Laboratuvar Başarısında

Kriyoprezervasyonun Rolü

Ayşen Durmaz, PhD

Ege Üniversitesi Aile Planlaması

İnfertilite Araştırma ve Uygulama

Merkezi

Tanım

Kriyoprezervasyon; hücrelerin ve dokuların

sıfır derecenin altındaki ısılara kadar

soğutularak, bütün biyolojik aktivitelerinin

durdurulması ve gelecekte kullanılması

amacıyla saklanmasını ifade eder.

(ASRM 2012)

Tarihçe

M.Ö. 2500 soğuğun medikal alanda kullanımı.

1776 Spallanzani L. kar içerisinde dondurduğu spermleri

çözdükten sonra hareketlilik gözlemiştir.

İlk kriyoprezervasyon denemeleri başarısız!

1940 yılında gliserolün sperm hücresini kriyo hasarına

karşı koruduğu keşfedilmiştir.

1953 yılında Bunge ve ark. dondurulmuş-çözülmüş insan

sperminden elde edilen ilk canlı doğumu bildirmişlerdir.

Tarihçe

1970 yılında propanediol, EG, DMSO keşfi

1972 programlanabilen dondurucuların kullanıldığı yavaş

dondurma tekniğinin geliştirilmesi

1984 dondurulmuş-çözülmüş insan embriyosundan elde

edilen ilk canlı doğum

1986 dondurulmuş-çözülmüş insan oositinden elde

edilen ilk canlı doğum

IVF Laboratuvarında Kriyoprezervasyon

Gamet (oosit ve sperm)

Testis ve over dokusu

Embriyo (2PN, Klivaj, Blastosist)

Laboratuvar Başarısında

Kriyoprezervasyonun Rolü

Laboratuvar Başarısı

Kriyoprezervasyon Başarısı

Laboratuvar Başarısı

Kullanılan indüksiyon ajanlarına

Mikromanipulasyon tekniğine

Kültür medyumunun içeriğine

Kültür ortamının pH, ısı ve osmolaritesine

Sterilite

Kriyoprezervasyon Başarısı

Gamet, zigot, ve embriyo kalitesine

Kullanılan malzemelere

Kullanılan yönteme

Yöntemi uygulayan kişinin tekniğine ve becerisine

bağlıdır.

Sterilite

Kriyoprezervasyon Hasarı

Hücre içi/dışı buz kristali oluşumu

Kimyasal toksisite

Osmotik şişme/büzüşme

Zona hasarı

Mayotik spindle hasarına ve dolayısıyla da anöploidilere

neden olmaktadır.

Kriyoprezervasyon Yöntemleri

Yavaş dondurma

Şok dondurma (ultra-rapid)

Vitrifikasyon

Yavaş Dondurma

CPA kons. düşük (1M Sukroz; 1,5M 1,2 propanediol)

-7oC’de seeding işlemi ile buz oluşumu başlatılır.

Dondurma hızı yavaş (0,3-0,5oC / dk.)

İşlem ~ 3 saat sürmektedir.

Dezavantajları

Uzun sürmesi

Pahalı olması

Buz kristali oluşturması

Şok Dondurma

Yavaş dondurma ile vitrifikasyon arasında bir yöntem

Yavaş dondurmaya göre daha hızlı ve pahalı ekipmana

gereksinim yok

Yavaş dondurmaya göre CPA kons. yüksek

Vitrifikasyona göre CPA kons. düşük

Vitrifikasyon

Herhangi bir sıvının yoğunluğunun arttırılarak buz kristali

oluşmaksızın camsı hale getirilmesi

Sıvı haldeki madde

Buz kristali oluşmadan camlaşma

Vitrifikasyon CPA konsantrasyonu yüksek (%15 EG, %15 DMSO)

Soğutma hızı yüksek (15,000 - 30,000oC/dk.)

Soğutma hızı ne kadar arttırılabilirse CPA kons.

İşlem süresi kısa (10 -15 dk.)

Buz kristali oluşmaz

Dondurma cihazına gereksinim yok.

Dezavantajı

Yüksek CPA kons. hücreler için toksiktir!!!

