhood

blindness. Nat Genet. 2001 May;28(1):92-5.

Algvere PV, Gouras P, Dafgard Kopp E. Long-term outcome of RPE allografts

in non-immunosuppressed patients with AMD. Eur. J. Ophthalmol. 1999;9:217-

230.

Allikmets R, Singh N, Sun H, Shroyer NF, Hutchinson A, Chidambaram A,

Gerrard B, Baird L, Stauffer D, Peiffer A, Rattner A, Smallwood P, Li Y,

Anderson KL, Lewis RA, Nathans J, Leppert M, Dean M, Lupski JR.

A photoreceptor cell-specific ATP-binding transporter gene (ABCR) is mutated

in recessive Stargardt macular dystrophy. Nat Genet. 1997;15:236–246.

Allikmets R. Further evidence for an association of ABCR alleles with age-

related macular degeneration. Am J Hum Genet. 2000;67:487-491.

Allikmets R, Hutchinson A, Jaakson K, Kulm M, Pavel H. Genotyping

microarray (gene chip) for the ABCR (ABCA4) gene. Invest Ophthalmol Vis

Sci. 2001 42:S714

Association for Research in Vision and Ophthalmology. 2002. ARVO resolution

for the use of animals in research. Association for Research in Vision and

Ophthalmology, Rockville, Md. http://www.arvo.org/AboutArvo/animalst.asp.

67

Auricchio A, Kobinger G, Anand V, Hildinger M, O'Connor E, Maguire AM,

Wilson JM, Bennett J. Exchange of surface proteins impacts on viral vector

cellular specificity and transduction characteristics: the retina as a model. Hum.

Mol. Genet. 2001;10:3075-3081.

Azarian SM, Travis GH. The photoreceptor rim protein is an ABC transporter

encoded by the gene for recessive Stargardt’ disease (ABCR). FEBS Lett

1997;409:247-252.

Azzouz M, Kingsman SM, Mazarakis ND. Lentiviral vectors for treating and

modeling human CNS disorders. J. Gene Med. 2004;6:951–962.

Beatty S, Murray IJ, Henson DB, Carden D, Koh H, Boulton M. Macular

pigment and risk of age-related macular degeneration in subjects from northern

European population. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42:439-446.

Beharry S, Zhong M, Molday RS. N-retinylidene-phosphatidylethanolamine is

the preferred retinoid substrate for the photoreceptor-specific ABC transporter

ABCA4 (ABCR). J Biol Chem. 2004;279:53972–53979.

Bemelmans AP, Kostic C, Crippa SV, Hauswirth WW, Lem J, Munier FL,

Seeliger MW, Wenzel A, Arsenijevic Y. Lentiviral gene transfer of RPE65

rescues survival and function of cones in a mouse model of Leber congenital

amaurosis. PLoS Med. 2006;3(10):e347.

Bennett J, Maguire AM, Cideciyan AV, Schnell M, Glover E, Anand V, Aleman

TS, Chirmule N, Gupta AR, Huang Y, Gao GP, Nyberg WC, Tazelaar J, Hughes

J, Wilson JM, Jacobson SG. Stable transgene expression in rod photoreceptors

68

after recombinant adeno-associated virus-mediated gene transfer to monkey

retina. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000;96:9920-9925.

Berendschot TT, Goldbohm RA, Klopping WA, van de Kraats J, van Norel J,

van Norren D. Influence of lutein supplementation on macular pigment, assessed

with two objective techniques. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41:3322-3326.

Bernstein PS, Balahov NA, Tsong ED, Rando RR. Retinal tubulin binds macular

carotenoids. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997;38:167-175.

Bernstein PS, Yoshida MD, Katz N, McClane RW, Gellerman W. Raman

detection of macular carotenoid pigment sin intact human retina. Invest

Ophthalmol Vis Sci. 1998;39:2003-2011.

Bhosale P, Larson AJ, Fredrick JM, Southwick K, Thulin CD, Bernstein PS.

Identification and characterisation of a Pi isoform glutathionS-transferase

(GSTP1) as a zeaxanthin-binding protein in the maculaoh the human eye. J Biol

Chem. 2004;279:49447-49454.

Birch DG, Peters AZ, Locke KL, Megarity CF, Travis GH. Visual function in

pateints with cone-rod dystrophy (CRD) associated with ABCR mutations.

Vision Sci Appl. 2000;1:53-56.

Bone RA, Landrum JT, Tarsis SL. Preliminary identification of the human

macular pigment. Vision Res. 1985;25:1531-1535.

Bone RA, Landrum JT, Fernandez L, Trasis SL. Analysis of the macular

pigment by HPLC: retinal distribution and age study. Invest Ophthalmol Vis Sci.

1988;29:843-849.

Bone RA, Landrum JT, Hime GW, Cains A, Zamor J. Stereochemistry of the

human macular carotenoids. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993;34:2033-2040.

69

Bone RA, Landrum JT, FriedesLN. Distribution of lutein and zeaxanthin

stereoisomers in the human retina. Exp Eye Res. 1997;64:211-218

Boulton M. Aging of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res.

1991;11:121-151.

Boulton M, Dontsov A, Jarvis-Evans J, Ostrovsky M, Svistunenko D. Lipofuscin

is a photoinducable free radical generator. J Photochem photobiolB.

1993;19:201-204.

Broekmans WM, Berendschot TT, Klopping-Ketelaars IA. Macular pigment

density in relation to serum and adipose tissue concentrations of zeaxanthin. Am

J Clin Nutr. 2002;76:595-603.

Buzzi F. Nuove sperienze fatte sulli occhio umano. Opuscoli Scetti sulle Scienze

e Sulle Arti. 1782;5:78.

Cao H, Koehler DR, Hu J. Adenoviral vectors for gene replacement therapy.

Viral Immunol. 2004;17:327–333.

Chen C, Okayama H. High-efficiency transformation of mammalian cells by

plasmid DNA. Molecular and Cellular Biology 1987;7:2745-2752.

Cideciyan AV, Aleman TS, Swider M, Schwartz SB, Steinberg JD, Bruckner

AJ, Maguire AM, Bennet J, Stone EM, Jacobson SG. Mutations in ABCA4

result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a

reappraisal of the human disease sequence. Human Mol Genet. 2004;13:525–

534.

Cole GA, Nathanson N, Prendergast RA. Requirement for theta-bearing cells in

lymphocytic choriomeningitis virus-induced central nervous system disease.

Nature 1972;238:335-337.

70

Conn PF, Schalch W, Truscott TG. Singlet oxygen and carotenoid interaction. J.

Photochem Photobiol B. 1991;11:41-47.

Cremers FP, van de Pol DJ, van Driel M, den Holander AI, van Haren FJ,

Knoers NV, Tijmes N, Bergen AA, Rohrschneider K, Blankeagel A, Pinckers

AJ, Deutman AF, Hoyng CB. Autosomal recessive retinitis pigmentosa and

cone-rod dystrophy caused by splice site mutation in the Stargardt’s disease gene

ABCR. Hum Mol Genet 1998;7:355-362.

Curcio CA, Millician CL, Allen KA, Kalina RE. Aging of the human

photoreceptor mosaic: evidence for selective vulnerability of rods in central

retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993;34:3278-3296.

Dafgard Kopp E, Winter-Vernersson AM, Algvere P. Expression of HLA Class

I and Class II antigens by human fetal RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci.

(1997) 38(4) S947. abstract no. 3395.

Derksen TA, Sauter SL, Davidson BL. Feline immunodeficiency virus vectors.

Gene transfer to mouse retina following intravitreal injection. J. Gene Med.

2002;4:463-469.

De La Paz M, Anderson RE. Region and age-dependent variation in

susceptibility of the homan retina to lipid peroxidation. Invest Ophthalmol Vis

Sci.199;33:3497-3499.

DeVries HL, Spoor A, Renske J. Properties of the eye with respect to polarized

light. Physica 1953; 19:419-432.

Doi K, Gouras P, Kong J. Lentiviral mediated gene transfer of subetinal space:

the importance of viral dosage. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;41(4), S396,

abstract no. 2090.

71

Doi K., Kong. J. Hargitai J. Lentiviral transtuction of retinal pigment epithelium

with green fluorescent protein. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001;42(4), S349,

abstract no. 1887.

Doi K, Hargitai J, Kong J, Tsang SH, Wheatley M, Chang S, Goff S, Gouras P.

Lentiviral transduction of green fluorescent protein in retinal epithelium:

evidence of rejection. Vision Res. 2002;42:551-558.

Doi K, Kong J, Hargitai J, Goff SP, Gouras P. Transient immunosuppression

stops rejection of viral transduced EGFP in rabbit retina. J Virology.

2004;78(20):11327-33.

Duan D, Yue Y, Yan Z, Engelhardt JF. A new dual-vector approach to enhance

recombinant adeno-associated virus-mediated gene expression through

intermolecular cis activation. Nat Med. 2000;6:595–598.

Dull T, Zufferey R, Kelly M. A third-generation lentivirus vector with a

conditional packaging system. J Virol. 1998;72:8463–8471.

During MJ, Kaplitt MG, Stern MB, Eidelberg D. Subthalamic GAD gene

transfer in Parkinson disease patients who are candidates for deep brain

stimulation. Hum Gene Ther. 2001;12:1589–1591.

Elsner AE, Burns SA, Weiter JJ, Delori FC. Infrared imaging of sub-retinal

structures in the human ocular fundus. Vision Res 1996;36:191-205.

Erdman JW Jr., Bierer TL, Gigger ET. Absorption and transport of carotenoids.

NY Acad Sci. 1993;691:76-85.

Ergun E, Hermann B, Wirtitsch M. Assessment of central visual function in

Stargardt’s disease/fundus flavimaculatus with ultrahigh-resolution optical

coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:310–316.

72

Eye Disease Case-Control Study Group. Risk factors in neovascular age-related

macular degeneration. Arch ophthalmol. 1992;110:1701-1708.

Ezra E, Fariss RN, Aylawaard WG, Gregor ZJ, Luthert PJ, Milam AH.

Immunocytochemical characterization of macular hole opercula. Arch

Ophthalmol 2001;119:223-231.

Ferrer A, Wells KE, Wells DJ. Immune responses to dystrophin: imlications for

gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Gene therapy 2000;7:1439-1446.

Fishman GA, Farbman JS, Alexander KR. Delayed rod dark adaptation in

patients with Stargardt’s disease. Ophthalmology 1991; 98:957-962.

Fishman GA, Stone EM, Grover S, Derlacki DJ, Haines HL, Hockey RR.

Variation of clinical expression in patients with Stargardt dystrophy and

sequence variations in the ABCR gene. Arch Ophthalmol. 1999;117:504–510.

Fonda G, Gardner LR. Characteristics and low vision corrections in Stargardt's

disease. Educational and vocational achievements enhanced by low vision

corrections. Ophthalmology. 1985 Aug;92(8):1084-91.

Fukui T, Yamamoto S, Nakano K, Tsujikawa M, Morimura H, Nishida K,

Ohguro N, Fujikado T, Irifune M, Kuniyoshi K, Okada AA, Hirakata A, Miyake

Y, Tano Y. ABCA4 gene mutations in Japanese patients with Stargardt disease

and retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002;43:2819–2824.

Gale CRHall NF, Phillips DI, Martyn CN. Lutein and zeaxanthin staus and risk

of age-related macular degeneration. Invest Ophtalmol Vis Sci. 2003;2461-2465.

Galileo DS, Hunter K, Smith SB. Stable and eficient gene transfer into the

muant retinal pigment epithelial cells of the Mitfvit mouse using a lentiviral

vector. Cur Eye Res. 1999;18, 135-142.

73

Gambotto A, Dworacki G, Cicinnati V, Kenniston T, Steitz J, Tuting T,

Robbins PD, DeLeo AB. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein

(EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.

Gene Ther. 2000;7:2036-2040.

Gass JDM. Muller cell cone, and overlooked part of the anatomy of the fovea

centralis. Arch Ophthalmol. 1999;117:821-823.

Gass JDM, Van Newkirk J. Xanthic scotoma and yellow foveolar shadow

caused by pseudo-operculum after vitreoretinal separation. Retina 1992;12:242-

244.

Gerth C, Andrassi-Darida M, Bock M, Preising MN, Weber BH, Lorenz B.

Phenotypes of 16 Stargardt macular dystrophy/fundus flavimaculatus patients

with known ABCA4 mutations and evaluation of genotype-phenotype

correlation. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2002;240:628–638.

Glorioso JC, Fink DJ. Herpes vector-mediated gene transfer in treatment of

diseases of the nervous system. Annu Rev Microbiol. 2004;58:253–271.

GoodwinTW. The biochemistry of the Carotenoids. Chapman and Hall 1980

Gouras P, Cao H, Sheng Y, Tanabe T, Efremova Y, Kjeldbye H. Patch culturing

and transfer of human fetal retinal epithelium. Graefes Arch Clin Exp

Ophthalmol. 1994; 232, 599-607.

Gregerson DS, Torseth JW, McPherson SW, Roberts JP, Shinohara T, Zack DJ.

Retinal expression of neo-self antigen, β-galactosidase is not tolerogenic and

74

creates a targe for autoimune-uveoretinitis. Journal of Immunlogy 1999;163,

1073-1080.

Gregerson, DS, Yang J. CD45-positive cells of the retina and their

responsiveness to in vivo and in vitro treatment with IFN-gamma or anti-CD40.

Invest Ophthalmol. Vis Sci. 2003;44:3083-3093.

Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M. LMO2-associated clonal T cell

proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science

2003;302:415–419.

Hammond BR jr., Johnson EJ, Russel RM. Dietary modification of human

macular pigment density. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997;38:1795-1801.

Hammond BR Jr., Curran-Celentano J, Judd S. Sex differences in macular

pigment optical density: relation to plasma carotenoid concentrations and dietary

patterns. Vision Res. 1996;36:2001-2012.(A)

Hammond Br Jr. Fuld K, Snodderly DM. Iris color and macular pigment optical

density. Exp eye Res. 1996;62:293-297. (B)

Hammond BR Jr., Wooten BR, Snodderly DM. Preservation of visual sensitivity

of older subjects: association with macular pigment density. Invest Ohthalmol

Vis Sci. 1998;39:397-406.

Hammond BR Jr., Carauso-Avery M. Macular pigment optical density in

southwestern sample. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;41:1492-1497.

Hargitai J, Zernant J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Salacz G, Allikmets R.

ABCR Mutations and Clinical Phenotype in Hungarian Patients with Stargardt

Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:4402-4408.

75

Heckenlively JR, Jacobson SG, Weleber RG, Sheffield VC, Stone EM. An

analysis of allelic variation in the ABCA4 gene. Invest Ophthalmol Vis Sci.

2001;42:1179–1189.

Hee MR, Izatt JA, Swanson EA, Huang D, Schuman JS, Lin CP, Puliafito CA,

Fujimoto JG. Optical coherence tomography of the human retina. Arch

Ophthalmol. 1995;113:325–332.

Helmholtz H. Handbuch der physiologischen Optik. Berlin 1924; vol.2 p.304.

Holz FG. Autoflourescence imagging of the macula. Ophthalmologe

2001;98:10-18.

Howarth PA, Bradley LA. Longitudinal chromatic aberration of the human eye

and its correction. Vis res. 1986; 26:361-366.

Huang D, Swanson EA, Lin CP, Schuman JS, Stinson WG, Chang W, Hee MR,

Flotte T, Gregory K, Puliafito CA. Optical coherence tomography. Science.

1991;254:1178–1181.

Jaakson K, Zernant J, Külm M, Hutchinson A, Tonisson N, Glavac D, Ravnik-

Glavac M, Hawlina M, Meltzer MR, Caruso RC, Testa F, Maugeri A, Hoyng

CB, Gouras P, Simonelli F, Lewis RA, Lupski JR, Cremers FP, Allikmets R.

Genotyping microarray (gene chip) for the ABCR (ABCA4) gene. Hum Mutat.

2003;22:395–403.

Jaffe GJ, Caprioli J. Optical coherence tomography to detect and manage retinal

disease and glaucoma. Am J Ophthalmol. 2004;137:156–169.

76

Jiang, HR, Lumsden L, Forrester JV. Macrophages and dendritic cells in IRBP-

induced experimental autoimmune uveoretinitis in B10RIII mice. Investi

Ophthalmol. Vis. Sci. 1994;40:3177-3185.

Jiang, LQ, Jorquera M, Streilein JW. Immunologic consequences of intraocular

implantation of retinal pigment epithelial allografts. Exp Eye Res. 1994;58:719-

728.

Johnson EJ, Hammond BR, Russel RM. Relation among serum and tissue

concentrations of lutein and zeaxanthin in macular pigment density. Am J Clin

Nutr. 2000;71:1555-1562.

Kaplan HJ, Yu XH, Zhang H.: Antigen specific CTL fail to recognize neoretinal

antigen in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995;36(4), S201, abstract no. 930.

Kaplan J, Gerber S, Larget-Piet D, Rozet JM, Dollfus H, Dufier JL, Odent S,

Postel-Vinay A, Janin N, Briard ML. A gene for Stargardt’s disease (fundus

flavimaculatus) maps to the short arm of chromosome 1. Nat Genet.

1993;5:308–311.

Kaplitt MG, Leone P, Samulski RJ. Long-term gene expression and phenotypic

correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat

Genet. 1994;8:148–154.

Kaspar BK, Llado J, Sherkat N, Rothstein JD, Gage FH. Retrograde viral

delivery of IGF-1 prolongs survival in a mouse ALS model. Science

2003;301:839–842.

Kells AP, Fong DM, Dragunow M, During MJ, Young D, Connor B. AAV-

mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of

Huntington disease. Mol Ther. 2004;9:682–688.

77

Khachik F, Spangler CJ, Smith JC Jr., Canfield LM, Steck A, Pfandler H.

Identification, quantification, and relative concentration of carotenoids and their

metabolitesin the himan milk and serum. Anal Chem. 1997;69:1873-1881.

Kim VN, Mitrophanous K, Kingsman SM, Kingsman AJ. Minimal requirement

for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1. J Virol.

1998;72:811–816.

Kirik D, Georgievska B, Bjorklund A. Localized striatal delivery of GDNF as a

treatment for Parkinson disease. Nat Neurosci. 2004;7:105–110.

Klevering BJ, van Driel M, van de Pol DJ, Pinckers AJ, Cremers FP, Hoyng CB.

Phenotypic variations in a family with retinal dystrophy as result of different

mutations in the ABCR gene. Br J Ophthalmol. 1999;83:914–918.

Kochanek S, Schiedner G, Volpers C. High-capacity ‘gutless’ adenoviral

vectors. Curr Opin Mol Ther. 2001; 3:454–463.

Koh HH, Murray IJ, Nolan D, Carden D, Feather J, Beatty S. Plasma and

macular responses to lutein supplementation in subjects with and without age-

related maculopathy: a pilot study. Exp Eye res. 2004;79:21-27.

Kong J, Kim SR, Binley K, Doi K, Naylor S, Sparrow JR, Gouras P, Allikmets

R. Efficient Delivery of Genes Into Photoreceptors by Lentiviral Vectors:

Application for Treatment of Stargardt Disease ARVO 2007; abs.1679/B495.

Kurg A, Tonisson N, Georgiou I, Shumaker J, Tollett J, Metspalu A. Arrayed

primer extension: solid-phase four-color DNA resequencing and mutation

detection technology. Genet Test. 2000;4:1–7.

78

Lehrman S. Virus treatment questioned after gene therapy death. Nature

1999;401:517–518.

Leibler DC, Stratton SP, Kaysen KL. Antioxidant action of β-carotene in

liposomal and microsomal membranes: role of carotenoid-membrane

incorporation and α-tocopherol. Arch Biochem Biophys. 1997; 338:244-250.

Lever AM, Strappe PM, Zhao J. Lentiviral vectors. J Biomed Sci. 2004;11:439–

449.

Lewis RA, Shroyer NF, Singh N, Allikmets R, Hutchinson A, Li Y, Lupski JR,

Leppert M, Dean M. Genotype/phenotype analysis of a photoreceptor-specific

ATP-binding cassette transporter gene, ABCR, in Stargardt disease. Am J Hum

Genet. 1999;64:422–434.

Liversidge J, Forrester JV. Antigen processing and presentation in the eye: a

review. Curr. Eye Res. 1992;11(Suppl.):49-58.

Liversidge JM, Forrester JV. Regulation of immune responses by retinal

pigment epithelium. in Marmor M.F., Wolfensberger T.J. (szerk.) The retinal

pigment epithelium. Oxford University Press, New York, Oxford, 1992: 511-

527.

Lois N, Holder GE, Bunce C, Fitzke FW, Bird AC. Phenotypic subtypes of

Stargardt macular dystrophy-fundus flavimaculatus. Arch Ophthalmol

2001;119:359-369.

Lotery AJ, Derksen TA, Russell SR, Mullins RF, Sauter S, Affatigato LM, Stone

E M, Davidson BL. Gene transfer to the nonhuman primate retina with

79

recombinant feline immunodeficiency virus vectors. Hum Gene Ther.

2002;13:689-696.

Lu Y. Recombinant adeno-associated virus as delivery vector for gene therapy: a

review. Stem Cells Dev. 2004;13:133–145.

Luo J, Kaplitt MG, Fitzsimons HL. Subthalamic GAD gene therapy in a

Parkinson's disease rat model. Science 2002;298:425–429.

Manivannan A, Kirkpatrick JNP, Forrester JV. Clinical investigation of an

infrared digital scanning laser ophthalmoscope. Br J Ophthalmol 1994;78:84-90.

Marr RA, Rockenstein E, Mukherjee A. Neprilysin gene transfer reduces human

amyloid pathology in transgenic mice. J Neurosci. 2003;23:1992–1996.

Markham R. Retinal disease and dystrophies. In: Easty DL, Sparrow JM. (szer.)

Oxford Textbook of Ophthalmology. Oxford University Press, Oxford

1999;1055–1070.

Martinez-Mir A, Paloma E, Allikmets R, Ayuso C, del Rio T, Dean M, Vilageliu

L, Gonzalez-Duarte R, Balcells S. Retinitis pigmentosa caused by a homozygous

mutation int he Stargardt disease gene ABCR. Nat Genet 1998;18:11-12.

Martin-Rendon E, Azzouz M, Mazarakis ND. Lentiviral vectors for the

treatment of neurodegenerative diseases. Curr Opin Mol Ther. 2001;3:476–481.

Mata NL, Weng J, Travis GH,. Biosynthesis of a major lipofuscin fluorophore in

mice and humans with ABCR-mediated retinal and macular degeneration. Proc

Natl Acad Sci USA. 2000;97:7154–7159.

Mata NL, Tzekov RT, Liu XR, Weng J, Birch DG, Travis GH. Delayed dark-

adaptation and lipofuscin accumulation in abcr+/– mice: implications for

80

involvement of ABCR in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol

Vis Sci. 2001;42:1685–1690.

Maugeri A, Klevering BJ, Rohrschneider K, Blankenagel A, Brunner HG,

Deutman AF, Hoyng CB, Cremers FP. Mutations in the ABCA4 (ABCR) gene

are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy. Am J Hum

Genet. 2000;67:960-966.

McKelvey T, Tang A, Bett AJ, Casimiro DR, Chastain M. T-cell response to

adenovirus hexon and DNA-binding protein in mice. Gene Ther. 2004;11:791–

796.

Miyoshi H, Takahashi M, Gage FH, Verma IM. Stable and efficient gene

transfer into the retina using an HIV-based lentiviral vector. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 1997; 94:10319-10323.

Müller H. Dies tagliche Aufnahme von Carotinoiden (Carotin und

Xanthophylle) aus Gesamtnahrungsproben und die Carotinoidgehalte

ausgewahlter Gemuse- und Obstarten. Z Ernahrungswiss 1996;35:45-50.

Nakai H, Storm TA, Kay MA. Increasing the size of rAAV-mediated expression

cassettes in vivo by intermolecular joining of two complementary vectors. Nat.

Biotechnol. 2000;18:527–532.

Nakai H, Montini E, Fuess S, Storm TA, Grompe M, Kay MA. AAV serotype 2

vectors preferentially integrate into active genes in mice. Nat Genet.

2003;34:297–302.

Naldini L, Blömer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono

D. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a

lentiviral vector. Science 1996;272: 263-267. (A)

81

Naldini, L, Blömer U, Gage FH, Trono D, Verma IM. Efficient transfer,

integration, and sustained long-term expression of the trangene in adult rat

brains injected with lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

1996;93:11382-11388. (B)

Naylor EJ, Stanworth A. Retinal pigment and the Haidinger effect. J Physiol

(London) 1954;124:543-552.

Németh J, Papp A, Mardin CY, Gründler AE, Jonas JB. Fotografikus és

konfokális scanning lézer módszerrel mért látóidegfőméretek összehasonlító

vizsgálata. Szemészet 1999;136:73-77.

Papaioannou M, Ocaka L, Bessant D, Lois N, Bird A, Payne A, Bhattacharya S.

An analysis of ABCR mutations in British patients with recessive retinal

dystrophies. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;41:16–19.

Papermaster DS, Schneider BG, Zorn M, Kraehenbuhl JP. Immuncytochemical

localization of a large intrinsic membrane protein to the incisures and margins of

frog rod outer segment discks. J Cell Biol. 1978;78:415-425.

Pluta K, Luce MJ, Bao L, Agha-Mohammadi S, Reiser J. Tight control of

transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation

tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 2005;7:803–817.

Post DE, Fulci G, Chiocca EA, Van Meir EG. Replicative oncolytic herpes

simplex viruses in combination cancer therapies. Curr Gene Ther. 2004;4:41–51.

82

Poeschla EM, Wong-Staal F, Looney DJ. Efficient transduction of nondividing

human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors. Nat Med.

1998;4:354–357.

Radu RA, Mata, NL, Nusinowitz S, Liu X, Sieving PA, Travis H. Treatment

with isoretinoin inhibits lipofuscin accumulation in a mouse model of recessive

Stargardt’s macular degeneration. Proc Nat Acad Sci. 2003;100:4742-4747.

Ralph GS, Binley K, Wong LF, Azzouz M, Mazarakis ND. Gene therapy for

neurodegenerative and ocular diseases using letiviral vectors. Clin Sci.

2006;110:37-46.

Rapp LM, Maple SS, Choi JH. Lutein and Zeaxanthin concentrations in rod

outer segment membranes from perifoveal and peripheral retina. Invest

Ophthalmol Vis Sci 2000;41:1200-1209.

Rattner A, Sun H, Nathans J. Molecular genetics of human retinal disease.

Annual Review of Genetics 1999; 33:89-131.

Relph K, Harrington K, Pandha H. Recent developments and current status of

gene therapy using viral vectors in the United Kingdom. Br Med J.

2004;329:839–842.

Rezai KA, Semnani RT, Patel SC, Ernest JT, van Seventer GA. The

immunogenic potential of human fetal retinal pigment epithelium and its relation

to transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997;38:2662-2671.

Rivera A, White K, Stöhr H, Steiner K, Hemmrich N, Grimm T, Jurklies B,

Lorenz B, Scholl HP, Apfelstedt-Sylla E, Weber BH. A comprehensive survey

83

of sequence variation in the ABCA4 (ABCR) gene in Stargardt disease and age-

related macular degeneration. Am J Hum Genet. 2000;67:800–813.

Rohll JB, Mitrophanous KA, Martin-Rendon E. Design, production, safety,

evaluation and clinical applications of nonprimate lentiviral vectors. Methods

Enzymol. 2002;346:466–500.

Rotenstreich Y, Fishman GA, Anderson RJ. Visual acuity loss and clinical

observations in a large series of patients with Stargardt disease. Ophthalmology

2003;110:1151–1158.

Sakhuja K, Reddy PS, Ganesh S. Optimization of the generation and

propagation of gutless adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 2003;14:243–254.

Schagen FH, Ossevoort M, Toes RE, Hoeben RC. Immune responses against

adenoviral vectors and their transgene products: a review of strategies for

evasion. Crit Rev Oncol Hematol. 2004;50:51–70.

Sedon JM, Ajani UA, Sperduto R. Eye Disease Case-Control Study Group.

Dietary Carotenoids, vitamins A, C and E, and advanced age-related macular

degeneration. JAMA; 1994;272:1413-1420.

Segal J. Localization du pigment maculaire de la retine. Soc Biol (Paris)

1950;144:1630-1634.

Serafini B, Columba-Cabezas S, Di Rosa F, Aloisi F. Intracerebral recruitment

and maturation of dendritic cells in the onset and progression of experimental

autoimmune encephalomyelitis. Am J Pathol. 2000;157:1991-2002.

84

Seres A, Seres T, Németh J, Süveges I.: Papillatopográfiai vizsgálatok scanning

lézer ophthalmoscop segítségével. Szemészet 1999;136: 37-40.

Silbert JE, Gao EK, Yu XH és mtsai.: Adult murine retinal pigment epthelium is

immunogenic. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1994;35(4), 1524, abstract no. 1261.

Simonelli F, Testa F, de Crecchio G, Rinaldi E, Hutchinson A, Atkinson A,

Dean M, D'Urso M, Allikmets R. New ABCR mutations and clinical phenotype

in Italian patients with Stargardt disease. Invest Ophthalmol Vis Sci.

2000;41:892–897.

Smith AJ, Schlichtenbrede FC, Tschernutter M, Bainbridge JW, Thrasher AJ,

Ali RR. AAV-Mediated gene transfer slows photoreceptor loss in the RCS rat

model of retinitis pigmentosa. Mol Ther. 2003;8(2):188-95.

Snellen EL, Verbeek AL, Van Den Hoogen GW, Cruysberg JR, Hoyng CN.

Neovascular age-related macular degeneration and its relationship to antioxidant

intake. Acta Ophthalmol Scand. 2002;80:368-371.

Snodderly DM, Brown PK, Delori FC, Auran JD. The macular pigment. I.

Absorbance spectra, localization and discrimination from other yellow pigments

in primate retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1984;25:660-673.(A)

Snodderly DM, Auran JD, Delori FC. The macular pigment. II. Spatial

distribution in primate retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1984;25:674-675. (B)

Snoderly DM, Mare JA, Wooten BR, Oxton L, Gruber M, Ficek T; CAREDS

Macular Pigment study Group. Macular pigment measured by heterochromatic

flicker photometry in older subjects: the Carotenoids and Age-Related Eye

Disease Study. Inevst Ophthalmol vis Sci. 2004;45:531-538.

85

Sodi AC, Capelli S, Menchini F, Menchini U. Optical Coherence Tomography

Findings in Hereditary Retinal Degenerations Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003

44: E-Abstract 526.

Stahl W, Briviba K, Hamusch M. Biological activities of natural and synthetic

carotenoids: induction of gap junctional communication and singlet oxygen

quenching. Carcinogenesis. 1997;18:89-92.

Stanworth A, Naylor EJ. Haidinger's brushes and the retinal receptors. British J

Ophthalmol. 1950;34:282-291.

Stargardt K. Über familiäre, progressive Degeneration in der Makulagegend des

Auges. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1909;71:534–550.

Stargardt K. Über familiäre, progressive Degeneration in der Makulagegend des

Auges, mit und ohne psychische Störungen. Arch Psychiatr Nervenkr.

1918;58:852–887.

Stripecke R, Villacres CM, Skelton D, Satake N, Halene S, Kohn D. Immune

response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Ther.

1999;6:1305-1312.

Sujak A, Okulski W, Gruszeczki WI. Organisation of xanthopyll pigments luten

and zeaxanthin in lipid membranes forme with dipamitoylphosphatidycholine.

Biochem Biophys Acta. 2000;1509:255-263.

Sun H, Nathans J. Stargardt’s ABCR is localized to the disc membrane of retinal

rod outer segments. Nat Genet. 1997;17:15–16.

86

Sun H, Molday RS, Nathans J. Retinal stimulates ATP hydrolysis by purified

and reconstituted ABCR, the photoreceptor-specific ATP-binding cassette

transporter responsible for Stargardt disease. J Biol Chem. 1999;274:8269–8281.

Sun H, Smallwood PM, Nathans J. Biochemical defects in ABCR protein

variants associated with human retinopathies. Nat Genet. 2000;26:242–246. (A)

Sun L, Li J, Xiao X. Overcoming adeno-associated virus vector size limitation

through viral DNA heterodimerization. Nat Med. 2000;6:599–602.

Sundelin SP, Nilsson SE, Brunk IT. Lipofuscin-formation in retinal pigment

epithelial cells is reduced by antioxidants. Free Radic Biol Med. 2001;31:217-

225.

Surace EM, Auricchio A, Reich SJ, Rex T, Glover E, Pineles S, Tang W,

O'Connor E, Lyubarsky A, Savchenko A, Pugh EN Jr, Maguire AM, Wilson JM,

Bennett J. Delivery of adeno-associated virus vectors to the fetal retina: impact

of viral capsid proteins on retinal neuronal progenitor transduction. J Virol.

2003;77:7957-7963.

Surya A, Foster KW, Knox BE. Transducin activation by the bovine opsin

apoprotein, J Biol Chem. 1995;270:5024-5031.

Takahashi M, Miyoshi H, Verma IM, Gage FH. Rescue from photoreceptor

degeneration in the rd mouse by human immunodeficiency virus vector-

mediated gene transfer. J Virol. 1999;73:7812-7816.

Thomas CE, Birkett D, Anozie I, Castro MG, Lowenstein PR. Acute direct

adenoviral vector cytotoxicity and chronic, but not acute, inflammatory

responses correlate with decreased vector-mediated transgene expression in the

brain. Mol Ther. 2001;3:36–46.

87

Tõnisson N, Zernant J, Kurg A, Pavel H, Slavin G, Roomere H, Meiel A,

Hainaut P, Metspalu A. Evaluating the arrayed primer extension resequencing

assay of TP53 tumor suppressor gene. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99:5503–

5508.

VolpersC, Kochanek S. (2004) Adenoviral vectors for gene transfer and therapy.

J Gene Med. 2004 6 (Suppl. 1):S164–S171.

Wald G. Human vision anfód the spectrum. Science 1945;101:653-658.

Weng J, Mata NL, Azarian SM, Tzekov RT, Birch DG, Travis GH. Insights into

the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt’s disease

from the phenotype in abcr knockout mice. Cell. 1999;98:13–23.

Winkler BS, Boulton ME, Gottsch JD, Sternberg P. Oxidative damage and age-

related macular degeneration. Mol Vis 1999;5:e32.

Wolbarsht ML. The function of intraocular color filters. Fed Proc. 1976;35:44-

49.

Wooten BR, Hammond BR. Macular pigment: influences on visual acuity and

visibility. Prog Retin Eye res. 2002;21:225-240.

Ye J, Wang HM, Ogden TE, Ryan SJ. Allotransplantation of rabbit retinal

pigment epithelial cells double-labelled with 5-bromodeoxyuridine (BrdU) and

natural pigment. Curr. Eye Res. 1993;12:629-639.

Yemelyanov AZ, Katz NB, Bernstein PS. Ligand-binding characterisation of

xanthophyll carotenoids to solubilized membarne proteins derived from homan

retina. Exp Eye Res. 2001;72:381-392.

Yemelyanov AY, Katz NB, Bernstein PS. Ligand-binding characterization of

xanthophyll carotenoids to solubilized membrane proteins derived from human

retina. Exp Eye Res. 2001;72:381-392.

88

Zaripheh S, Erdman JW Jr. Factors thet influence the bioavailabilityof

xanthophylls. J Nutr. 2002;132:531S-534S.

Zrenner E. Will retinal implants restore vision? Science. 2002 Feb

8;295(5557):1022-5. Review. Erratum in: Science 2002;22;295(5563):2213.

Zhang K, Kniazeva M, Han M, Li W, Yu Z, Yang Z, Li Y, MetzkerML,

Allikmets R, Zack DJ, Kakuk LE, Lagali PS, Wong PW, MacDonald IM,

Sieving PA, Figueroa DJ, Austin CP, Gould RJ, Ayyagari R, Petrukhin K. A5-

bp deletion in ELOVL4 is asociated with two related forms of autosomal

dominant macular dystrophy. Nat Genet 2001;27:89-93.

Zhang X, Hargitai J, Tammur J, Hutchinson A, Allikmets R, Chang S, Gouras P.

Macular pigment and visual acuity in Stargardt macular dystrophy. Graefe's

Arch Clin Exp Ophthalmol. 2002; 240: 802-809.

89

10. Összefoglalás

A Stargardt betegség (STGD) a leggyakrabban előforduló fiatalkori macula-

dystrophia, amelynek jellegzetes tünete az általában a huszadik életév előtt jelenkező

centrális látóélesség csökkenés. Számos vizsgáló módszer áll rendelkezésre, amelyek a

betegek pillanatnyi állapotának felmérésére alkalmasak, azonban a betegség

progressziójának megítélésére nem adnak lehetőséget. A Stargardt betegség hátterében

zajló összetett molekuláris szintű változásokat csak részben ismerjük, és a terápia

jelenleg még nem megoldott.

Klinikai vizsgálatokkal kimutattuk, hogy mind az optikai koherencia tomográfia,

mind a scanning laser ophthalmoscopia olyan non-invazív eljárás, amely új és értékes

információkat ad a betegek állapotáról. Vizsgálataink alapján a betegek legjobb

korrigált látóélessége és macula térfogata között lineáris összefüggés volt kimutatható.

Hasonló összefüggést találtunk a visus és a foveoláris vastagság között.

Az SLO vizsgálatok alapján a látóélesség és a maculapigment mennyisége

között szoros összefüggés volt kimutatható.

35 magyar STGD beteg genetikai vizsgálata más népcsoportokkal ellentétben

nagyfokú homogenitást mutatott, amely nagyobb betegcsoport esetén elősegítheti a

genotípus-fenotípus összehasonlító vizsgálatokat, és a betegség prognózisának korai

megítélését.

A napról-napra bővülő genetikai ismeretek több öröklődő betegség kezelését

teszi már jelenleg is lehetővé. Állatkísérleteinkben sikerrel juttattuk be egy nyomjelző

fehérje génjét lentivírus-vektor segítségével a retina pigmenthám sejtjeibe mind in vitro,

mind in vivo körülmények között. Kimutattuk, hogy a szervezet immunrendszere

számára idegen fehérje által kiváltott kilökődési reakció immunszuppresszió

alkalmazásával sikeresen kivédhető.

Kísérleteink alapján feltételezhető, hogy a génterápia a Stargardt macula-

dystrophia egyik kezelési módja lesz a jövőben.

90

11. Summary

Stargardt disease is the most common juvenile-onset macular dystrophy. The

disease is characterized by a severe reduction of central vision, often occuring before

the age of 20 years. Several clinical data are available to assess the status of a patient,

however the prognosis is still hard to predict. The molecular background of this

complex pathology is still unclear, and no definitive therapy is available yet.

Optical coherence tomography and scanning laser ophthalmascope are two non-

invasive methods capable to bring new and valuble information about the patient.

Linear correlation was observed between visual acuity and foveolar thickness and

between visual acuity and macular volume.

SLO examination of STGD patients showed strong correlataion between the amount of

pigment in the fovea and visual acuity.

Genetic analysis of 35 Hungarian STGD patients showed homogeneous

distribution of disease associated mutations in contrast with other ethnical groups, thus

it favours genotype-phenotype correlation studies in the Hungarian population. This

would help us to determine the prognosis of our - juvenile- patients at an earlier age.

Rapid advancing of genetics has allowed us to treat several inhereted diseases

already. In our basic research we succesfully transduced the gene of reporter protein

into the retinal pigment epithelium using lentivirus vector both in vitro and in vivo

nature. The immuno-rejection caused by the foreign protein was succesfully overcome

by using immunosuppression. According to our findings, gene therapy seems to be a

promising candidate for the treatment of Stargardt macular-dystrophy in the future.

91

12. Publikációk jegyzéke

12.1. Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények

1. Hargitai J, Zernant J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Salacz G, Allikmets R.

ABCR Mutations and Clinical Phenotype in Hungarian Patients with Stargardt

Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:4402-4408. IF: 3,643

2. Doi K, Kong J, Hargitai J, Goff SP, Gouras P. Transient immunosuppression

stops rejection of viral transduced EGFP in rabbit retina. J Virology.

2004;78(20):11327-33. IF: 5,398

3. Hargitai J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Allikmets R. Foveolaris vastagság

és maculatérfogat változásai Stargardt-maculadystrophiában. Szemészet 2004;

141: 35-40.

4. Zhang X, Hargitai J, Tammur J, Hutchinson A, Allikmets R, Chang S, Gouras

P. Macular pigment and visual acuity in Stargardt macular dystrophy. Graefe's

Arch Clin Exp Ophthalmol. 2002; 240: 802-809. (társ első szerző) IF:1,191

5. Doi K, Hargitai J, Kong J, Tsang SH, Wheatley M, Chang S, Goff S, Gouras

P. Lentiviral transduction of green fluorescent protein in retinal epithelium:

evidence of rejection. Vis Res. 2002; 42:551-558. IF:1,956

12.2. Egyéb közlemények

1. Hargitai J, Paku S. Fém részecske az elülső szegmentumban

phacoemulsificatio-t követően. SHIOL, Keszthely, 2006 Évkönyv.

2. Hargitai J, Gouras P. Autoimmmune-like retinopathy. Doc Ophthalmol.

2004;109(3):215-21.

92

3. Hargitai J, Farkas Á, Fiedler O, Thirkill EC. Paraneoplasticus retinopathia

hatására kialakult késői látásromlás. Szemészet 2004; 141: 31-34.

4. Nemes J, Somfai G, Hargitai J.: A maculamorfologia és a maculafunkció

összefüggésének vizsgálata culorbetegekben optikai koherencia tomográfia

segítségével. Szemészet 2004; 141: 41-44.

5. Ekesten B, Gouras P, Hargitai J. Co-Expression of Murine Opsins Facilitates

Identifying the Site of Cone Adaptation. Visual Neuroscience Visual

Neuroscience 2002;19(4):389-93. IF: 1,771

6. Bögi J, Dura E, Fiedler O, Hargitai J, Papp M, Récsán Zs. Gyakori problémák

pseudoexfoliatiós szemek kezelésében: a szürkehályog-műtétek komplikációi, az

argonlézeres trabeculoplastica hatásossága. Szemészet 1999;136:149-155.

12.3. Idézhető absztaktok az értekezés témájában

1. Vámos R, Hargitai J, Varsányi B, Lesch B, Szabó V, Farkas Á. Research on

inherited retinal diseases at the University Eye Clinic, Budapest. Pro Retina

Research-colloquium Potzdam, 2006.

2. Hargitai J, Zernant J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Nemes J, Salacz G,

Allikmets R. Correlation of clinical and genetic findings in Stargardt disease

patients from Hungary. SOE 2005, Berlin, Németország.

3. Hargitai J, Zernant J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Nemes J, Salacz G.

Allikmets R. ABCR Mutations and Clinical Phenotype in Hungarian Patients

with Stargardt Disease. ARVO 2005, Fort Lauderdale, USA.

4. Hargitai J, Zernant J, Somfai GM, Vamos R, Farkas Á, Nemes J, Salacz G.,


patients from Hungary. ARVO 2004, Fort Lauderdale, USA.

93

5. Gouras P, Kong J, Hargitai J, Goff S, Doi K. Transient immunosuppression

stops rejection of viral transduced EGFP in rabbit retina. ARVO 2004, Fort

Lauderdale, USA.

6. Vámos R, Hargitai J, Somfai G, Farkas Á. Multifocal Electrophysiology and

Optical Coherence Tomography in Cases with Stargardt’s Macular Dystrophy.

EVER 2003, Allicante, Spanyolország.

7. Gouras P, Goff S, Doi K, Kong J, Hargitai J. Rejection and induced tolerance

of viral transduced transgenic proteins in retinal epithelium. “Age-Related

Macular Degeneration” (III. International Symposium of the German

Ophthalmological Society) 2003, Baden-Baden, Németország.

8. Vámos R, Hargitai J , Somfai G, Farkas Á. Multifocal Electrophysiology and

Optical Coherence Tomography in Cases with Stargardt’s Macular Dystrophy.

SOE 2003, Madrid, Spanyolország.

9. Somfai G, Hargitai J, Vámos R, Farkas Á, Gouras P, Salacz G. Optical

Coherence Tomography in the Study of in Stargardt Macular Dystrophy. SOE

2003, Madrid, Spanyolország.

10. Hargitai J, Somfai G, Vámos R, Farkas Á, Gouras P, Salacz G. Foveal

Thickness and Macular Volume Changes in Stargardt Macular Dystrophy.

ARVO 2003, Fort Lauderdale, USA.

11. Kong J, Doi K, Hargitai J, Goff SP, Gouras P. Gene Therapy and RPE

Transplantation in the RPE65 -/- Mutant Mouse. ARVO 2003, Fort Lauderdale,

USA.

12. Vámos R, Hargitai J, Somfai G, Farkas Á, Lesch B, Salacz G. Multifocal

Electrophysiology and Optical Coherence Tomography in Cases with

Stargardt’s Macular Dystrophy. ISCEV, 2003, Nagoya, Japán.

94

13. Hargitai J, Doi K, Kong J, Ivert L, Gouras P. Lentiviral Transduction of

Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Retinal Pigment Epithelium

Causes Vascular Changes in Rabbit. ARVO, 2002, Fort Lauderdale, USA.

14. Gouras P, Kong J, Kjeldbye H, Hargitai J.: Aging of the Basal Side and Lamina

of RPE of Normal and RPE65-/- Mice. ARVO; 2002 május, Fort Lauderdale,

USA.

15. Doi K, Hargitai J, Kong J, Goff SP, Gouras P. Onset of Immune Response is

Caused by the Amount of Induced Protein, not by the Viral Vehicle Type.

ARVO; 2002 május, Fort Lauderdale, USA.

16. Zhang X, Hargitai J, Tammur J, Hutchinson A, Allikmets R, Chang S, Gouras

P. Macular Pigment and Visual Acuity in Stargardt Dystrophy. AAO; 2001,

New Orleans, USA. (technikai okokból az összefoglaló füzetben nem szerepel)

17. Gouras P, Doi K, Hargitai J, Tsang SH, Goff S. Strategies to Virally Transduce

Genes Into Specific Retinal Layers. Europai Uniós Konferencia “New

Therapeutic Approaches in Hereditary Eye Disease –From Genes to Cure”;

2001, Prága, Csehország

18. Hargitai J, Kong J, Gouras P, Doi K. Transduction of Vascular Endothelial

Growth Factor (VEGF) in Cultured Human Fetal Retinal Pigment Epithelial

(RPE) Cells After Lentiviral Infection. Fifth Annual Vision Research

Conference; 2001, Fort Lauderdale, USA

19. Doi K, Kong J, Hargitai J, Wheatley M, Tsang SH, Chang S, Goff SP, Gouras

P. Lentiviral Transduction of Retinal Epithelium with Green Fluorescent

Protein. ARVO; 2001, Fort Lauderdale, USA.

95

12.4. Az értekezés témájában elhangzott előadások

1. Hargitai J, Zernant J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Nemes J, Salacz G,


patients from Hungary. SOE 2005; Berlin, Németország.

2. Hargitai J, Farkas Á, Fiedler O, Thirkill EC, Salacz G. Paraneoplasztikus

retinopathia hatására kialakult késői látásromlás. Magyar Szemorvostársaság

Kongresszusa 2003; Budapest.

3. Hargitai J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Ekesten B, Allikmets R, Gouras P,

Salacz G. A fovea vastagság és macula térfogat változásai Stargardt

betegségben. Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa 2003; Budapest.

4. Hargitai J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Ekesten B, Allikmets R, Gouras P,

Salacz G. Foveal thickness and macular volume changes in Stargardt macular

dystrophy. Euretina 2003; Hamburg, Németország.

5. Hargitai J, Doi K, Kong J, Salacz G,Gouras P.: Kisérletes génterápia a

szemészetben. Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa 2002; Miskolc.

6. Hargitai J: Transduction of Green Fluorescent Protein (GFP) and Vascular

Endothelial Growth Factor (VEGF) in RPE after Lentiviral Infection. 2001

május, Columbia Egyetem, New York, USA

13. Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények másolatai

Documents

Korszerű vizsgáló eljárások és potenciális terápiás lehető…semmelweis.hu/wp-content/phd/phd_live/vedes/export/... · 2012-05-15 · folyamatoknak és specifikus xantofill-kötő