Upload
benjamine-renard
View
104
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Les virus comme Les virus comme vecteurs thérapeutiquesvecteurs thérapeutiques
Par Patrick Salmonchercheur au Département de Microbiologie
et Médecine Moléculaire de l’Université de Genève
Parkinson,Huntington
HypercholestérolémieHémophilie
Dystrophies
Mucoviscidose
ImmunodéficiencesAnémies
Thérapie génique: quelques applications
WWW.genetherapy.com
Questions à se poser lorsqu’on envisage une thérapie génique
Ou…
WWW.genetherapy.com
What?
Where?
When?
WHAT? Quel produit le gène doit-il exprimer? Quelle est la taille de sa séquence
codante?
WHERE? Quelles sont les cellules à cibler?
WHEN? Combien de temps le transgène doit-il être exprimé?
Son expression doit-elle être régulée?
MALADIE HEREDITAIRES
Pathologie Défaut génétiquePrévalence Cible thérapeutique
Immunodéficience ADA, X-SCID rare CSH ou lympho T
Hémophilie A facteur VIII 1: 10.000 mâles foie, muscleHémophilie B facteur IX 1: 30.000 mâles CSH, fibroblaste Hyper-cholestérolémie récepteur LDL 1:1.000.000 foiefamiliale
Mucoviscidose CFTR (transporteur 1:3.000 cauc. poumon des ions chlores)
Hémoglobinopathies: globine 1:600 (éthnie!) CSHanémie falciforme, thalassémie
Maladie de Gaucher glucocérébrosidase 1:450 (éthnie!) CSH
Emphysème héréditaire -1 antitrypsine 1:3.500 foie et poumon
Maladies candidates pour la thérapie génique
Maladies candidates pour la thérapie génique
Cancer 1 million/an aux USA cellules cancéreuses ou dendritiques cellules présentatrices d'antigènes
maladies dégénératives:Parkinson 1 million aux USAAlzheimer 4 millions aux USA neurones, cellules gliales
désordres « immunologiques »:diabète de type I dizaines de millions cellules du pancréas, autres…
Cardiovasculaire:resténose, ATS dizaines de millions cellules endothéliales vasculaires
maladies infectieuses:SIDA, hépatite B ou C centaines de millions CSH, hépatocytes
MALADIE ACQUISES
Pathologie Prévalence Cible thérapeutique
Le vecteur idéal- Est défini par les exigences thérapeutiques (expression stable ou transitoire).- Peut atteindre de hautes concentrations permettant l’infection de nombreuses cellules.- Est aisément produit par des techniques reproductibles.- Pour l'expression à long terme, est intégré dans un site spécifique du chromosome, ou persiste en épisome stable. - Possède une unité transcriptionelle contrôlable.- Cible certaines cellules spécifiquement.- Est dénué de composants induisant une réponse immunitaire.
MAIS: un vecteur moins-que-parfait sera souvent
adéquat...
VecteurVecteur
VecteurVecteur
CellulesCellules
CellulesCellulesGénétiquement Génétiquement
ModifiéesModifiées
IsolationIsolation
TransplantationTransplantation
InjectionInjection
Thérapie génique: in ou ex?
In vivo Ex vivo
Vecteurs pour la thérapie génique
Viraux• adénovirus• virus adéno-associé (AAV)• rétrovirus: oncorétrovirus lentivirus• virus herpes• virus à ARN (polio, sendaï, etc…)
Non viraux• ADN nu• liposomes
Vecteurs viraux
Vecteurs viraux
Trois familles de virus utilisés pour le Trois familles de virus utilisés pour le développement de vecteursdéveloppement de vecteurs
AAVAdénovirus Rétrovirus
Adénovirus
OOOOH…Ne s’intègre pasImmunogénique (moins si « éviscéré »)Peut induire une « acute phase response »
AAAH!Grande capacité (30-40 kb)Facile à produire à hauts titresInfecte les cellules non-mitotiques
Non-enveloppé Génome: ADNTaille: 70-90 nm
AAV
OOOOH…Faible capacité (4 kb)Difficulté de production (« dependovirus! »)LE VECTEUR s’intègre au hasardImmunogénicité conditionnée par lacontamination par le virus helper
AAAH!Infecte les cellules non-mitotiquesLE VIRUS s’intègre à un site spécifique
Non-enveloppé Génome: ADN Taille: 20-30 nm
Retrovirus
OOOOH…S’intègre au hasardN’infecte pas les cellules non-mitotiques(ONCORETROVIRUS)
AAAH!Capacité raisonnable (10 kb)Facilité de production adéquateInfecte les cellules non-mitotiques (LENTIVIRUS)S’intègrePas de transfert de séquences codantes virales
Enveloppé Génome: ARN-ADN Taille: 90-120 nm
Cycle de réplication du HIV
MaturationAttachement
Fusion
decapsidation
Retro-Transcription
ImportNucléaire
Intégration
Transcription
ExportNucléaire
Assemblagebourgeonnement
ModificationsPost-traductionnelles
SynthèseProteines
CCR5CXCR4
CD4
Transduction par vecteur lentiviral
Fusion / Décapsidation
Rétro-Transcription
Import Nucléaire
Intégration
Endocytose
Attachement
Expression
Quelques dates marquantes…
1996: Un vecteur lentiviral peut effectuer le
transfert, l’intégration et l’expression à long terme
un gène dans les neurones in vivo.
1998: Transduction stable de CSH humaines
capables de reconstituer des souris NOD/SCID.
2000: Traitement de la mucopolysacharidose, du
Parkinson et de la thalassemie dans des rongeurs.
2002: transgenèse avec vecteur lentiviral.
2003: Premier essai clinique avec un vecteur
lentiviral.
1e génération
2e génération
3e génération
Génome HIV-1TATREV
CMV
CMV polyA
TATREV
CMVpolyA
RSV polyAREV
VIFVPRVPU NEF
TATREV
VIFVPRVPU NEF
LTR LTRGAG
POL
GAGPOL
GAGPOL
GAGPOL
Plasmides d’empaquetage lentivecteurs:
polyA
gag
pol
env
éléments actifs en cis
LTR LTR dPPT
Capacité: 10 kb
RRE
tat
nefvprvif
vpu
rev
SD SA
Vecteur de transfert
cPPTRRE
cPPT rev
LTR LTRdPPT
Prototypes de lentivecteurs
Inductible
Ubiquiste Gene XEF1-a cPPTRRE
Gene Xgp91phox cPPTRRE
Gene XTet-O cPPTRRE
Gene X cPPT
RRE
Gene YBicistronique
Gene X cPPT
RRE
U6sihRNAU6sihRNA
Inhibiteur
Spécifique
WPRE SIN
SIN
SIN
SIN
SIN
WPRE SIN
WPRE SIN
WPRE SIN
SIN SIN
Production de lentivecteurs
CMV
RSV An
GAGPOL
An
REV
CMV An
VSV G
50 TU/cellule x jour
293T
WPREGene XLTR cPPT
RRE
LTR
Dox
30 TU/cellule x jour
Lignée stable productrice de lentivecteurs
WPREGene XLTR cPPT
RRE
LTR
CMV
Tet An
GAGPOL
An
REV
Tet An
VSV G
Titration d’un vecteur lentiviral
1. Décompte des particules:p24-CA
2. Décompte des génomes:real-time QPCR
1. Titration provirale:real time QPCR
2. Expression du trangène:FACS, etc…
Applications
Hepatocytes comme cibles de thérapie Hepatocytes comme cibles de thérapie géniquegéniquePour le traitement de maladies hépatiquesCrigler-Najjar type I (Bilirubine UDP-Glucuronosyl transferase)
Tyrosinémie héréditaire type I (Fumaryl acetoacetate hydrolase)
Hyperammoniémie (Ornithine transcarbamylase)
Maladie de Wilson (ATP 7B)
Hépatite viral B ou C (Immunisation intracellulaire)
Comme site de production de protéines systémiquesMaladies génétiques hépatiquesEmphysème (alpha-1 Antitrypsine) Hémophilie A,B (Facteur VIII, Facteur IX)Trouble du métabolisme lipidique (Apolipoprotéines)Maladies génétiques non-hépatiquesDiabète type I (Insulin, PDX-I)Mucopolysaccharidose (alpha-L-Iduronidase)Thalassémie (Erythropoiétine)
Hypercholestérolémie homozygote familiale
(récepteur low-density lipoproteins -LDL-)
Récolte
Purification des hépatocytes
Lobectomie
20%
Réimplantation
Transfert de gène
Culture
5 wks1%
50% hepatectomy
x100
x200
R2 R2
31%0.02%
GFP
FL2
1%2 wks
x100
x200
70% hepatectomy
2x107 hep.
Gfp-LV, moi 10, with vit E
CSH
Précurseur myeloide
Précurseur érythroide
Précurseur Lymphoide
Neutrophiles, monocytes
Lymphocytes
Erythrocytes
Migration Migration (transdifferenciation?)(transdifferenciation?)
CSH
Précurseur myéloide
Précurseur érythroide
Précurseur lymphoide
Neutrophiles, monocytes
Lymphocytes T
Erythrocytes
IL-7
IL-15IL-7
IL-7IL-15
Il-7 et homéostase des lymphocytes T
IL-7R
c
YY
P
PJAK1
JAK3
Cyt C
Bcl-2Bcl-X
Bad
PI3-K
Anti-apoptose
STAT3STAT5a
STAT5b
Pro-differenciation
P-Bad
IL-7
CSHPrécurseur lymphoide
Lymphocytes T
X-SCID
IL-7
IL-15IL-7
IL-7IL-15
TransductionTransduction
CSHCSHGénétiquement Génétiquement
ModifiéesModifiées
Isolation des CSHIsolation des CSH
TransplantationTransplantation
Thérapie génique des « enfants bulles »
Chaîne ILRLTR LTR
Thérapie génique X-SCID
Vecteur: MLV (oncorétrovirus)
Cibles: ~ 2x108 cellules CD34+ activées
Efficacité de transduction: ~ 30%
Fraction de cellules sanguines positives pour le transgène:- lymphocytes T: ~ 100%- neutrophiles: ~ 0.1%
Chaîne ILRLTR LTR
TransgèneLTR LTRPromoteur
Oncogène
Oncogène
Effet promoteurEffet “enhancer”
Oncogenèse par intégration
Promoteur LMO2
Leucémie post-thérapie génique X-SCID
Chaîne ILRLTR LTR Exon 2
Exon 4
Exo
n 3
Exon 5
Exon 1
IL-7
IL-15
IL-15
IL-15
IL-7
IL-7
IL-7
IL-7
Thérapie génique X-SCID
11 enfants traités
1 sans réponse
2 leucémies (1 rémission, 1 rechute)
8 à la maison avec une vie normale
Thérapie génique SCID-ADA
4 enfants traités
4 enfants guéris
Conclusion: les vecteurs viraux peuvent être
thérapeutiques,
MAIS…
Quelques axes de recherche en thérapie
génique
- vectorologie (ex: ciblage)
- toxicologie (ex:
oncogenèse)
- immunologie (ex:
tolérization)
- développement de
modèles
Intégration des vecteurs rétroviraux
Promoteur Exon 1
Exon 3
Exon 2
Exon 4MLV
HIV
Intégration ciblée
Promoteur Exon 1
Exon 3
Exon 2
Exon 4