MALDI-TOF MSy

Análisis de Proteínas

Alberto Jorge GarcíaLaboratorio de Proteómica

Centro de Biología Molecular Severo OchoaUniversidad Autónoma de Madrid- CSIC

Curso Espectrometría de masas, Electrospray Trampa Iónica y Maldi-Tof

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE VITORIA

Oferta del Servicio de Proteómica

• Análisis mediante Espectrometría de Masas• Identificación sistemática de proteínas

presentes en las bases de datos a partir de geles

• La Síntesis de Péptidos y la Secuenciación de Edman son servicios independientes

Servicio de “Proteómica”• Digestión manual en gel• Análisis mediante MALDI-TOF:

• Obtención del mapa peptídico e identificación mediante huella peptídica (PMF)

• Análisis mediante LC-ESI-IT• Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión dinámica

(DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest• Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos

determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

Equipos disponibles• Un espectrómetro de masas tipo MALDI-TOF, modelo

Autoflex de Bruker, equipado con reflector y sistema para PSD

• Un espectrómetro de masas de trampa iónica modelo LCQ Classic de Thermo Finnigan, equipado con sistemas de ionización de nanospray y microspray de fabricación propia, acoplado a una bomba de HPLC Beckman Gold controlada por un ordenador IBM PS2 de 500K de RAM y un restrictor de flujo Accurate de LCPackings

• Interface “metal needle kit” para el acoplamiento LC-ESI-IT regalada por Thermo Finnigan y columna RP de 180 mm

Procedimiento de trabajo

• Recepción y control de muestras– Aviso previo a la entrega de geles– Escaneo del gel, Confección de ficha de usuario,

Asignación de fichero– Instrucciones del trabajo a realizar

• Análisis– Digestión manual en gel– Obtención del mapa peptídico mediante MALDI-TOF– Análisis mediante LC-ESI-IT

Requisitos para la preparación de geles y digestión

• Preparación de geles– Reactivos– Manipulación– Confección del gel– Tinción (Coomassie/Imidazol-Zn, Sypro-Ruby,plata)

• Digestión en gel– Procedimiento adaptado de Mann y cols optimizado

para portamuestras de Bruker– Control interno de contaminación y eficiencia y externo

de eficiencia

Identificación mediante PMF

• Tres niveles de preparación de muestras:– Sensibilidad normal (Coomassie): método

estándar– Alta sensibilidad: método “anchorchip” con

matriz HCCA y cristalización homogénea de Bruker

– Muy alta sensibilidad (Coomassie, Sypro-Ruby, Plata): método “anchorchip” con matriz DHB y cristalización heterogénea (método sin publicar)

Identificación mediante PMF• Métodos de calibración:

– “close-external” para búsquedas en DB con 100-150 ppm

– mediante “zonas prohibidas” (*) para búsquedas con 50-100 ppm

– interna de forma manual, mediante macro ó software (*) para búsquedas con 30-50 ppm

• Motores de búsqueda:– Internet (Mascot, Profound)– Motor de desarrollo propio (*)

* Campillo, Martín and Vázquez (en preparación)

Proteoma

Proteína

Péptidos

Fragmentos

BASE DEDATOS

BASE DEDATOS

Identificación Proteína

Identificación Péptido

Proteómica:

ESTRATEGIA INTEGRADORA PARA EL ANÁLISIS DEL PROTEOMA

SDS-PAGE

2D-IEF-SDS-PAGEBandas de proteínasDigestión “in situ”

en paralelo

MALDI-TOF mapa de péptidos

m-desalado automático

Electrospray-trampa iónica

aislamiento y fragmentación

Identificación de proteína

Secuenciación “de novo”

Extracto de péptidos

0

20004000

6000

8000

1000012000

14000

1000 1500 2000 2500 3000

Inte

nsid

ad

m/z

Mapa de péptidos (MALDI-TOF)Extracto crudo digestión “en gel”

1. gi|191618 Mass: 223549 Score: 87 (M76598) alpha cardiac myosin heavy chain [Mus musculus]Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Start End Miss Peptide 1061.02 1060.01 1060.13 -0.12 1366 - 1374 0 ANSEVAQWR 1085.02 1084.01 1084.32 -0.31 436 - 443 0 MFNWMVTR 1239.27 1238.26 1238.28 -0.01 1253 - 1262 0 TLEDQANEYR 1346.49 1345.48 1345.52 -0.04 24 - 34 0 LEAQTRPFDIR 1442.63 1441.62 1441.61 0.02 1680 - 1691 0 NNLLQAELEELR 1489.17 1488.16 1488.57 -0.41 1117 - 1128 0 IEELEEELEAER 1602.80 1601.79 1601.82 -0.02 955 - 968 1 DIDDLELTLAKVEK 1703.76 1702.75 1702.90 -0.14 1423 - 1436 0 LQNEIEDLMVDVER 1741.93 1740.92 1740.98 -0.06 726 - 741 0 ILNPAAIPEGQFIDSR 1840.03 1839.02 1838.99 0.03 1179 - 1195 0 DLEEATLQHEATAAALR 1896.08 1895.07 1895.02 0.06 1198 - 1214 0 HADSVAELGEQIDNLQR 1979.38 1978.37 1978.18 0.19 1620 - 1636 0 MEGDLNEMEIQLSQANR 2107.39 2106.38 2106.35 0.03 1619 - 1636 1 KMEGDLNEMEIQLSQANR 2277.72 2276.71 2276.54 0.17 1063 - 1081 1 LTQESIMDLENDKLQLEEK 2343.63 2342.62 2342.42 0.20 887 - 906 0 NDLQLQVQAEQDNLNDAEER 2809.57 2808.56 2809.04 -0.48 1000 - 1024 1 ALQEAHQQALDDLQAEEDKVNTLTK 2837.05 2836.04 2836.07 -0.02 1654 - 1678 1 DTQLQLDDAVHANDDLKENIAIVERNo match to: 1771.94

Identificación de la proteína a partir del mapa de péptidos(“peptide-mass fingerprinting”)

Búsqueda en MASCOT(D.Pappin, ICRF, Londres)

MALDI-TOF: How’s It Work?

•Pulsed laser

2. Target is introduced into high vacuum of MS

4. Ions are accelerated by an electrical field to the same kinetic energy el

Flight tube

1. Sample is mixed with matrix& dried on sample plate

High vacuum

Time

High voltage

3. Sample spot is irradiated with laser, desorbing ions into the gas phase and starting the clock measuring the time of flight.

20 - 30 kV

7. A data system controls all instrument parameters, acquires the signal vs. time, and permits data processing.

6. Ions strike the detector at different times, depending on the mass to charge ratio of the ion.

5.They drift (or fly) down a field free flight tube where they are separated in space.

MALDI-TOF/MS

Laser

Sample Target DetectorClock

Time-of-Flight Molecular Mass

matrix analyte sample solution

sample deposition

dry samples

insert target andperform analysis

MALDI-TOF/MS

Sample embedded inlight-absorbing matrix

LASER

LASER-excitation ofmatrix molecules

H+

Sample desorption andprotonation

Matrix for Proteins: sinapinic acid, dihydroxybenzoic acid etc.Matrix for Peptides: 4-hydroxy-a-cyanocinnamic acid, DHB.

it co-crystallizes, absorbs laser energy, evaporates and acts as acid

Ionización/Desorción

++

+

Cationized analyte

Analyte moleculesMatrix

molecules

Laser beam

Matrix molecules

Matrix ions

+

Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization (MALDI)

Cortesía de Bruker Daltonics

Tres niveles de preparación de muestras:

– Sensibilidad normal: método estándar. – Alta sensibilidad: método “anchor-chip” con

matriz HCCA y cristalización homogénea de Bruker.

– Muy alta sensibilidad: método “anchor-chip” con matriz DHB y cristalización heterogénea.

Preparación de la muestra: anchor-DHB

Fundamentos del TOF

Laser

ReflectorSource

Lineardetector

Reflector detector

MALDI-TOF

Resolución isotópica

1106 1111 1116 1121 1126 m/z

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

a.i.

Voltaje de extracción

Extracción retardada

Extracción retardada

Laser

ReflectorSource

Lineardetector

Reflector detector

Decay can occur at any point along here

Decomposition occurs in the flight tube

1. PSD refers to a method of detecting and measuring the masses of fragment ions formed from a selected precursor ion during the flight time.

2. Fragment ions are mainly formed by unimolecular decomposition after the precursor ions are fully accelerated (after they exit the source—hence post-source decay)

3. Fragment ions are separated in the reflector.

Fundamentals of PSD

PSD fragment ion velocities are the same as their precursors

+

+All three of these species travel at the same velocity in the flight tube until they reach the mirror.

Why? Velocity is determined by initial acceleration. Initial energy = 20 keV. Bond energies = ~ 10 eV, so breaking a bond has a very minor effect on velocities.

Neutral fragments are not detectedReflector

detector

Reflector +20 kV0 V.

Fragmentedprecursor ion

+

+

Fragment ions take different paths in the reflector

Reflectordetector

Reflector +20 kV0 V.

Fragment ion formed by PSD

Intact precursor ion

++

PSDISD