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MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE

PATOLOGÍA CLÍNICA

 

       

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CONTENIDO Página

I. PRESENTACIÓN

Introducción 3

II. PRÁCTICAS

1. Reconocimiento de Material y Equipo de Laboratorio. 4

2. Hemograma. 21

3. Pruebas de coagulación 37

4. Pruebas cruzadas. 43

5. Urianálisis o Examen General de Orina. 45

6. Valoracion de la glucemia y su relación con alteraciones metabólicas

en los individuos 51

7. Metabolismo Hepático y Renal. 54

8. Evaluacion Citológica y de Acumulación de líquidos. 60

III. BIBLIOGRAFÍA 82 IV. ANEXOS Valores de referencia para distintos analitos 83 V. ACTUALIZACIÓN 86

 

       

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FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE PATOLOGIA CLINICA

INTRODUCCION

Describir los procedimientos rutinarios realizados en laboratorio clínico condensados en un solo documento

para su fácil acceso y consulta por parte de los alumnos que realicen practica en el Laboratorio.

Este procedimiento aplica a todas las practicas realizadas por los alumnos de la Unidad de Aprendizaje de

patología clínica con la finalidad de mantener una mejor expectativa en la Unidad de Aprendizaje.

El presente manual está dirigido a todo aquel personal (Alumnos) que opera o proporciona mantenimiento

preventivo a equipos de laboratorio clínico. En el manual se describen algunos de los equipos más

comúnmente usados y sus principales funciones. Algunos de estos son de funcionamiento sencillo tales

como: Microscopio binocular, Centrífuga, Balanza Analítica, Espectrofotómetro y Pipetas automáticas.

Es importante hacer notar que este manual no pretende ser un sustituto del manual del fabricante, sino por

el contrario un complemento de él.

OBJETIVOS

1. Mostrar al Alumno el uso adecuado de los equipos, fomentando el seguimiento de las

recomendaciones del fabricante.

2. Mostrar los procedimientos para el adecuado mantenimiento y cuidado de los equipos.

3. Darle las Herramientas al Alumno para el desarrollo de las practicas de laboratorio realizadas en

la unidad de aprendizaje de Patologia Clinica.

 

       

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PRACTICA I. RECONOCIMIENTO DE MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

I. Introducción

Es fundamental conocer el equipo y material de laboratorio comúnmente usado en Patología Clínica para facilitar el desenvolvimiento de los alumnos en prácticas posteriores.

II. Objetivos

El discente reconocerá el material de laboratorio comúnmente usado en Patología Clínica.

El discente desarrollará las habilidades y conocimientos que le permitan identificar y usar el material de laboratorio.

El discente reconocerá el equipo de laboratorio comúnmente usado en Patología Clínica y aprenderá a trabajar con el microscopio con la iluminación de Köeler.

I.1. Reconocimiento de equipo de laboratorio

Describir la operación de algunos de los equipos

El microscopio es un equipo que consta de un juego de lentes que permiten al ojo humano observar detalles

que a simple vista es imposible observar. El uso de este equipo en los laboratorios clínicos, permite

determinar la presencia de parásitos, larvas, cristales, restos de tejido, componentes de la sangre y otros

cuerpos. En el Laboratorio de Anatomía Patológica, permite el estudio de tejidos para poder determinar

enfermedades, malformaciones o deficiencias.

El microscopio se compone básicamente de tres partes (Ver figura 1):

• Sistema Óptico.Constituido por lentes, espejos y prismas dispuestos en un tubo que amplían la imagen.

Este incluye: Los oculares, el cuerpo binocular, y los objetivos.

• Sistema de Iluminación.Por lo general consta de un bombillo que puede ser de tungsteno (halógeno), el

cual es controlado por un interruptor de encendido y un regulador de intensidad; además consta de un

condensador, que tiene como función concentrar y enviar un haz de luz perpendicular a la muestra y luego al

objetivo.

• Sistema Mecánico. Es toda la estructura del microscopio y lo compone: El revólver, la base, El

Macrométrico y el Micrométrico, la base de platina, la perilla de platina en cruz, la perilla del

portacondensador y el brazo.

 

       

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Figura 1. Microscopio Binocular

I.2 Recomendaciones de uso

De un buen uso y manejo del microscopio depende el funcionamiento continuo de éste. Es importante tomar

muy en cuenta las siguientes recomendaciones:

a. El microscopio debe ser cubierto con cobertores de tela, no con plásticos, ya que estos por el

calor que producen, permiten la formación de hongos en los lentes.

b. Nunca debe ser expuesto directamente a los rayos del sol, ni cerca de sustancias tóxicas, ni cerca

de lavaderos. Tampoco deben estar en el mismo mueble donde se encuentran equipos que

producen vibración.

c. El polvo se encuentra prácticamente en todo lugar, ocasionando serios problemas en las partes

mecánicas que se deslizan sobre guías con extrema precisión, si estas guías están sucias, el polvo

con la lubricación hace las veces de esmeril o lija, ocasionando desajustes en los movimientos, por

lo que será necesario limpiar y lubricar periódicamente.

d. Verifique si su equipo funciona correctamente:

1.  Oculares  

2.  Cuerpo  Binocular  

3.  Brazo  o  Estativo  

4.  Macrométrico  

5.  Micrométrico  

6.  Interruptor  de  encendido  

7.  Revólver  

8.  Objetivos  

9.  Platina  

 

       

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• Revise en forma visual que el tomacorriente macho se encuentre conectado al

tomacorriente hembra de la pared, de modo que se establezca un buen contacto.

• Accione el interruptor (switch), compruebe que la lámpara encienda. Mueva de izquierda a

derecha el regulador de intensidad y compruebe su funcionamiento.

• Revise si las partes mecánicas y ópticas funcionan adecuadamente: movimientos

macrométricos y micrométricos, desplazamientos libres de la platina en cruz,

portacondensador, diafragmas, revolver.

• Cualquier anormalidad en el microscopio, repórtela al Departamento de Mantenimiento.

Nunca trate de corregirla o que la corrijan personas que no poseen los conocimientos

técnicos necesarios.

e. No se debe fumar cerca del microscopio, ya que eventualmente los lentes, llegan a cubrirse con

una capa de material no combustible, mezclado con residuos de carbón. Lo que produce

decoloración y un campo borroso.

f. No se deben usar cantidades exageradas de aceite de inmersión, pues si éste no se quita cuando

se termina el trabajo, se secará sobre los lentes y producirá problemas para el microscopista. En la

mayoría los casos, es suficiente usar una gota de aproximadamente 5 mm de diámetro. NOTA:

Favor de no rotar el objetivo 10 X ó 40X, sobre el aceite de inmersión, por lo tanto girar primero al

lado contrario para utilizar el objetivo 100X con aceite.

g. Cuando hay necesidad de movilizar el microscopio de un sitio a otro, éste debe sostenerse

en posición vertical, y tomarlo por el brazo y por la base, que son las partes más sólidas del equipo.

La movilización inadecuada puede desviar los prismas y su arreglo solo puede hacerlo un experto.

h. La calidad del microscopio depende de la calidad de los objetivos. Estos objetivos son lentes

muy costosos y se debe tener un excesivo cuidado para evitar que se rallen. Siempre se debe

comenzar enfocando con el objetivo de menor aumento y luego pasar al de mayor aumento.

Enfoque siempre hacia arriba y no hacia abajo, pues el lente puede golpearse y rallarse con la

lámina o la platina.

i. Las lámparas no deben usarse al máximo de intensidad, ya que se acorta su vida útil. Lo que se

debe hacer es centrar, enfocar y subir el condensador o diafragmas para lograr optimizar al máximo

la luz.

 

       

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I.3 Mantenimiento preventivo por parte del operador

De los elementos que componen el microscopio, los sistemas de lentes son las partes que exigen mayor

número de cuidados especiales. Los componentes mecánicos y de iluminación pueden ser reemplazados y

ajustados sin que para ello se realicen grandes esfuerzos; en cambio el deterioro de un componente óptico

es un hecho lamentable, cuyo costo es considerable y no puede compararse al de los otros tipos de fallas.

Debido a esto, a continuación se detalla el procedimiento para realizar un buen mantenimiento preventivo

para mantener en optimas condiciones los diferentes sistemas que forman el microscopio:

a. Limpie la superficie del equipo con un trapo humedecido con agua, no use alcohol, acetona u otra

sustancia demasiado fuerte, ya que la pintura puede desprenderse.

b. Verifique que el cable de conexión no presente ningún deterioro en su aislante, especialmente en

sus extremos, si se presenta cámbielo o repórtelo a Mantenimiento.

c. Compruebe el buen funcionamiento de él o los diafragmas, y el correcto montaje del condensador.

Céntrelo si es necesario.

d. Verifique los desplazamientos mecánicos de la platina y el portaobjetos; limpie y lubrique con

grasa fina las cremalleras o guías visibles.

e. Es recomendable tener a la mano un bombillo de repuesto, para no interrumpir el trabajo cuando

se queme el que está en uso.

f. Desmontar los objetivos y oculares para su limpieza, según se detalla:

f.1 Objetivos:

− Con un ocular en posición invertida observar el lente externo del objetivo, conservando un

ángulo de aproximadamente 30º, para detectar partículas de polvo o aceite, rayones u

hongos.

− Con un hisopo humedecido ligeramente en agua destilada frotar el lente externo del

objetivo en forma circular y luego pasarle un hisopo seco para secar el lente.

− Con una perilla insufladora sopletear cualquier partícula de polvo o algodón interna y

externamente del objetivo.

− Por ningún motivo desarme el objetivo, porque puede dañarlo o hasta desajustarlo.

− Si la suciedad persiste, repórtelo de inmediato al Departamento de Mantenimiento.

 

       

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f.2 Oculares:

− Para determinar si los oculares se encuentran sucios, montar una lámina con cualquier

muestra en el portaobjeto de la platina y observarla con el objetivo 40x, una vez enfocado el

objeto hacer girar un ocular a la vez y si se observan partículas que giran, es signo de

suciedad en los lentes de los oculares.

− Cuando se retiren los oculares, cubrir los orificios donde estos se encuentran para que no

entre polvo en los prismas del cuerpo binocular del microscopio.

− Sobre una franela o pedazo de tela desarme cuidadosamente el ocular, teniendo especial

cuidado de conservar el orden y posición en la que se encuentran los lentes y separadores.

− Cada lente debe limpiarse con un pedazo de algodón ligeramente humedecido con agua

destilada y luego secarlo con algodón seco, teniendo el cuidado de no tocar los lentes con la

yema de los dedos, porque quedaran impresas sus huellas digitales.

− Con la pera insufladora sopletear los lentes para retirar cualquier partícula de polvo o

algodón.

− Armar cuidadosamente de nuevo el ocular, conservando el orden, de manera inversa a la

cual se desarmo.

− Nunca use sustancias como acetona, xilol, alcohol 90º, éter u otro para limpiar los lentes;

estas sustancias solamente son usadas por personal de Mantenimiento técnicamente

capacitados.

− Si la suciedad persiste y dificulta demasiado la visualización del objeto, repórtelo al

Departamento de Mantenimiento del Laboratorio.

I.4 CENTRÍFUGAS

I.4.1 Descripción del Equipo

Las centrífugas son equipos médicos utilizados en los laboratorios, clínicas y otros, para la separación de

solutos de sus solventes. Por ejemplo en la rama de laboratorio clínico, para el análisis de sangre, por lo

general es necesario separar el plasma de los otros componentes para poder ser analizado. Existen varios

tipos básicos:

 

       

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Centrífugas Clínicas (para separación de sueros o plasma) de baja velocidad (Macrocentrífuga, entre 2,000

y 6,000 R.P.M. aproximadamente), Centrífugas para microhematócritos (Microcentrífuga entre 10,000 y

18,000 R.P.M. aprox.) y las ultracentrífugas (de 20,000 hasta 75,000 R.P.M.) para la separación de

proteínas.

También pueden ser catalogadas basándose en otras características, como: grandes, medianas y pequeñas;

o de piso.

En la figura No. 2, se muestra una centrífuga típica, con sus partes. Las partes principales de este equipo

son las siguientes (Ver figura 2):

Figura 2. Centrífuga

1. Tapadera

2. Cámara o gabinete

3. Base

4. Interruptor de encendido

5. Marcador de tiempo

6. Tacómetro

7. Freno

8. Control de velocidad

• Tapadera. Impide el acceso a las muestras, mientras estas están en movimiento. En la mayoría de

modelos funciona en forma automática, de modo que no pueda ser abierta mientras la centrífuga

está en funcionamiento.

• Cámara o gabinete. Es el espacio físico donde se realiza el proceso de centrifugación.Dentro de

esta gira el rotor (araña).

   

 

       

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• Base. Está construida generalmente de materiales pesados, y con sistemas de fijación a las

superficies, de modo que brinda estabilidad al equipo. Generalmente aquí están ubicados los

controles.

• Interruptor de encendido. Permite controlar el suministro de energía al equipo, a modo de

encenderlo, apagarlo, y generalmente incluye selección de modo de operación.

• Control de Tiempo. Permite controlar el tiempo de centrifugación. Generalmente también permite

visualizar el tiempo transcurrido o pendiente para que finalice un proceso seleccionado.

• Tacómetro. Muestra la velocidad a la que gira el rotor, es decir la velocidad de centrifugación (en

revoluciones por minuto, RPM).

• Freno. Algunas centrífugas, dependiendo del modelo, presentan este control, el cual permite ya

sea hacer más rápido el proceso de paro de la centrífuga, o detenerla en situaciones de emergencia.

Su función específica es determinada por el fabricante, por tanto debe ser utilizado con precaución

según las instrucciones de éste.

Otras partes no mostradas en la figura, pero importantes en la centrífuga son:

• El rotor. También conocido como araña, es la parte en la cual se colocan los porta muestras. Para

su conservación es importante seguir las instrucciones de cargado de la centrífuga (sección IV.2).

• Porta muestras. Son una especie de recipientes donde se colocan las muestras. Su tamaño

depende de la aplicación para la que esté diseñado el equipo: Banco de sangre, hematócrito, etc.

Estos componentes pueden ir variando dependiendo de la complejidad y calidad del equipo.

I.4.2 Cargado de la Centrífuga

El cargar la centrífuga en una forma adecuada es muy importante para el funcionamiento correcto de la

misma, y su preservación. Un procedimiento incorrecto de cargado, ocasiona que la centrífuga vibre durante

el proceso de centrifugación, lo que ocasiona que el rotor sufra daños que pueden llevar a su sustitución.

Un procedimiento de cargado correcto, implica el colocar las cargas en el rotor de forma balanceada.

Las centrífugas están diseñadas para obtener un balance cuando están en movimiento. Para esto es

necesario cumplir los siguientes requisitos:

a) Colocar las cargas de modo que las cargas que tienen la misma masa o peso queden colocadas

de forma opuesta en el rotor. Si tiene un número impar de muestras para ser cargadas, busque otra

muestra de igual peso a modo de siempre formar pares opuestos de igual peso; nunca coloque un

 

       

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número impar de muestras dentro de la centrífuga. Utilice la balanza para estar seguro de la

igualdad de los pesos.

b) Además de tener la misma masa (peso), deben tener el mismo centro de gravedad, es decir: no

coloque tubos y recipientes como pares contrapuestos, que tengan diferente forma, tamaño,

espesor, etc.

c) Utilice la centrífuga colocando todos los accesorios en el rotor, ya que estos equipos han sido

diseñados para trabajar con estos.

d) Utilice el rotor y accesorios originales del equipo. Las piezas no originales pueden producir un

desbalance y acortamiento de la vida útil del equipo.

e) Complemente estas recomendaciones con las instrucciones del fabricante.

I.4.3 Otras Recomendaciones de Uso

Además de seguir las recomendaciones de la sección I.4.2, es importante tomar en cuenta otras para

mantener la centrífuga en las condiciones adecuadas:

1. Mantenga la centrífuga limpia de restos de muestras, vidrio o polvo.

2. Cuando esté centrifugando mantenga cerrada la tapadera. Si algo se rompe apague

inmediatamente el equipo y no lo abra hasta que se detenga o el indicador de apertura de la

tapadera lo indique.

3. Reemplace los recipientes metálicos que estén deformados, pues producen una presión no

uniforme sobre el tubo de muestra.

4. No utilice equipo de vidrio rallado o agrietado, porque la presión centrífuga puede producir una

ruptura en estos puntos, pulverizando el vidrio y contaminando las otras muestras.

5. Reemplace los tapones amortiguadores de los portamuestras. Cuando se deterioren y/o se rompa

un tubo de vidrio, limpie los restos (macrocentrífuga).

6. Compruebe que la superficie donde tiene el equipo esté perfectamente nivelada, ya que si sucede

lo contrario causaría vibraciones.

7. Compruebe el funcionamiento del equipo realizando los siguientes pasos:

− Cargue la centrífuga correctamente y ciérrela.

 

       

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− Asegúrese que la centrífuga esté bien cerrada.

− Accione el interruptor de encendido, fijando previamente la velocidad y/o el tiempo de

centrifugación (sí el equipo cuenta con estos controles).

− Observe detenidamente el funcionamiento; si no existiese ningún problema continúe con

su trabajo.

− Si existen problemas de vibración, balancear correctamente los portamuestras.Si no

funciona el equipo, revisar el cable de conexión eléctrica, carbones o fusibles.

I.4.4 Mantenimiento Preventivo por parte del operador

1. Tome un pañuelo humedecido con agua y limpie internamente la cámara y la superficie externa;

luego pase suavemente un pañuelo seco. Si tiene manchas póngale al pañuelo humedecido, un

poco de detergente, si las manchas persisten repórtelas a mantenimiento. Recuerde que la orina y la

sangre son altamente corrosivas, por lo tanto, cuando se derramen limpie inmediatamente como se

detalló anteriormente.

2. Revise que el mecanismo de seguridad de la puerta funciona correctamente.

3. Verifique el funcionamiento y exactitud del control de tiempo y velocidad, si los tuviese.

4. Revise el estado del freno automático o manual, si lo tuviera.

5. Revise él o los empaques de hule, en la mayoría de los casos el tubo capilar (en la

microcentrífuga) perfora el empaque, botando la muestra de sangre, la plastilina y/o pulverizando el

tubo capilar. No hay necesidad de cambiar el empaque, basta con despegarlo con mucho cuidado y

girarlo un tercio del espacio entre marca y marca de un tubo capilar y el otro; pegarlo nuevamente

con pega de zapatero. Este procedimiento puede hacerse hasta dos veces, después cámbielo.

6. Verifique la alimentación eléctrica del equipo para detectar posibles peladuras, cortes o

degradación del material aislante.

7. Para cambiar los carbones, algunas centrífugas tienen acceso directo a ello, y basta con

desmontar las tapaderas de los portacarbones y verificar el estado de estos. Si estuviesen bien

gastados (entre un 60% y 75% de su tamaño normal), agrietados o astillados, cámbielos

inmediatamente. Siempre se cambian los dos carbones, nunca debe cambiarse solo uno. En la

mayoría de las centrífugas el acceso a los carbones se tiene por la parte de abajo del equipo, basta

con retirar los portamuestras e invertir el equipo, con un destornillador plano o Phillips (según sea el

 

       

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caso), retirar los tornillos de la tapa inferior; verificar los carbones usando el criterio anterior. Antes

de realizar este procedimiento es importante que el técnico de mantenimiento le haya explicado

cómo hacerlo, de lo contrario reporte la falla a mantenimiento.

8. Verifique que al centrifugar las muestras, no exista vibración excesiva. Si la hay, verifique las

cargas; si estas están bien y la vibración persiste, repórtelo al departamento de Mantenimiento del

laboratorio.

1.5 BALANZA GRANATARIA

1.5.1 Descripción del Equipo

Se estudia la balanza granataria en el presente manual por ser un equipo que tiene importancia en el

Laboratorio Clínico, ya que de su buen uso depende la exactitud en la preparación de reactivos y de

estándares.

La balanza granataria (Ver figura 3) es la que nos proporciona mayor exactitud, es por eso que es usada de

preferencia en ambientes como los laboratorios clínicos, en donde se requiere de gran precisión en la

medida.

Figura 3. Balanza Analítica

1. Botón de liberación de platos

2. Botón de liberación del fiel

3. Escala de centésimas de gramo

4. Soporte de platillos

5. Tornillos de base

6. Botón de movilización de caballete

 

       

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7. Platillos 8. Escala de décimas de gramo

Cabe observar que la balanza analítica manual de dos platillos, es muy delicada, ya que todas sus piezas

van colocada sobre pequeñas cuñas, lo que hace que una vibración fuerte, cerca de ella pueda

desequilibrarla.

1.5.2. Operación del Equipo

a) Antes de iniciar el uso de la balanza, asegúrese que todo el sistema esté a 0 (calibrado).

b) Para pesar un reactivo, debe pesarse primero el papel para film o papel encerado y a ese peso

sumarle la sustancia que se desea pesar.

c) Se coloca la sustancia que se va a pesar, en el platillo de la izquierda y en el platillo de la derecha

las unidades de gramo.

d) Cuando se inicia el proceso de pesado primero se liberan los platillos de sus soportes con el

botón lateral y luego se libera el fiel, con el botón central.

e) Cuando se ha liberado el fiel, nos indica de acuerdo a su desplazamiento, si la sustancia que

estamos pesando, necesita mayor o menor peso.

f) Las unidades de gramos, las colocamos sobre el platillo de la derecha, las décimas sobre la escala

superior.

g) Para obtener las centésimas y milésimas de gramos, se busca en la escala colocada al lado

derecho de los platillos, se toma como referencia el 0 de un pequeño nonius colocado bajo la escala.

1.5.3. Cuidados del Equipo

a) La balanza debe protegerse de las variaciones de temperatura y humedad, exposición a la luz

solar, no colocarse cerca de hornos, baños de María, etc., tanto al almacenarse como en su uso, ya

que los objetos calientes o tibios tienen un peso menor que cuando están fríos, debido a corrientes

que se establecen con el aire que los rodea.

b) Debe colocarse en una mesa que sea firme y protegerla de vibraciones (de ser posible una mesa

exclusiva para ella).

 

       

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c) Los platillos y el fiel deben descansar en sus soportes, siempre que no se está utilizando la

balanza.

d) La campana debe permanecer siempre cerrada.

e) Mientras la balanza está oscilando, la sustancia a pesar no debe colocarse sobre los platillos, ni

removerse. Para colocar el peso, debe de estar cerrado el fiel y los platillos colocados sobre los

soportes.

f) Si se derrama algún reactivo durante la pesada, hay que limpiar de inmediato con un paño limpio y

seco.

g) No manipular con los dedos, hay que utilizar las pinzas que se encuentran en la caja de pesas.

h) Para mantener un ambiente libre de humedad dentro de la campana, colocar en las esquinas de

la misma dos beakers (de 100 ml.) llenos de sílica gel o Carbonato de Sodio.

i) Los pesos mayores de 1 gr deben ser añadidos estando el brazo en posición de reposo, pues de lo

contrario se puede dañar la porción oscilante que une el platillo al brazo. El brazo siempre debe

soltarse suave y lentamente.

j) Se debe observar si hay una marcada oscilación del platillo después de soltarse el brazo, pues

esto indica falta de alineación. La alineación debe hacerla personal capacitado. Repórtela al

departamento de mantenimiento.

k) La balanza debe protegerse de corrientes de aire, pues estas producen inestabilidad. Se requiere

más o menos 15 minutos con 30 segundos para que el flujo de aire cese después de que se ha

cerrado la puerta.

I.6 PIPETAS AUTOMATICAS

I.6.1 Descripción del equipo

El creciente aumento en las enfermedades de alto riesgo (VIH y Hepatitis B) hace necesario que el personal

que trabaja en los laboratorios clínicos tome muy en serio las recomendaciones dadas por la OMS. Una de

las más importantes recomendaciones es la prohibición de usar pipetas con la boca.

Es por ello que se hace necesario el conocimiento del uso de las pipetas automáticas y de las pro-pipetas

(Ver figura 8).

 

       

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Figura 8. Pipetas automáticas de diferentes volúmenes

I.6.2 Operación del Equipo

Técnica de pipeteo para líquidos claros:

a. Se presiona el botón superior suavemente hasta el primer tope.

b. Se sumerge la punta, en la solución que se necesita pipetear estando seguros que la punta este

bien colocada y que no haya ningún tipo de residuos entre la punta y el cuerpo de la pipeta.

c. Mantenga la pipeta verticalmente mientras toma la solución.

d. Para descartar la solución de la punta presione el botón hasta el segundo tope.

e. Descarte las puntas utilizando el eyector que traen las pipetas.

Técnica de pipeteo para líquidos con alta viscosidad:

a. Presione el botón superior hasta el segundo tope.

b. Sumerja la punta en la solución (2-3 mm) y suelte el botón despacio. La punta tiene que estar bien

llena.

c. Descarte el líquido de la punta presionando suavemente el botón superior hasta el primer tope.

 

       

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I.6.3 Cuidados y Mantenimiento del Equipo

a. Iniciar el día limpiando la parte externa de las pipetas de polvo o suciedad.

b. Use solamente etanol al 70% para la limpieza de la pipeta. Otro tipo de solvente no es

aconsejable.

c. Utilizar las puntas adecuadas a las pipetas y a la cantidad de solución que se va a medir.

d. El pistón y el cilindro pueden ser chequeados al menos una vez al año si la pipeta es usada

diariamente.

EQUIPO FALLA POSIBLES SOLUCIONES

Microscopio binocular a) No enciende -Revise que el cordón está bien

conectado al toma-corriente

-Remueva el foco, inspeccione

visulamente si está quemado sí

es así reemplazelo

b) Luz parpadea

c) Hongos en los lentes y

prismas

Sí no están muy dañados limpiar

con líquido a base de alcohol ó

éter

Centrífuga a) Vibración fuerte, quiebra

tubos de ensayo

b) Funciona muy lento

-Revisar patas de hule

-Poner iguales todos los tapones

de hule en los portamuestras

-Pesar y balancear pesos de los

portamuestras

-Revisar si los electrodos de

carbón están gastados y cambiar

carbones

Balanza analítica No se puede calibrar -Revisar el agua de preferencia

que esté centrada

-Centrarla con los tornillos que

sirven de base

 

       

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TÉCNICAS DE HEMATOLOGÍA

PRACTICA II. - HEMOGRAMA

I. Introducción

El hemograma es un estudio rutinario realizado para el diagnóstico clínico de algunas entidades patológicas

o como medio de seguimiento de evolución de las mismas. Los datos que aporta de manera importante es la

presencia de anemia o eritrocitosis, así como la evidencia de enfermedades inflamatorias y ocasionalmente

alérgicas, asi como también permite identificar agentes etiológicos (Babesia spp.).

Consta de partes importantes, el eritrograma (Hematocrito, eritrocitos e índices de Wintrobe), el leucograma

(Leucocitos totales y cálculo diferencial) así como la evaluación de las plaquetas y la medición de sólidos

totales por refractometría. A continuación se describen las técnicas para obtener los distintos valores del

hemograma.

II. Objetivo

El discente desarrollará las habilidades necesarias para hacer un hemograma obteneniendo el hematocrito,

el número de eritrocitos, los índices de Wintrobe, conteo de leucocitos, así como el diferencial, para clasificar

las anemias o en su caso policitemias presentes en el paciente, procesos inflamatorios y/o infecciosos, para

asi tomar decisiones terapéuticas sobre los pacientes.

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL MICROHEMATOCRITO

III. MATERIAL NECESARIO

• Tubos capilares

• Microcentrífuga

• Plastilina o un encendedor

• Sangre con EDTA o heparina

 

       

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TECNICA

1. Llenar un tubo capilar liso (75 mm x 1.0 mm), hasta 3/4 partes de su capacidad con sangre

anticoagulada con EDTA o heparina, sosteniendo el tubo en una posición casi horizontal para

facilitar el llenado.

a. Como una alternativa puede obtenerse sangre por punción capilar de la oreja, la uña o dedo

utilizando tubos heparinizados.

2. Limpiar el exceso de sangre del exterior del capilar.

3. El extremo capilar que tiene el anillo coloreado debe sellarse con plastilina manteniendo el capilar en

posición horizontal e introduciendo este extremo seco en la placa con el compuesto sellador en un

ángulo de 90°, girar el capilar ligeramente y retirar la placa. El tapón formado debe tener menos de 4

mm de longitud.

a. También puede ser sellado acercándolo a la flama de un mechero (o encendedor en su

defecto) teniendo cuidado de no calentar la sangre.

4. Colocar el capilar en la microcentrifuga con la parte sellada hacia la periferia. Identificar bien los

tubos.

5. Fijar el cabezal de la centrífuga y cerrar la tapa.

6. Centrifugar durante 5 minutos entre 12.500 y 15.000 rpm. no usar el freno para detener la centrífuga.

7. Se retiran los tubos de la centrifuga y se lee el porcentaje de hematocrito o también conocido como

PVC (packed cell volume). Utilizando la tabla para su lectura.

 

       

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8. Se debe leer el nivel de eritrocitos centrifugados; no incluir la capa rica en leucocitos y plaquetas

(buffy coat). El valor del hematocrito se calcula dividiendo la longitud de la capa de eritrocitos entre

la longitud total constituida por los eritrocitos, buffy coat y plasma.

Valor de referencia

Perros adultos = 0.37 – 0.55 L/L (37 a 55%)

Cachorros perros y gatos = (4 a 6 semanas) 0.24 a 0.34 L/L (24 a 34%)

Gatos adultos = 0.30 a 0.45 (30 a 45%)

Estos valores son ligeramente más bajos en hembras, y dependen de la localidad donde se evalúen, por lo

que se recomienda realizar tablas de referencia para valores hematológicos.

RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS

MATERIAL NECESARIO

• Hematocitómetro o cámara de

Neubauer

• Pipeta de Thomas

• Tubo de hule y boquilla

• Sangre con EDTA

• Diluyente de Harem (cloruro de

mercurio 0.5g, cloruro de sodio 1.0g,

sulfato de sodio 5.0g, y agua destilada

200ml) ó solución salina

TÉCNICA

1. Se ensambla el equipo, uniendo la boquilla al tubo de hule y este a la pipeta de Thomas.

2. Mezclar la sangre.

3. Aspirar la sangre con la pipeta hasta la marca de 0.5 usando una suave succión.

 

 

       

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4. Se debe limpiar la sangre del exterior de la pipeta con un trozo de papel filtro.

a. Si se rebasa la marca se debe ajustar eliminando el exceso de sangre con un papel filtro o

un algodón, aun así pueden quedar adheridas células a la pipeta y la cuenta podría resultar

más alta.

5. Después se aspira el diluyente de Harem ó sino tenemos utilizar solución salina, con una succión

uniforme hasta la línea de 101 por encima del bulbo y se debe girar suavemente mientras se llena.

6. La pipeta se retira del diluyente de forma horizontal y se tapan los orificios con los dedos, toda la

sangre debe estar en el bulbo.

7. La pipeta debe agitarse por 2 o 3 en un agitador mecánico, si se hace manual debe ser formando

8´s con la muñeca.

Conteo de eritrocitos

1. La cámara y el cubreobjetos deberán limpiarse cuidadosamente quitando la pelusa y grasa.

2. Se coloca el cubreobjetos especial con los extremos más largos paralelos y sobre los bordes de

apoyo de la cámara, manejándolo solo de los extremos más largos paralelos y sobre los bordes de

apoyo de la cámara, manejándola solo de los extremos largos.

3. Inmediatamente después de agitada la pipeta se desechan 3 gotas y se limpia la punta de la pipeta

con un algodón.

4. Con la punta de la pipeta se toca el espacio entre el cubreobjetos y la cámara dejando fluir el líquido

por capilaridad, sin que se derrame por los bordes, y se retira la pipeta.

 

 

 

       

22/70  

5. Si se derrama hay que repetir este paso, previamente limpiando la cámara.

6. Se esperan 3 minutos para que sedimenten las células, pasado ese tiempo inicia la evaporación.

7. Con el objetivo de 10x del microscopio se localiza el cuadro central de los 9 cuadros grandes y una

distribución homogénea de las células.

8. Con el objetivo de 40x se deben contar los eritrocitos en 5 de los 25 cuadros pequeños del área

central.

9. Cada uno de los 5 cuadros está limitado por líneas dobles y triples y se dividen en 16 más

pequeños.

a. Se cuenta iniciando a la izquierda de la fila superior de los cuatro cuadros pequeños, luego

de derecha a izquierda en la siguiente fila y así sucesivamente.

b. En la línea triple: no se cuentan las células que toquen las líneas internas superior e

izquierda.

c. En la línea doble: no se cuentan las que toquen las líneas interna inferior y derecha y si se

cuentan las que toquen las líneas externas superior e izquierda.

 

       

23/70  

d. Cálculo

• Eritrocitos/Litro= Células contadas ÷ 100 (0.1mm de profundidad) X 5 (1/5 de mm cuadrado) X 200

(dilución de 1:200)

• Lo que es igual a 1 x1012/L la suma de las células contadas en los 5 cuadros = Eritrocitos / micro

litro

• Si existe anemia marcada (Hto < 0.2 L/L) la pipeta se llena con sangre hasta la marca de 1 de la

pipeta y se diluye hasta 101 y las células contadas se multiplican por 5000.

• Cuando son demasiados eritrocitos o muy grandes la sangre se extrae hasta la marca de 0.3 y se

diluye hasta la marca de 101 y la dilución que se usa en el cálculo es de 1:333.

INDICES ERITROCITARIOS

Volumen globular medio (VGM)

VGM= Hto (L/L) x 1000 /recuento de eritrocitos (x 1012/L)

VGM= Hto (%) x 10 /recuento de eritrocitos (x 1012/L)

Valores de referencia

Perros adultos 60 a 77 Femtolitros (fL).

Perros recién nacidos 95 a 100 fL hasta los 2 meses de edad.

Gatos adultos 39 a 55 fL.

Gatos recién nacidos 90 fL hasta el mes de edad.

 

       

24/70  

Concentración media de hemoglobina globular (CMHG)

CMHG (g/dL) = hemoglobina (g/dl) x 100 / Hto (%)

CMHG (g/L) = hemoglobina (g/L) / Hto (L/L)

Valores de referencia

Los valores de las células normocrómicas varían de 320 a 370 g/L, de las células hipocrómicas son menores

a 320 g/L y los de células hipercrómicas son mayores que 370 g/L.

RETICULOCITOS

En los casos en que es diagnosticada una anemia (Hto < 0.37 L/L) es imperativo determinar si esta es

regenerativa, por lo que se debe realizar un conteo de reticulocitos y calcular todos los parámetros que este

conteo ofrece.

MATERIAL NECESARIO

• Colorante (Nuevo azul de Metileno –NAM, Azul de cresilo brillante)

• Sangre completa con EDTA

• Pipeta automática

TECNICA

1. Colocar 50 microlitros de sangre en un tubo de ensayo.

2. Agregar 50 microlitros del colorante.

3. Homogenizar la mezcla y tapar el tubo.

4. Dejar reposando por 15 minutos.

5. Realizar un frotis y secarlo al aire

6. Teñirlo con Wright *.

7. Enfocar con el objetivo de 10X y realizar el conteo con el objetivo 100x utilizando aceite de

inmersión.

8. Se realiza el conteo de 500 eritrocitos incluyendo reticulocitos. Se debe calcular el:

a. Porcentaje relativo de reticulocitos

b. El valor absoluto (n° de reticulocitos real en 1 litro de sangre)

c. Cuando el hematocrito esta bajo, el porcentaje de reticulocitos puede elevarse de forma

artificial porque la sangre entera tiene menos eritrocitos y por lo tanto se usa un factor de

corrección que considera al hematocrito normal de 0.45 L/ L

 

       

25/70  

* EL FROTIS PUEDE OBSERVARSE SIN NECESIDAD DE TEÑIR NUEVAMENTE CON WRIGHT.

Cálculo

% de reticulocitos = N° de reticulocitos X 100 / 500

Valor absoluto de reticulocitos (reticulocitos x109/L) = Eritrocitos totales X porcentaje de reticulocitos X

10. Si el valor es mayor a 60 x10 9/L se considera una anemia regenerative.

Reticulocitos corregidos= Porcentaje de reticulocitos X Hto. observado (L/L)/ Hto. Normal (0.45L/L perro;

0.35 L/L en gato). Este valor corrige para casos donde existe destrucción de eritrocitos maduros de forma

aguda.

Índice de producción de reticulocitos (IPR)

Representa el incremento de la producción de eritrocitos: es decir, un IPR de 4 significa que la producción de

eritrocitos es 4 veces mayor que la tasa normal.

IPR = Recuento de reticulocitos (%) x valor de Hto observado (L/L)

Tiempo de maduración

Hto (L/L) Hto (%) Tiempo de maduración

reticulocitaria

0.45 45 1

0.35 35 1.5

0.25 25 2

0.15 15 2.5

Interpretación: IPR < 2 = anemia no regenerativa; IPR > 2 = anemia regenerativa; IPR > 3 = sugerente a

anemia hemolítica

 

       

26/70  

RECUENTO DE GLOBULOS BLANCOS

MATERIAL NECESARIO

• Hematocitómetro o cámara de Neubauer

• Pipeta de Thomma para blancos

• Tubo de hule y boquilla

• Sangre con EDTA

• Microscopio

• Solución de Turk (ácido acético glacial 3ml, violeta de genciana al 1% 1ml, agua destilada c.b.p. 100

ml)

TÉCNICA

1. Se sigue la misma técnica que con los eritrocitos solo que la pipeta tiene una marca de 11 por

encima del bulbo.

2. La sangre se aspira hasta la marca del 0.5 y diluida hasta la marca de 11 con la solución de Turk.

3. Se desechan 2 o 3 gotas de la pipeta antes de llenar la cámara.

4. Se deja 1 minuto para que los eritrocitos se lisen y que los leucocitos sedimenten.

5. Con el objetivo de 10x se cuentan las células de cada uno de los 4 cuadros grandes de las esquinas como se muestra en la siguiente figura.

 

     

 

       

27/70  

a. Se debe reducir la iluminación para detectar a los leucocitos como objetos uniformes y

oscuros.

b. La regla de incluir y excluir las células es la misma que la de los eritrocitos.

Cálculo

• Leucocitos totales /x109/L= Células contadas x 0.05.

• Lo que es igual a 50 por la suma de las células contadas en los 4 cuadrados= Leucocitos totales

/microlitro.

• Cuando se encuentran más de 5 eritrocitos nucleados en el diferencial, la cuenta leucocitaria

se debe corregir de la siguiente manera:

Cuenta corregida = Leucocitos totales X 100 / 100 + Glóbulos rojos nucleados

observados.

RECUENTO DIFERENCIAL

Este conteo permite saber los porcentajes y valores absolutos de las distintas líneas de leucocitos, que

permitiría determinar la presencia de diferentes reacciones.

MATERIAL NECESARIO

• Portaobjetos

• Cubreobjetos

• Tinción de Wright

• Sangre con EDTA

TÉCNICA

1. Hacer una extensión de sangre bien mezclada con sangre con anticoagulante EDTA o capilar con el

método de atraer y arrastrar.

2. Seque rápidamente al aire o en una corriente de aire tibio.

3. Tiña el frotis con la técnica indicada en el apartado de tinciones soluciones.

4. Formas incorrectas de extendido de frotis:

 

       

28/70  

Examen microscópico

• En 10x examinar calidad global del frotis, color y distribución de células, la formación de rodillos por

los eritrocitos o la aglutinación de los mismos, debe revisarse con rapidez en busca de cualquier

célula anormal grande o incluso parásitos inesperados.

• En 40x se selecciona la zona correcta del extendido donde se debe iniciar el recuento y evaluar la

morfología celular. Para ello se selecciona el área en la que los eritrocitos estén superpuestos de 2 a

3 pero que la mayoría estén separados entre sí.

 

       

29/70  

• En 100x se coloca una gota de aceite de inmersión y se enfoca con este objetivo, se cuentan y

clasifican 100 leucocitos y se informan como porcentajes de leucocitos (valores relativos). La

morfología de eritrocitos y plaquetas así como la estimación de estas últimas se hacen también con

este.

Diferencial leucocitario

• Cuando el recuento leucocitario es mayor a 40.0 x 109/L se debe realizar el conteo diferencial en 200

células.

• El barrido del frotis debe hacerse en forma de almena para lograr que la observación sea

representativa como se muestra en la figura siguiente.

• Es importante incluir los bordes laterales para incluir las células más grandes como monocitos,

linfocitos reactivos y células inmaduras.

 

       

30/70  

• También se informan anomalías de leucocitos, granulaciones toxicas (se informan como ligeras a

marcadas o 1+ a 3+), cuerpos de Dohle, linfocitos reactivos (pueden reportarse como porcentajes o

como aislados o abundantes).

La formula para convertir valores relativos en absolutos nunca debe omitirse ya que son los

valores más útiles para la interpretación es la siguiente:

Línea celular/x109/L= % de línea celular contado X total de leucocitos (x109/L)/ 100

• La morfología eritrocitaria se informa de acuerdo a las formas encontradas y además en cantidad

como ligera, moderada y abundante o en escala de 1+ a 3+

PROTEINAS PLASMÁTICAS

MATERIAL NECESARIO

• Tubo capilar

• Sangre con EDTA

• Refractómetro

• Tornillo calibrador (Flecha blanca)

TÉCNICA

1. Se realiza la técnica para medir el microhematocrito mencionada anteriormente.

2. Una vez separados los componentes se revisa el color del plasma sobre un fondo blanco. Se

pueden observar las coloraciones siguientes: amarillo pálido o paja, transparente, amarillo intenso,

rosado o rojizo, blanco lechoso o turbio, rosa lechoso.

3. Posteriormente el tubo capilar se rompe por encima del Buffy coat.

 

 

 

       

31/70  

4. Se depositan 1 o 2 gotas del plasma sobre el prisma del refractómetro por la parte contraria a la que

se rompió el tubo capilar.

5. Se observa y se registran los niveles de proteínas plasmáticas en g/dl para multiplicarlos por 10 para

obtener el valor en g/L.

Nota: los valores pueden estar falsamente elevados en hiperlipidemia, hemólisis y/o hiperbilirrubinemia.

Las proteínas plasmáticas y el hematocrito deben interpretarse en forma conjunta.

Se tiene que calibrar antes de la lectura el refractometro, aplicando una gota de solución buffer,

ajustando el tornillo (flecha blanca), despues de la lectura se realiza la limpieza con solucion fisiologica y

secar perfectamente el refractómetro.

 

       

32/70  

PRACTICA III. - PRUEBAS DE COAGULACIÓN

I. Introducción

La evaluación de los tiempos de coagulación es una práctica ideal para conocer los distintos tipos de coagulopatías que podrían presentarse en la práctica clínica. Aunque no son enfermedades comunes si son situaciones que ponen en peligro la vida de los pacientes y deben ser reconocidas correctamente.

II. Objetivo

El discente desarrollará las habilidades necesarias para evaluar los tiempos de coagulación y poder diferenciar las vías afectadas de dicha coagulación.

TIEMPO DE PROTROMBINA (PT TEST)

III. MATERIAL REQUERIDO:

• Plasma citratado (tubo azul)

• Tromboplastina tisular (reactivo refrigerado) “simplastin”

• Cubetas pequeñas

• Equipo (Trombotimer)

TÉCNICA

El trombotimer- 1 debe ser encendido 10 minutos previos al inicio del análisis.

Centrifugar la sangre a 1500 a 2000 rpm por 3 minutos.

1. Colocar 100 microlitros de plasma citratado en 1 cubeta pequeña y posicionarla en el trombotimer en

el lado derecho.

2. Colocar 200 microlitros de reactivo (tromboplastina tisular- TP) en una cubeta grande y posicionarla

en el trombotimer en el lado izquierdo.

3. Colocar el Balín en la cubeta con el plasma y comprimirla.

4.

Eso hará que el foco de LED se encienda indicando el inicio de la incubación. El foco comenzará a

parpadear cuando ya este por terminar la incubación y se apagara cuando así sea.

 

       

33/70  

5. Cuando termine la incubación, pasar la cubeta pequeña con el plasma y el balín al orificio central

(lector) e inmediatamente detener el conteo oprimiendo RESET. 6. Agregar los 200 microlitros del reactivo PT incubado en la cubeta grande a la cubeta pequeña que se

encuentra en el lector, posteriormente este se comprime.

7. Registrar el tiempo de coagulación.

El porcentaje y el índice de coagulación es el siguiente:

Tiempo de protrombina % del pool de5 animales sanos Interpretación

6.3 segundos 100 % Normal

8.1 segundos 50 % Normal

15.9 segundos 25 %

29.4 segundos 12.5 %

Valores de referencia

Perro 7 a 10 seg.

Gato 7 -12 seg.

PT  Plasma  +  

LED  

LED  

Lecto

 

       

34/70  

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL (PTTA TEST)

MATERIAL REQUERIDO:

• Plasma citratado (tubo azul)

• Reactivo refrigerado APTT “Dade Actin”

• Cloruro de Calcio refrigerado

• Cubetas pequeñas

• Equipo (Trombotimer)

TECNICA

Centrifugar la sangre a 1500 a 2000 rpm por 3 min.

1. Colocar 100 microlitros de plasma citratado en 1 cubeta pequeña más 100 microlitros de reactivo

(APTT) y posicionarla en el trombotimer en el lado derecho.

2. Colocar 100 microlitros de Cloruro de calcio en una cubeta pequeña y posicionarla en el trombotimer

en orificio inferior derecho.

3. Colocar el Balín en la cubeta con el plasma y comprimirla.

Eso hará que el foco de LED se encienda indicando el inicio de la incubación. El foco comenzará a

parpadear cuando ya este por terminar la incubación y se apagara cuando así sea.

4. Cuando termine la incubación, pasar la cubeta pequeña con el plasma mas el APTT y el balín al

orificio central (lector) e inmediatamente detener el conteo oprimiendo RESET.

5. Agregar los 100 microlitros del cloruro de calcio incubado a la cubeta pequeña que se encuentra en

el lector, posteriormente este se comprime.

6. Registrar el tiempo de coagulación.

Valor Normal: < 20 segundos.

Plasma  +  APTT+  Balín  

LED  

LED  

CaCl  

Lector  

 

       

35/70  

Valores de referencia

Perro < 11 seg

Gato < 15 seg

RECUENTO PLAQUETARIO

MATERIAL NECESARIO

• Sangre venosa con EDTA

• Realizarse entre los primeros 30 min a 6 hrs de colectada la muestra.

• Pipeta para conteo de eritrocitos

• Caja de petri y papel filtro

• Hematocitometro o cámara de neubauer normal

TECNICA

1. Con la pipeta de eritrocitos se aspira sangre capilar que fluye hasta la marca de 0.5 y se diluye hasta

la marca con oxalato amónico.

2. Se mezcla durante 5 minutos, de preferencia en un rotor mecánico.

3. Se desechan las primeras 3 o 4 gotas y se llena la cámara.

4. En la caja de petri con el papel filtro húmedo sobre la tapa o bien la hoja de papel húmedo en la

parte de abajo y la cámara sobre dos soportes que la separen del papel filtro húmedo, y encima la

tapa de la caja de petri para evitar la entrada de detritus y basura. 5. Ahí se deja reposar la cámara por 15 minutos para que las células sedimenten

6. Se cuentan todos los trombocitos en toda el área rayada reservada para la cuenta de eritrocitos. Se

utiliza microscopia de contraste con el aumento de 40x.

7. Deben contarse ambos lados del hematocitometro y los recuentos no deben diferir en más de un

10%

8. Como se usó una dilución 1:100 se observa 0.1mm3, el valor de trombocitos es el mismo para

concentracion de x 109/L.

 

       

36/70  

Valores de referencia

Perros 200 a 575 x109/L

Gatos 230 a 680 x109/L

Trombocitopenia leve 100 – 175 x109/L

Trombocitopenia grave < 20 x109/L en el cual puede haber signos clínicos.

Estimación plaquetaria

1. Se lleva a cabo sobre el frotis de sangre teñido con Wright

2. Se evalúa el final del frotis en busca de agregados plaquetarios en caso de observarlos se señala

que hay una cantidad “adecuada o suficiente”

3. Si no se observan estos se hace la lectura en 10 campos homogéneos en el objetivo de 100x en

donde se tiene una sola capa celular y se divide entre 10 para obtener un promedio y el promedio se

multiplica por 20.

4.

Cada plaqueta contada por campo a 100 X equivale a 20 x 109/L plaquetas.

Valores de referencia

Perros 8 ≥ 15 plaquetas por campo

Gatos 8 ≥ 15 plaquetas por campo

 

       

37/70  

PRUEBA DE FIBRINOGENO

1. El tiempo de trombina mide la cantidad de fibrinógeno funcional.

2. Método de Millar. Se calienta el plasma a 56° C en un tubo capilar para microhematocrito para

precipitar el fibrinógeno: medición sencilla y bastante confiable del fibrinógeno.

a. Se colecta la sangre con EDTA y se pone en un tubo de microhematocrito, se sella uno de

los extremos

b. Se hace girar por 5 minutos en una centrifuga de microhematocrito

c. Se coloca el tubo en un baño de agua a 56° C (± 1) por 3 minutos. Asegurando se la

columna de plasma quede completamente bajo la superficie del agua.

d. El fibrinógeno precipitado queda empacado arriba de una capa amortiguada por

centrifugación, esto dura 3 minutos.

e. Una vez precipitado por temperatura y centrifugado se obtiene el suero y se hace la lectura

en el refractometro.

La diferencia de las proteinas plasmaticas observadas antes y despues de la incubacion es el valor de

fibrinogeno en la muestra.

 

       

38/70  

PRÁCTICA IV. - PRUEBAS CRUZADAS

I. Introducción

La anemia es una entidad clínica sumamente común en la práctica diaria, en ocasiones esta anemia puede

ser tan grave que los mecanismos compensatorios podrían verse superados y por tanto poner en riesgo la

vida del paciente. La transfusión sanguínea es una técnica que se lleva a cabo siempre que existe un déficit

de eritrocitos que transporten suficiente cantidad de oxígeno a los tejidos. Una de sus principales

desventajas es la existencia de incompatibilidades que deben ser evaluadas previamente a la administración

de sangre entre individuos, para hacer a esta práctica más segura.

No se debe transfundir a un paciente simplemente con base a un hematocrito (Hto), sino también tomar en

cuenta la causa y si persiste la pérdida de sangre, si está respondiendo al tratamiento sintomático, etc. El

funcionamiento renal, cardiaco y pulmonar también deben ser tomados en cuenta antes de realizar una

transfusión. Cuando el Hto es menor a 0.30 L/L se encuentra deprimida la función ventricular, sin embargo,

la extracción de oxígeno y la presión venosa central de O2, permanecen normales hasta que se alcanza un

Hto de 0.20 L/L (2, 3). El volumen sanguíneo circulante (plasma + eritrocitos) normal en perros es de 85 a 90

ml/kg., y en el gato es de 65-75 ml/kg (4).

II. Objetivo

El discente desarrollará las habilidades necesarias para identificar las posibles incompatibilidades

sanguíneas entre individuos de la misma especie, antes de realizar la transfusión sanguínea.

III. Material

2 Mililitros de sangre con EDTA de cada paciente (donador y receptor).

Solución salina

Microscopio clínico

Centrífuga clínica

Laminillas

Cubreobjetos

Pipetas automáticas 20-200 µL

Pipetas pasteur

 

       

39/70  

Técnica

Procedimiento para las pruebas cruzadas

1. Se deben extraer al menos 2 mililitros de sangre con EDTA de cada paciente (donador y

receptor).

2. Se centrifugan las muestras a 3500 r.p.m. durante un minuto, a partir de aquí se separa el

plasma.

3. Se realiza un lavado con solución salina de los eritrocitos, se homogeinizan, se vuelve a

centrifugar y se elimina el sobrenadante, esta acción se repite tres veces.

4. Del concentrado de eritrocitos de cada paciente se obtienen 20 µL de eritrocitos se mezclan con

980 µL de solución salina (Eritrocitos al 2%). De ambos el receptor y el donador.

5. Prueba cruzada MAYOR

Se agregan 150 µL de eritrocitos del donador (solución al 2%) a 150 µL del plasma del receptor.

6. Prueba cruzada MENOR

Se agregan 150 µL de solución de eritrocitos (solución al 2%) del receptor a 150 µL de plasma

del donador

7. Prueba CONTROL

Se agregan 150 µL de eritrocitos del donador a 150 µL de plasma del donador. (Figura 1).

8. Se incuban las tres preparaciones a 25º C durante 30 minutos.

9. Evaluar la presencia de hemólisis o aglutinación, tanto macro como microscópicamente en las

tres pruebas. Colocar en un portaobjetos 10 µL de cada reacción y cubreobjetos encima.

Interpretación

La aglutinación o hemólisis indica un resultado de incompatibilidad. El desarrollo de alguna de estos

fenómenos es indicativo de la presencia de anticuerpos contra uno o más de los antígenos de superficie de

los eritrocitos, tanto del donador como del receptor, por lo que se corre un alto riesgo de desarrollo de

reacciones adversas post-tranfusionales.

 

       

40/70  

Eritrocitos y Plasma Receptor Eritrocitos Y Plasma Donador

Preguntas para discusión:

¿Cuantos tipos de sangre tiene la especie de la que se realizó la prueba?

¿Existen anticuerpos naturales en la especie contra otros grupos sanguíneos?

¿A que pueden deberse las reacciones adversas a parte de los grupos sanguíneos?

 

       

41/70  

PRÁCTICA V.- URIANÁLISIS O EXAMEN GENERAL DE ORINA

I. Introducción

El Urianálisis como herramienta diagnóstica, permite evaluar distintos órganos y sistemas tales Como la

sangre, el páncreas endocrino, el hígado y el sistema inmunológico, así como algunas enfermedades

neoplásicas y musculares. Lo anteriormente descrito indica que se deben interpretar correctamente los

resultados para poder tomar decisiones diagnósticas y/o terapéuticas.

II. Objetivo

El discente desarrollará las habilidades necesarias para evaluar las alteraciones presentes en el Urianálisis

que le permitirán diferenciar los orígenes de estas.

III. Material

5 mililitros de orina.

Tubos de ensayo

Refractómetro

Microscopio clínico

Centrífuga clínica (1500-3000 rpm)

Tiras reactivas de orina (diferentes marcas)

IV. Técnica

El examen de la orina está conformado por tres partes, un examen físico, uno químico y uno microscópico,

que se realizan en ese orden. El procedimiento entiende de la obtención de 5 mililitros de orina por

diferentes técnicas como son:

Micción espontánea

Ventajas

Fácil.

No traumático.

 

       

42/70  

Desventajas

Falta de cooperación del animal.

Necesidad de evitar el residuo del final de la micción.

Riesgo de hematuria y rotura de la vejiga con la presión manual.

Volumen variable.

Riesgo de contaminación fecal/muestra no adecuada para cultivo.

Cistocentesis

Ventajas

Rápida.

Aséptica.

Sin contaminación uretral.

Fácil de realizar cuando la vejiga esta moderadamente distendida el paciente

adecuadamente sujeto.

Riesgo mínimo de hematuria e iatrogenia.

Desventajas

Experiencia

Contraindicado cuando hay Trombocitopenia o la vejiga esta hiperdistendida (obstrucción

del tracto urinario inferior) ó no está suficientemente llena.

Cateterización

Ventajas

Sin riesgo de contaminación

Desventajas

Experiencia

Riesgo de infección e iatrogenia, hematuria por lesión en la mucosa

Coste del equipo y del catéter desechable.

Una vez obtenida la muestra esta debe ser vertida en un tubo de cristal nuevo o limpio que no contenga

ningún tipo de aditivo. En este tubo es donde se observarán las distintas pruebas a realizar en la orina.

 

       

43/70  

EXAMEN FÍSICO Evaluar las características organolépticas de la orina

1. Color.- suele ser amarilla, pálido o ámbar, depende de la concentración urinaria y se debe

interpretar junto con la densidad urinaria. El color se determinan al observar la orina en el tubo de

ensayo.

1. Amarilla (clara, pálida, oscura)

2. Incolora

3. Café-amarillenta o rojiza

4. Verde

5. Rojo

6. Azul

7. Lechoso

2. Olor.- (este paso suele evitarse) pero se determina por medio del olfato indirectamente al verter la

muestra de orina al tubo, debe hacerse con distancia y puede reportarse:

1. Normal o característico

2. Amoniacal

3. Dulce

4. Putrefacto

5. A fármacos

3. Aspecto.- hay que comparar el aspecto de la orina fresca en los perros y gatos normales, la cual

suele ser transparente durante la micción; puede presentar cierto grado de turbidez debido a

factores como cristales, células, lípidos, etc. Puede reportarse:

1. Transparente

2. Ligeramente turbia

3. Turbia

4. Muy turbia

4. Densidad urinaria, Refracción urinaria o Gravedad específica.- se determina mejor utilizando un

refractómetro (Fig.1), el cual tiene una escala de densidad calibrada según el índice de refracción,

que es lo que realmente mide. Se debe utilizar un refractómetro compensado para temperatura, el

cual debe calibrarse diariamente equilibrando con agua destilada y poniendo la base a cero con el

tornillo calibrador.

 

       

44/70  

Técnica:

Después de centrifugar la muestra a 1500 rpm durante 3 minutos.

Con un pipeta se toma una pequeña cantidad de orina fresca

Colocar una(s) gota(s) sobre el prisma del refractómetro

Se observa el lente del mismo y se anota la densidad observada

Al terminar la lectura se limpia el prisma con un algodón humedecido con agua destilada y

después de seca con otro seco, cuidando de no rayar el prisma.

Si la lectura sale de la escala, se diluye un pequeño volumen de orina con igual volumen de agua destilada,

se toma la lectura de nuevo y se multiplica por 2 las últimas cifras.

Fig. 1 Refractómetro

EXAMEN QUÍMICO

Técnica manual:

Realizar el examen químico dentro de la primera hora de recolectada la orina.

La muestra de orina deberá depositarla en un tubo de ensayo, lo suficiente para poder introducir la

tira reactiva de orina y esta se humedezca de manera correcta y completa; retirarla inmediatamente

para evitar que se disuelvan los reactivos.

Al momento de sacar la tira deslice el borde de la tira contra el canto del recipiente para eliminar el

exceso de orina.

Mantenga la tira en una posición horizontal para prevenir posibles mezclas de los reactivos y/o

contaminar las manos con orina.

Leer visualmente comparando las áreas reactivas con la correspondiente escala de color de la carta

adherida al frasco a los tiempos especificados más adelante.

Mantenga la tira cerca de los bloques de color y compare cuidadosamente

Evitar tocar la carta de color con la tira para que no se deteriore la carta.

 

       

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Los tiempos para estas tiras son:

Glucosa

30”

pH 60”

Bilirrubina 30” Proteínas 60”

Cetonas 40” Urobilinogeno 60” Gravedad Específica

45”

Nitrito 60”

Sangre 60”

NOTA: Estos tiempos pueden variar con la marca productora de la tira reactiva.

Técnica con el aparato:

Prender el aparato, posterior introducir el nombre del ID del operador y

2 veces el ID del paciente, al tener estos datos proceder a los siguiente.

Realizar mismo procedimiento, de colocar la muestra de orina en un

tubo de ensayo

Introducir la tira reactiva lo suficiente para que se humedezca y retirar

de inmediato, para evitar las complicaciones antes mencionadas.

Oprimir la opción INICIO y colocar la tira reactiva sobre la repisa que

sobre sale del aparato (hay que retirar el exceso de orina con papel de baño). Esperar los 10

segundos.

Se te pedirá que introduzcas las características de la orina.

Al tener los datos, oprimir la opción IMPRIMIR.

Es importante resaltar que para que los resultados por este equipo sean validos, debe

utilizarse la marca de tiras reactivas compatible que en la mayoria de los casos es la misma

marca del equipo.

EXAMEN MICROSCÓPICO

Para interpretar el sedimento urinario deberá de ser de manera inmediata o bien centrifugar la muestra y

recoger el sedimento para comenzar a examinarlo. Si se demora para hacer la inspección las células pueden

lisarse, cambiar el pH y la precipitación de cristales sin trascendencia.

 

       

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Técnicas: hay dos planteamientos de la microscopia, cada uno de los cuales requiere una interpretación

diferente.

T1: Microscopia directa

Mezclar una muestra de orina reciente por inversión

Poner con una pipeta una gota en un portaobjetos limpio y cubrirlo con un cubreobjetos. La gota

de la orina debe ser lo suficientemente grande para ocupar toda la superficie del cubreobjetos

pero no tan grande que este flote.

Explorar el portaobjetos a baja intensidad con contraste de fases o reducción de la luz mediante

cierre parcial del diafragma y moviendo el condensador hacia abajo, si no dispone de un

microscopio de contraste de fases.

Examinar primero los campos con un objetivo de 10X y posterior 40X para identificar cilindros,

células y cristales.

Formarse una impresión subjetiva de leucocitos y eritrocitos por campo.

T2: Sedimento centrifugado

En un tubo de ensayo añadir aproximadamente 5 ml de orina en un tubo de ensayo limpio y

utilizar otro tubo de ensayo que contenga la misma cantidad (para equilibrar la centrifuga) y

centrifugar de 1,500 a 2, 000 rpm durante 3 minutos.

Una vez centrifugado reportar la cantidad de sedimento como escaso, moderado o abundante.

Se deberá decantar la muestra y con una pipeta de Pasteur mezclar el sedimento y recolectar

aproximadamente 0.5-1 ml del sobrenadante.

Sobre un portaobjetos limpio colocar una gota de la orina y colocar encima un cubreobjetos.

Examinar la muestra primero con un objetivo de 10X y posterior con 40X.

Los hallazgos pueden reportarse como cantidad promedio que se observa por campo o escasos,

varios y abundantes.

Interpretación u Observaciones

Examen Químico

Los resultados se deben reportar de manera cualitativa (como 1+, 2+, 3+, etc.) ya que la determinación del

color es apreciativa del técnico y la concentración depende de la gravedad específica o densidad urinaria).

Sólo deberán colocarse concentraciones aproximadas cuando se utilicen aparatos ópticos para la lectura de

las tiras reactivas.

 

       

47/70  

Examen Microscópico

La muestra se observa en un objetivo 10X, para encontrar el plano donde hay sedimento, determinar la

cantidad del sedimento y encontrar elementos de mayor tamaño como cilindros y agregados celulares, se

debe examinar el área completa bajo el cubreobjetos debido a que los cilindros tienden a flotar en el extremo

de cubreobjetos. Estos se reportan como el número medio observado en el objetivo poco aumentado.

Para detectar la presencia de bacterias e identificar algunos cristales y diferenciar tipos celulares es

necesario el objetivo 40X. las células epiteliales, los eritrocitos y leucocitos se reportan como número medio

observado por un objetivo de muchos aumentos.

Las bacterias se registran como escasas, moderas o abundantes y su morfología (coco, bacilo, filamento,

etc).

 

       

48/70  

PRÁCTICA VI.- VALORACIÓN DE LA GLUCEMIA Y SU RELACIÓN CON ALTERACIONES METABÓLICAS EN LOS INDIVIDUOS.

DETERMINACIONES BIOQUIMICAS

Las determinaciones bioquímicas en nuestro laboratorio se realizan utilizando suero como principal muestra,

se prefiere trabajar con suero porque este se hemoliza menos probablemente que el plasma, además no

contiene anticoagulantes los cuales pueden interferir en las determinaciones que se vayan hacer o pueden

extraer el agua de las células sanguíneas originando la dilución de los constituyentes. Sin embargo, el

plasma puede ser utilizado en las determinaciones de urea y glucosa porque no existe una diferencia muy

marcada en la concentración de estos metabolitos en los eritrocitos y en el plasma, pero la diferencia en las

concentraciones de otros constituyentes es mas elevada. En nuestro laboratorio se realizan con mayor

frecuencia y con fines diagnósticos las siguientes determinaciones:

GLUCOSA

I. Introducción

El nivel de glucosa sanguínea refleja las condiciones nutricionales, emocionales y endocrinas del sujeto.

Después de la comida aumenta “hiperglucemia alimentaria” en animales monogástricos, pero no en los

rumiantes. Durante la excitación aumenta probablemente como efecto de la liberación de norepinefrina. Por

esta razón es costumbre obtener la sangre de individuos post-absortivos quietos, para determinar la “glucosa

sanguínea en ayunas”. La concentración de glucosa en los eritrocitos se aproxima a la concentración de

glucosa en plasma en la mayoría de los monogástricos y rumiantes jóvenes. Los eritrocitos de los equinos

contienen también poca glucosa, la concentración de glucosa en el plasma excede generalmente a la de

glucosa en sangre en 10 a 30 mg/dL en rumiantes y caballos adultos.

La concentración de glucosa sanguínea aumenta por la norepinefrina, epinefrina y glucagón, tres

substancias glucogenolíticas, y por los glucocorticoides que inhiben la utilización de la glucosa y estimulan la

gluconeogénesis. También se elevan los valores de glucosa por diabetes mellitus asociada con

hiperadrenocorticalismo, debido a una hipersecreción de las hormonas adrenocorticales por neoplasia o

superdosificación de corticoesteroides, se asocia también con hipertiroidismo y convulsiones. La

concentración de glucosa disminuye por el ayuno o por el ejercicio prolongado, por el exceso de insulina ya

sea por un insulinoma o por dosis altas de insulina como terapia; en toxemia, inanición y lesiones hepáticas;

también disminuye en hipoadrenocorticalismo debido a una reducción en la secreción de las glándulas

adrenales o a una producción reducida de ACTH por la glándula pituitaria.

 

       

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II. Objetivo

La medición de la glucemia en muestras sanguíneas en animales domésticos, tanto en suero como plasma y

describir las diferencias encontradas

III. Material

2 mililitros de sangre con EDTA o suero de distintas especies domésticas

Tiras reactivas dextrostix

Espectrofotómetro con varios canales para la medición por química húmeda

Tubos de reacción de 3 ml

5 mililitros de orina.

Pipetas automáticas con volumen variable.

IV. Método.

GOD-POD. Test color - enzimático. Glucosa - oxidasa - peroxidasa.

Principio.

La glucosa es transformada por la glucosa oxidasa (GOD), en ácido glucónico y en peróxido de

hidrógeno, el cual en presencia de peroxidasa (POD), oxida el cromógeno (4-aminofenazonal/ fenol),

convirtiéndolo en un compuesto de color rojo, el cual es cuantificado por el fotómetro del equipo.

MUESTRA.

Suero o plasma con EDTA.

EQUIPO.

QUICK LAB

REACTIVOS.

1 reactivo (tampón/enzimas/cromógeno)

1-A Fenol

La solución 1 es estable a 2-8°C durante 2 meses y a 15 -25°C durante 2 semanas.

 

       

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CONDICIONES.

El animal en lo posible debe estar en “ayunas”. (Mínimo 8 horas).

Evitar en lo posible la fuerza en el momento de la toma de muestra, para minimizar las condiciones

de estrés, que pueden alterar el metabolismo de los carbohidratos.

LINEALIDAD.

La linealidad del método se obtiene hasta 500mg/dl.

PROCEDIMIENTO

Preparar fotómetro a una temperatura de 37°C.

Blanco Standard Muestra

Solución 1 1000 µl 1000µl 1000µl

Solución standard -- 10µl --

Suero problema -- -- 10µl

Incubar a 37°C en baño de María por 15 min, o a temperatura ambiente por 30 min.

Colocar el Blanco en la cubeta de reacción y presionar la tecla “BLANK”, luego colocar el estándar y

presionar la tecla “CALIBRATE”, por último colocar la muestra y presionar la tecla “ANALYSE”.

EXPRESION DE RESULTADOS.

Los resultados para esta prueba en nuestro laboratorio, se expresan en mg/dl. Para convertirlo al

sistema internacional de Unidades debe multiplicarse por 0.051 o dividirse entre 18 (mg/dL a

mmol/L)

V. Interpretación u observaciones

Las concentraciones de glucemia evalúan indirectamente la actividad endocrina del páncreas, adrenales,

hipófisis y el estado nutricional del individuo. Valores de hiperglucemia pueden indicar insuficiencia de

insulina o efecto esteroidal endógeno o exógeno. Valores de hipoglucemia pueden indicar desnutrición

severa, insuficiencia hepática o consumo in vitro, por lo que se recomienda interpretar los resultados a la luz

de la historia clínica de cada individuo.

 

       

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PRÁCTICA VII.- METABOLISMO HEPÁTICO Y RENAL.

UREA

La urea es un compuesto orgánico relativamente simple producido por los mamíferos en el hígado como

producto final del catabolismo de las proteínas. Es una de las substancias más difusibles en el cuerpo y se

encuentra en todos los líquidos del cuerpo. Es relativamente atóxica, aunque en concentraciones altas

desnaturaliza proteínas con la formación de productos tóxicos. La urea se elimina principalmente por los

riñones, pero una porción de ella por la piel, sobre todo en los animales que sudan. Se ha observado que el

nitrógeno ureico sanguíneo no se eleva en perros, salvo pocas excepciones, hasta que al menos el 75% del

riñón funcional se ha destruido, y se aconseja hacer la determinación en todos los pacientes quirúrgicos de

mas de 5 años y en toda enfermedad en perros viejos antes de iniciar el tratamiento. La urea se aumenta en

sangre por trastornos renales como la insuficiencia renal crónica y aguda; por obstrucción de las vías

urinarias; excesiva destrucción de proteínas como en estados de fiebre, toxicidad o sepsis extensa. También

se pueden aumentar los niveles de urea por una hemoconcentración debida generalmente a graves vómitos

o diarreas; cuando existe alteración de la función cardiaca que reduce el flujo de sangre a través del riñón se

ve aumentada la concentración de urea en sangre.

El descenso en los niveles de urea son raros, teóricamente pueden presentarse en asociación con graves

enfermedades hepáticas o malnutrición de proteínas.