Hangi Yöntem?

1) Vitrifikasyon

2) Yavaş dondurma

3) Şok dondurma

Hangi Yöntem?

Vitrifikasyon-Yavaş Şok-Yavaş dondurma

Klinik gebelik oranı OR= 1,55

%95 CI=1,03-2,32

OR= 0,35

%95 CI= 0,16-0,76

Devam eden gebelik

oranı

OR= 1,82

%95 CI=1,04-3,20

OR= 0,37

%95 CI= 0,17 – 0,81

İmplantasyon oranı OR= 1,49

%95 CI=1,03-2,15 -

Yavaş dondurma - Vitrifikasyon Düşük oranda CPA

Dondurma hızı düşük

(0,3-0,5oC / dk.)

Yavaş dehidrasyona bağlı

olarak buz kristali oluşumu

İşlem süresi uzun (3 saat)

Pahalı ekipman

☻Yüksek oranda CPA

☻Dondurma hızı yüksek

(15,000-30,000oC / dk.)

☻ Buz kristali oluşmaz

☻ İşlem süresi çok kısa (10-15 dk)

☻ Dondurma cihazına ihtiyaç yok

Ege Üniversitesi IVF Lab. Sonuçları

Siklus

sayısı

Transfer

sayısı

Gebe

sayısı

Gebelik oranı

(%)

2010 yavaş

2010 vit.

55

27

42

24

9

5

21,42

20,83

2011 yavaş

2011 vit.

38

107

29

98

4

37

13,79

37,75

2012 yavaş

2012 vit.

13

121

7

111

1

48

14,28

43,24

2013 yavaş

2013 vit.

13

91

5

82

2

35

40,00

42,68

Vitirifikasyon Başarısı

1985 Rall ve Fahy fare embriyoları ile gerçekleştirilmiştir.

CPA kombinasyonu denenmiş,

Çeşitli taşıyıcı sistemler tasarlanmıştır.

Dondurma – çözme hızı

CPA konsantrasyonu

Kriyoprotektanlar

Hücre içine geçebilen

☻ DMSO, EG, PROH, Gliserol

Hücre içine geçemeyen (Sakkaritler)

☻Sukroz, Trehaloz

Makromoleküller

☻Fikol, PVP, PEG

Hücre içi su

Kriyoprotektan

CPA Seçimi

Hücre üzerine olan toksik etkisi

Diffüzyon hızı yüksek olan CPA seçilmelidir.

En çok kullanılan ve kabul edilen EG dür.

Kriyoprotektan toksisitesini azaltmak için iki farklı CPA

kombinasyonu kullanılabilir!!!

Major CPA kombinasyonu EG/DMSO kombinasyonudur.

Hücre içine geçemeyenler

Başarılı bir vitrifikasyon için gerekli olan CPA kons.

Toksik etkiyi azaltırlar

Osmotik etki

Çözme işlemleri sırasında osmotik tampon gibi

davranarak osmotik şoku engeller.

Ice

H2O

Kontrolsüz rehidrasyon sonucu şişme

Çözme Solüsyonları

1.0 M Sükroz

0.5 M Sükroz

Sükrozsuz

Çözme Solüsyonu

Dilüsyon Solüsyonu

Yıkama Solüsyonu

Makromoleküller

Fikol, PVP, PEG

Vitrifikasyonu kolaylaştırmakta

Etki mekanizmaları konusunda farklı yorumlar

bulunmaktadır.

Soğutma Hızı

Örnek hacmi ne kadar az olursa soğutma hızı

Vit. solusyonu ne kadar az olursa toksik ve ozmotik etkisi de o kadar azalır.

VitMaster sıvı azotun ısısını -205/ -210 kadar düşürür

Taşıyıcı sistemlerin ısı iletim hızları farklıdır.

Taşıyıcı Sistemler

Açık Sistemler

☺Soğutma ve ısıtma oranlarını hızlandırarak hücrelerin vitrifikasyon

solüsyonlarında tutulma zamanlarını azaltırlar.

Kapalı Sistemler

☺İzolasyon katının bulunması soğutma ve ısıtma oranlarını yavaşlatır.

Taşıyıcı Sistemler

Açık sistemler → Cryotop

→ OPS

→ Flexipet-denuding pipet

→ Hemistraw sistemi

→ Cryoloop

→ Cryoleaf

→ Elektron mikroskop grid

→ Fibre-plug

Kapalı sistemler

→ Cryotip

→ High security straw

→ Rapid-I

→ Straw-straw sistemi

→ Cryopet

Açık Sistemlerin Dezavantajı

Açık sistemlerde oosit/embriyo kaybolma ihtimali

Bakteriyel, viral ve fungal kontaminasyon riski

Kontaminasyon embriyonun in vitro yaşamını olumsuz

yönde etkiler.

Lab. da high security straw kullanmaktayız

Azot Kontaminasyonu

Azot sterilizasyonu

Azot Buharında Saklama

Oosit Kriyoprezervasyonu

Isı değişimlerine ve ekstrasellüler ozmotik basınca karşı

oldukça duyarlıdır.

Hücre içi sıvı miktarı yüksek

CPA kons. ve soğutma hızı yüksek olan vitrifikasyon!!

En uygun CPA ise EG’dur.

Literatürde 900’ün üzerinde doğum

Anomali insidansı normal

İmmatür oosit kriyoprezervasyonu

Mayotik iğcik hasarını engellemek için bir alternatif

Mayoz bölünme profaz I evresindedir

İmmatür oosit vitrifikasyonu

immatür oosit cryo + IVM

prematüre ovaryan yetmezliği ☺

İmmatür oosit vitrifikasyonu

İmmatür oosit vitrifikasyonu

→ PCO’li hastalardan alınan immatür oositlerin vitrifikasyon

yöntemi ile dondurulması sonrasında %90’ında klivaj

gördüklerini ancak implantasyon elde edemediklerini

açıklamışlardır.

Zigot Kriyoprezervasyonu

Almanya

Danimarka

İsveç

Avusturya

İsviçre

İtalya

En iyi yöntem vitrifikasyon

IVF – ICSI

IVF/ ICSI sonrası dondurulan

2PN aşamasındaki zigotlarda

benzer canlılık ve gebelik oranı

bildirilmiştir.

Zigot Kriyoprezervasyonu

Griesinger ve ark. yaptığı çalışmada dondurulan zigotların doğal

sikluslarda çözülerek transfer edildiği çalışmada embriyonun

canlılığını sürdürme oranının %77, devam eden gebelik oranının

da %36 olduğu bildirilmiştir.

Embriyo kriyoprezervasyonu

En iyi yöntem vitrifikasyon

8 hücreli embriyolarda canlılık oranı %79,2

Hücre sayısı < 6 olanlarda canlılık oranı %21,1

Canlılık oranı blastomer sayısının artmasıyla artar

Embriyo kriyoprezervasyonu

Dondurma işlemleri sırasında ZP sertlerşir

Transfer öncesi AH uygulanması gebelik ve

implantasyon oranlarını arttırır.

Blastosist Kriyoprezervasyonu

Blastosistlerdeki hücre sayısı fazla

Birkaç hücre hasar görse bile embriyonun bütünlüğü

bozulmaz

En iyi yöntem vitrifikasyon

Blastosöl sıvısının boşaltılması başarıyı arttırmaktadır.

Needle used shrinkage

Laser pulse shrinkage

Mukaida et al., 2006

Artificial Shrinkage

Blastosist Kriyoprezervasyonu

Konjenital anomali insidansı normal

Saklama Süresi

Saklama Süresi

Oosit

☺Canlılık, fertilizasyon, klivaj, embriyo kalitesi,

implantasyon ve canlı doğum

Embriyo

☺ Yaşam kapasitesi

☺ Gebelik oranları

☺ İmplantasyon oranlarına etkisi yoktur.

Tekrar dondurma

Bir kez çözünmüş embriyoların tekrar dondurulması ile ilgili çok

fazla veri olmamasına rağmen Kumasako ve ark. yaptıkları

araştırmada tekrar vitrifiye edilmelerinin belirgin bir olumsuzluk

yaratmadığını bildirmişlerdir.

KOH – Kriyoprezervasyon İlişkisi

YÜT de başarıyı gösteren en önemli parametrelerden bir tanesi implantasyondur.

→ embriyo kalitesine

→ endometriyal reseptiviteye

→ embriyo-endometriyum arasındaki ilişkiye bağlıdır.

YÜT’de implantasyon başarısızlıklarının;

→ 3/2’den endometriyum hasarı

→ 3/1’den ise embriyo sorumludur.

KOH – Kriyoprezervasyon İlişkisi

↑E2 ve P düzeyleri

endometriyum morfolojisi ve

biyokimyasını bozar.

Embriyo ile endometriyum

arasındaki senkronizasyon

bozulur.

İmplantasyon Başarısızlığı !

KOH – Kriyoprezervasyon İlişkisi

FET’de endometriyum doğal ya da doğala yakın

dozlarda ilaç kullanılarak hazırlanmaktadır.

Bu nedenle FET’de endometriyum reseptivitesi fresh

siklusa kıyasla daha iyidir.

Fresh embriyo vs. FET

KOH’nun embriyo-endometriyum senkroznizasyonu

üzerine olan olumsuz etkisinden kaçınmak için elektif

embriyo kriyoprezervasyonun yapılması

Bir sonraki siklusta endometriyum reseptivitesinin yüksek

olduğu FET’nin yapılması YÜT’de kümülatif başarıyı

arttıracaktır.

Çoğul gebeliklerin önlenmesi

KOH protokolleri → çok oosit → çok embriyo

Siklusların %60’ında transfer için uygun çok

sayıda emb.

Embriyo kriyoprezervasyonundaki başarının

artması

Transfer edilen embriyo sayısının azaltılmakta

Çoğul gebelikler önlenebilmektedir.

Fertilitenin Korunması

Bayanlar

Ciddi ovaryan hastalıklar

Kistler

Over kanserleri

Kemoterapi

Radyoterapi

Baylar

Testiküler yetmezlik

Ejakülatuvar disfonksiyon

Cerrahi girişimler

Kemoterapi

Radyoterapi

SONUÇ

Oosit kriyoprezervasyonu yerine Embriyo

kriyoprezervasyonu

Klivaj aşamasında 8 hücreli embriyo

Transfer öncesi AH yapılması

Hücre sayısı fazla olduğundan blastosist dondurma daha

avantajlı

Blastosöl sıvısının boşaltılması

Fresh embriyo transferi yerine FET yapılması

TEŞEKKÜRLER

Sperm kriyoprezervasyonu

Sıvı içeriği az olduğu için daha dayanıklıdırlar.

İnsan semeninde en çok kullanılan CPA Gliserol egg

yolk sitrattır.

Daha çok manuel yöntem tercih edilmektedir.

Motilite, Morfoloji, Fertilizasyon kapasitesi azalır.

Sperm DNA integritesi tartışmalı

Blastosist Vitrifikasyonu

Current data on the

vitrification tablo 2

Canlılık oranı (%) Gebelik oranı (%)

Oosit 54 14,2

Embriyo 67 28,2

Human Oocyte Vitrification (Kuwayama et al. Highly Efficient Vitrification of Human Oocytes. RBM

Online 11:300-308, 2005)

Parameter Result (% of # vitrified)

# oocytes vitrified 107

# Surviving (normal morphology) 86 (80%)

Fertilized (by ICSI) 77 (72%)

Blastocyst development 40 (37%)

# embryo Transfers 29 (18 D2, 11 D5)

Total # embryos transferred 64 (53 D2, 11 D5)

Avg # embryos/ transfer 2.2 (3 D2, 1 D5)

% Pregnancy (# sacs by ultrasound) 12 (41.3%)

# deliveries 7 babies (3 ongoing pregnancies)

Vit Kit™ - Freeze Solutions Basal medium is M199-H + 20% DSS

7.5% ethylene

glycol

7.5% DMSO

15% ethylene glycol

15% DMSO

0.5 M sucrose

Equilibration

Solution (ES)

Vitrification

Solution (VS)

Irvine Scientific’s Vitrification System: