LA RIPRODUZIONE DEI PESCI: ASPETTI TEORICI ED APPLICATIVI

1. INTRODUZIONE I pesci rappresentano il più grande phylum dei vertebrati viventi, con circa 30.000 specie di pesci su circa 50.000 specie di vertebrati. I pesci abitano quasi ogni ambiente acquatico del pianeta, sebbene questo presenti un’enorme variazione di temperatura, salinità, ossigeno, e altre proprietà chimiche e fisiche dell'acqua. Questi ambienti hanno esercitato forti pressioni evolutive che hanno portato alla evoluzione del numero enorme di pesci e di una immensa varietà di strategie riproduttive. I pesci presentano vari tipi di determinazione del sesso (dalla genetica al controllo ambientale), di differenziamento sessuale (da ermafroditismo a gonocorismo), di età della pubertà (da pochi mesi a molti anni), di fecondità (da un paio di milioni di uova a fecondazione interna o esterna), una vasta gamma di formati di uova, alcuni che affondano e altri che rimangono attaccati a substrati, uova abbandonate e sparse nell'ambiente o uova sottoposti alle cure parentali. L'esistenza di queste numerose e diversificate strategie riproduttive ha importanti implicazioni per l’allevamento dei pesci e per la gestione dei riproduttori. Il numero di specie che viene allevato è in costante aumento. Nel 2008 circa 67 specie di pesci venivano allevate, contro le 28 specie allevate nel 1980. Uno dei più importanti aspetti alla base di questa continua crescita del numero di specie allevate è la crescente comprensione delle complessità delle strategie riproduttive di vari pesci e di come questi si comportano in cattività.

2. I CICLI RIPRODUTTIVI DEI PESCI Il ciclo riproduttivo è un insieme di processi successivi che portano le cellule germinali immature alla produzione di gameti maturi, con lo scopo finale di ottenere un uovo fecondato dopo la fecondazione con uno spermatozoo. Il processo di crescita e differenziamento dei gameti è chiamato gametogenesi, e porta alla formazione dell’ ovocita femminile (oogenesi) e dello spermatozoo maschile (spermatogenesi). Sia i gameti maschili sia quelli femminili hanno un'origine comune nella popolazione di cellule germinali embrionali primordiali (PGC) che migrano durante lo sviluppo embrionale fino al luogo della formazione della gonade, a livello dell’epitelio germinale. Le PGC proliferano attraverso divisioni mitotiche e formano gli oogoni o spermatogoni a seconda della sesso dell'individuo. Con l'ultima divisione mitotica, oogoni e spermatogoni entrano in meiosi e diventano ovociti o spermatociti, iniziando così la gametogenesi in animali adulti. In entrambi maschi e femmine, il ciclo riproduttivo prevede due fasi principali, la fase di crescita delle gonadi e sviluppo (gametogenesi) e la fase di maturazione, che culmina nella ovulazione / spermiazione e la deposizione delle uova. Il rilascio di gameti maturi nell'ambiente esterno (deposizione delle uova) è un evento altamente sincronizzato, che porta alla fecondazione dell'uovo e allo sviluppo dell'embrione. Il successo della riproduzione dipende dal successo della progressione attraverso le fasi del ciclo riproduttivo, che porta alla produzione di gameti di buona qualità. Questa sezione descrive alcune caratteristiche generali della fisiologia riproduttiva e dello sviluppo delle gonadi nei pesci. 2.1 Sviluppo ovarico nelle femmine: oogenesi, maturazione ed ovulazione L'ovaio dei pesci è un organo allungato bilaterale, localizzato nella cavità addominale. I lobuli ovarici sono circondati dal mesovario e comunicano attraverso una coppia di ovidotti alla papilla genitale, che si apre nell’ambiente esterno. Le ovaie sono costituite da pieghe dell’epitelio germinale che si proiettano nel lume ovarico, le lamelle ovigere. In queste lamelle, gli ovociti subiscono le varie fasi della gametogenesi, fino a diventare ovuli maturi ( uova), vengono rilasciati nella cavità ovarica o cavità addominale (e.g., i salmonidi) durante l'ovulazione e quindi all'ambiente esterno durante la deposizione delle uova. Gli ovociti ovulati possono rimanere nella cavità ovarica / addominale per un periodo di tempo prima delle deposizione. In questa cavità essi mantengono la fertilità per un certo periodo di tempo, ma se non deposti, gli ovuli diventano "troppo maturi" e degenerano. Questa è una considerazione importante nei pesce di allevamento la

cui riproduzione si basa sulla deposizione manuale delle uova (stripping) e sull'inseminazione artificiale, per cui lo “stripping” dovrebbe essere eseguito prima che si verifichi un eccesso di maturazione. Il lasso di tempo che intercorre tra l'ovulazione e maturazione varia notevolmente tra i pesci, da minuti (ad esempio, il persico spigola striato, Morone saxatilis) a giorni (ad esempio, salmonidi) e dipende molto dalla temperatura dell'acqua. Nei salmonidi, che non hanno una mesovario completo e gli ovociti sono ovulati direttamente nella cavità addominale, gli ovuli ovulati possono rimanere per diversi giorni senza maturare. L'unità germinale dell'ovaio è costituito da un ovocita circondato da due strati di cellule follicolari. Queste cellule follicolari avvolgono la cellula germinale e offrono supporto strutturale e funzionale per l'ovocita in via di sviluppo, mediando l'interiorizzazione di molecole, ormoni e fattori necessari per la differenziazione, la crescita e la sopravvivenza dell’ovocita. Ogni oocita è circondato da un monostrato interno delle cellule della granulosa e un monostrato esterno di cellule della teca. Tra i due strati follicolari vi è una sottile membrana basale, che li separa. Inoltre, uno strato acellulare circonda l'ovocita (la zona radiata), a cui le cellule della granulosa sono direttamente collegate. La zona radiata si sviluppa progressivamente durante la gametogenesi, diventando sempre più densa e compatta per costituire il corion o guscio d'uovo. Il ciclo riproduttivo femminile dei pesci è caratterizzato dal processo specifico di vitellogenesi, la sintesi di vitellogenina (VTG), il precursore delle riserve vitelline dell'uovo. La VTG è una lipofosfoglicoproteina sintetizzata nel fegato sotto lo stimolo di estradiolo (E2). Essa viene rilasciata nel flusso sanguigno e incorporata progressivamente dagli ovociti in accrescimento, attraverso un processo di endocitosi mediata dal recettore. La VTG viene successivamente scissa proteoliticamente in componenti più piccoli (fosvitina, lipovitellina), dando luogo alle riserve vitelline dell’uovo, il tuorlo o vitello. Il processo della vitellogenesi è di vitale importanza per la qualità delle uova e per la sopravvivenza delle larve schiuse, poiché costituisce le sole riserve nutritive della larva, fino all'inizio dell’alimentazione esterna, vari giorni dopo la fecondazione. La VTG è una proteina specifica della femmina ed i suoi livelli ematici correlano bene con l'inizio e la progressione del periodo gametogenico. Queste caratteristiche della molecola VTG rendono l'uso di specifici immunodosaggi della VTG uno strumento molto utile nel settore dell'acquacoltura. Tali saggi immunologici per la VTG sono utilizzati per la determinazione del sesso dei riproduttori in quelle specie senza dimorfismo sessuale esterno, perché la rilevazione della VTG nel sangue indica chiaramente una femmina. I test immunologici per la VTG sono utilizzati anche per seguire lo sviluppo delle gonadi, poichè i livelli ematici della VTG aumentano in concomitanza con l’oogenesi. Il ciclo riproduttivo delle femmine dei pesci può essere diviso in un periodo di accrescimento ovocitario (gametogenesi o vitellogenesi) ed un periodo di maturazione degli ovociti, ovulazione e deposizione delle uova (Fig. 1).

Figura 1 - Sviluppo e maturazione degli ovociti nella femmina. Si inizia con la proliferazione mitotica degli oogonia che diventano ovociti primari quando entrano in meiosi. Gli ovociti primari subiscono una fase primaria di crescita (pre-vitellogenesi), che prevede la comparsa di materiale chiaro nel citoplasma e la formazione di due strati cellulari, le cellule della granulosa e della teca (parete follicolare). La fase di crescita secondaria (vitellogenesi) comporta la sintesi e incorporazione nell’ovocita della vitellogenina (VTG), ed è associata a un drastico aumento delle dimensioni. Durante la vitellogenesi, nuove inclusioni appaiono nel citoplasma, come alveoli corticali (cerchi bianchi), globuli lipidici (cerchi grigi) e granuli di tuorlo (cerchi grigio scuro) e la parete dell’ovocita (la zona radiata) e la parete follicolare diventano sempre più spesse. Alla fine della vitellogenesi, il citoplasma è completamente pieno di globuli lipidici e granuli di tuorlo che iniziano la coalescenza, il nucleo (vescicola germinale, GV) (cerchio nero) si trova in posizione centrale e una spessa zona radiata avvolge l'ovocita. A maturazione precoce, globuli lipidici e granuli di tuorlo continuano la coalescenza e il nucleo migra verso il polo animale (migrazione GV, GVM). Appena inizia la maturazione, c'è una massiccia coalescenza di granuli di tuorlo e la localizzazione del nucleo in una posizione periferica. La maturazione finale dell’ovocita (UFM) è caratterizzata dalla dissoluzione della membrana GV (GVBD) e l'idratazione dell'ovocita. Gli ovociti sono finalmente ovulato nella cavità ovarica o addominale, e vengono rilasciati in acqua durante la deposizione delle uova. In questo diagramma, le dimensioni delle cellule sono proporzionali.

Lo sviluppo degli ovociti è stato descritto in dettaglio in diverse specie di pesci. All’inizio del ciclo riproduttivo, l'ovario immaturo contiene nidi di oogonia lungo le lamelle ovigere, che proliferano attraverso divisioni mitotiche. Ad un certo momento, una parte della popolazione degli ovogonia entra in meiosi e diventano ovociti primari, arrestandosi alla profase I. Questo è l’l'inizio della gametogenesi, e la meiosi non sarà ripresa fino alla maturazione finale (FOM). Gli ovociti primari attraversano una fase di crescita primaria o previtellogenesi, che comporta un aumento delle dimensioni, la comparsa di materiale chiaro nel citoplasma e la comparsa della granulosa e della teca (follicolo). Questa è una fase ormone-indipendente, che si verifica prima del periodo di sintesi della VTG indotta dall’estradiolo. La fase di crescita secondaria, o vitellogenesi, si caratterizza per la sintesi e per l’enorme accumulo di VTG e proteine correlate alle vitelline nel citoplasma dell'ovocita, con conseguente aumento di 10 volte in termini di dimensioni. Questo periodo si può dividere in una fase di vitellogenesi precoce caratterizzata da ovociti di piccole dimensioni (circa 100 micron di diametro), con un citoplasma opaco quasi privo di inclusioni, ad eccezione di alcune gocce di olio. Con la progressione della vitellogenesi, nuove inclusioni appaiono nel citoplasma, come le vescicole corticali, i globuli lipidici ed i granuli di tuorlo. L'ordine di apparizione di delle inclusioni è specie-specifico. Queste inclusioni aumentano in dimensioni e numero durante la vitellogenesi, promuovendo l'aumento delle dimensioni degli ovociti. Inoltre, la zona radiata, come gli strati della granulosa e della teca diventano sempre più spesse per sostenere la rapida crescita dell’ovocita. Alla fine del periodo di vitellogenesi (fine vitellogenesi), l’ovocita post-vitellogenico è caratterizzato da un ampio citoplasma trasparente completamente pieno di granuli di tuorlo e globuli lipidici, un nucleo centrale (o vescicole germinale, GV), e una spessa zona radiata, avvolta dagli strati follicolari della granulosa e della teca. Dopo la vitellogenesi, gli ovociti sono sottoposti a maturazione, con la ripresa della meiosi avanzando fino alla metafase II, momento in cui il primo corpo polare è rilasciato e l’ovocita diventa un ovocita secondario. A maturazione precoce, i globuli lipidici e i granuli di tuorlo iniziano la coalescenza e la vescicola germinale inizia la sua migrazione verso il polo animale (migrazione GV, GVM). Come avanza la maturazione, c'è una massiccia coalescenza di inclusioni di tuorlo e la localizzazione delle GV in una posizione periferica. La maturazione finale degli ovociti è caratterizzata dalla dissoluzione della membrana nucleare, un processo chiamato GV breack down (GVBD). La trasformazione dei lipidi e delle inclusioni di tuorlo modifica la composizione ionica del citoplasma, provocando una drastica incorporazione di acqua all'interno dell’ovocita, attraverso un aumento della pressione osmotica. Questa forte idratazione è particolarmente rilevante nei pesci pelagici che producono uova, e provoca un rapido aumento di 2-3 volte del volume degli ovociti. Dopo l'idratazione, la parete follicolare si rompe e l'ovocita viene ovulato nella cavità ovarico / addominale e rilasciato nell’acqua durante la deposizione delle uova. Durante la stagione riproduttiva, follicoli post-ovulatori (POF) possono essere trovati nell’ovaio. Si tratta degli involucri follicolari che rimangono vuoti dopo il rilascio degli ovociti; al microscopio hanno l'aspetto di strutture ripiegate, e scompaiono durante la riorganizzazione ovarica pochi giorni dopo l'ovulazione. Ovociti atresici o apoptotici possono anche essere trovati. Si tratta di ovociti che hanno interrotto il processo di vitellogenesi o FOM a causa di un errore nella regolazione ormonale del processo riproduttivo. Quando gli ovociti muoiono, il rivestimento vitellino è frammentato e le cellule follicolari ipertrofiche invadono l’ooplasma per la fagocitosi. L’atresia follicolare appare al microscopio come una struttura compatta e ben vascolarizzata. Il numero di ovociti atresici aumenta durante la stagione della pre-deposizione e della deposizione delle uova e riflette chiaramente il successo della riproduzione della femmina. Essa avviene in tutte le specie e rispecchia l’adeguatezza dell'ambiente riproduttivo. L’atresia follicolare può verificarsi in tutte le fasi dell’oogenesi e regola il numero di ovociti che avanza attraverso il processo riproduttivo, influenzando la fecondità della specie. La determinazione del livello di sviluppo delle gonadi nei pesci di sesso femminile allevati è un importante strumento in acquacoltura. Questo può essere determinato mediante esame di biopsie di

campioni di ovociti. La biopsia viene eseguita nelle femmine anestetizzate, mediante inserimento di una cannula attraverso il gonodotto e delicata aspirazione di ovociti intraovarici. Gli ovociti raccolti sono osservati al binoculare e classificati secondo la loro dimensione, posizione del GV (centrale, migrante o periferico), il grado di coalescenza dei granuli di tuorlo, ecc.; queste classificazioni danno un'indicazione relativa della fase dello sviluppo della gonade femminile.

2.2 Lo sviluppo testicolare nei maschi: spermatogenesi, maturazione e spermiazione Le gonadi maschili (testicoli) sono composte di tessuto germinale e somatico. Le cellule germinali si sviluppano durante la spermatogenesi per dare origine ai gameti, gli spermatozoi. Il tessuto somatico dei testicoli forma i tubuli seminiferi e sostiene il tessuto connettivo, così come le cellule somatiche specializzate, le cellule di Leydig e del Sertoli. Queste cellule somatiche offrono un supporto strutturale e funzionale allecellule germinali e giocano un ruolo cruciale nella produzione di ormoni e altri fattori necessari alla differenziazione delle cellule germinali, alllo sviluppo e alla sopravvivenza. Le cellule del Sertoli avvolgono le cellule germinali per formare unità chiamate cisti o spermatocisti. La somma di tutte le cisti costituisce l'epitelio germinale dei testicoli. Le cellule del Sertoli sono attaccate ad una membrana basale, che separa l'epitelio germinale dal compartimento interstiziale. Il compartimento interstiziale è formato da tessuto somatico, in cui si trovano le cellule di Leydig, tra i tubuli seminiferi. Le cellule di Leydig, come le cellule del Sertoli, sono anche cellule endocrine specializzate, con un ruolo importante nella produzione degli ormoni necessari per lo sviluppo delle cellule germinali. Il processo della spermatogenesi può essere suddiviso in tre fasi principali, 1) la proliferazione mitotica degli spermatogoni, 2) la divisione meiotica degli spermatociti, e 3) la trasformazione degli spermatidi aploidi in spermatozoi flagellati (spermiogenesi). Attraverso queste fasi, le cellule germinali passano attraverso differenti stadi dello sviluppo: spermatogoi A e B, spermatociti primari (2n) e secondarie (1n), spermatidi e spermatozoi (Fig. 2).

Figura 2 - Processo di sviluppo e maturazione degli spermatozoi nei pesci di sesso maschile. Si inizia con la proliferazione mitotica del spermatogoni, prima attraverso divisioni lente (spermatogoni A) e poi attraverso rapide divisioni (spermatogoni B). Gli spermatogoni B compaiono come spermatociti primari, che entrano nella prima divisione meiotica; questi diventano spermatociti secondari ed entrano nella seconda divisione meiotica, che porta alla formazione di spermatidi aploidi. Gli spermatidi differenziano in spermatozoi flagellati durante la spermiogenesi, che comporta una drastica riduzione delle dimensioni (> 80%) e la formazione del flagello. Gli spermatozoi flagellati sono poi rilasciati nel lume del testicolo, dove subiscono il processo di maturazione, attraverso il quale acquisiscono la capacità fecondante. Gli spermatozoi maturi sono immagazzinati nei testicoli finché non vengono rilasciati in acqua durante la spermiazione. In questo diagramma, le dimensioni delle cellule sono proporzionali. La presenza e l'abbondanza relativa di ciascuna di queste cellule nei testicoli è utilizzata come indicazione del grado di sviluppo testicolare. Prima di iniziare la sviluppo delle gonadi, i testicoli immaturi contengono gli spermatogoni (cellule staminali spermatogoniali) che proliferano mediante divisioni mitotiche, attraverso un processo di auto-rinnovamento. Durante questa fase la popolazione di cellule staminali nei testicoli aumenta di numero. Ad un certo momento, alcune cellule staminali spermatogoniali entrano nel processo della spermatogenesi e si impegnano nella produzione di spermatogoni.

Durante la fase di proliferazione mitotica degli spermatogoni (fase 1), ciascun spermatogonio passa attraverso diversi cicli di divisioni mitotiche, che vanno da cinque a quindici, a seconda della specie. Durante la divisione, la citodieresi è incompleta e le cellule figlie mantengono ponti citoplasmatici diretti tra loro, rimanendo insieme in un cluster, chiamato spermatocisti. Questo gruppo di cellule figlie è quindi formato da cloni di spermatogoni, poichè provengono tutti da una singola cellula originale. Ogni cisti è avvolta da una parete di cellule somatiche del Sertoli che mantengono i diversi cloni separati l'uno dall'altro. Durante questa fase di proliferazione mitotica, gli spermatogoni passano prima attraverso una fase di divisione lenta (spermatogoni A) e poi attraverso una fase di divisione rapida (spermatogoni B). L'ultima divisione mitotica di spermatogoni B dà luogo a spermatociti primari, che entrerà nel processo della meiosi (fase 2). Durante la seconda fase, gli spermatociti primari procedono alla prima divisione meiotica, in cui avviene la duplicazione del DNA e la ricombinazione delle informazioni genetiche, portando alla formazione di spermatociti secondari. Questi entrano rapidamente nella seconda divisione meiotica, senza duplicazione del DNA, che porta alla formazione di cellule germinali aploidi, gli spermatidi. Gli spermatidi entrano nel processo di spermatogenesi (fase 3), in cui gli spermatidi aploidi differenziano in spermatozoi flagellati. Questo processo non comporta proliferazione cellulare, ma solo trasformazione cellulare, che include una riduzione drastica delle dimensioni (> 80%) a causa della condensazione del nucleo e l'estrusione del contenuto citoplasmatico alle cellule del Sertoli circostanti. Inoltre, la concentrazione di mitocondri, la formazione di un tratto intermedio e del flagello avviene in questo momento. In alcune specie di pesci non c'è formazione dell’acrosoma presente in tutti gli altri vertebrati, perché la fecondazione è raggiunta attraverso il micropilo dell'uovo dei pesci. Una volta che la spermiogenesi è completata, gli spermatocisti rompono la parete cellulare del Sertoli e gli spermatozoi flagellati vengono rilasciati nel lume del testicolo. Qui, gli spermatozoi subiranno il processo finale di maturazione o di capacitazione, con cui acquisiscono la capacità fertilizzante (capacità della motilità). La maturazione si verifica durante la migrazione degli spermatozoi lungo il dotto efferente e coinvolge solo cambiamenti fisiologici. Contemporaneamente alla maturazione dello sperma, il dotto efferente produce una elevata quantità di liquido (idratazione degli spermatozoi), portando alla formazione del fluido contenente gli spermatozoi in sospensione. Gli spermatozoi rilasciati sono immagazzinati prima della deposizione e, a seconda della specie, il punto di riserva è il lume tubulare, il sistema dei dotti efferenti o le vescicole germinali. Inoltre, a seconda della specie, ci sono variazioni del grado di maturazione (capacità fertilizzante) degli spermatozoi immagazzinati. Per esempio, nei salmonidi, gli spermatozoi intratesticolari presentano una ridotta capacità fecondante rispetto agli spermatozoi presenti nel dotto efferente. Questo aspetto é importante da tenere in considerazione quando si raccoglie lo sperma di una determinata specie per gli esperimenti di fertilizzazione, poichè la capacità fecondante di tale sperma può variare a seconda del sito di raccolta. Strutturalmente, i testicoli dei pesci teleostei possono essere classificati in due tipi principali, tubolari o lobulari. I testicoli tubolari sono i più comuni tra i pesci. In questo tipo, le spermatocisti sono distribuite nei testicoli, in una struttura tubolare, e non si muovono durante il processo della spermatogenesi. I testicoli lobulari si trovano in alcuni Perciformi e Atheriniformi e si caratterizzano per l'esistenza di lobuli che terminano ciechi nella periferia dei testicoli; in questi lobuli gli spermatogoni sono limitati alle estremità e gli spermatociti / spermatidi si muovono attraverso il sistema del dotto efferente durante la spermatogenesi.

2.3 Tipi di sviluppo delle gonadi La grande diversità di strategie riproduttive dei pesci e quello degli ambienti abitati si riflette anche nell'esistenza di una varietà elevata di tipologia dello sviluppo delle gonadi. Questo ha importanti conseguenze per la fecondità e la deposizione delle uova caratteristiche di ogni specie. Lo sviluppo delle gonadi di pesce può essere classificato in tre tipi principali: sincrono, gruppo-sincrono e asincrono.

Il tipo sincrono viene esibito da quelle specie che depongono le uova solo una volta nella loro vita. Questo è il caso della lampreda (Petromyzon spp), l'anguilla d'acqua dolce (Anguilla spp), alcune alose (Alosa spp) e salmoni del Pacifico (Oncorhynchus spp). In questo tipo di ovaio, tutti gli ovociti procedono in maniera sincrona attraverso tutte le fasi della gametogenesi, FOM e ovulazione. Il tipo di gruppo-sincrono è esibito dai riproduttori di stagione, quelle specie che si riproducono una o più volte durante la stagione riproduttiva annuale. In questo tipo, un gruppo di ovociti vitellogenici viene reclutato e procede in modo sincrono attraverso le fasi di sviluppo successive, mentre gli altri ovociti rimangono in fase di arresto. Il cluster di ovociti reclutati subirà la maturazione, l'ovulazione e la deposizione delle uova. Questo tipo di sviluppo ovarico può essere diviso in due sottogruppi: single-batch e riproduttori multiple-batch. Nelle specie sincrone di tipo single-batch, un solo cluster di ovociti subisce la maturazione ogni stagione e, quindi, produrrano una singola deposizione delle uova all'anno (ad esempio, la trota iridea, Oncorhynchus mykiss). Nel caso multiplo-batch i pesci sono in grado di ripetere questo processo più volte durante la stagione riproduttiva, con la produzione di diverse deposizioni di uova all'anno. Il numero di deposizione delle uova dipende dal numero di reclutamento dei cluster di ovociti, per esempio, il branzino (Dicentrarchus labrax) produce 2-4 deposizioni per stagione. Il tipo asincrono di sviluppo ovarico è esibito da quelle specie che producono multiple deposizioni di uova in un esteso periodo di tempo (diversi mesi). Questo è tipico di alcune specie tropicali, ma anche molti di pesci mediterranei della famiglia Sparidae. La popolazione di ovociti si sviluppa in modo asincrono e tutte le classi di ovociti (da inizio vitellogenesi a maturazione tardiva) possono essere trovate nelle ovaie, in qualsiasi momento del ciclo riproduttivo. Non ci sono cluster di crescita degli ovociti. Ciò rappresenta l’estremo dello sviluppo ovarico di tipo multiplo-batch, rendendo per alcune specie la classificazione in una di queste categorie difficili. Infatti, è possibile trovare nei pesci tutte le possibili strategie tra i due estremi. Per quanto concerne il maschio dei pesci, lo sviluppo dei testicoli è in qualche modo più omogeneo e potrebbe essere descritto come un tipo asincrono di sviluppo per tutte le specie. In ogni momento, diverse classi di cellule, dagli spermatogoni immaturi agli spermatozoi, possono essere trovati nei testicoli. Durante la piena spermiazione, i testicoli sono per lo più occupati da spermatozoi maturi, mentre all'inizio della stagione, è presente un'alta percentuale spermatociti non maturi. .

3. REGOLAZIONE AMBIENTALE DELLA RIPRODUZIONE DEI PESCI Lo scopo della riproduzione è quello di produrre prole che sopravviva. È stato riconosciuto per lungo tempo che la disponibilità di cibo e le condizioni ambientali rappresentano fattori fondamentali nel determinare la sopravvivenza e, quindi, come una specie si evolve attraverso la selezione naturale. La disponibilità di cibo e la capacità di immagazzinare energia determina quando un pesce avanza al completamento della maturazione (Fig. 3). Sperimentalmente è stato dimostrato che i gruppi di pesci alimentati con basse razioni di cibo esibiscono una riduzione della percentuale di pesci che completano la maturazione. Alcune teorie suggeriscono che i pesci hanno la capacità, attraverso una soglia biochimica geneticamente determinata, di accertare quali dimensioni e / o quali condizioni di età sono ottimali per completare la maturazione. La disponibilità di cibo per la prole e quindi la sopravvivenza della prole determina i tempi di riproduzione. La disponibilità di cibo esibisce variazione stagionale nelle latitudini più elevate ma anche in quelle più basse nei tropici. La riproduzione è controllata per garantire che i periodi critici di alimentazione per la sopravvivenza della prole, in particolare larve e giovanili, coincida con i periodi stagionali di elevata disponibilità di cibo. Per le specie alle alte latitudini questo è di solito in primavera mentre per le specie in latitudini più basse questo è spesso in relazione alle fluttuazioni dei livelli di nutrienti causati da cambiamenti nelle correnti oceaniche, cicli di temperatura o cicli metereologici come stagioni delle

piogge (Fig. 3). Pertanto, la maturazione è un processo complesso che deve essere cronometrato perfettamente per garantire che la deposizione delle uova coincida con elevate disponibilità di cibo. I pesci si sono evoluti adattandosi ai parametri ambientali in continua evoluzione (ad esempio, fotoperiodo); questi parametri avviano la maturazione e predicono le condizioni ottimali per la sopravvivenza della prole (Fig. 3). Forse non è sorprendente che i parametri prevedibili sono spesso gli stessi fattori ambientali che determinano il cambiamento di stagione, cicli meteorologici e cambiamenti delle correnti oceaniche che danno luogo a cicli della disponibilità di cibo. Questi parametri sono definiti prevedibili ed esempi sono fotoperiodo, temperatura, disponibilità di cibo, ciclo lunare, precipitazioni, correnti e pressione (Fig. 3).

Figura 3 - Schema dei fattori ambientali che influenzano i pesci. I fattori ambientali quali fotoperiodo, temperatura, cicli lunari, cicli metereologici e delle correnti oceaniche, controllano la stagionalità della disponibilità di cibo e la maturazione dei pesci. La disponibilità di cibo e la capacità di immagazzinare energia determinano quando un pesce raggiunge una soglia genetica e procede al completamento della maturazione. Lo sviluppo di maturazione del pesce è influenzato da fattori ambientali che garantiscono che i periodi critici di alimentazione della prole coincidano con i picchi di disponibilità di cibo.

È difficile comprendere il grado di importanza di un fattore rispetto ad un altro. Forse il più importante è il fotoperiodo. Il ruolo del fotoperiodo è stato completamente descritto per i salmonidi e in particolare per la trota iridea, attraverso studi che hanno esaminato l'effetto di fotoperiodi naturali e alterati sulla riproduzione mantenendo costanti altri fattori come la temperatura. Da questo tipo di studi è stato dimostrato che il fotoperiodo produceva un ritmo endogeno che controllava tutti gli aspetti dello sviluppo maturativo, vale a dire, l’intero asse encefalo-ipofisi-gonadi. Pertanto, nella trota iridea il crescente fotoperiodo primaverile è stato mostrato indurre il completamento della maturazione e a sua volta l'inizio della vitellogenesi / spermatogenesi, il passaggio del fotoperiodo dalla primavera all'estate all'autunno induce l’avanzare della vitellogenesi / spermatogenesi e la diminuzione del fotoperiodo autunnale porta alla maturazione definitiva, all'ovulazione e alla spermiazione. Il fotoperiodo probabilmente svolge un ruolo importante nella riproduzione della maggior parte delle specie di pesci temperati influenzando i tempi di maturazione in numerose famiglie che abitano a latitudini temperate, come salmone atlantico (Salmo salar, famiglia: Salmonidi), spigola (Dicentrarchus labrax, Percichthyidae), orata, (Sparus aurata, Sparidae), scorfano (Sciaenops ocellatus, Sciaenidae), merluzzo (Gadus morhua, Gadidae), halibut dell'Atlantico (Hippoglossus hippoglossus, Pleuronettidi), sogliola (Solea solea, Soleidae), rombo (Psetta maxima, Scoftalamidi) e a latitudini tropicali, come ad esempio tilapia del Nilo (Oreochromus niloticus), cefalo (Mugil cephalus, Mugilidae), pesce gatto (fossilis Heteropneustes, Heteropneustidae) e carpa (Cyprinus carpio, ciprinidi). Tuttavia, gli aspetti dello sviluppo maturativo indotto dal fotoperiodo e l'interazione con altri fattori dipenderà dalla strategia riproduttiva di ogni specie. La temperatura svolge anche un ruolo importante e molte specie, soprattutto quelle tropicali e sub-tropicali sembrano deporre le uova proprio in relazione ai cambiamenti della temperatura. Tuttavia, il ruolo della temperatura non è chiaro e può essere ritenuto un fattore di controllo o permissivo, avente un effetto diretto sui processi biologici, ma in realtà non è utilizzato come innesco con il quale un organismo regola il proprio sviluppo maturativo. Questa situazione poco chiara è in parte causaao dalla mancanza di studi che hanno esaminato singolarmente l'interazione della temperatura con la maturazione, mantenendo costanti gli altri fattori, come è stato invece fatto negli studi per il fotoperiodo. Tuttavia, nonostante questa povera comprensione, l'importanza della temperatura nel processo maturativo non può essere contestato. La maggior parte delle specie esaminate mostrano una temperatura ottimale per le varie fasi di sviluppo e in generale la maturazione sarà in ritardo al di sotto di questo range ottimale mentre temperature superiori accelerano la maturazione. Temperature che sono estremamente diverse dalla temperatura ottimale arrestano la gametogenesi e inducono atresia. In particolare, tali effetti della temperatura sono stati osservati in relazione alla deposizione delle uova. Ad esempio, è stato osservato che la limanda (Limanda limanda) nel Mare del Nord matura in relazione ai cambiamenti stagionali delle temperature, la gametogenesi da ottobre a gennaio e la deposizione delle uova quando la temperatura comincia a salire da febbraio ad aprile. La deposizione delle uova di diversi stock di limanda era progressivamente ritardata nei pesci più a nord e la deposizione delle uova era correlata alla differente temperatura dovuta all’aumentare della latitudine. Tali osservazioni hanno confermato che la deposizione delle uova può essere prevista dal profilo della temperatura. Ad esempio, Baynes et al. (1993) hanno dimostrato che per le sogliole (Solea solea) esisteva una correlazione positiva (r = 0.9) tra la temperatura invernale e l’inizio della deposizione delle uova in primavera e Rothbard e Yaron (1995) hanno descritto come in Israele i giorni successivi a quelli in cui la temperatura sale sopra i 15 ° C sono utilizzati per prevedere quando le carpe saranno pronte alla deposizione delle uova. Altri parametri ambientali che sono stati osservati in coincidenza con aspetti dello sviluppo maturativo includono la disponibilità di cibo, cicli lunari o di marea, pioggia, correnti e pressione. La conoscenza di questi tipi di parametri si basa quasi interamente su osservazioni. Queste osservazioni offrono poche spiegazioni su come tali parametri possano influenzare i tempi di maturazione pertanto l'utilità di tali parametri in acquacoltura è discutibile, data la difficoltà e l’impossibilità di manipolare o riprodurre questi parametri. Una spiegazione potrebbe essere che

molti di questi parametri rappresentino degli stimoli finali per pesci maturi in fase avanzata di vitellogenesi / spermatogenesi i quali in relazione al fotoperiodo e / o alla temperatura completino la maturazione finale e la deposizione delle uova. Comunque, questi parametri mettono in evidenza la diversità e la complessità delle strategie riproduttive che evolute. Alcuni esempi interessanti includono la correlazione dei tempi di deposizione delle uova di pesci pelagici con le fioriture di plancton, la deposizione delle uova di carpe indiane in relazione alle piogge monsoniche e alle inondazioni, i tempi di deposizione delle uova con i cambiamenti nelle correnti sulla costa californiana e l'associazione della deposizione delle uova dell’orata in cattività con il ciclo lunare. 4. REGOLAZIONE ORMONALE DELLA RIPRODUZIONE DEI PESCI Il ciclo riproduttivo è regolato da una cascata di ormoni lungo l’asse encefalo-ipofisi-gonadi, il cosiddetto asse riproduttivo (Fig. 4).

Figura 4 – Asse encefalo-ipofisi-gonadi, mostrante gli ormoni critici coinvolti nella regolazione della riproduzione dei pesci. Il processo riproduttivo inizia nel cervello, che integra le informazioni esterne (ad esempio, ambiente) e risponde con l'attivazione del sistema ormonale rilasciante le gonadotropine (GnRH). Il GnRH stimola la sintesi e il rilascio delle gonadotropine ipofisarie (GTHs), l’ormone follicolo-stimolante (FSH) e luteinizzante (LH), che agiscono sulla gonade (ovaie o testicoli) per stimolare la sintesi di steroidi sessuali, gli effettori ultimi dello sviluppo delle gonadi. Gli steroidi sessuali svolgono ruoli complementari su tessuti nongonadali, principalmente azioni di feedback sul cervello / ipofisi e nelle femmine, sulla stimolazione di vitellogenina (VTG) sintetizzata nel fegato.

Lungo questo asse, le gonadotropine ipofisarie (GTHs), gli ormoni follicolo-stimolante (FSH) e luteinizzante (LH), sono gli attori chiave nel controllo della riproduzione endocrina. La secrezione delle due GTHs è controllata dal cervello attraverso l'azione stimolante dell’ormone rilasciante le gonadotropine (GnRH). Questo neuropeptide è il sistema principale che regola la riproduzione, che agisce come un integratore di informazioni esterne (ad es, ambiente) e l'invio di input neuroendocrini per la regolazione dell’asse riproduttivo. Il GnRH agisce direttamente sull’ipofisi per stimolare la secrezione di FSH ed LH che vengono rilasciati nel flusso sanguigno per agire sulla gonade, dove stimolano la sintesi di ormoni steroidei, che sono gli effettori finali dello sviluppo delle gonadi. Nelle fasi iniziali, la stimolazione delle GTHs (principalmente di FSH) induce la secrezione di androgeni (ad esempio, il testosterone (T) e 11-ketotestosterone (11KT)) nei maschi ed estrogeni (per esempio, estradiolo (E2)) nelle femmine, che agiscono in concomitanza con FSH nel controllo della gametogenesi. Il E2 gioca un ulteriore ruolo importante nella gametogenesi della femmina, con la stimolazione della sintesi della VTG nel fegato. Così, il periodo della gametogenesi è caratterizzato da elevati livelli ematici di FSH e livelli crescenti di androgeni nei maschi, e l'aumento di E2 e VTG nelle femmine. Alla fine della gametogenesi, la secrezione di LH dall'ipofisi induce un cambiamento nella via steroidogenica della gonade, stimolando la sintesi e la secrezione di progestinici simili agli steroidi, gli steroidi che inducono la maturazione (MIS). L'azione concomitante di LH e MIS stimola il processo di maturazione delle gonadi. Questo periodo è caratterizzato da diminuiti livelli ematici di FSH e androgeni / estrogeni e da un aumento dei livelli ematici di LH e MIS. Una volta che la maturazione delle gonadi è completata, il GnRH encefalico stimola un forte aumento della secrezione di LH dall'ipofisi, che induce l’ovulazione nelle femmine, mentre nei maschi, i livelli relativamente stabili ma elevati di LH inducono la spermiazione (Fig. 5).

Figura 5 - Evoluzione dei cambiamenti endocrini e gonadici associati al ciclo riproduttivo di femmine e maschi dei pesci. La metà superiore del diagramma mostra le secrezioni degli ormoni ipofisari e le concentrazioni di tali ormoni nel plasma; la metà inferiore mostra le fasi correlate dello sviluppo di ovociti e sperma. Nelle fasi iniziali, la stimolazione ipofisaria di FSH induce la secrezione da parte delle gonadi di estrogeni nelle femmine (estradiolo (E2)) e androgeni nei maschi (11-ketotestosterone (11KT)) che regolano lo sviluppo della gonade. Nelle femmine, E2 gioca un ruolo aggiuntivo sul fegato, stimolando la sintesi di VTG (Vitellogenesi). Il periodo della gametogenesi è caratterizzata da elevati livelli di FSH nel sangue e da un aumento dei livelli di androgeni nei maschi, e E2 e VTG nelle femmine. Alla fine della gametogenesi, la secrezione ipofisaria di LH induce la sintesi di steroidi che inducono la maturazione (MIS), che regolano il processo di maturazione delle gonadi; questa è caratterizzata da diminuiti livelli ematici di FSH e androgeni / estrogeni e aumentati livelli ematici di LH e MIS. Al termine della maturazione, un picco di GnRH stimola l'ovulazione indotta da LH, la spermiazione e la deposizione delle uova. Il picco di LH pre-ovulatorio indotto dal GnRH nel plasma è essenziale per il successo dell'ovulazione. Infatti, la dimostrazione che questo caratteristico picco di LH era assente nei pesci in cattività che non riuscivano ad ovulare, ma non nell’ovulazione spontanea del pesce selvatico, getta le basi per lo sviluppo di terapie che inducono la deposizione delle uova basate sugli ormoni in acquacoltura. Il successo della maturazione riproduttiva e il rilascio dei gameti vitali dipende dal corretto funzionamento di tutti i componenti dell'asse riproduttivo nell’intero ciclo riproduttivo, dalla

gametogenesi alla deposizione delle uova. La secrezione sincronizzata di GnRH, GTHs e steroidi attraverso il ciclo riproduttivo e la loro azione coordinata è essenziale per il successo della deposizione delle uova. Lo stress associato alla cattività o all'assenza di adeguate condizioni ambientali negli allevamenti in “facilities”, può agire sulla secrezione neuroendocrina inibente dell’encefalo e quindi bloccareo l’asse riproduttivo, inibendo il successo riproduttivo. 4.1 Ormone rilasciante le gonadotropine dell’encefalo (GnRH) Il cervello è il più alto livello dell'asse riproduttivo e agisce come il direttore della riproduzione, integrando le informazioni esterne ed interne e rispondendo con segnali neuroendocrini. Il sistema neuronale primario nella regolazione della riproduzione in tutti i vertebrati è il GnRH. Questo è un neuroormone sintetizzato in specifiche aree del cervello, da cui le cellule GnRH proiettano le fibre neuronali direttamente nell’ipofisi. Questo sistema è unico nel pesce, poiché in vertebrati superiori i neuroni GnRH non si proiettano direttamente nella ghiandola ipofisaria, ma terminano nell’eminenza mediana e GnRH viene rilasciato in un sistema portale, da dove raggiunge la ghiandola ipofisaria. Il GnRH viene rilasciato in vicinanza alle cellule gonadotrope, si lega a specifici recettori di membrana e stimola la sintesi e il rilascio di FSH e LH. Dato il suo ruolo cruciale per l'integrazione e la regolazione della segnalazione neuroendocrina che regola la riproduzione, il sistema GnRH è stato al centro di una intensa ricerca in biomedicina riproduttiva, sia per la ricerca di base che applicata per l’utilizzo di farmaci derivati dal GnRH per il trattamento di disordini riproduttivi. Il GnRH è un decapeptide che è stato scoperto nel cervello di una specie di mammifero e originariamente chiamato ormone rilasciante l’ormone luteinizzante (LHRH), data la sua attività LH-rilasciante. Successivamente è stato chiamato GnRH di mammifero (mGnRH), una nomenclatura più appropriata dopo la dimostrazione della sua azione stimolante sulla secrezione di FSH e LH. Dopo la caratterizzazione del primo GnRH, altre forme di GnRH sono state isolate e caratterizzate dal cervello di altre specie, e ad oggi sono note 24 forme diverse di GnRH. Da questi, 14 varianti sono state identificate nei vertebrati, 9 nei tunicati e 1 in un mollusco cefalopode. Tutti i GnRHs sono decapeptidi (ad eccezione del GnRH del polipo, che è una dodecapeptide), con lievi variazioni nella loro sequenza aminoacidica. Ogni GnRH identificato è stato chiamato con il nome delle specie in cui è stato scoperto (Tabella 1).

Tabella 1 - Struttura primaria delle 24 forme native note di GnRH. La prima scoperta (mGnRH) è preso come riferimento. Il GnRH di Octopus è l'unica variante con 12 aminoacidi, presentando un inserimento Asn-Tyr all'estremità N-terminale. Il GnRH di medaka (mdGnRH) è anche conosciuto come pejerrey GnRH (pjGnRH).

Oltre alla molteplicità di varianti di GnRH, un dato importante era la dimostrazione che la maggior parte delle specie dei vertebrati esprime più di una forma di GnRH nel cervello. Come regola generale, due GnRHs sono espressi simultaneamente nel cervello di una determinata specie, localizzate in diverse regioni del cervello e apparentemente esercitanti distinte funzioni biologiche. Uno è direttamente coinvolto nella regolazione della secrezione della ghiandola ipofisaria (sistema ipofisiotropico) mentre l'altro GnRH non lo è. I pesci sono unici tra i vertebrati, perché alcune specie di teleostei esprimono tre forme di GnRH nel cervello. In queste specie, il terzo GnRH è legato al sistema ipofisiotropico e probabilmente lavora con il primo GnRH in maniera coordinata nella regolazione della secrezione ipofisaria. A causa del numero crescente di forme di GnRH e nomi proposti, la nomenclatura del GnRH è diventata in qualche modo confusa. Recentemente, un nuovo e più appropriato nome è stato proposto per la famiglia GnRH, sulla base filogenetica e sui dati neuroanatomici. Questa nomenclatura raggruppa tutti i GnRHs in tre tipi principali, chiamati GnRH-1, GnRH-2 e GnRH-3.

Il GnRH-1 rimanda alla forma direttamente coinvolta nella regolazione della secrezione di GHT ipofisaria, il classico sistema ipofisiotropico. Nella vecchia nomenclatura questo GnRH-1 corrisponderebbe ad una delle undici varianti di GnRH, a seconda della specie: mGnRH o gpGnRH nei mammiferi e nei pesci primitivi (ad esempio, Anguilla spp), cGnRH-I in uccelli e rettili, frGnRH in anfibi e sGnRH, ctGnRH, sbGnRH, hgGnRH, mdGnRH, whGnRH o dfGnRH nei pesci. Questi GnRHs hanno in comune la loro funzione biologica e la distribuzione nel cervello. Essi sono sintetizzati dai neuroni situati nell'ipotalamo, da dove inviano numerose proiezioni all'ipofisi, dove viene rilasciato il GnRH-1 per stimolare la secrezione di GTH. Il GnRH-2 si riferisce alla forma sintetizzata dai neuroni situati nel mesencefalo. Questi neuroni non inviano proiezioni all'ipofisi, dove questa forma è assente, e pertanto, si ritiene che GnRH-2 non ha un ruolo diretto nel controllo della secrezione di GHT da parte dell’ipofisi. A differenza del precedente sistema, il GnRH-2 corrisponde sempre alla variante cGnRH-II della vecchia nomenclatura. Tutte le specie studiate, dai pesci ai mammiferi, esprimono cGnRH-II in questa zona del cervello. Questo sistema ubiquitario, altamente conservato nell'evoluzione, dovrebbe avere funzioni importanti, ma ad oggi non ci sono chiare evidenze delle specifiche funzioni biologiche di GnRH-2, sebbene sia sostenuto un suo potenziale ruolo nella regolazione del comportamento riproduttivo. Il sistema di GnRH-3 è unico nei pesci teleostei. Esso è chiaramente legato al GnRH-1, considerando i dati filogenetici e morfologici. La localizzazione dei neuroni di GnRH-3 varia leggermente tra le specie, ma normalmente si sovrappone con quella dei neuroni GnRH-1. Tuttavia, GnRH-3 è sempre predominante nelle regioni anteriori (bulbi olfattivi), mentre GnRH-1 predomina nell'area preottica (ipotalamo). I neuroni GnRH-3 inviano alcune proiezioni all’ipofisi, suggerendo un potenziale coinvolgimento nella co-regolazione della secrezione ipofisaria. La molteplicità delle varianti di GnRH e la presenza contemporanea di più GnRHs nel cervello ha sollevato questioni importanti sulle loro funzioni biologiche specifiche, ma anche sullo sviluppo di specifici analoghi derivati dal GnRH per applicazioni terapeutiche. È stato dimostrato che tutte le forme di GnRH stimolano la secrezione di LH. La ricerca sulla struttura e attività di GnRH è stata indirizzata verso lo sviluppo di agonisti del GnRH (GnRHa), in cui le modifiche della struttura di GnRH potrebbero portare ad una maggiore bioattività rispetto alla forma nativa. Le regioni altamente conservate della struttura decapeptide, l’NH2-terminale (pGlu-His-Trp-Ser), il COOH-terminale (Pro-GlyNH2) e l'ammino acido in posizione sei, sono indicativi dell'importanza di queste sequenze nella bioattività della molecola, in riferimento alla resistenza enzimatica, al legame recettoriale e all’attivazione. Sulla base di questi studi, migliaia di GnRHa e antagonisti sono stati sviluppati per applicazioni terapeutiche nel controllo dei disturbi della riproduzione. L'azione stimolante del GnRH sulla secrezione di GTH è dipendente dalla presenza dei recettori del GnRH (GnRH-R) nell’ipofisi. Così come i ligandi GnRH, anche molteplici recettori GnRH-R sono espressi in una singola specie. Nei mammiferi sono stati identificati due tipi di GnRH-R, di tipo I e tipo II, che mostrano una specificità di ligando per ogni variante del GnRH. Nei pesci, molteplici GnRH-R sono stati identificati e, a differenza dei mammiferi, non mostrano specificità di ligando Tutti i GnRH-R dei pesci mostrano maggiore affinità per cGmRH-II che per sGnRH o per la forma iopofisiotropica. I livelli di espressione dei geni GnRH-R nell’ipofisi mostrano un andamento stagionale, fattore importante che influenza la risposta stagionale della ghiandola ipofisiaria alla stimolazione del GnRH. Alti livelli di GnRH-R e quindi più alta reattività dell'ipofisi si verificano nel periodo di pre-deposizione delle uova, mentre bassi livelli di GnRH-R si trovano durante il periodo di riposo e le prime fasi di sviluppo gonadico. Questo è fondamentale non solo per lo sviluppo naturale del ciclo riproduttivo, ma anche quando si applicano terapie ormonali, poiché questo incide notevolmente sull'efficienza dei trattamenti ormonali basati sul GnRHa basati, a seconda del momento del ciclo in cui i trattamenti sono applicati. Oltre al sistema di stimolazione primario GnRH, la secrezione di GTH è sotto l’influenza di un tono inibitorio del cervello, del sistema dopaminergico. I neuroni che secernono la dopamina (DA) esercitano un'azione inibitoria sia su cervello che ipofisi. DA inibisce la sintesi e il rilascio di

GnRH. Nella ghiandola ipofisaria, DA down-regola GnRH-R e interferisce con le vie di trasduzione del segnale di GnRH, inibendo la secrezione di LH da parte dell’ipofisi stimolata dal GnRH. Una inibizione dopaminergica del rilascio di LH è stata dimostrata in tutti i vertebrati, anfibi, uccelli, mammiferi ed esseri umani. La sua intensità e il momento di azione possono differire notevolmente tra le specie, a seconda soprattutto delle differenti strategie riproduttive. Nei pesci, un'inibizione dopaminergica della riproduzione è stata dimostrata nei ciprinidi, nei siluridi, nei salmonidi, nella tilapia (Oreochromis spp.), nell’anguilla europea (Anguilla anguilla) e nel cefalo (Mugil cephalus). In queste specie, DA inibisce fortemente l’aumento pre-ovulatorio di LH stimolato dal GnRH e, quindi, l'ovulazione e la deposizione delle uova; sembra anche essere coinvolto nella inibizione della pubertà. Al contrario, un sistema inibitore della DA sembra essere molto debole o assente nella maggior parte dei pesci marini. Anche se GnRH è il principale regolatore della riproduzione, il cervello sintetizza altri neuro-ormoni e neurotrasmettitori che stimolano la secrezione di LH e partecipano alla regolazione della riproduzione dei pesci. Tra questi i più rilevanti sono il neuropeptide Y (NPY) e il neurotrasmettitore Ã-amino-acido butiric (GABA). Il NPY è coinvolto nella regolazione dello stato nutrizionale del pesce; i neuroni NPY esercitano azioni di stimolo sia su GnRH che su GTH e sembrano giocare un ruolo importante nel correlare i segnali dell'alimentazione e della riproduzione. Il GABA è il più rilevante neurotrasmettitore del cervello; nei mammiferi e nei pesci esercita un'azione stimolante sulla secrezione di LH. Sembra che i neuroni GABA nel cervello, svolgano un ruolo importante nella interconnessione dei diversi sistemi neuronali, sincronizzazione e messa a punto delle secrezioni neuronali provenienti da sistemi diversi. Altri sistemi neuronali sono stati anche dimostrati di esercitare una certa azione stimolante di LH, ma sono di minore rilevanza. In generale, tutti questi sistemi neuronali agiscono sui neuroni GnRH sulle gonadotropine che stimolano la secrezione di GnRH, sui livelli di GnRH-R e sulla sintesi e rilascio di FSH / LH. Essi possono anche agire sui neuroni dopaminergici, inibendo la secrezione di DA ed esercitando quindi una azione stimolante sul rilascio di LH. Questa rete neuronale sembra essere finalizzata nel mettere a punto il corretto funzionamento del sistema endocrino primario GnRH-GTH. 4.2 Gonadotropine ipofisarie (GTH) L'ipofisi è un importante ghiandola endocrina localizzata nella regione ventrale del cervello ed è responsabile del rilascio delle GTHs, oltre a diversi altri ormoni coinvolti nella crescita, nel metabolismo e nell'adattamento allo stress. Le due GTHs ipofisarie, FSH e LH, insieme con la tiroide-stimolante (TSH) e la gonadotropina corionica placentare (CG), costituiscono una famiglia di molecole strutturalmente correlate, gli ormoni glicoproteici. Esse sono proteine eterodimeriche, costituite da una comune subunità α, legata in maniera non covalente a una subunità β specifica dell’ormone che conferisce la specificità biologica all'ormone. Ogni subunità è codificata da un gene diverso. Subito dopo la sintesi, la catena peptidica è ripiegata, glicosilata e assemblata per formare la conformazione dimerica, necessaria per la attività biologica dell'ormone. La bioattività dei GTHs dipende dalla durata di tempo che l'ormone è presente nella circolazione (emivita), dal legame a recettori specifici e all'attivazione di meccanismi di trasduzione del segnale intracellulare che conducono alla risposta biologica. L'emivita dei GTHs nel sangue è determinata principalmente dal suo grado di glicosilazione. Questo è uno dei principali motivi per l'uso di CG umana (hCG) nel trattamento ormonale di diversi disturbi riproduttivi, inclusi i protocolli di induzione di deposizione delle uova nei pesci. L'hCG è la più altamente glicosilata GTH e quindi, presenta maggiore resistenza alla degradazione di qualsiasi altra glicoproteina, avendo così effetti di lunga durata d'azione. La stimolazione delle cellule bersaglio dipende anche dal legame di GTH e dall'attivazione di specifici recettori di membrana. Ci sono due tipi di recettori GTH,che esibiscono la specificità di ligando per ogni gonadotropina. La specifica subunità β determina la specificità di legame (FSH per l'FSH-R, LH per LH/CG-R), impedendo l'interazione di un dato GTH con i

recettori di altre glicoproteine. CG umana (hCG) si lega agli stessi recettori di LH. Questo è un’importante ragione che giustifica l'uso di hCG come trattamento ormonale per l'induzione della deposizione delle uova nei pesci, poichè hCG esplica funzioni simili a LH e quindi induce l'ovulazione e la spermiazione nei pesce in cattività (vedi paragrafi seguenti). Per molti anni, si è creduto che l'ipofisi dei pesci generasse un singolo GTH responsabile del controllo di tutti gli aspetti della riproduzione, in contrasto ai vertebrati superiori. Questo singolo GTH dei pesci aveva caratteristiche simili a LH dei vertebrati superiori. Nel 1988, due GTHs distinti sono stati purificati e identificati per la prima volta dall'ipofisi di una specie di pesce, e chiamati GTH-I e GTH-II. La somiglianza di questi GTHs di pesci con FSH e LH dei tetrapodi è stata stabilita attraverso tecniche molecolari, biochimiche e immunologiche. Ecco perché in riferimento alla letteratura sulla riproduzione dei pesci, occorre precisare che prima del 1988 ci si riferisce solo al nome "GTH", facendo riferimento all’ormone successivamente identificato con LH. Nel corso del decennio successivo, le informazioni riguardanti le GTHs di pesce, si riferiscono ai nomi "GTH-I e GTH-II" (o "GTH-1 e GTH-2"): GTHII è il GTH precedentemente conosciuto (ormone LH-like) e GTH-I l’ormone scoperto successivamente. Questa nomenclatura è stata ormai abbandonata e la recente bibliografia dei pesci fa riferimento a "FSH e LH," standardizzando la nomenclatura con quella di tutti i vertebrati, con FSH omologo alla precedente GTH-I e LH al precedente GTH-II. Le informazioni sulle struttura, attività e funzioni biologiche di LH nella riproduzione dei pesci è molto più ampia di quella di FSH. Questo perché metodi immunologici per l'analisi della secrezione di LH nel pesce sono stati disponibili per molti decenni, mentre immunodosaggi FSH erano disponibili solo dal 1988, e limitati quasi esclusivamente alle specie di salmonidi. L'avvio del ciclo riproduttivo è caratterizzato da un aumento dei livelli di FSH, che restano elevati durante la gametogenesi, mentre i livelli LH rimangono non rilevabili. Durante la maturazione delle gonadi, i livelli di FSH diminuiscono e aumentano quelli di LH, mostrando un picco di LH prima dell'ovulazione. Il recente sviluppo di strumenti molecolari ha permesso l'analisi dei livelli di espressione dei geni FSH e LH in diverse specie di pesci, ottenendo informazioni sulle funzioni biologiche di entrambi gli ormoni in una gamma più ampia di pesci. Nelle specie di salmonidi, che mostrano uno sviluppo ovarico sincrono, i livelli di mRNA di βFSH aumentano durante la gametogenesi mentre βLH predomina durante FOM. Informazioni in specie non-salmonide mostrano un quadro leggermente diverso. Nell’orata (Sparus aurata), con lo sviluppo delle ovaie asincrono, sia βFSH che βLH sono espressi durante tutto l'anno, aumentando entrambi durante la stagione riproduttiva. In altre specie non-salmonide, caratterizzate da uno sviluppo delle ovaie asincrono o a più clusters sincroni, come ad esempio gourami blu (Trichogaster trichopterus), occhialone (Pagrus major), spigole (Dicentrarchus labrax) e spinarelli (Gasterosteus aculeatus), i livelli di espressione genica di FSH e LH sono presentidurante l’intero ciclo riproduttivo, anche se nella maggior parte dei casi la sintesi di FSH è maggiore rispetto a quella di LH. L'opinione generale è che FSH controlli principalmente le prime fasi della gametogenesi, mentre LH regoli FOM, l'ovulazione e la spermiazione. Tuttavia, è chiaro che ci sono differenze importanti tra specie di pesci, probabilmente correlate a differenti modelli di sviluppo delle gonadi e differenti strategie riproduttive. 4.3 Steroidi delle gonadi La gonade è il tessuto deputato alla generazione dei gameti, ma anche un importante organo endocrino, specializzato nella sintesi di ormoni steroidei sessuali. Questi ormoni steroidei sono gli effettori endocrini finali di sviluppo delle gonadi, in coordinamento con le GTHs ipofisarie. La steroidogenesi avviene nelle cellule somatiche della gonade, le cellule della granulosa e della teca nelle ovaie e le cellule interstiziali di Leydig e cellule di Sertoli nei testicoli. I principali ormoni steroidei nella regolazione della gametogenesi dei pesci sono l’estrogeno estradiolo (E2) nelle femmine e l’androgeno 11ketotestosterone (11KT) nei maschi. Nei mammiferi, l'estrogeno

principale nelle femmine è sempre E2, ma l'androgeno principale nei maschi è il testosterone (T), invece di 11KT, e in misura minore il diidrotestosterone (DHT). L'ovaio dei pesci sintetizza anche T, che svolge altre funzioni correlate riproduttive. Allo stesso modo, anche i maschi sintetizzano E2, ma questo si trova a livelli molto più bassi rispetto alle femmine. I testicoli dei pesci maschi producono altri androgeni oltre 11KT (ad esempio, T), che esercitano funzioni complementari durante lo sviluppo del testicolo. Oltre al loro ruolo nella regolazione dello sviluppo delle gonadi, gli ormoni steroidei sessuali esercitano anche feedback sia positivi che negativi sull'asse cervello-ipofisi e quindi, regolano il rilascio di GTH. Un’importante azione positiva degli steroidi è quella di migliorare la risposta ipofisaria al GnRH, probabilmente stimolando GnRH-R. Un’importante azione negativa di questi ormoni steroidei viene esercitata attraverso il sistema dopaminergico, aumentando il turnover di DA e migliorando così il tono inibitorio DA sulla secrezione di GTH. In questo modo, il cervello è costantemente informato circa l'evoluzione dello sviluppo delle gonadi, attraverso l'azione della fluttuazione dei livelli di steroidi circolanti durante il ciclo riproduttivo. 4.3.1 Gli steroidi che regolano l’oogenesi femminile e la maturazione Nelle femmine, E2 agisce in coordinamento con le GTHs ipofisarie nella regolazione dello sviluppo degli ovociti. Nelle ovaie, la steroidogenesi è un processo biosintetico in cui lo strato esterno della teca sintetizza precursori steroidei che sono trasportati nelle cellule della granulosa, dove vengono trasformati in derivati. Durante la vitellogenesi, le cellule della teca sintetizzano T che viene convertito in E2 nelle cellule della granulosa, dall’azione dell'enzima aromatasi. Durante la vitellogenesi, E2 esercita due funzioni principali, una nella gonade che regola lo sviluppo dell’ovocita ed una nel fegato stimolando la sintesi di VTG e altre proteine del tuorlo. Una volta che la vitellogenesi è completata, la secrezione ipofisaria di LH induce un cambiamento nell’attività biosintetica degli steroidi dell'ovaio con una riduzione della produzione di T ed E2 e un potenziamento della sintesi di MIS. Ciò è causato dalla riduzione della attività della aromatasi e una maggiore attività degli enzimi della via MIS. Ci sono due principali MIS identificato nei pesci, 17α,20β,diidrossi-4-pregnen-3-one (17,20β-P o DHP) e 17α,20β,21-triidrossi-4-pregnen-3-one (20β-S). Entrambi probabilmente agiscono come MIS nella maggior parte dei pesci, ma normalmente uno di questi rappresenta il MIS predominante per una determinata specie. Il 17,20β-P è il principale MIS in diverse specie di salmonidi e non salmonidi, mentre 20β-S è il principale MIS nell’ombrina Atlantica, nella trota di mare e nella spigola. La sintesi di MIS è anche un processo a due cellule, con cui il precursore 17α-idrossiprogesterone è sintetizzato nelle cellule della teca e trasformato in 17,20β-P nelle cellule della granulosa, dall'enzima 20βidrossisteroide deidrogenasi. Il MIS insieme alla secrezione di LH ipofisaria regola la maturazione delle gonadi. L'azione di MIS su FOM non è diretta, ma mediata dalla complessa interazione di fattori diversi, tra cui prostaglandine (PGE1, PGE2, PGF1α, PGF2α), fattori di crescita insulino-simile (IGF-I e IGF-II), activina B e altre vie di trasduzione del segnale. È l'aumento di MIS piuttosto che la riduzione di altri steroidi responsabile dell’induzione di FOM. È per questo che in molte specie di pesci i livelli ematici di estrogeni rimangono elevati durante la maturazione gonadica. In riproduttori multipli e in alcuni singoli riproduttori, i livelli plasmatici di MIS correlano bene con il ciclo di maturazione e i livelli di E2 sono mantenuti alti durante l’intero periodo di maturazione. Durante la maturazione, l'ovocita passa prima attraverso una fase di competenza di maturazione degli ovociti (OMC) che precede FOM. Durante questa fase, l'ovocita acquisisce la competenza a maturare, ovvero le cellule del follicolo sono stimolate da LH a produrre fattori necessari per la biosintesi di MIS (enzimi, etc.) e la stimolazione delle cellule germinali a rispondere a MIS (recettori MIS, etc.) MIS. Durante OMC, che si sviluppa senza secrezione di MIS, i primi segni di FOM sono evidenti (coalescenza dei granuli di lipidi e GVM). Durante la FOM, la secrezione di

MIS LH-dipendente dalle cellule follicolari agisce su recettori di membrana degli ovociti per sottoporli alla coalescenza finale dei granuli tuorlo, GVBD e la ripresa della meiosi. 4.3.2 Gli steroidi che regolano la spermatogenesi maschile e la maturazione La spermatogenesi testicolare e la maturazione è regolata anch’essa dalla secrezione delle GHT ipofisaria ma l'azione degli steroidi secreti dai testicoli ha una più forte influenza. L’androgeno 11KT è il principale regolatore della spermatogenesi, mentre MIS regola la maturazione degli spermatozoi. Entrambi gli steroidi vengono sintetizzati dalle cellule somatiche dei testicoli sotto stimolazione delle GTH. L'LH è principalmente coinvolto nella stimolazione di della produzione di androgeni nelle cellule di Leydig, mentre FSH sembra esercitare funzioni più complesse nei testicoli maschili, stimolando la produzione di androgeni nelle cellule di Leydig e regolando l'attività delle cellule del Sertoli durante la spermatogenesi. Anche se i meccanismi di regolazione di FSH sono più sconosciuti, possibili funzioni di FSH nei testicoli sono la stimolazione di proliferazione e differenziamento delle cellule del Sertoli e la sintesi di fattori di crescita, che agiscono come fattori autocrini e paracrini coinvolti nella proliferazione cellulare e nel differenziamento delle cellule del Sertoli e nello sviluppo delle cellule germinali. Prima di iniziare la spermatogenesi, il rinnovamento delle cellule staminali spermatogoniali sembra essere regolata da E2 agendo sulle cellule del Sertoli. Ad un certo momento, la secrezione ipofisaria di GTHs (soprattutto FSH) induce il passaggio dal rinnovamento spermatogoniale a proliferazione di spermatogoni, che rappresenta l'inizio della spermatogenesi. L'FSH agisce sulle cellule del Sertoli e stimola la biosintesi di 11KT attraverso l'attivazione di enzimi specifici (11β-idrossilasi e 11β-idrossisteroide deidrogenasi). Da allora in poi, 11KT regola il completo processo della spermatogenesi, un'azione che viene mediata da fattori di crescita secreti dalle cellule del Sertoli. Nei maschi, i livelli di FSH sono elevati all’inizio della spermatogenesi, raggiungono i massimi livelli durante la fase di rapida crescita testicolare e diminuiscono dopo la deposizione delle uova. D'altra parte, LH è molto bassa nella prima spermatogenesi, inizia ad aumentare durante la fase di rapida crescita testicolare e mostra dei picchi durante la deposizione delle uova. Con l'avanzare della spermatogenesi, LH diventa importante nel sostenere la produzione di 11KT. Dopo il completamento della spermatogenesi, la secrezione di LH da parte cdell’ipofisi induce un cambiamento nel percorso steroiodogenico dei testicoli portando alla produzione di MIS, che a sua volta regola la maturazione degli spermatozoi. Durante la maturazione, 17αhydroxyprogesterone sintetizzato nelle cellule di Leydig viene convertito in MIS negli spermatozoi grazie all'attività di 20β-idrossisteroide deidrogenasi. L'azione di MIS sulla maturazione degli spermatozoi non è diretta sullo sperma, ma attraverso l'attivazione di specifici enzimi che aumentano il pH del plasma seminale, che a sua volta induce la capacitazione degli spermatozoi. Nei maschi, la produzione di androgeni rimane alta per tutto il periodo di maturazione sessuale, anche quando i livelli di MIS sono elevati. 5. DISFUNZIONI RIPRODUTTIVE NEI PESCI IN CATTIVITA’ Come indicato nelle sezioni precedenti, vi è una variazione significativa nelle strategie riproduttive dei pesci e nel tipo di sviluppo delle gonadi. Durante il loro ciclo riproduttivo, che può durare per giorni, mesi o anni a seconda della specie, i pesce subiscono una varietà di influenze esterne. Nel loro habitat naturale, l’asse endocrino riproduttivo dei pesci funziona correttamente e la riproduzione si sviluppa con successo, con la deposizione delle uova che si svolge nel momento in cui i pesci rilevano che le condizioni esterne sono le più idonee per la sopravvivenza della prole e, naturalmente, la propria sopravvivenza. Purtroppo, la situazione potrebbe cambiare drasticamente quando i pesci vengono allevati in cattività e la riproduzione è in qualche modo influenzata dalle condizioni di cattività. In realtà, tutte le specie di pesci tenuti in cattività presentano un certo grado di disfunzione riproduttiva; e normalmente le femmine presentano problemi riproduttivi più gravi.

Queste disfunzioni dipendono dalla specie e possono variare da una totale assenza di deposizione delle uova ad una significativa riduzione della quantità e qualità di uova e sperma prodotti. I problemi riproduttivi rilevati nei pesci in cattività derivano da due cause: lo stress associato alla cattività e l'assenza di appropriati segnali ambientali permissivi per la riproduzione. L'azione di uno di questi fattori o la combinazione di entrambi sottende l'inibizione totale o parziale di riproduzione in cattività. Pertanto, il compito principale di un gestore della riproduzione sarà minimizzare gli effetti negativi di questi due parametri, così da ottenere le migliori prestazioni riproduttive degli allevamenti. L'influenza negativa dello stress dovrebbe essere minimizzata da parte dei riproduttori attraverso un’adeguata gestione (manipolazione, cura, profilassi degli animali, etc.) e adeguate condizioni di allevamento (progettazione del serbatoio, approvvigionamento idrico, intensità luminosa, ecc). Tali accortezze dovrebbero essere adattate a ciascuna specie, considerando che la resistenza e l’adattabilità allo stress varia da specie a specie. Il secondo parametro, l'assenza di appropriati segnali ambientali, è in qualche modo molto più difficile da risolvere. I riproduttori dovrebbe imparare il più possibile sulla biologia riproduttiva della specie nel proprio habitat naturale e cercare di adattare le condizioni di allevamento alla situazione naturale. Per molte specie, è quasi impossibile imitare le condizioni ambientali a cui è generalmente esposto il pesce durante la stagione riproduttiva (ad esempio, la migrazione verso le zone di riproduzione). La complessità dei fattori ambientali a cui il pesce è esposto durante l'intero periodo riproduttivo è un oggetto sconosciuto per la maggior parte delle specie e sarebbe, comunque, più probabilmente difficile da riprodurre in condizioni di allevamento. Questo è normalmente più fattibile per le specie non migranti che abitano gli habitat stabili, ma diventa più complesso o impossibile per le specie migratorie a lunga distanza (ad esempio, Anguilla spp, Seriola spp, e Thunnus spp). In ogni caso, meglio saranno mimati i segnali ambientali, minori saranno i problemi che avranno gli allevatori per la riproduzione. Se i disordini riproduttivi persistono anche dopo aver curato al massimo le condizione di allevamento per ridurre gli effetti negativi questi parametri, allora è possibile utilizzare trattamenti ormonali per superare i problemi riproduttivi, come dimostrato per molti pesci in allevamento. Il sistema sensoriale ed endocrino dei pesci si è evoluto per riconoscere quando le condizioni esterne e interne sono ottimali per lo sviluppo riproduttivo e ha la capacità di: 1) in condizioni ottimali completare lo sviluppo riproduttivo e deporre le uova, 2) in condizioni sub-ottimali arrestare lo sviluppo in una fase particolare e rinviare la produzione di gameti quando saranno migliorate le condizioni, o 3) in condizioni non ottimali abortire lo sviluppo riproduttivo, riassorbire le sostanze nutritive investite per la gonade e riportare la gonade ad una fase di riposo. Queste strategie sono state sviluppate per garantire la sopravvivenza sia della prole che dei genitori. In condizioni ottimali il sistema sensoriale ed endocrino dei genitori ha la capacità di riconoscere se la prole ha una elevata possibilità di sopravvivenza, quindi, i genitori rischiano la propria sopravvivenza investendo le energie per la riproduzione e la deposizione delle uova. Tuttavia, quando le condizioni non sono ottimali per la deposizione delle uova il sistema endocrino riconosce che le energie investite dai genitori nella maturazione non può essere ricompensato con la sopravvivenza della prole pertanto la maturazione viene arrestata o, in condizioni estreme, interrotta. In cattività, di solito le femmine mostrano maggiori problemi riproduttivi rispetto ai maschi; le disfunzioni femminili possono essere classificati in tre tipi principali (Fig. 6).

Figura 6 - Le principali disfunzioni riproduttive osservate nelle femmine dei pesci in cattività. Sono classificate in tre tipi principali (indicate da X), 1) l'inibizione della vitellogenesi, 2) l'inibizione della maturazione dell’ovocita che provoca atresia degli ovociti post-vitellogenici e, 3) l'inibizione della deposizione delle uova, con gli ovociti ovulati trattenuti nella cavità ovarica o addominale. Ogni tipo è fisiologicamente diverso, ma la conseguenza finale è simile per la aquaculturista, l'assenza di spontanea deposizione delle uova nel serbatoio. L'applicazione di trattamenti ormonali ha efficacemente risolto la riproduzione in molte specie che esibiscono la disfunzione di tipo due. Soluzioni per la disfunzione di tipo uno è in fase di studi, mentre la riproduzione di specie con il tipo di disfunzione tre può essere raggiunta attraverso la fecondazione artificiale, dopo la rimozione manuale di uova e sperma. Il primo tipo è l'inibizione della vitellogenesi. In queste specie, la riproduzione è bloccato nelle primissime fasi dello sviluppo, ad esempio, Anguilla spp e qualche volta Seriola spp. Fisiologicamente, questo è il disturbo riproduttivo più grave, poiché il sistema riproduttivo endocrino del pesce non ha funzionato in nessun momento del processo riproduttivo. Il secondo tipo di disfunzione riproduttiva è l'inibizione del processo di FOM. Nelle specie che presentano questo problema, la vitellogenesi è stata completata correttamente, ma gli ovociti post-vitellogenici non sono in grado di sottoporsi a FOM e diventano atresici. Il grado dell'inibizione varia a seconda della specie e anche delle condizioni ambientali di ogni stagione riproduttiva specifica. L’atresia può interessare l'intera popolazione di ovociti postvitellogenici della gonade, causando la totale assenza di deposizione delle uova, oppure può interessare solo una parte degli ovociti post-vitellogenici, che infine causa una riduzione del numero di uova rilasciato. La produzione di uova diminuita può essere lieve, o può essere drammatica, provocando solo una sporadica deposizione di poche uova. Questo secondo tipo rappresenta la disfunzione riproduttiva più comune e viene rilevata nella maggior parte delle specie ittiche allevati in cattività. Il terzo tipo di disfunzione riproduttiva è l'inibizione della deposizione delle uova soltanto. I pesci che presentano questa disfunzione sono sottoposti correttamente a tutte le fasi del ciclo riproduttivo, con gli ovociti che passano attraverso vitellogenesi, FOM e ovulazione, ma la deposizione delle uova è bloccata e gli ovociti ovulati rimangono nella cavità ovarica o addominale. Questo è, fisiologicamente, la meno grave di tutte le disfunzioni riproduttive, poiché solo l'evento di deposizione delle uova è inibito di tutto il processo riproduttivo, anche se la conseguenza finale è simile, l'assenza di deposizione spontanea. Questa tipologia di disfunzione è osservata nei salmonidi e in alcuni pesci piatti (ad esempio, rombo Psetta maxima). In queste specie, è necessaria la rimozione manuale delle uova (cioè strippaggio). Se stripping non è eseguito, le uova degenerano e vengono riassorbite, ma possono causare la morte della femmina.

Anche se stripping e fecondazione artificiale sono attività comuni nei vivai di queste specie, esse rappresentano ancora un grave problema di gestione, poiché lo stripping deve essere cronometrato per evitare un'eccessiva maturazione delle uova e una riduzione della qualità. Richiede inoltre ripetuta manipolazione da parte degli allevatori poiché le femmine sono generalmente asincrone e ogni animale deve essere controllato per determinare la sua fase di ovulazione, cosa anche alquanto stressante per i riproduttori. Sebbene i disturbi riproduttivi sono più comuni e gravi nelle femmine, anche i maschi riportano alcuni problemi importanti. Comunque, tranne in rari casi, i maschi di tutte le specie di pesci di solito in cattività sono in spermiazione. Le disfunzioni riproduttive rilevate in pesci di sesso maschile in cattività sono diminuite volume di sperma e diminuita fluidità del liquido, che possono influenzare negativamente il successo di fecondazione dell'uovo. La produzione di spermatozoi diminuita rappresenta un serio problema per quelle specie in cui la riproduzione in cattività si basa sulla fecondazione artificiale e sull'acquisizione di gameti mediante stripping manuale. La difficoltà ad ottenere abbastanza sperma dagli animali è in grado di bloccare i programmi di fertilizzazione e richiede la gestione di un numero elevato di riproduttori maschi. D'altra parte, per specie che depongono spontaneamente nelle vasche, la produzione di liquido altamente viscoso riduce la rapida dispersione degli spermatozoi e quindi riduce la loro capacità fecondante. 6. TECNICHE PER LA MANIPOLAZIONE AMBIENTALE DELLA RIPRODUZIONE

DEI PESCI Come descritto nella sezione ambientale e più completamente in quella riproduttiva, quando le condizioni ambientali non sono ottimali, come spesso accade per i pesci tenuti in cattività, la maturazione può essere arrestato fino a quando le condizioni sono tali da permettere che essa possa procedere oppure, in condizioni estreme, addirittura che venga bloccata e le gonadi fatte regredire. Lo scopo della manipolazione ambientali è quello di fornire condizioni che siano sufficientemente vicine alle condizioni ottimali o naturali per indurre nella maggior parte dei pesci il completamento della la maturazione e la deposizione delle uova. Le manipolazioni ambientali possono essere utilizzate per realizzare due scopi: 1) adeguare gli aspetti della natura mutevole all’ambiente in cattività per assicurare che i pesci procedano alla maturazione e alla deposizione delle uova durante la stagione riproduttiva naturale o, 2) fornire il ciclo completo delle modificazioni ambientali necessarie ad indurre l'intero ciclo di maturazione e la deposizione delle uova fuori stagione ottenendo così la produzione della uova al di fuori della stagione naturale di deposizione.. Durante queste manipolazioni la preoccupazione principale è quella di fornire le condizioni corrette o ottimali per la deposizione delle uova e condizioni ottimali per la gametogenesi. La gametogenesi sembra essere più flessibile o avere una gamma più ampia ottimale per lo sviluppo, mentre la deposizione delle uova richiede spesso condizioni molto precise. Pochi studi hanno esaminato in realtà la flessibilità ambientale della gametogenesi. Tuttavia, un certo numero di studi in cui hanno utilizzato il controllo ambientale per ottenere con successo la deposizione fuori stagione è stato anche inavvertitamente modificato il tempo della gametogenesi in coincidenza con temperature molto estreme rispetto alle temperature normalmente presenti durante la gametogenesi e apparentemente senza effetto negativo sulla deposizione delle uova o sulla qualità delle uova nella trota iridea (Oncorhynchus mykiss), nel salmone atlantico (Salmo salar) e nel branzino (Dicentrarchus labrax). Per garantire la deposizione delle uova durante la stagione riproduttiva naturale, le considerazioni principali sono: l’ambiente nelle vasche, la qualità dell'acqua, lo spazio e gli aspetti sociali e temperatura (supponendo che fotoperiodo è ambiente). In poche parole, la qualità dell'acqua dovrebbe essere la migliore disponibile, il numero di maschi e femmine deve essere corretto in base alla specie, la densità di stoccaggio degli animali dovrebbe essere bassa (ad esempio, <5 kg m-3),

ed è richiesto lo spazio necessario per la formazione dei gruppi sociali e di corteggiamento. Infine e forse più importante, la temperatura dovrebbe essere nell'intervallo che la specie richiede per la deposizione delle uova. Nella sezione successiva sono riportati alcuni esempi di specie allevate ed è descritto come viene eseguita la selezione e il trasferimento della corretta proporzione di maschi e femmine di carpe adulte e pesci gatto per la deposizione delle uova, la preparazione di appositi spazi che forniscono il substrato per la riproduzione, il profilo di temperatura ottimale, e la selezione di salmoni atlantici e il trasferimento in impianti di acqua dolce con temperature decrescenti. Questi tipi di manipolazioni possono anche essere utilizzato per modificare la temporizzazione o aumentare la lunghezza del periodo riproduttivo, infatti è stato osservato che avanzando, ritardando ed estendendo la finestra delle temperature ottimali è possibile anticipare, ritardare o estendere il periodo di deposizione delle uova. Per ottenere una deposizione fuori stagione, dovrebbero essere monitorati sia il fotoperiodo che la temperatura. Nella trota arcobaleno è stato stabilito che è la variazione del fotoperiodo e la durata del giorno influenza i ritmi che controllano la maturazione. Pertanto, poiché la maturazione nella trota iridea è influenzata dal fotoperiodo primavera-estate-autunno, l'applicazione di un fotoperiodo esterno altera i tempi di maturazione e di deposizione, infatti, è stato dimostrato che un fotoperiodo sfasato (spostando l'intero fotoperiodo di alcuni mesi) produrrà una maturazione sfasata, un fotoperiodo compresso (12 mesi di ciclo compresso a meno di 12 mesi) avanzeranno la maturazione ed un fotoperiodo espanso (ciclo di 12 mesi ampliato a più di 12 mesi) ritarderà la maturazione. Tuttavia, alcuni aspetti devono essere considerati. In primo luogo, la deposizione delle uova potrebbe non coincidere in relazione a un modificato fotoperiodo, per esempio con un fotoperiodo compresso ci si aspetta che la deposizione avvenga in ritardo rispetto al fotoperiodo compresso (ma in anticipo rispetto ai controlli in condizioni ambientali), per esempio per la trota, l'inverno o addirittura la primavera piuttosto che l'autunno. In secondo luogo, quando si applica un fotoperiodo modificato, qualsiasi modifica apportata per avviare il fotoperiodo interesserà i ritmi endogeni, ad esempio, l'applicazione di un fotoperiodo primaverile in estate (passando da luce:buio 12:12 a 18:6) sarebbe l'equivalente di applicare una riduzione diretta (autunno) seguito da una breve fotoperiodo invernale ed infine un crescente fotoperiodo primaverile. Come accennato in precedenza, gran parte dei lavori sulle trote sono stati effettuati in condizioni di temperatura costante di 8-11ºC, che rappresentano temperature ottimali per la gametogenesi della trota iridea e la deposizione delle uova. Riproduzioni fuori stagione per altre specie possono essere realizzate regolando il ciclo di fotoperiodo e temperatura nello stesso modo in cui il fotoperiodo è stato usato per manipolare la deposizione nelle trote iridee. Il modo più semplice e sicuro per manipolare la deposizione delle uova è quello di utilizzare cicli fototermici sfasati, come descritto per l’orata oppure fotoperiodi compressi come descritto per la trota iridea e la spigola. Infine alcune specie principalmente tropicali o sub-tropicali sembrano non richiedere periodi di regressione delle gonadi, di riposo e di recrudescenza, ma sono stimolati spesso durante i cicli ambientali stagionali. Per esempio, specie come tilapia, carpa e tamburo rosso quando portati alle condizioni di deposizione delle uova attraverso la manipolazione ambientale e tenuti in condizioni di riproduzione ottimali costanti (fotoperiodo e temperatura) è stato osservato che depongono per un anno intero. Nel caso del tamburo rosso due maschi e due femmine sono stati mantenuti nello stato di deposizione delle uova per 7 anni sotto un costante fotoperiodo di luce:buio 12:12 e una temperatura prossima a 24ºC. 7. TECNICHE PER LA STIMOLAZIONE ORMONALE Lo sviluppo e l'applicazione di terapie ormonali per il trattamento di disturbi della riproduzione nei pesci in allevamento hanno permesso la riproduzione in cattività di diverse specie di pesci che non riescono a riprodursi spontaneamente. Le terapie ormonali non hanno consentito solo la

riproduzione, ma hanno anche permesso il miglioramento delle prestazioni riproduttive dei pesci e lo sviluppo di una industria di acquacoltura con successo tecnologico ed economico per diverse specie di pesci. Nelle femmine in cattività che esibiscono una inibizione dello sviluppo delle gonadi (disfunzione di tipo I), i trattamenti ormonali possono stimolare la gametogenesi e la maturazione degli ovociti, tuttavia questo è ancora in fase sperimentale e non ancora fattibile per la produzione di uova su scala commerciale. Nel caso delle femmine con inibizione della deposizione delle uova (disfunzione tipo III), i trattamenti ormonali non sono realmente necessari per ottenere le uova, in quanto possono anche essere prelevati manualmente (stripping), tuttavia spesso sono utilizzati come strumento di gestione per sincronizzare l'ovulazione e quindi accelerare l’attività di acquisizione delle uova. È nelle femmine con inibizione della FOM (disfunzione tipo II) che l'uso di terapie ormonali ha dato i migliori risultati. Ci sono due situazioni principali in acquacoltura per l'uso della stimolazione ormonale per l'ottenimento di gameti: 1) per stimolare la deposizione delle uova in specie di pesci che, a causa di disfunzioni riproduttive non completano la maturazione in cattività o la deposizione delle uova è imprevedibile, e 2) per sincronizzare la deposizione delle uova dei riproduttori e, quindi, migliorare la gestione. Naturalmente, i tempi di deposizione delle uova di individui in un gruppo di riproduttori tenuto sotto le stesse condizioni saranno approssimato a quello di una distribuzione normale. La maggior parte dei riproduttori deporrà le uova durante il picco della stagione con alcuni riproduttori in anticipo e alcuni in ritardo. Questo può significare che all'inizio e alla fine del periodo riproduttivo non si ottengono uova sufficienti in modo da formare una coorte di giovani per formare un allevamento e, viceversa, nel picco della stagione riproduttiva troppe uova possono essere prodotte per le strutture disponibili per l'incubazione e l'allevamento larvale. Questo potrebbe rappresentare un problema particolare nelle specie che depongono le uova una volta all'anno, come la trota e il salmone. La stimolazione ormonale può essere utilizzata per sincronizzare e promuovere la deposizione di un gruppo di animali, dando la possibilità di gestire un certo numero di grandi lotti di uova nella stagione riproduttiva. La storia delle terapie ormonali per il trattamento delle disfunzioni riproduttive nei pesci è stata strettamente legata alle scoperte della ricerca nel campo della riproduzione endocrinologica e dei progressi tecnici nella purificazione e nello studio degli ormoni della riproduzione. Una scoperta chiave è la determinazione dei principali fallimenti endocrini sottostanti al blocco del processo riproduttivo nei pesci in cattività. È stato dimostrato in diversi pesci, che l'inibizione della deposizione spontanea in cattività era chiaramente legata alla inibizione del rilascio di LH da parte dell'ipofisi. Per le specie oggetto di indagine, è stato dimostrato che i pesci che depongono le uova nel loro habitat naturale presentavano alti livelli di LH nel sangue durante la maturazione degli ovociti, con il picco di LH tipico che precede l'ovulazione e la deposizione delle uova. In contrasto, i pesci tenuti in cattività che non depongono le uova spontaneamente, sono esposti a livelli di LH nel sangue altamente ridotti o assenti senza alcun picco di LH, anche in individui che presentavano alte concentrazioni di LH nella ghiandola ipofisaria. Pertanto, il blocco di ovulazione è stato specificamente legato ad una inibizione del rilascio di LH dall'ipofisi, indipendentemente dalla concentrazione ipofisaria dell'ormone. Questa scoperta è stata ulteriormente corroborata dalla applicazione di trattamenti ormonali che semplicemente inducevano il rilascio del LH immagazzinato nell’ipofisi di questi pesci, il quale ha ulteriormente stimolato la progressione della FOM e la deposizione delle uova. Le terapie ormonali sviluppate e applicate per l'acquacoltura nei pesci possono essere raggruppate in due tipi principali, "prima generazione" e tecniche di "seconda generazione". La prima generazione include le preparazioni a base di ormone ipofisario, e include gli estratti ipofisari e GTHs purificati. La seconda generazione comprende trattamenti basati sull'ormone del cervello, gli agonisti del GnRH (GnRHa) e antagonisti della dopamina (DA). Questi due tipi di terapie ormonali agiscono a

diversi livelli dell’asse BPG riproduttivo. Farmaci appartenenti al primo tipo agiscono direttamente sulle gonadi, mentre i farmaci del secondo tipo agiscono sull’ipofisi e quindi indirettamente sulla gonade, attraverso la stimolazione del rilascio ipofisario di GTH endogena. Questa è un’importante considerazione al momento di decidere il trattamento ormonale da applicare per una determinata specie; l'efficacia dei farmaci di seconda generazione dipende dalla risposta dell’ipofisi dei pesci trattati. Ciò significa che questi trattamenti possono essere totalmente inefficaci in specie in cui la ghiandola ipofisaria, per qualsiasi ragione, non rilascerà GTHs sotto trattamento GnRHa e, quindi, non si otterrà alcun effetto sulla gonade. D'altra parte, poiché i farmaci di prima generazione agiscono direttamente sulla gonade, la loro efficacia non dipende dal funzionamento dell'ipofisi dei pesci trattati. 7.1 Prima generazione: preparati di gonadotropine Il termine "preparati GTH" si riferisce a tutti quei preparati ormonali che mostrano attività GTH e comprendono omogenati ipofisari, estratti ipofisari (PE) e purificati di GTHs. Questi sono generalmente chiamati di prima generazione perché rappresentano il primo tipo di trattamenti ormonali sviluppati e applicati per la stimolazione della riproduzione. Tutti hanno in comune il loro organo bersaglio, poichè tutti agiscono direttamente sulla gonade dei pesci trattati, per stimolare lo sviluppo delle gonadi e la deposizione delle uova. Queste diverse preparazioni differiscono per il grado di purezza del componente attivo (GTH) e sono state sviluppate, storicamente, in relazione ai progressi tecnologici nella purificazione delle proteine. I primi preparati di gonadotropine utilizzati per l'induzione della deposizione delle uova nei pesci in cattività sono stati gli omogenati dell’ipofisi dei pesci (ipofisazione). La base di questo trattamento è semplice e consiste nella estrazione della ghiandola ipofisaria di un pesce completamente maturo, nella sua omogeneizzazione in una soluzione tampone appropriata e la somministrazione dell’omogenato ottenuto ad un pesce ricevente. L'omogeneizzato induce l'ovulazione e la deposizione delle uova nei pesci trattati. In Cina, l’ipofisazione è stata ampiamente utilizzata nella stimolazione della riproduzione della carpa, molto prima della comprensione delle basi fisiologiche del trattamento. Successivamente è stato compreso che l'efficacia del trattamento fosse dovuta all'elevato contenuto di LH dell'ipofisi del pesce donatore. Sebbene primitiva, l'applicazione degli omogenati ipofisari hanno rappresentato per molti anni l'unico metodo che ha permesso la stimolazione di riproduzione in pesci in cattività e ha gettato le basi per ulteriori e più sofisticati trattamenti ormonali. La tecnica della ipofisazione mostra diversi vantaggi. Si tratta di preparati che possono essere facilmente ottenuti in allevamento ittico e non richiede personale specializzato e strumentazione per la sua preparazione. Lo svantaggio principale è l'inesattezza del metodo. Un omogenato ipofisario non è una preparazione calibrata e non è nota esattamente la dose del principio attivo (LH), a causa del contenuto variabile dell’LH ipofisario contenuti nel pesce donatore. Questo rende difficile stabilire un metodo accurato. Un altro svantaggio è il rischio di trasmissione di agenti patogeni, durante il trasferimento del materiale biologico (ipofisi) da un pesce ad un altro. Questa è ovviamente una tecnica primitiva, forse adatta per piccoli allevamenti localizzati in aree remote, ma non per lo sviluppo di un impianto di acquacoltura intensiva, anche se il metodo è ancora impiegato oggi. Un miglioramento di tale metodo è dato dall'uso di estratti ipofisari (PE), che sono preparazioni arricchite del componente ormonale dell’omogenato ipofisario senza le parti cellulari. I PE richiedono un po’ di esperienza tecnica e attrezzature specializzate e sono, quindi, preparati da personale qualificato. Le basi fisiologiche del trattamento sono simili a quelle degli omogenati ipofisari. Una varietà di PE è stata utilizzata in acquacoltura, e alcuni estratti ipofisari, come quelli di salmone (SPE) e di carpa (CPE), sono disponibili in commercio. Gli estratti ipofisari sono più efficaci rispetto agli omogeneizzati ipofisari in quanto sono di solito calibrati utilizzando test biologici. Tuttavia, essi mantengono gli svantaggi di rischio di trasmissione di agenti patogeni e un alto grado di specificità di specie.

L'ultimo e più sofisticato tipo di preparazioni GTH sono i purificato o GTHs ricombinanti. Essi richiedono una preparazione più elaborata, poichè è utilizzata solo la GTH dell’omogenato ipofisario. Questi trattamenti si sono resi disponibili con gli sviluppi della ricerca su GTH e sui progressi tecnologici nella purificazione della proteina, che hanno permesso l’isolamento di GTHs altamente purificati da una varietà di specie e di fonti biologiche. GTHs purificati ottenuti da materiale biologico umano e dei mammiferi sono stati ampiamente utilizzati per usi clinici e veterinari, come FSH e LH isolati dall’ipofisi dei mammiferi, la gonadotropina del siero di cavalla gravida (PMSG) o la gonadotropina corionica umana (hCG) isolata dalle urine di donne in gravidanza. Le più comuni GTHs utilizzate per l’induzione della deposizione delle uova di pesce sono l'hCG e GTHs purificate dai pesci. Funzionalmente, hCG mostra la bioattività di LH, poichè si lega ai recettori LH delle gonadi e stimola lo sviluppo delle ovaie e dei testicoli, la maturazione dei gameti e il rilascio dei gameti. L'hCG, anche se di origine umana, è stata ampiamente utilizzata in acquacoltura, a causa della sua elevata disponibilità sul mercato, a basso costo e ad attività standardizzata. Al contrario, le difficoltà tecnologiche per isolare GTHs dei pesci e il più piccolo mercato di acquacoltura rispetto alle applicazioni umane e veterinarie, hanno limitato l'uso di GTHs dei pesci, che sarebbe fisiologicamente più appropriata di hCG per i pesci. Attualmente, solo le preparazioni di GTH di salmone e di carpa sono disponibili sul mercato per l'acquacoltura. L'uso di GTHs purificati ha importanti vantaggi rispetto agli omogeneizzati ipofisari e PE, principalmente per la calibrazione del preparato, che consente un dosaggio accurato, la ripetitività del trattamento e la riduzione del rischio di trasmissione di agenti patogeni di preparati altamente purificati. Il trattamento con hCG ha un inconveniente importante, che riguarda la complessa struttura della molecola. L'hCG è una proteina di grandi dimensioni e specie-specifica, che può causare la risposta immunitaria quando somministrata a specie non mammifere. Tale risposta immunitaria nei pesci trattati può renderli non responsivi o meno sensibili ai trattamenti successivi. Ovviamente, l'approccio migliore sarebbe l'uso di LH purificato dalla stessa specie a cui verrà applicato il trattamento, che è il caso dell’induzione della deposizione delle uova di carpe utilizzando il GTH purificato dalla carpa (CGTH). Tuttavia, questo non è fattibile nella maggior parte dei casi, e di conseguenza è utilizzata hCG come trattamento generale di GTH in molti pesci d'allevamento. 7.2 Seconda generazione: gli agonisti del GnRH (GnRHa) Le terapie ormonali di seconda generazione sono state sviluppate dopo la scoperta dell'ormone del cervello responsabile della regolazione della secrezione ipofisaria di GTH, il GnRH. L'applicazione di terapie basate sul GnRH ha importanti vantaggi rispetto alle precedenti preparazioni di GTH, grazie alla possibilità di agire ad un livello superiore dell’asse riproduttivo e favorendo così una stimolazione più generale e fisiologica dell'intero processo riproduttivo. Come visto nelle sezioni precedenti, esistono diverse GnRHs nativi prodotti nel cervello delle specie di vertebrati, tutti con attività di rilascio di GTH. Il GnRH è un breve decapeptide sintetizzato in aree specifiche del cervello, trasportato attraverso fibre neuronali all’ipofisi dove agiscono immediatamente sul GnRH-R che stimola il rilascio di GTH. Questo ruolo è correlato con una breve emivita in circolazione. I GnRHs sono degradati rapidamente da specifici enzimi proteolitici in circolazione, rendendo le somministrazi esogene di GnRHs nativi un trattamento inefficace. Studi su struttura e attività di GnRHs nativi hanno spinto lo sviluppo di GnRHs, che sono GnRHs strutturalmente modificati che presentano una maggiore efficacia di rilascio di GTH quando somministrati per via esogena. Le caratteristiche più importanti per un GnRHa sono (a) elevata resistenza alla degradazione enzimatica, (b) alta affinità di legame al GnRH-R e (c) alta attivazione del gonadotrope, che insieme determinano un aumento degli agonisti di GTH. Di conseguenza, le modifiche della struttura sono per lo più concentrate sulla protezione degli aminoacidi nelle posizioni 6 e 9, che sono le regioni del riconoscimento enzimatico e della degradazione, e sul miglioramento degli aminoacidi dell’estremità NH2- (pGlu-His-Trp-Ser) e

COOH- (-GlyNH2 Pro), che sono le regioni responsabili del legame al recettore. I GnRHs nativi hanno una emivita di ~ 5 minuti, mentre i più attivi GnRHa hanno una emivita di circa ~ 20 min. Pertanto, una iniezione perfino del più potente GnRHa stimola un aumento di GTH in circolo per 24-72 h, anche se questo è molto variabile a seconda della specie e temperatura. La somministrazione di GnRHa induce il rilascio di LH da parte dell'ipofisi, che a sua volta stimola la maturazione delle gonadi. Nelle femmine, il trattamento con GnRHa induce la FOM, l'ovulazione e la deposizione delle uova, e nei maschi aumenta il volume di sperma e, a volte, la densità degli spermatozoi. Le terapie ormonali a base di GnRHa hanno importanti vantaggi rispetto ai preparati di GTH. I GnRHa sono facili da preparare e risultano in un minor costo di preparazione rispetto a un GTH purificato. Essi sono generici e pertanto utili per una vasta gamma di specie, dai pesci ai mammiferi, rendendoli ampiamente disponibili in commercio. Le ridotte dimensioni del GnRHa non induce la risposta immunitaria negli animali trattati e quindi ripetuti trattamenti possono essere applicati senza problemi di desensibilizzazione. Inoltre, i GnRHa agiscono sull'ipofisi inducendo il rilascio endogeno di GTHs propri dei pesci e una più appropriata stimolazione gonadica rispetto a quella ottenuta con la somministrazione di elevati livelli di GTHs esogeni. Questi vantaggi hanno reso l'utilizzo dei GnRHa la scelta migliore per l’induzione della deposizione delle uova nei pesci. I trattamenti a base di GnRHa hanno una limitazione, che è la breve emivita del decapeptide. La modalità classica di somministrazione è l’iniezione intraperitoneale o intramuscolare dei GnRHa disciolti nella soluzione salina, alla dose richiesta. Dipendentemente dal tipo di GnRHa, dalla specie dei pesci e dalla temperatura dell'acqua, una singola iniezione di GnRHa induce un picco di LH che dura circa 12-72 ore, prima che l'effetto scompare. In alcuni casi, questo effetto di breve durata di una singola iniezione di GnRHa è sufficiente a indurre la deposizione delle uova 2-3 giorni dopo il trattamento. Ma, in molti casi, ulteriori iniezioni sono necessarie per indurre un rilascio prolungato di LH e stimolare la maturazione completa delle gonadi e la deposizione delle uova. Nelle femmine, iniezioni multiple di GnRHa sono normalmente richieste per le specie che esibiscono una tipologia di sviluppo a gruppo sincrono o asincrono, e anche in specie il cui sviluppo gonadico è inibito nelle fasi iniziali e necessita di una stimolazione prolungata per influenzare l'intero processo di maturazione. Nei maschi, iniezioni multiple sono normalmente raccomandate, a causa della tipologia asincrono dello sviluppo dei testicoli. Tuttavia, iniezioni multiple sono pericolose e stressanti per i riproduttori, e, a lungo termine possono causare l’inibizione della riproduzione, la comparsa di patologie da stress e persino la morte di alcuni animali. Per queste ragioni, i trattamenti con GnRHa sono stati somministrati sottoforma di un sistema a rilascio prolungato. In questo modo la somministrazione costante di GnRHa al flusso sanguigno provoca una stimolazione prolungata del rilascio di LH ipofisario, che può durare per diverse settimane, a seconda della specie e temperatura. Così, una singola somministrazione sostituisce efficacemente l'effetto causato da 4-5 iniezioni. Tanti differenti tipi di sistemi di distribuzione sono stati sviluppati per la somministrazione di GnRHa, compresi pellets di colesterolo-cellulosa, gli impianti etilene-acetato di vinile(EVAc), microsfere biodegradabili, pompe osmotiche, ecc. Una delle preparazioni più conveniente ed efficiente è l’impianto EVAc, che può essere facilmente applicata nella muscolatura dorsale con un applicatore simile a una siringa. Questi impianti hanno dimostrato di indurre ovulazione, spermiazione e deposizione delle uova in una vasta gamma di specie di pesci, essendo anche molto efficaci nella stimolazione della spermiazione maschile. Oltre ai GnRHa, vi è un altro tipo di trattamento ormonale di seconda generazione, gli antagonisti della dopamina (DAant), che sono farmaci che bloccano il sistema della dopamina (DA) nell’encefalo, necessario per la stimolazione della riproduzione in varie specie di pesci. Come descritto in precedenza, la regolazione endocrina della riproduzione è sotto un doppio controllo del cervello, l'azione stimolante del GnRH e quella inibitoria della DA. L’attività di entrambi i sistemi determina la stimolazione endogena o l'inibizione del rilascio di LH. Non tutte le specie di pesci possiedono un attivo sistema di DA nel cervello. Sembra che il sistema inibitorio di DA è forte nelle specie d'acqua dolce, ma debole o assente nella maggior parte delle specie marine. L'attività del tono inibitorio della DA varia anche a seconda della stagione e dei livelli fisiologici di steroidi dei

pesci. Nelle specie di pesci con un attivo sistema di DA, l'inibizione dell’ovulazione e della spermiazione in cattività è causata sia da una maggiore attività di DA che da una diminuita attività di GnRH, mentre nelle specie ittiche con un sistema DA debole, i disturbi riproduttivi sono dovuti quasi esclusivamente alla diminuita attività di GnRH. Un forte tono inibitorio di DA è stato dimostrato nei ciprinidi, nei siluridi, nei salmonidi e in alcuni Perciformi. In queste specie, il trattamento con GnRHa stimola da solo il rilascio di LH, simile al trattamento con i DAant, ma è il trattamento combinato (GnRHa+DAant), che fornisce i risultati migliori. Normalmente, solo il co-trattamento è efficace nella stimolazione della maturazione degli ovociti, della spermiazione e della deposizione delle uova. Ci sono diversi DAants disponibili sul mercato che mostrano di essere utili per i trattamenti ormonali in acquacoltura, tra i più comuni pimozide, domperidone e metoclopramide. Normalmente, essi vengono somministrati come soluzione liquida iniettata per via intraperitoneale o per via intramuscolare, su base settimanale. 8. PROTOCOLLO GENERALE PER L’INDUZIONE DELLA DEPOSIZIONE DELLE

UOVA E LO STRIPPING

La base per lo sviluppo di un protocollo per controllare la maturazione riproduttiva in una specie di pesce è la comprensione della sua strategia riproduttiva e del ciclo riproduttivo in relazione alle condizioni ambientali, in particolare fotoperiodo e temperatura. La conoscenza della differenziazione sessuale, la taglia alla prima maturità, lo sviluppo della maturazione in relazione ai cambiamenti ambientali, l’endocrinologia riproduttiva, il comportamento riproduttivo e i parametri delle uova, consentono la progettazione di un protocollo per mantenere i pesci in condizioni che permettono alla maturazione di procedere alle ultime fasi della gametogenesi o alla deposizione delle uova (Tabella 2). Tabella 2 – Informazioni riproduttive di interesse per la progettazione di un protocollo di deposizione delle uova e come tali informazioni possono essere utilizzate nella pratica. Informazioni riproduttive di interesse Uso pratico delle informazioni

Strategia di differenziazione sessuale, gonocorismo (sessi separati), ermafrodita, scambio di sesso.

Indica la proporzione dei sessi richiesti e come la selezione deve essere fatta in specie che cambiano sesso.

Dimensioni all’inizio della maturazione.

Dà le dimensioni minime e indicazione delle misure ottimali per la covata dei pesci. Indicazione del progetto del serbatoio.

Tempi di avvio di vitellogenesi in relazione ai cambiamenti ambientali.

Preferibilmente, mesi prima di questa data la covata del pesce dovrebbe essere selezionata e si deve prestare attenzione a garantire che i pesci siano nutrizionalmente preparati per la riproduzione.

Timing e parametri ambientali naturalmente sperimentati durante la vitellogenesi.

Le condizioni ambientali in cattività durante la vitellogenesi dovrebbero essere controllate per garantire l’approssimazione alle condizioni naturali

Timing e parametri ambientali naturalmente sperimentati durante la stagione riproduttiva, in particolar modo: · Quando lo sperma può facilmente essere espresso da maschi. · Quando le femmine presentano fasi tardive della vitellogenesi. · Timing del picco o metà della stagione di deposizione delle uova

Condizioni ambientali in cattività durante la stagione di deposizione dovrebbero essere controllate per garantire l’approssimazione alle condizioni naturali. · La deposizione delle uova può essere anticipata e la covata dei pesci può essere controllata per lo stato di maturazione. · Se non si osserva la deposizione delle uova, una revisione dei riproduttori con l'obiettivo di induzione ormonale può essere fatta coincidere con il picco

· Timing della fine della stagione, quando le gonadi tornano ad una fase di riposo.

della stagione riproduttiva.

Endocrinologia della riproduzione. · induzione ormonale · In particolare l'attività della dopamina.

Selezione di ormoni e le dosi di ormoni per indurre la deposizione delle uova.

comportamento riproduttivo: · La poligamia, la monogamia. · Numero di deposizioni per stagione: lotto giornaliero di depositori, depositori a lotti sincroni o deposizioni singole per stagione.

Indicazione di: · Progettazione del serbatoio. · Proporzione dei sessi richiesti. · Metodo di raccolta delle uova, stripping, substrato di deposizione delle uova o la raccolta delle uova pelagiche

dimensioni uova

Indicazione di: · Fecondità (uova generalmente più grandi = inferiore fecondità) · Dimensioni degli ovociti necessari per l'induzione ormonale · Cura richiesta per le larve

Fecondità. Indica il numero di covate di pesci richieste. Tipo di uova: pelagici, demersali, adesive. Indicazione di:

· Metodo di raccolta delle uova, stripping, substrato di deposizione delle uova o la raccolta delle uova pelagici. · Metodi di incubazione.

Strategia di cure parentali per le uova. Indicazione di: · Metodo di raccolta delle uova, stripping, substrato di deposizione delle uova o la raccolta delle uova pelagiche · Metodi di incubazione. · La fecondità (generalmente, più cure parentali=più bassa fecondità).

Il protocollo descrive la nutrizione, le condizioni ambientali, la luce, il fotoperiodo, la temperatura, lo spazio, il substrato e le condizioni sociali necessarie durante la maturazione e, quando necessario, la terapia ormonale necessaria per stimolare la maturazione finale In generale, per una specie con una lunga storia nel settore dell'acquacoltura tali informazioni sono note in condizioni di cattività e i protocolli, anche se non descritti ancora, sono regolarmente seguiti anche se non necessariamente pienamente compresi. Laddove un protocollo è seguito ma non completamente compreso, può essere difficile da spiegare un’inaspettata variazione nello sviluppo riproduttivo causata, ad esempio, da una condizione ambientale anormale, mentre una piena comprensione di un protocollo e, quindi, delle condizioni richieste, possono consentire previsioni dei possibili problemi. Per una specie che non ha ancora una sua storia nel campo dell’acquacoltura, le seguenti fonti di informazioni possono essere utilizzate per proporre protocolli che hanno buone opportunità di successo: • studi sulle strategie riproduttive, sullo sviluppo della maturazione e i parametri delle uova di popolazioni selvatiche, • informazioni aneddotiche di pescatori, i quali spesso hanno una buona conoscenza dei cambiamenti stagionali delle gonadi di alcune specie, • informazioni sui parametri ambientali di aree in cui vengono catturati gli individui maturi di specie particolari, • estrapolazione dalle strategie riproduttive, dallo sviluppo maturativo e dai parametri delle uova di altrettante specie strettamente collegate, quando possibile.

In particolare, il protocollo deve identificare i punti critici, come selezione dei riproduttori, nutrizione prima e durante la vitellogenesi, condizioni ambientali durante la vitellogenesi e deposizione delle uova, spazio e condizioni sociali per la deposizione delle uova e terapie ormonali necessarie. I punti critici più comuni che causano problemi con lo sviluppo maturativo e, di conseguenza, la definizione di un protocollo per ottenere gameti può essere organizzato come nutrizione > fattori ambientali che controllano o inducono l'iniziazione e il progresso di vitellogenesi o spermatogenesi > fattori ambientali che controllano o inducono la maturazione finale e l'ovulazione o spermiazione > terapie per l’induzione ormonale (Fig. 7).

Figura 7 – Diagramma di flusso dei punti critici nell’induzione della deposizione in cattività.

La nutrizione ha implicazioni sia sulla decisione di procedere con la maturazione in un dato anno (sulla base di riserve energetiche) sia sulla valutazione che tutti i componenti nutrizionali necessari siano disponibili per lo sviluppo dei gameti. Quando un nutrizione adeguata non viene fornita, effetti profondi sono stati osservati su fecondità e qualità delle uova. Tra i più importanti aspetti nutrizionali per la riproduzione troviamo la qualità delle proteine, la composizione in acidi grassi/ipidi e vitamine. Spesso l'unica soluzione per una povera deposizione di uova a causa di un'alimentazione inadeguata è quella di migliorare la nutrizione per l’episodio di maturazione successivo. Nessun controllo ambientale o ormonale potrà risolvere un problema nutrizionale, e prima di qualsiasi tentativo di controllo ormonale o ambientale della maturazione, è essenziale controllare che la nutrizione sia adeguata (Fig. 7). Parametri ambientali errati o sub-ottimali durante la gametogenesi e/o la maturazione finale comporteranno, rispettivamente, disfunzioni riproduttive primarie o secondarie. Le soluzioni includono il miglioramento dell’ambiente in cattività o l'applicazione di terapie ormonali, quando non è tecnicamente possibile migliorare le condizioni o le condizioni ottimali non sono note. Le disfunzioni primarie richiedono una terapia ormonale prolungata per stimolare l'intero periodo di gametogenesi, simile a quello utilizzato per deporre le uova per le anguille di acqua dolce. Le disfunzioni secondarie, che sono le più comuni disfunzioni riscontrate in acquacoltura, richiedono una terapia ormonale a breve termine per indurre la maturazione finale, l’ovulazione o la spermiazione. Questi tipi di terapie sono state utilizzate in vari pesci, tra cui carpe, spigole, orate, tamburi, corvine, cernie, dentici, salmonidi, pesce gatto, triglie, pesce piatto e pesce palla. Quando si sviluppa una terapia ormonale per una disfunzione secondaria, due fattori critici devono essere considerati, 1) la fase dello sviluppo ovarico, spesso misurata attraverso le dimensioni degli ovociti, e 2) la dose dell'ormone. Generalmente, la deposizione delle uova mediante le terapie di induzione ormonale è compromessa quando vengono trattati i pesci al di fuori di un range ottimale di dimensioni degli ovociti o delle dosi ormonali. La risposta di pesci aventi il diametro degli ovociti inferiore al diametro minimo consiste nella non deposizione o in una povera deposizione delle uova. Dosi superiori a quelle ottimali determinano una riduzione della qualità delle uova e dosi più basse producono una frequenza di riproduzione ridotta. Sembra esserci una relazione tra dimensione minima dell’ovocita indotto alla deposizione e le dimensioni delle uova e la seguente equazione: dimensione minima degli ovociti = -95,98 + 0,624 x dimensione delle uova, può essere usata per dare un'indicazione o un punto di partenza per definire la dimensione desiderata degli ovociti per sviluppare una terapia di induzione ormonale. La dose ottimale di ormone dovrebbe essere determinata per ogni specie. Un punto di partenza è esaminare dosi che sono state utilizzate in specie strettamente correlate. Alcuni dosi ottimali per diverse specie ittiche sono presentati nella Tabella 3.

Tabella 3 - Terapie ormonali selezionate che hanno indotto con successo l'ovulazione o la deposizione delle uova in una gamma di specie provenienti da diverse famiglie. Terapie simili sono state raggruppate come un'indicazione del fatto che le terapie potrebbero essere considerate per le specie affini. Inj. = Iniezione, imp. = Dell'impianto, PIM = pimozide, MET = metoclopramide.

Va inoltre considerato che le dimensioni degli ovociti e la dose di ormoni sembrano interagire. Quando l'ovulazione è stata raggiunta, ma i gameti devono essere rimossi, una finale considerazione è la tempistica di strippaggio in relazione all’ovulazione. Dopo l'ovulazione, le uova non fecondate presenti nella cavità addominale o ovarico vanno incontro ad una over-maturazione, un processo mediante il quale le uova perdono vitalità, misurata come percentuale di fertilizzazione e di sviluppo dell'embrione. L’over-maturazione sembra essere un processo in cui le uova subiscono una serie di cambiamenti morfologici e chimici, attraverso cui le uova perdono vitalità. Un certo numero di specie sono sottoposte ad un periodo di maturazione prima che inizi il periodo di over-maturazione, vale a dire, dopo l'ovulazione la vitalità delle uova non fecondate può aumentare per poi diminuire a causa di un eccesso di maturazione, rendendo tale periodo ottimale per lo stripping e la fecondazione. Si deve prestare attenzione ad eseguire lo stripping delle uova durante il periodo di validità ottimale. La maturazione nei pesci è un processo molto complesso e la sua manipolazione e realizzazione della deposizione delle uova di buona qualità richiede una comprensione completa e un attento esame di tutti i diversi fattori che influenzano l'esito delle manipolazioni. Molti studi hanno dimostrato che i pesci possono essere ambientalmente e / o ormonalmente manipolati per deporre le uova di buona qualità, uguali in termini di qualità alle uova deposte naturalmente. Si deve pertanto considerare che una povera qualità delle uova di pesce manipolato indica che alcuni aspetti del protocollo di deposizione delle uova non era corretta e tutti i parametri dovrebbero essere riconsiderati.