II. Objetivo

La evaluación orgánica de los distintos sistemas es importante al interpretar los cambios clínicos observados

en el paciente, la evaluación hepática y renal son dos de las pruebas que se realizan más frecuentemente en

la clínica veterinaria.

III. Material

IV. Técnica

METODO.

UV a tiempo fijo.

PRINCIPIO.

La urea se hidroliza en presencia de ureasa, en amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco

 

       

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producido en esta reacción se combina con α-cetoglutarato y NADH en presencia de

deshidrogenasa de glutamato, para producir glutamato y NAD. La cantidad consumida de NADH

determinado por la disminución de absorbancia en el ultra violeta es proporcional a la cantidad de

urea en la muestra.

MUESTRA.

Suero, plasma con EDTA y orina diluida 1:50 con agua destilada.

EQUIPO.

QUIK LAB

REACTIVOS

1 ENZIMAS/ COENZIMA/ SUBSTRATO

1 A Tampón

PATRON: Urea 80mg/dl. Listo para su uso.

La solución 1 se mantiene estable durante 4 semanas de 2- 8°C y durante una semana de 15-

25°C.

CONDICIONES.

El animal debe tener un “ayuno” de 12 horas antes de la toma de muestra.

Aunque la urea es estable en suero, plasma u orina durante varios días bajo refrigeración, las

muestras, especialmente la orina, deberán valorarse a las pocas horas para evitar la contaminación

bacteriana, que podrían provocar una perdida rápida de la urea.

LINEALIDAD.

En suero y plasma la linealidad del método es hasta 300mg/dl y 150 g/l para la orina. Para

concentraciones altas, diluir la muestra 1:2 con agua destilada, repetir la valoración y multiplicar el

resultado por 2.

 

       

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PROCEDIMIENTO.

Preparar el fotómetro a una temperatura de 30°C.

Standard Muestra

Solución de trabajo 1000 µl 1000µl

Solución Standard 10µl --

Suero problema -- 10µl

Leer inmediatamente colocando muestra por muestra.

EXPRESION DE RESULTADOS.

Los valores en el laboratorio se expresan en mg/dl.

CREATININA

La creatinina esta en el cuerpo principalmente en forma de fosfato de alta energía. En los músculos es

fuente de energía. En animales jóvenes de crecimiento se encuentra en mayores cantidades. La creatinina

es una substancia muy difusible y distribuida de manera uniforme en el agua corporal. Se elimina del plasma

aproximadamente en la tasa de filtración glomerular.

Al estudiar la excreción de creatinina, tiene valor el hecho de que los niveles séricos de creatinina casi no

son afectados por la creatinina exógena de los alimentos, por la edad, el sexo, el ejercicio o la dieta. Por lo

tanto los niveles elevados solamente se presentan cuando se altera la función renal. La medición de los

niveles de creatinina en sangre proporcionan la misma información para el diagnóstico y pronóstico de la

función renal que la obtenida por la medición del nitrógeno ureico.

MÉTODO.

Picrato alcalino con desproteinización

PRINCIPIO.

La creatinina reacciona en un medio alcalino que no contenga proteínas con picrato, para formar un

compuesto rojo –anaranjado (Reacción de Jaffé).

 

       

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MUESTRA.

Suero o plasma.

Orina: diluida: 1:50 con agua destilada

EQUIPO.

QUIK LAB

REACTIVOS.

1 Picrato de sodio............ 44mmol/L

2 Hidróxido de sodio....... 4.0 N

PATRON: Creatinina 2 mg/dl. Listo para ser utilizado.

Los reactivos 1 y 2 son estables a temperatura ambiente de 15 a 25°C hasta la fecha de caducidad

que viene indicada en la etiqueta.

CONDICIONES.

No requiere ayuno previo, porque su excreción depende muy levemente de la alimentación y la

diuresis. No debe estar el animal sometido a estrés intenso que puede ser causado en el momento

de la toma de muestra, por la resistencia que el animal ejerza.

LINEALIDAD.

El método es lineal hasta 12 mg/dl de creatinina. Para concentraciones mayores mezclar un

volumen de la muestra con un volumen igual de agua destilada, repetir el ensayo y multiplicar el

resultado por 2.

PROCEDIMIENTO.

Prepara el fotómetro a una temperatura de 30°C.

Standard Muestra

Solución de trabajo 1000 µl 1000µl

Solución Standard 100µl --

 

       

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Suero problema -- 100µl

Leer inmediatamente colocando muestra por muestra.

Colocar la solución standard y presionar la tecla “CALIBRATE”, luego colocar la muestra y presionar

la tecla “ANALYSE”.

EXPRESION DE RESULTADOS

Los resultados dependiendo del tipo de muestra se expresan así:

SUERO: Se expresa en mg/dl o µmol/L.

ORINA: Se expresa en mg/Kg de peso en 24 horas.

ALANINA AMINO TRANSFERASA ó TRANSAMINASA GLUTAMICA PIRUVICA (ALT-GPT)

Esta enzima cataliza la transferencia de un grupo a- amino de la alanina al ácido a-cetoglutarico. La enzima

se encuentra en el hialoplasma de todas las células y existe una relación lineal entre la GPT hepática y el

peso del animal. Siendo este el caso la determinación de GPT es casi especifica del hígado del perro y el

gato, mientras que es de escaso o de ningún valor en las enfermedades de bovinos y equinos. Se ha

encontrada muy elevada en la necrosis hepática. Es una enzima muy estable, y en estado de congelación se

conserva largo tiempo. La ictericia no estorba la determinación de la enzima, pero debe evitarse la hemólisis.

Las enfermedades hepáticas que producen niveles elevados de GPT comprenden neoplasias malignas,

cirrosis y hepatitis, incluyendo la que se produce en el perro por el virus de la hepatitis canina infecciosa

(HCI)

METODO.

Test cinético UV

PRINCIPIO.

α-cetoglutarato + L- alanina en presencia de GPT produce L–glutamato + piruvato, este a su vez

NADH + H+ en presencia de LDH produce lactato + NAD.

 

       

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MUESTRA.

Suero, plasma con EDTA.

EQUIPO.

QUIK LAB

REACTIVOS.

1 Reactivo Tampón / substrato.

1 A NADH/LDH

2 a - cetoglutarato

PIRIDOXAL 5-FOSFATO

La solución 1 es estable de 2-8°C durante 3 meses y de 15-25°C durante 1 semana.

La solución 2 es estable de 2-8°C durante 4 meses y de 15-25°C durante 1 mes.

CONDICIONES.

El animal debe tener un “ayuno” de 8 horas como mínimo.

LINEALIDAD.

Para concentraciones mayores de 265 y 271 U/L a una absorbancia de 340 y 334 nm

respectivamente, realizar una dilución 1:10.

PROCEDIMIENTO

Preparar el fotómetro a una temperatura de 37°C.

Muestra

Solución 1 1000 µl

Suero Problema 100 µl

Incubar en baño de María a 37°C

 

       

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Solución 2 100 µl

Colocar a temperatura ambiente durante 30 segundos.

Leer muestra por muestra, colocar la muestra en la cubeta de reacción y presionar al tecla

“START”.

EXPRESION DE RESULTADOS

Los resultados para esta prueba se expresan en U/L.

FOSFATASA ALCALINA (ALP)

Esta enzima hidroliza los fosfatos orgánicos en fosfato inorgánico y la fracción orgánica. Es una enzima muy

estable y puede ser congelada con poca o ninguna pérdida de actividad se halla gran cantidad en el hígado,

riñón, mucosa intestinal y hueso. En la mayoría de los animales, quizá con excepción del gato se elimina en

su forma natural por el hígado por lo tanto cualquier obstrucción al flujo de la bilis causa aumento de la

enzima en el suero. El problema es determinar la fuente de esta elevación cuando no es patente la

enfermedad hepática. Se producen elevaciones de la enzima en el suero, en enfermedades del bazo,

hígado, riñón, mucosa intestinal o hueso. En la obstrucción biliar se eleva notablemente, las neoplasias

óseas malignas causan a veces niveles elevados. También se puede elevar la ALP por una mayor actividad

de los osteoclastos durante el crecimiento del esqueleto, por enfermedades óseas degenerativas en

animales adultos, raquitismo, osteomalacia y en osteosarcoma. Durante interferencias con la excreción

hepática, debida a una destrucción de las células hepáticas o a una destrucción del conducto biliar. Los

resultados se interpretan mejor en conjunción con los niveles de GPT, que generalmente se encuentran

aumentados en estos casos.

MÉTODO.

Colorimétrico.

PRINCIPIO.

P-nitrofenilfosfato + H2O en presencia de fosfatasa alcalina produce fosfato + P-nitrofenol.

MUESTRA.

Suero o plasma heparinizado.

 

       

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EQUIPO.

QUIK LAB

REACTIVOS.

1 TAMPON

1 A substrato

CONDICIONES.

El animal debe tener un “ayuno” mínimo de 8 horas.

LINEALIDAD

El método tiene una linealidad de 1492U/I, valores superiores a este realizar diluciones 1:10.

PROCEDIMIENTO

Preparar el fotómetro a una temperatura de 37°C.

Muestra

Solución 1 1000 µl

Suero Problema 10 µl

Incubar en baño de María a 37°C 60 segundos.

Solución 2 100 µl

Colocar a temperatura ambiente durante 30 segundos.

Leer muestra por muestra, colocar la muestra en la cubeta de reacción y presionar la tecla

“START”.

ACCIONES CORRECTIVAS PARA RESULTADOS INACEPTABLES.

EXPRESION DE RESULTADOS.

Los resultados se expresan en U/l.

 

       

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La utilización del equipo depende del técnico laboratorista preparado, por lo que se recomienda siempre leer

el manual del usuario. Para corregir algunos problemas se presentan las siguientes acciones:

ACCIONES CORRECTIVAS PARA RESULTADOS INACEPTABLES.

_ Calibración del equipo.(Remitirse al manual del equipo).

_ Centrifugar muestras lo más rápido posible.

_ Cambio de lote de sueros multicalibradores y reactivos, realizar nueva calibración del equipo.

_ Verificar reactivos que correspondan a la prueba pedida y evitar agotamiento de los mismos.

_ Rechazar muestras hemolizadas e insuficientes.

_ Muestras que no se preparan el mismo día, refrigerar a 4ºC.

_ Confirmar la linealidad de la prueba y si es necesario realizar las diluciones respectivas.

_ Asegurar el mantenimiento del equipo.

V. Interpretación u observaciones

Incrementos en la Urea y Creatinina se asocian a estados de hiperfusión renal y posiblemente lesión activa,

es importante compara estos resultados con la concentración urinaria dada por el resultado de

refractometría: densidad urinaria (ver Urianálisis).

La estructura hepática evaluada a través de la medición de la actividad enzimática sérica de las

transaminasas y la fosfatasa alcalina permite determinar en la mayoría de la especies un daño hepático.

 

       

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Práctica VIII.- Evaluación Citológica y de acumulación de líquidos

I. Introducción

La evaluación citológica de los líquidos corporales, de los tejidos y de las lesiones tumorales se ha convertido en una opción muy importante en medicina veterinaria. Sobre todo desde hace casi 20 años. Se trata de un medio de diagnóstico muy rápido, fácil de realizar, barato, con un mínimo de riesgos y que permite con frecuencia evaluar las muestras e interpretarlas antes de que el paciente se retire de la sala de examen, e identificar el proceso como neoplásico o inflamatorio. En algunos casos se pueden establecer los procedimientos indicados para llegar a un diagnóstico final, como el realizar una biopsia, una evaluación microbiológica, un examen radiológico, etc. Con revisiones periódicas se puede efectuar un seguimiento de la evolución del caso, así como un control del tratamiento, determinando si éste es eficaz o se debe reemplazar por otro. En una gran proporción de casos, la citología permite llegar a un diagnóstico final y establecer un pronóstico.

Aquellos clínicos que se inician en el muestreo citológico, frecuentemente obtienen muestras no significativas, contaminadas con sangre u otros tejidos o por microorganismos, etcétera, esto disminuye el entusiasmo por el empleo de la citología. Si no se realiza con la asepsia adecuada existe la posibilidad de que se contaminen tejidos sanos con microorganismos, o si se punciona un absceso, que se ocasionen fístulas u otros abscesos.

Una importante limitante es que en algunos casos es necesario recurrir a una biopsia para la evaluación histológica, ya que es prácticamente imposible distinguir un adenoma o una hiperplasia; lo mismo sucede cuando una neoplasia maligna es bien diferenciada y citológicamente no podemos ver la estructura histológica ni la presencia de invasión a vasos o tejidos circundantes.

II. Objetivo

El discente desarrollará las habilidades necesarias para reconocer cuando las lesiones tumorales y en su caso lesiones susceptibles de ser muestreadas, para diferenciar eventos inflamatorios o neoplásicos.

III. Material

• Jeringa de 10 ml • Aguja No. 21 • Laminas portaobjetos • Pistola para citología

 

       

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IV. Técnica

Técnicas de colección de muestras

Existen varios tipos de preparación de laminillas para su evaluación. El que se emplea con mayor frecuencia en citología es el frotis o extendido, similar al que se realiza en hematología. Se deben emplear laminillas limpias, no melladas, sin huellas (porque la grasa hace impermeable a la laminilla e impide que se adhiera la película celular a ésta).

Aspiración de lesiones con aguja fina

La aspiración es la técnica en citología más usual para la obtención de muestras de lesiones inflamatorias o neoplásicas de la mayoría de tejidos, pues en general permite una muy buena conservación de la morfología celular y con muy poca destrucción.

Se introduce una aguja directamente en la lesión, se aplica una presión negativa de algunos cm3 (en general de 5 a 8), dependiendo de la consistencia de la masa: mientras más sólida, mayor presión; si es muy dura la masa se puede mantener la presión efectuando en corto un "raspado" con la aguja, para obtener mejores muestras y más celulares. Generalmente se ejerce presión negativa jalando el émbolo dos o tres veces, se suelta y se permite que regrese a su posición original antes de retirar la aguja de la masa, de lo contrario, la muestra pasará al barril de la jeringa y será prácticamente imposible recuperarla. Si ejercemos demasiada presión negativa y nos esperamos hasta ver sangre en el barril, las muestras estarán muy contaminadas. Las muestras más "limpias", es decir, con menor contaminación sanguínea, se obtienen cuando se percibe ligeramente un líquido en la base plástica de la aguja. en ese momento se debe dejar de ejercer la presión negativa. Son aún mejores las muestras si el líquido celular accede solamente a la parte metálica de la aguja.

Cuando la lesión cuenta con varias consistencias (dura. turgente, suave o blanda) se recomienda efectuar las aspiraciones cambiando la dirección de la aguja para obtener material del centro, de un lado, de la periferia, de las partes sólidas, de las blandas, con la finalidad de conseguir una imagen completa de la lesión.

En la mayoría de los casos no es necesario efectuar este tipo de maniobra, ya que el tejido para las muestras en general es homogéneo.

Extendido (frotis)

Antes de efectuar el frotis, se ensaya el deslizamiento sin tocar la muestra para detectar imperfecciones en el lavado o el borde de la laminilla en que se va a extender y poder reemplazarla cuando no deslice libremente. Se aplica en líquidos con una densidad parecida a la sangre, también en material de lesiones tumorales aspirado con aguja fina. La fuerza de separación es de moderada a ligera, dependiendo del ángulo que se emplee para su confección. En general, debe ser de alrededor de 45º para líquidos como la sangre, >45º para líquidos poco celulares o en tejidos muy

 

       

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delicados y <45º cuando se desea mayor fuerza de separación celular para su extendido adecuado y su cómoda evaluación.

Sedimentación

Se coloca un cilindro (por ejemplo 0.5 mL de una jeringa), se adhiere a la laminilla con cera, asegurándose de que sea hermético para evitar la salida de la muestra en la unión cilindro y laminilla, se coloca hasta 0.5 mL del líquido que se va a evaluar y se deja reposar 30 minutos.

Impresiones

Se pueden realizar directamente de una lesión cutánea o de un órgano interno o llevarse acabo a partir de biopsias.

En las biopsias, las impresiones se realizan con una porción del tejido de interés de una dimensión no mayor de 1 cm3, se toma con las pinzas de disección y se hacen unas impresiones sobre papel absorbente para eliminar el exceso de líquido y que exista mayor poder de adhesión de las células al vidrio de la laminilla.

Se hacen impresiones en secuencia en el papel, cada vez es menor la cantidad de líquido que se desprende, hasta que se encuentra casi seco siguiendo la dirección de las flechas.

Raspados

Se realizan en lesiones duras, con una hoja de bisturí para obtener mayor número de células. El raspado se efectúa con ligeros movimientos en corto hasta obtener una pasta celular.

Posteriormente se lleva a cabo la extensión de esa "pasta celular", con delicadeza para evitar un destrozo celular.

Hisopados

Esta técnica está reservada para lesiones fistulosas o para órganos tubulares como vagina. útero, canal auditivo, fosas nasales; inclusive se ha llegado a emplear en muestreos de tráquea bajo una técnica particular. Se verifica que el hisopo estéril de algodón esté bien adherido al palillo para evitar que se quede por accidente dentro de la luz del órgano que se está muestreando, posteriormente se introduce y se gira suavemente para descamar células del epitelio o canal, se retira y se deposita

 

       

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sobre la laminilla, se ejerce una ligera presión con el índice y se rueda hasta el otro extremo, se puede efectuar hasta 3 veces sobre la misma laminilla.

LÍQUIDOS SINOVIALES, CEFALORRAQUÍDEOS Y DE LAVADOS

Estos tipos de líquidos son habitualmente poco celulares: para su evaluación se requiere de un método de concentración eficaz, que no afecte la morfología celular.

La citocentrifugación es el método de elección empleado para los diferentes tipos de líquidos, a excepción de los que se encuentran muy turbios o viscosos. La ventaja es que puede concentrar las células en un área aproximada a la de un confeti, todos los elementos formados (células, microorganismos, cuerpos extraños, etc.) que se encuentren en 0.3 a 0.5 ml de muestras, se encontrarán en el "confeti celular", por lo tanto, la evaluación citológica completa se lleva a cabo en unos minutos.

V. Interpretación u Observaciones

La evaluación precisa de lesiones en el laboratorio requiere de una descripción apropiada, la ubicación anatómica, un muestreo con la técnica adecuada para el tipo de lesión y finalmente de una protección de esas muestras para que lleguen a su destino en buenas condiciones.

Es necesario incluir la reseña del animal (especie, raza, género, edad), ya que ciertas neoplasias no se encuentran en todas las especies o son particulares para una de ellas. También es importante conocer la raza, ya que algunas son más propensas que otras a ciertos tumores; lo mismo ocurre con el género y la edad.

El objetivo principal de la evaluación citológica es determinar si las lesiones son Inflamatorias, degenerativas o neoplásicas; para ello se requiere conocer las diferentes clasificaciones y los criterios para una interpretación apropiada.

Clasificación de la inflamación según el tipo celular

a) Neutrofílica. Con valores de los neutrófilos superiores a 85%.

 

       

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b) Neutrofílica-Macrofágica. Cuando hay predominio de los neutrófilos y se acompañan con valores de 30-50% de macrófagos.

c) Macrofágica. Cuando hay predominio de macrófagos y en presencia de células epitelioides o de células gigantes.

d) Eosinofílica. Cuando se observa una cantidad superior a 20% de eosinófilos o de 5% de mastocitos.

Clasificación de la inflamación en cuanto a la presencia o no de microorganismos

a) Séptica. Cuando se observen bacterias intracelulares o, en su defecto, cuando no se observen microorganismos, los neutrófilos deben presentar diferentes grados de degeneración rápida (por toxinas) como la degeneración hidrópica nuclear, vacuolación de citoplasma o la cariolisis (es decir, la destrucción del núcleo).

b) No séptica. Cuando la muerte de los neutrófilos ocurre en forma lenta (muerte natural) donde se observan los núcleos de los neutrófilos en picnosis o en cariorrexis (picnosis de cada lóbulo).

Características clínicas de las lesiones neoplásicas

Clasificación de las neoplasias

a) Epiteliales. Las muestras en estos casos suelen ser bastante celulares. Estas células se distinguen por ser poliédricas, son angulares cuando están bien diferenciadas y pueden encontrarse en forma individual o en sábanas o en ambas. Pueden ser epiteliales: papilomas.si son benignas o carcinomas, si son malignas; o glandulares: adenomas o adenocarcinomas, si son benignas o malignas, respectivamente. Las células glandulares en general muestran una fragilidad del citoplasma superior a las otras células, el citoplasma se encuentra en cantidad de moderada a abundante y con frecuencia se observan núcleos desnudos. En ocasiones se aprecia en el citoplasma material de secreción. Asimismo, pueden encontrarse células con el núcleo excéntrico y oprimido por la gran cantidad de material de secreción.

b) Mesenquimatosas. En general la celularidad suele ser muy escasa, por lo tanto, de mayor dificultad para la evaluación. Las células se presentan comúnmente en forma individual y se caracterizan por ser fusiformes, en general, y tener una membrana citoplásmica no aparente. El núcleo es principalmente céntrico ovalado o fusiforme.Ejemplos de estos tumores son los benignos, con el sufijo oma, y los malignos.con el sufijo sarcoma (osteoma, osteosarcoma; condroma, condrosarcoma; fibroma, fibrosarcoma; hemangioma, hemangiosarcoma).

 

       

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c) Células redondas. Este tipo de tumores presenta, por lo general, muestras con una celularidad elevada, la forma es redonda como su clasificación lo dice. Este tipo de células se caracteriza por tener una membrana citoplásmica evidente, el citoplasma en cantidad moderada y un núcleo redondo generalmente céntrico. Como ejemplos de tumores de células redondas están los histiocitomas, melanomas, tumores venéreos transmisibles, mastocitomas, linfosarcomas y sarcomas de plasmocitos (mielomas múltiples).

Criterios de malignidad

Existen criterios generales de malignidad como la anisocitosis, macrocitosis, la hipercelularidad y el pleomorfismo, que no tienen gran peso en la interpretación final, al igual que los criterios de malignidad del citoplasma como la basofilia, vacuolación y la membrana citoplásmica más espesa.

Los criterios de importancia capital en la interpretación son los nucleares y los nucleolares, los últimos tienen mayor peso en la designación final.

Criterios de malignidad nucleares y nucleolares

a) Macrocariosis. Es la presencia de núcleos de mayor dimensión que los de la estirpe celular normal.

b) Anisocariosis. Núcleos de diferente tamaño.

e) Relación núcleo/citoplasma. Aumentado por incremento del tamaño nuclear.

el) Multinucleación. Células que presentan dos o más núcleos. Criterio más importante si la misma célula presenta, además, anisocariosis.

e) Índice mitótico. Elevado. En general no se observan células en mitosis.

f) Mitosis anormales. Criterio de mucho peso para la designación de maligno.

g) Cromatina granular gruesa, en cordones o en terrones. Indica alta actividad o capacidad mitótica de las células.

h) Anisonucleolosis. Nucléolos de diferente tamaño.

i) Macronucleolosis. Cuando los nucléolos son mayores que un eritrocito (>5Jlm).

j) Numero diferente de nucléolos

k) Nucléolos angulares

 

       

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ANEXOS

 

       

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V. ACTUALIZACIÓN Manual de Prácticas de Laboratorio de Inmunología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma del Estado de México. Toluca, México; 25de febrerode 2013. Primera Edición Director: Dr. en C. José Mauro Victoria Mora Elaboró: M en C. Lemuel León Lara Revisó: