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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MARIANA MUNARI MAGNUS
PERFIL DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E MICROQUIMERISMO EM
RECEPTORES DE TRANSFUSÃO SANGUÍNEA SUBMETIDOS À CIRURGIA
ORTOPÉDICA
CAMPINAS
2016
MARIANA MUNARI MAGNUS
PERFIL DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E MICROQUIMERISMO EM
RECEPTORES DE TRANSFUSÃO SANGUÍNEA SUBMETIDOS À CIRURGIA
ORTOPÉDICA
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
ORIENTADOR: PROF(A) DR(A) SARA TERESINHA OLALLA SAAD
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA MARIANA MUNARI MAGNUS, E ORIENTADO PELA
PROF(A). DR(A). SARA TERESINHA OLALLA SAAD.
CAMPINAS
2016
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
MARIANA MUNARI MAGNUS
ORIENTADOR: PROF (A). DR (A). SARA TERESINHA OLALLA SAAD
MEMBROS:
1. PROF(A). DR (A). SARA TERESINHA OLALLA SAAD
2. PROF. DR. MARCELO ADDAS CARVALHO
3. PROF. DR. ANTONIO FABRON JUNIOR
Programa de Pós-Graduação em [PROGRAMA] da Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 20 de Dezembro de 2016
AGRADECIMENTOS:
Ao meu marido, Thiago, pelo constante apoio e compreensão durante os
momentos difíceis. E aos meus filhos, Miguel e Clara, pelo tempo que não pude
estar com eles.
Aos meus pais por me ensinarem a enfrentar obstáculos e a continuar
caminhando.
À Profa Dra Simone Gilli por ter me incentivado a pesquisar e a estudar o
que me despertava verdadeiro interesse.
À minha orientadora, Profa Dra. Sara Teresinha Olalla Saad, pelo
constante apoio e pela ajuda. Agradeço pelas discussões e por me mostrar um
caminho quando não pude enxergar. Pessoa admirável, de grande conhecimento e
enorme experiência.
À Profa Dra. Patrícia Favaro pelas ideias e sugestões.
Ao departamento de ortopedia da Unicamp, à equipe do centro cirúrgico e
aos funcionários do serviço de transfusão do Hospital das Clínicas por me ajudarem
a coletar as amostras.
Ao João Agostinho, à Maria Helena Medola e à Fernanda Niemann por
me auxiliarem na parte técnica.
Ao meu amigo Fernando por me escutar e me ajudar a ilustrar meus
resultados.
À Tereza pelo suporte com o material e reagentes.
Ao Michel pela ajuda com os gráficos e as figuras.
Ao Roberto Zulli pelo auxílio com as análises estatísticas.
E por fim aos pacientes que aceitaram participar e que tornaram este
trabalho possível.
RESUMO:
A transfusão sanguínea alogênica tem sido associada com
complicações em pacientes cirúrgicos e no trauma. Os leucócitos e plaquetas
presentes nos hemocomponentes parecem ser uma das principais causas do efeito
conhecido como imunomodulação associada à transfusão. Apesar das evidências
clínicas dos efeitos deletérios da transfusão sanguínea, o real mecanismo envolvido
não é conhecido. Realizamos um estudo observacional prospectivo para avaliar a
presença de microquimerismo associado à transfusão e a resposta imune em 28
pacientes submetidos à cirurgia ortopédica eletiva comparando os pacientes
transfundidos no intra-operatório com os não transfundidos. Os hemocomponentes
utilizados foram concentrado de hemácias (CH) não leucodepletados. Os
marcadores inflamatórios IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17, IL-21, IL-22,
IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, interferon-γ (IFN-γ), CD40 ligante solúvel (sCD40L) e fator
de necrose tumoral (TNFα) foram quantificados no sangue periférico dos pacientes
em três tempos: pré-operatório, final da cirurgia e 6 horas de pós-operatório. Além
disso, avaliamos a presença de microquimerismo nos pacientes transfundidos
durante a internação utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo
real com um painel contendo iniciadores específicos para 12 alelos HLA DR. Como
resultados, encontramos maiores concentrações de IL-6 (p = 0,023) e uma redução
significativa de sCD40L (p = 0,016) ao final da cirurgia, assim como maiores níveis
de IL-10 (p = 0,022) com 6 horas de pós-operatório nos pacientes transfundidos
quando comparados aos não transfundidos. A presença de microquimerismo foi
documentada em 13 dos 15 pacientes avaliados, com uma mediana de seguimento
de 14 dias após a última transfusão (variando de 5 a 30 dias). Comparando os
pacientes com e sem microquimerismo, não houve diferença nas características
sexo, idade, número de unidades transfundidas ou na dosagem dos marcadores
inflamatórios após a transfusão. Concluímos que a transfusão de CH não
leucodepletados, neste contexto onde já existe um estresse inflamatório secundário
ao trauma cirúrgico, leva a uma maior resposta inflamatória imediata, com aumento
de IL-6 e diminuição do sCD40L e posterior estímulo imunossupressor evidenciado
pelo maior aumento de IL-10; a redução da concentração de sCD40L no sangue
periférico pode prever este efeito anti-inflamatório. Palavras–chave: transfusão de
sangue, efeito imunomodulatório, citocinas, microquimerismo, leucócitos.
ABSTRACT
Transfusion of red blood cells (RBCs) has been associated with
complications in trauma and surgical patients. Leukocytes present in blood
components seems to be one of the main causes of the effect know as transfusion-
related immunomodulation. Despite evidence of deleterious clinical effects of
allogeneic blood transfusion, the real mechanism involved is unclear. A prospective
observational study was conducted to evaluate transfusion-associated
microchimerism and immune responses in 28 patients undergoing elective
orthopedic surgery divided into leukocyte-containing RBCs transfused and non-
transfused groups. Inflammatory markers IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-
17, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, interferon-γ (IFN-γ), soluble CD40 ligand
(sCD40L), Tumor necrosis factor (TNFα) were measured in both groups at three time
points: preoperative, end of surgery and 6 hours of postoperative. The presence of
microchimerism was performed by polymerase chain reaction (PCR) analysis using
quantitative allele-specific HLA DR assays to detect non-recipient alleles in
transfused patients. Higher levels of IL-6 (p = 0.023) and significant reduction of
sCD40L (p = 0.016) at the end of surgery, as well as higher levels of IL-10 (p =0.022)
after 6 hours of postoperative were demonstrated in transfused patients compared to
non-transfused. Microchimerism was documented in 13 of 15 patients after
leukocyte-containing RBC transfusion and the median time of evaluation was 14
days after transfusion (range 5-30 days). Comparing patients with and without
microchimerism, there was no difference in sex, age, number of units transfused or in
inflammatory markers after transfusion. We concluded that leukocyte-containg RBC
transfusion is associated with an early inflammatory response followed by an anti-
inflammatory response in trauma surgery patients and the reduction in sCD40L level,
after transfusion, may predict an anti-inflammatory effect.
Key words: blood transfusion; transfusion-related immunomodulation; cytokines;
microchimerism; leukocytes.
Sumário:
1. Introdução.......................................................................................
1.1 A Resposta Imune.........................................................................
1.2 Possíveis efeitos clínicos associados à TRIM...............................
1.3 Fisiopatologia da TRIM.................................................................
1.4 Microquimerismo associado à transfusão.....................................
1.5 Características dos hemocomponentes e TRIM...........................
9
9
10
11
14
17
2. Objetivos......................................................................................... 19
3. Material e métodos.......................................................................... 20
3.1 Pacientes e protocolo transfusional.............................................. 20
3.2 Coleta das amostras..................................................................... 20
3.3 Análise dos marcadores inflamatórios.......................................... 21
3.4 Pesquisa de microquimerismo...................................................... 22
3.4.1Extração do DNA genômico .......................................................
3.4.2 Amplificação do DNA pela reação em cadeia da polimerase
(PCR) em tempo real..........................................................................
22
22
3.4.3 Eletroforese em gel de agarose a 4%........................................
3.5 Pesquisa de anticorpo contra antígeno eritrocitário.....................
23
23
3.6 Análise estatística......................................................................... 23
4. Resultados...................................................................................... 25
4.1 Análise dos marcadores inflamatórios.......................................... 25
4.1.1 Características dos pacientes.................................................... 25
4.1.2 Dosagem dos marcadores inflamatórios por multiplex..............
4.2 Correlações entre as citocinas .....................................................
25
34
4.3 Resultados microquimerismo........................................................ 36
4.3.1 Características dos pacientes.................................................... 36
4.3.2 Análise dos marcadores inflamatórios....................................... 42
4.3.3 Confirmação pela tipagem HLA-DR dos doadores.................... 42
4.4 Pesquisa de anticorpos contra antígenos eritrocitários.................
5. Discussão........................................................................................
43
44
6. Conclusão....................................................................................... 48
7. Referências.....................................................................................
8. Apêndices........................................................................................
49
55
9. Anexos............................................................................................ 58
9
1. INTRODUÇÃO:
Os efeitos imunomodulatórios relacionados à transfusão sanguínea
alogênica são conhecidos há décadas. Foram primeiramente descritos em 1973 por
Opelz e colaboradores, ao observar que a transfusão sanguínea precedendo o
transplante renal poderia melhorar a sobrevida do rim transplantado, demonstrando
seu efeito imunossupressor[1]. Posteriormente, Gantt demonstrou em 1981 a
associação entre a transfusão sanguínea e o maior risco de recorrência tumoral, o
que reforçou a hipótese de um efeito imunomodulador relacionado à transfusão [2].
Desde então muito avanços ocorreram para melhorar a segurança
transfusional, diminuindo os riscos de transmissão de doenças e de aloimunização
conforme o desenvolvimento de novos testes para agentes infecciosos e com a
maior compreensão dos antígenos presentes nas hemácias, leucócitos e plaquetas.
Por outro lado, a existência de um efeito imunológico e possivelmente deletério
associado à transfusão sanguínea, síndrome conhecida como Imunomodulação
relacionada à transfusão (TRIM-Transfusion-related Imunomodulation) vem sendo
amplamente discutido na literatura.
1.1. A Resposta Imune:
O sistema imunológico é constituído pela resposta imune inata e
adaptativa. A resposta inata é a primeira defesa do organismo frente a uma
agressão, não dependendo de estímulo prévio. A resposta adaptativa é mediada
pelos linfócitos T e B, sendo uma resposta específica contra patógenos
reconhecidos como antígenos. Os principais subtipos de linfócitos T efetores são os
Linfócitos T CD4+ auxiliares e os linfócitos T CD8+ citotóxicos. Dentre os linfócitos T
CD4+, são bem caracterizadas 4 subpopulações: Th1, Th2, T reguladores e Th17.
As células Th1 produzem IFN-, principal citocina que leva a ativação de
macrófagos. As células Th2 secretam IL-4 e IL-5, estando associadas a doenças
alérgicas e a infecções por helmintos. Os linfócitos T reguladores atuam impedindo
respostas imunes exacerbadas e secretam citocinas anti-inflamatórias como IL-10 e
TGF-. Por último, os linfócitos T CD4+ de padrão Th17 secretam principalmente IL-
17, cujo papel é recrutar neutrófilos, além de IL-21, que leva a diferenciação de
linfócitos B, e IL-23 que tem sido associada à ocorrência de doenças autoimunes [3].
10
Figure 1. Representação esquemáticas das 4 vias da resposta imune derivadas de linfócitos
T CD4+: Th1, Th2, Th17 e Treg.
1.2. Possíveis efeitos clínicos associados à TRIM:
Diversos estudos observacionais associaram a transfusão sanguínea
alogênica com maior risco de recorrência tumoral, maior ocorrência de infecção no
pós-operatório e maior mortalidade [4-6]. Porém como viés de confusão comum
nestes estudos, temos que frequentemente os pacientes transfundidos representam
aqueles com piores condições clínicas e maior gravidade, o que torna questionável
esta associação.
Já os estudos randomizados controlados apresentam resultados
heterogêneos e de difícil comparação por utilizarem diferentes estratégias
transfusionais, como transfusão restritiva contra transfusão liberal, transfusão
autóloga contra transfusão alogênica ou ainda comparando pacientes recebendo
hemocomponentes contendo diferentes graus de contaminação por leucócitos.
Tendo em vista que a presença do leucócito do doador é um dos
mecanismos centrais na fisiopatologia da TRIM, grandes estudos randomizados
foram feitos analisando diferentes desfechos clínicos em pacientes transfundidos
com concentrados de hemácias leucodepletados (contendo < 5x106 leucócitos por
unidade) comparados a pacientes transfundidos com concentrado de hemácias
buffy-coat depletados (contendo <1,2x109 leucócitos por unidade) ou ainda com
11
concentrado de hemácias com maior contaminação leucocitária (109 a 1010
leucócitos por unidade).
Neste contexto, os estudos randomizados que analisaram a taxa de
recorrência tumoral em pacientes transfundidos com hemácias leucodepletadas
comparados a pacientes que receberam hemácias buffy-coat depletadas no
perioperatório de cirurgias oncológicas não evidenciaram diferença entre os grupos
em até 5 anos de seguimento. [7-9]
Da mesma forma, diversos estudos randomizados analisaram o risco de
infecção no pós-operatório, de falência de múltiplos órgãos e de mortalidade em
pacientes transfundidos em diferentes contextos cirúrgicos [8, 10-13]. Novamente os
resultados são heterogêneos e de difícil comparação. Duas meta-análises realizadas
para avaliar estes estudos chegaram a conclusões discordantes sobre o benefício
da leucodepleção para diminuição do risco de infecção no pós-operatório [14, 15].
Os resultados mais concordantes estão nos estudos que avaliaram a
transfusão em cirurgia cardíaca, evidenciando menor risco de infecção no pós–
operatório, menor ocorrência de disfunção de múltiplos órgãos e menor mortalidade
por causas não cardíacas nos pacientes que receberam transfusões de concentrado
de hemácias leucodepletadas quando comparados aos transfundidos com
concentrados de hemácias com maior contaminação por leucócitos [16-20]. Porém
neste cenário é importante ressaltar que o volume transfundido é maior e que os
pacientes são submetidos a um grande trauma cirúrgico, envolvendo a circulação
extracorpórea e a lesão de isquemia e reperfusão secundária a hipotermia, o que
poderia exacerbar os efeitos da imunomodulação relacionada à transfusão. Além
disso, alguns trabalhos conseguiram demonstrar este efeito dose dependente, onde
o benefício da leucodepleção é evidenciado apenas em pacientes que receberam
acima de 3 unidades de concentrados de hemácias [17, 19, 20].
1.3. Fisiopatologia da TRIM:
Inúmeros mecanismos foram propostos na tentativa de explicar essa
síndrome, incluindo a presença de leucócitos alogênicos nos hemocomponentes
transfundidos, a liberação de citocinas e mediadores inflamatórios durante o
armazenamento e a presença de proteínas solúveis no plasma dos
hemocomponentes, porém sua real fisiopatologia continua incerta [5].
12
Os primeiros estudos in vivo e em modelo animal que avaliaram o perfil
de citocinas inflamatórias após uma transfusão sanguínea demostraram aumento da
liberação de interleucinas IL-4 e IL-10. Assim, o efeito imunológico da transfusão foi
inicialmente descrito como um desbalanço na resposta imune do receptor, com
exacerbação da resposta Th2 e supressão da resposta Th1, o que explicaria o seu
efeito imunossupressor [21, 22]. Posteriormente, a transfusão sanguínea foi também
relacionada a um efeito pró-inflamatório, com a evidência de maior liberação de
Interleucina 6 no pós-operatório de cirurgia cardíaca em pacientes transfundidos
comparados aos não transfundidos ou com a utilização de concentrados de
hemácias não leucodepletados quando comparados aos leucodepletados [5, 20, 23].
Clinicamente este efeito pró-inflamatório poderia ser traduzido pelo
maior risco de disfunção de múltiplos órgãos levando a maior mortalidade, enquanto
o efeito imunossupressor seria traduzido pelo maior risco de recorrência tumoral e
de infecção no pós-operatório, como já discutido anteriormente. Dessa forma, tendo
em vista a dualidade destes achados, com aumento de citocinas tanto pró como
anti-inflamatórias após a transfusão, o termo imunomodulação passou a ser mais
utilizado para descrever esta síndrome [5].
Um dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da TRIM é a
presença de mediadores inflamatórios no plasma dos hemocomponentes, como
citocinas IL-1β, IL-6, IL-8, TNF α, além de CD40 ligante solúvel (sCD40L), moléculas
HLA e Fas-ligante [24, 25]. Sabidamente, leucócitos e plaquetas liberam essas
proteínas durante o armazenamento e assim sua concentração é influenciada pelo
tempo de estocagem e pela presença dos leucócitos e plaquetas no concentrado de
hemácias [26-28]. Além disso, após a transfusão, todo este material contido no
hemocomponente leva a ativação dos linfócitos do receptor com novo estímulo ao
sistema imune [29]. É interessante perceber que os estudos que avaliaram pacientes
transfundidos em contexto clínico, na ausência de trauma cirúrgico ou de lesão
tecidual, falharam em demonstrar o benefício da leucodepleção e os possíveis
efeitos clínicos da imunomodulação, sustentando a hipótese de um modelo baseado
no “duplo insulto” [6, 29-31]. Dessa forma, a TRIM funcionaria como um segundo
estímulo em um ambiente onde já existe ativação imunológica, tornando mais
evidente uma resposta pró-inflamatória ou imunossupressora.
Um segundo mecanismo, talvez o de maior destaque na literatura, é a
presença do leucócito do doador nos hemocomponentes. Ele seria responsável não
13
apenas por contribuir com a chamada lesão de armazenamento, mas também por
interagir com o sistema imune do receptor após a transfusão, levando a um efeito
com fisiopatologia semelhante à doença do enxerto contra o hospedeiro. Acredita-se
que a compatibilidade HLA parcial entre doador e receptor facilitaria a persistência
dessas células alogênicas no paciente transfundido por um processo de anergia e
imunotolerância [5, 32]. Estudos in vitro e em modelo animal demonstram que as
células apresentadoras de antígenos alteram sua expressão de sinal coestimulatório
durante o armazenamento e sua capacidade de estimular a proliferação de linfócitos
T [33, 34]. Possivelmente, a interação dos leucócitos do doador com os linfócitos T
do receptor levaria a proliferação de células T supressoras, prolongando a sobrevida
das células alogênicas e ocasionando o microquimerismo associado à transfusão.
Fortalecendo esta hipótese, estudos in vitro demonstraram que a transfusão
alogênica induz à proliferação de linfócitos T regulatórios (Treg), uma população de
linfócitos com imunofenótipo CD4+CD25+ amplamente envolvida no controle da
resposta imune, responsável pela imunotolerância e prevenção de autoimunidade.
Os linfócitos Treg inibem a resposta imune celular suprimindo tanto a atividade dos
linfócitos T CD4+ e CD8+ como a função das principais células apresentadoras de
antígeno, as células dendríticas [35, 36]. Além disso, estas células já foram
relacionadas à fisiopatologia da sepse e do trauma, onde pacientes com lesão
tecidual apresentam supressão da imunidade celular por exacerbação dos linfócitos
T regulatórios [35, 37, 38].
Sustentando a hipótese de que a fisiopatologia da TRIM está centrada na
presença do leucócito do doador, temos como evidência os estudos clínicos que
demonstram o benefício da leucodepleção principalmente em pacientes submetidos
a cirurgias cardíacas [17, 19]. Além disso, estudos realizados em modelo animal
também demonstraram que o efeito da transfusão sanguínea na promoção do
crescimento de lesões tumorais está centralizado na presença dos leucócitos
alogênicos [39].
Por último, proteínas derivadas de moléculas HLA existentes no plasma
poderiam contribuir para este efeito imunológico. Estudos em modelo animal e in
vitro demonstraram que peptídeos não polimórficos derivados de moléculas HLA
classe I suprimem a resposta imune celular enquanto peptídeos polimórficos
induzem a anergia [5, 40]. Porém, estudos clínicos que avaliaram o efeito da
14
transfusão de concentrado de hemácias plasma reduzidos não conseguiram
demonstraram benefícios em cirurgia cardíaca [16].
1.4. Microquimerismo associado à transfusão (TA-MC):
O termo quimerismo significa a presença de linhagens genéticas distintas
em um organismo, enquanto microquimerismo refere-se à presença de uma
população alogênica correspondente a menos de 5% das células totais. Este
fenômeno pode ocorrer na gestação (entre a mãe e o feto), entre gêmeos, em
transplante de órgãos sólidos ou de medula óssea e associado à transfusão
sanguínea alogênica (transfusion-associated microchimerism-TA-MC) [41].
O TA-MC foi inicialmente observado na década de 70, a partir da análise
de cariótipo evidenciando a persistência de células femininas em neonatos
masculinos após realização de transfusão fetal de sangue materno [42, 43].
Historicamente era possível identificar os leucócitos do doador a partir da presença
do cromossomo Y em pacientes femininas que receberam transfusões de doadores
masculinos.
Um dos grandes obstáculos para o estudo do microquimerismo associado
à transfusão foi o desenvolvimento de uma metodologia capaz de identificar
quantidades mínimas de células do doador entre grandes quantidades de células do
receptor, além da necessidade de selecionar um marcador genético sensível o
suficiente para diferenciar estas duas populações.
Com o surgimento da técnica de amplificação gênica alelo-específica foi
possível desenvolver uma metodologia mais sensível para estudar o
microquimerismo, mas ainda baseada na pesquisa de genes do cromossomo Y em
receptoras femininas ou utilizando alelos HLA classe II em receptores com tipagem
HLA conhecida e ausência destes marcadores. Isto tornava a avaliação do
microquimerismo restrita a algumas populações de pacientes e/ou doadores. Além
disso, a pequena concentração do DNA do doador em um ambiente com grande
concentração de um DNA muito similar, correspondente às células do receptor,
tornava possível a falha na identificação do material genético em menor quantidade
por exaustão dos iniciadores durante o processo de amplificação [44, 45].
Mais recentemente, a partir da utilização do PCR (polymerase chain
reaction) em tempo real, Lee et al desenvolveu uma metodologia para identificar
células do doador em mínimas concentrações no sangue periférico do receptor.
15
Essa técnica é baseada em um painel contendo iniciadores específicos para 12
alelos HLA-DR, o que torna possível diferenciar a existência de duas populações
distintas geneticamente conforme a concentração do DNA. Assim, temos a presença
de um DNA em maior quantidade que amplificaria com uma menor quantidade de
ciclos, correspondente às células do receptor, e um DNA em menor concentração
que amplificaria com maior quantidade de ciclos, correspondendo às células do
doador. Conforme demonstrado pelos autores, a partir da diluição de amostras de
DNA onde era esperada a existência de uma única cópia para cada alelo HLA-DR foi
observado amplificação em 96,7% das amostras, conferindo uma alta sensibilidade.
Além disso, nas 564 amostras utilizadas como controle, ou seja, sem a presença do
marcador HLA específico, não houve amplificação, demonstrando alta especificidade
e ausência de falsos positivos [46].
Apesar dessas dificuldades, o TA-MC já foi estudado em diversos
contextos clínicos, não sendo evidenciada a persistência de leucócitos do doador
por mais de 4 semanas em pacientes transfundidos na ausência de trauma como em
portadores de HIV e de Talassemia [44, 45].
Para melhor entender como ocorreria a persistência dessas células
alogênicas no receptor, um estudo comparou 8 mulheres transfundidas em cirurgia
eletiva com 10 mulheres transfundidas em politrauma, encontrando grandes
diferenças. Houve clareamento dessas células com até 14 dias após a transfusão
em todas as pacientes submetidas à cirurgia eletiva, enquanto foi encontrada a
persistência do microquimerismo por até 1,5 anos nas pacientes traumatizadas [47].
A partir de então foi definida a existência de um microquimerismo a curto prazo, com
eliminação dos leucócitos do doador em dias ou semanas após a transfusão, e um
microquimerismo a longo prazo, com persistência dessas células por mais de 6
meses ou anos, fenômeno que foi descrito apenas em pacientes transfundidos em
grandes traumas.
Um trabalho marcante conseguiu demonstrar a presença de leucócitos do
doador com até 58 anos após a transfusão em soldados que combateram nas
guerras do Vietnam, Coreia ou II Guerra Mundial [48].
É interessante perceber que estas células teriam a capacidade não só de
permanecer no receptor, mas também de proliferar como um verdadeiro enxerto,
porém ainda existem muitas dúvidas sobre como aconteceria esta interação entre o
leucócito do doador e o sistema imune do receptor. Em pacientes transfundidos em
16
cirurgia ortopédica já foi demonstrado que ocorre clareamento de 99% das células
do doador com 24 horas após a transfusão e posteriormente, após 3 a 5 dias, estes
leucócitos proliferam e observamos aumento da sua concentração. Em
contrapartida, em pacientes traumatizados, a concentração dos leucócitos
alogênicos parece ser maior nos primeiros dias após a transfusão, porém não é
possível predizer em quais pacientes estes leucócitos persistirão a longo prazo [47,
49, 50]. Acredita-se que o grau de compatibilidade HLA entre doador e receptor
possa interferir na eliminação ou persistência das células alogênicas ou ainda que
ocorram respostas diferentes a partir da interação dos linfócitos de um paciente com
doadores distintos [51]. Inicialmente acreditava-se que maiores volumes
transfundidos e que a maior contaminação de leucócitos nos hemocomponentes
facilitaria a presença do microquimerismo associado à transfusão, porém foi
observada ausência de correlação com o número de unidades transfundidas e que a
leucodepleção não previne o TA-MC [41, 46, 52, 53]. Além disso, é curioso notar que
nos pacientes transfundidos em trauma, que receberam transfusão de múltiplos
doadores, os leucócitos alogênicos identificados como quimera correspondem na
maioria das vezes a tipagem HLA de 1 ou 2 doadores, o que reforça a teoria de que
a ocorrência do TA-MC não depende da quantidade de leucócitos recebida e do
volume transfusional, mas sim de características intrínsecas da interação entre o
doador e o receptor. Sustentando esta hipótese, um desses estudos demonstrou,
através da cultura mista de linfócitos, hiporreatividade bidirecional entre os
leucócitos do receptor e os leucócitos do doador cujas células foram identificadas
como microquimerismo [41, 46, 47]. Por outro lado, é provável que o trauma por
apresentar grande lesão tecidual e ativação inflamatória leve a alterações no
sistema imune que possam facilitar a proliferação e persistência dessas células, o
que explicaria a diferença na cinética dos leucócitos do doador nestes pacientes e o
microquimerismo a longo prazo. Sabemos que após grandes traumas ocorre
diminuição da resposta de linfócitos e imunossupressão, sendo esta diminuição
ainda mais acentuada naqueles pacientes traumatizados que apresentaram TA-MC
[54].
Por último, os trabalhos que tentaram identificar características dos
pacientes que facilitariam a ocorrência do TA-MC não encontraram diferenças entre
os grupos com e sem microquimerismo em relação à idade, ao sexo, ao tipo de
trauma, a gravidade do trauma, a ocorrência de hipotensão, a presença de
17
comorbidades, ao intervalo de tempo entre o trauma e a transfusão e ao volume
transfundido. Porém houve associação com o tempo de armazenamento dos
hemocomponentes, sendo que os pacientes com microquimerismo receberam
bolsas com menor tempo de estocagem quando comparados aos pacientes sem
microquimerismo [52]. Possivelmente, o leucócito armazenado a menos tempo
apresente maior viabilidade favorecendo a sua proliferação no receptor após a
transfusão e sua persistência.
Apesar da ampla discussão na literatura, não sabemos ao certo qual o
significado clínico da persistência dessas células no receptor. Trabalhos que
analisaram a ocorrência de complicações e a taxa de mortalidade nesses pacientes
não encontraram associação entre o TA-MC e pior desfecho clínico. Discute-se
ainda se a ocorrência do microquimerismo a longo prazo poderia ocasionar o
desenvolvimento de autoimunidade, câncer ou outras complicações, porém também
não foi encontrada maior ocorrência dessas patologias nos pacientes avaliados [48,
52].
1.5. Características dos hemocomponentes e TRIM:
Algumas características dos hemocomponentes transfundidos parecem
influenciar diretamente o efeito da TRIM. Como já amplamente discutido, a principal
delas é a quantidade de leucócitos do doador presente nos hemocomponentes.
Diversos estudos avaliaram o benefício da leucodepleção para diminuir a
imunomodulação associada à transfusão. Além disso, o volume transfusional
também parece ter grande importância sobre este efeito no sistema imune, uma vez
que os trabalhos em cirurgia cardíaca encontraram seus principais resultados em
pacientes que receberam acima de 3 unidades de concentrado de hemácias [17, 19,
20]. Enquanto o número de bolsas transfundidas parece influenciar a liberação de
citocinas inflamatórias após a transfusão, com maior aumento de IL-6 em pacientes
com maior número de transfusões, não observamos correlação com a ocorrência do
microquimerismo. Como última característica, discute-se o quanto o tempo de
armazenamento poderia influenciar a imunomodulação. A lesão de armazenamento
do concentrado de hemácias vem sendo amplamente estudada na literatura, com a
constante discussão se haveria prejuízo em utilizarmos sangue mais “velho” quando
comparado ao mais recente, porém sem evidência clínica suficiente [55-57]. Alguns
estudos retrospectivos demonstraram que a transfusão de concentrados de
18
hemácias com maior armazenamento foi fator de risco independente para pior
desfecho clínico com maior número de complicações e maior mortalidade em alguns
grupos de pacientes, principalmente em cirurgia cardíaca e em trauma [58-61].
Porém parece haver influência do volume total transfundido sobre esses resultados
e outros estudos não comprovaram esse prejuízo, o que torna o efeito clínico do
tempo de armazenamento controverso [27, 29, 56].
Por fim, a avaliação da resposta imune em pacientes transfundidos em
cirurgia abdominal revelou forte correlação entre a concentração sérica de
interleucina 10 no pós-operatório e o tempo médio de armazenamento dos
hemocomponentes, sendo que os pacientes que receberam concentrados de
hemácias mais antigos apresentaram maior pico de IL-10 no pós-operatório, porém
não houve diferenças significativas no número de complicações infecciosas e na
evolução destes pacientes [62].
19
2. OBJETIVOS:
Em vista do exposto, foram objetivos deste estudo:
- Avaliar as dosagens séricas dos mediadores inflamatórios em pacientes
submetidos à cirurgia ortopédica eletiva;
- Comparar as dosagens séricas dos mediadores inflamatórios entre os grupos de
pacientes com e sem transfusão no intra-operatório, a partir da utilização de
concentrados de hemácias com grande contaminação por leucócitos e plaquetas;
- Avaliar a presença de microquimerismo associado à transfusão nos pacientes
transfundidos.
20
3. MATERIAL E MÉTODOS:
3.1. Pacientes e protocolo transfusional:
Foram avaliados 28 pacientes submetidos à cirurgia ortopédica eletiva de
artroplastia total de quadril ou de fratura de fêmur proximal no Hospital das Clínicas
da Unicamp, com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa e após consentimento
informado. Os pacientes foram entrevistados previamente à cirurgia para responder
a um questionário com informações sobre dados para contato, diagnóstico, cirurgia a
ser realizada, histórico gestacional, uso de medicações atuais, comorbidades e
ocorrências de transfusões anteriores. Foram excluídos pacientes com diagnóstico
de neoplasia em quimio ou radioterapia, com tratamento imunossupressor, em uso
de corticoide sistêmico nos últimos 30 dias ou de anti-inflamatório nas últimas 48
horas, ou com antecedente de infecção ou uso de antibiótico nos 15 dias anteriores
à cirurgia.
Todos os pacientes foram operados pela mesma equipe cirúrgica e a
necessidade de transfusão foi avaliada pela equipe anestésica no decorrer da
cirurgia, conforme parâmetros hemodinâmicos, volume de sangramento e dosagem
de hemoglobina. Os hemocomponentes transfundidos foram concentrados de
hemácias não-leucodepletados, fracionados a partir do sangue total pela separação
do plasma rico em plaquetas e armazenados em CPDA-1.
3.2. Coleta das amostras:
Foram coletadas amostras de 8 ml de sangue periférico em três tempos:
no pré-operatório, ao final da cirurgia e com 6 horas de pós-operatório. Após
centrifugação, o soro foi aliquotado e armazenado a -80°C.
Dos 28 pacientes, foi coletada uma amostra de 8 ml de sangue periférico
em EDTA antes da cirurgia, da qual foi armazenado DNA de leucócitos extraído pelo
método fenol-clorofórmio.
Os pacientes transfundidos durante a internação foram submetidos a uma
nova coleta após a alta, no primeiro retorno ambulatorial. Nesta ocasião foi coletado
8 ml de sangue periférico em EDTA para extração do DNA juntamente com 8 ml de
sangue periférico em tubo seco para realização da pesquisa de anticorpos
irregulares e verificação de aloimunização eritrocitária após a transfusão.
21
3.3. Análise de marcadores inflamatórios:
Foram dosados IL-1B, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL12p70, IL-17, IL-21, IL-22,
IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, interferon-γ (IFN-γ), CD40 ligante solúvel (sCD40L) e Fator
de necrose tumoral (TNF) pela metodologia multiplex no soro das amostras
coletadas no pré-operatório, final da cirurgia e com 6 horas de pós operatório.
A metodologia multiplex é baseada em um teste de imunoensaio em
formato “sanduíche” que utiliza a citometria de fluxo. Anticorpos de captura
específicos para cada analito estão ligados a microesferas que são codificadas por
cores. Além disso, existe um anticorpo de detecção que emite fluorescência após se
ligar ao analito permitindo a sua quantificação. No presente estudo, foram utilizados
dois kits de multiplex: Bio-Plex Pro Human Th17 Cytokine Painel, BioRad
Laboratories Inc. USA e ProcartaPlex Multiplex Immunoassay, eBioscience,
conforme instruções do fabricante. A sensibilidade informada pelo kit para cada um
dos marcadores inflamatórios avaliados encontra-se na tabela 1.
Tabela 1. Limite inferior de detecção dos marcadores inflamatórios
pg/ml
IL-1B 0,26
IL-2 0,37
IL-4 1,73
IL-6 0,83
IL-10 0,18
IL-12p70 0,76
IL-17A 1,73
IL-17F 1,51
IL-21 14,93
IL-22 4,13
IL-23 9,81
IL-25 0,93
IL-31 3,14
IL-33 5,63
IFN-γ 0,80
sCD40L 1,51
TNF-α 1,35
22
3.4. Pesquisa de microquimerismo:
3.4.1. Extração do DNA genômico:
O DNA foi isolado de células nucleadas a partir de 8 ml de sangue
periférico coletado em EDTA. O sangue foi centrifugado a 2.000 rpm por 10 minutos.
O plasma foi desprezado. Para lise de hemácias foi adicionado solução de cloreto de
amônio (NH4Cl 0,144) na proporção de 5 vezes o volume de células e solução de
bicarbonato de amônio (NH4HCO3 0,01M) na proporção de 0,5 vezes o volume de
células. Após 15 minutos a 4ºC, a solução foi centrifugada a 2.200 rpm por 20
minutos. Esta etapa foi repetida até a obtenção de um precipitado de leucócitos livre
de hemácias.
Os leucócitos foram dissolvidos em 5ml de tampão contendo Tris/HCl pH
7,5 10mM, KCl 10mM, MgCl2 10mM, EDTA 20mM e 30µl de Triton X-100 com
incubação a temperatura ambiente por 15 minutos e centrifugação a 2.200 rpm por
15 minutos. Foi novamente adicionado 800µl de tampão contendo NaCl 0,4M,
Tris/HCl pH 7,5 10mM, KCl 10mM, MgCl2 10mM, EDTA 20mM e dodecil sulfato de
sódio 10% (SDS) com nova incubação a 55ºC por 30 minutos e centrifugação a
12.000 rpm por 5 minutos. Foi realizada a extração com igual volume de mistura
contendo fenol, clorofórmio e álcool isoamílico na proporção 25:24:1 com
centrifugação a 12.000 rpm por 5 minutos. Após, nova extração foi realizada apenas
com clorofórmio e álcool na proporção 24:1. A precipitação do DNA foi feita com
acetato de sódio 3M pH 5,3 (10% do volume total) e 1000µl de etanol absoluto
gelado. O DNA precipitado foi lavado com etanol a 70% para eliminar resíduos de
fenol e posteriormente diluído em água estéril ou em TE (TRIS pH 8,0 10mM e
EDTA 1mM). A concentração do DNA foi determinada por espectrofotometria pela
leitura das densidades ópticas nos comprimentos de onda de 260 e 280 nM em luz
ultravioleta.
3.4.2. Amplificação do DNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR) em
tempo real:
Foi realizado PCR em tempo real com a utilização de um painel contendo
12 alelos HLA-DR (DR1, DR3, DR4, DR7, DR8, DR9, DR10, DR11, DR12, DR13,
DR15 e DR16) utilizando sequências de iniciadores específicas (Integrated DNA
Technologies), conforme metodologia descrita por Lee et al em 2005 [46]. A
amplificação foi realizada no equipamento ABI 7500 Sequence detector System (Life
23
Technologies) utilizando Maxima Sybr Green PCR máster mix (MBI Fermentas).
Setenta e cinco ng de cada amostra de DNA foram utilizados na reação com os
iniciadores para os genes alvos. Um controle negativo, sem adição de DNA, foi
utilizado para cada par de iniciadores. Foi avaliada a temperatura de dissociação
para cada amplificação para garantir a especificidade do material amplificado (tabela
1). Após a reação, foi verificada a presença de DNAs em concentrações diferentes
conforme o número de ciclos necessários para amplificação. O DNA amplificado com
menor número de ciclos (cycle thresold, Ct), ou seja, em maior concentração,
corresponde ao material genômico do receptor e havendo amplificação de um
segundo alelo com maior número de ciclos, ou seja, em menor concentração, é
verificada a presença de material genômico do doador.
3.4.3. Eletroforese em gel de agarose a 4%:
Os produtos da reação de amplificação do PCR foram visualizados em gel
de agarose a 4% corado com brometo de etídio. Foi realizada eletroforese com
corrida a 80V por uma hora e visualização em equipamento LPIX. Com a utilização
de marcador de DNA de 100 pb, foi verificado o tamanho dos fragmentos de DNA
amplificados para cada alelo HLA-DR (tabela 2).
3.5. Pesquisa de anticorpos contra antígenos eritrocitários:
Para os pacientes transfundidos, foi realizada a pesquisa de anticorpos
irregulares (PAI) no soro pela técnica em gel em meio de baixa força iônica (solução
LISS) e em meio enzimático (papaína) na amostra coletada no primeiro retorno
ambulatorial.
3.6. Análise Estatística:
As análises estatísticas foram realizadas utilizando R version 3.1.3 (2015)
(R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). Para as comparações,
foram utilizados o teste exato de Fisher para as variáveis categóricas com dois
níveis e o teste não paramétrico de Mann-Whitney para os fatores mensuráveis.
Para os testes de correlação foi utilizada a análise de correlação de Spearman.
24
Tabela 2. Sequência dos iniciadores, concentração, temperatura de dissociação e tamanho do fragmento de DNA.
Alelo HLA-DR Concentração Sequência iniciador Temperatura dissociação (°C) Tamanho
DR1 300 nM DR1A (CTTGTGGCAGCTTAAGTTTGAATG) 82 91bp
DR1C (GGACTCCTCTTGGTTATAGATGCA)
DR3 300 nM DR3A (TACTTCCATAACCAGGAGGAGA) 90.9 153bp
DR3C (TGCAGTAGTTGTCCACCCG)
DR4 300 nM DR4A (GTTTCTGGAGCAGGTTAAAC) 91.4 250bp
DRBB (CCGCTGCACTGTGAAGCTCT)
DR7 300 nM DR7A (CCTGTGGCAGGGTAAGTATA) 91.4 232bp
DR7C (CCCGTAGTTGTGTCTGCACAC)
DR8 300 nM DR8A (AGTACTCTACGGGTGAGTGTT) 90.7 215bp
DR8C (CTGCAGTAGGTGTCCACCAG)
DR9 300 nM DR9A (GTTTCTTGAAGCAGGATAAGTTT) 91.8 236bp
DR7C (CCCGTAGTTGTGTCTGCACAC)
DR10 300 nM DR10A (CGGTTGCTGGAAAGACGCG) 91.8 204bp
DR10C (CTGCACTGTGAAGCTCTCAC)
DR11 300 nM DR11A (GTTTCTTGGAGTACTCTACGTC) 89 214bp
DR11C (CTGGCTGTTCCAGTACTCCT)
DR12 300 nM DR8A (AGTACTCTACGGGTGAGTGTT) 89.7 260bp
DR12C (CACTGTGAAGCTCTCTCCACAG)
DR13 300 nM DR3A (TACTTCCATAACCAGGAGGAGA) 89.7 130bp
DR13C (CCCGCTCGTCTTCCAGGAT)
DR15 300 nM DR2A (CTGTGGCAGCCTAAGAGGGAGT) 90.7 195bp
DR15C (CCGCGCCTGCTCCAGGAT)
DR16 300 nM DR2A (CTGTGGCAGCCTAAGAGGGAGT) 91.2 241bp
DR16C (AGGTGTCCACCGCGGCG)
25
4. RESULTADOS:
4.1. Análise dos marcadores inflamatórios:
4.1.1. Características dos pacientes
Foram avaliados 15 pacientes que receberam transfusão no intra-
operatório e 13 pacientes não transfundidos durante a cirurgia. Não houve
diferenças nas características de sexo, idade, peso, altura, tipo de cirurgia realizada,
tempo cirúrgico e dosagem de hemoglobina no pré-operatório nos dois grupos.
(tabela 3).
O grupo com transfusão recebeu de 1 a 2 unidades de CH não
leucodepletados e não irradiados durante a cirurgia. A mediana de armazenamento
dos hemocomponentes foi de 11 dias, variando de 6 a 28 dias.
Como referência da concentração média de leucócitos e plaquetas nestes
hemocomponentes, temos os resultados da análise realizada pelo controle de
qualidade do Hemocentro de Campinas onde foram coletadas amostras no primeiro
dia de armazenamento dos concentrados de hemácias standard produzidos de 12
de fevereiro a 30 de março de 2015 e de 08 de abril a 27 de julho de 2016, com
amostragem de 31 e 40 unidades respectivamente, selecionadas semanalmente e
de forma aleatória. Foram encontradas as concentrações médias de 3,0 x 109
leucócitos por unidade, com desvio padrão de 0,5 e de 1,8 x 1010 plaquetas por
unidade, com desvio padrão de 0,9.
4.1.2. Dosagem dos marcadores inflamatórios por multiplex:
As dosagens dos marcadores inflamatórios IL-1B, IL-2, IL-4, IL12p70, IL-
17, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-33 e TNFα foram próximas ao limite de detecção do
kit em todos os pacientes e nos três tempos avaliados, não sendo possível a análise
estatística.
Os resultados das dosagens de IL-6, IL-10, sCD40L, IL-31 e IFN-γ nos 3
tempos analisados estão descritos na tabela 4.
A interleucina 6 (IL-6) comportou-se de forma semelhante nos dois
grupos, apresentando aumento da sua concentração sérica, quando comparada ao
valor inicial (pré-operatório), ao final da cirurgia e com 6 horas de pós-operatório.
Porém, houve maior aumento de IL-6 no grupo com transfusão quando comparado
ao grupo sem transfusão ao final da cirurgia (p=0,023) (Figura 1).
26
O CD40 ligante solúvel (sCD40L) apresentou valores com grande
variação nas dosagens pré-operatórias em ambos os grupos. No grupo com
transfusão, ao final da cirurgia houve redução da sua concentração sérica em
relação ao valor inicial, sendo esta diminuição mantida na amostra coletada após 6
horas. Já no grupo não transfundido os resultados mantiveram maior variação entre
os pacientes nas dosagens realizadas ao final da cirurgia e após 6 horas. Houve
diferença significativa entre os dois grupos na amostra coletada ao final da cirurgia,
com menor concentração de sCD40L no grupo transfundido (p=0,016) (figura 2).
A interleucina 10 (IL-10) apresentou aumento da concentração sérica nas
amostras coletadas ao final da cirurgia e após 6 horas nos dois grupos. Houve
diferença significativa entre os grupos com 6 horas de pós operatório, sendo maior a
dosagem de IL-10 no grupo com transfusão quando comparado ao grupo não
transfundido (p=0,022) (Figura 3).
Tabela 3. Características dos pacientes com e sem transfusão no intra-operatório.
Característica Grupo com transfusão (n=15)
Grupo sem transfusão (n=13)
Valor p
Idade (anos) 70 (40-93) 69 (47-89) 0,58a
Sexo
Masculino (%) 8 (53) 7 (54) 1b
Feminino (%) 7 (47) 6 (46)
Peso (Kg) 69 (50-98) 70 (50-101) 0,91a
Altura (m) 1,67 (1,52-1,80) 1,60 (1,49-1,80) 0,39a
Cirurgia ortopédica
Artroplastia total de quadril (%) 9 (60) 7 (54) 1b
Fratura proximal de fêmur (%) 6 (40) 6 (46)
Duração da cirurgia (horas) 4 (2-6,5) 3,5 (2,3-5,16) 0,38b
Hb pré-operatório (g/dl) 11,8 (8,2-14,9) 12,7 (11-15,6) 0,069b
Volume transfundido (unidades) 1 (1-2) 0 0a
Os valores estão demonstrados como mediana com valores mínimos e máximos ou
como valor absoluto com a porcentagem relativa.
(a) teste de Mann-Whitney (b) teste exato de Fisher
27
A interleucina 31 (IL-31) apresentou valores heterogêneos no pré-
operatório em ambos os grupos. No grupo com transfusão, observamos uma
diminuição da sua concentração ao final da cirurgia e com 6 horas de pós operatório,
em relação ao valor inicial. Além disso, observamos resultados mais homogêneos
entre os pacientes deste grupo. Já no grupo sem transfusão, os resultados são mais
heterogêneos e com menor variação entre os tempos. Porém não houve diferença
significativa entre os grupos nos 3 tempos avaliados. (Figura 4).
O interferon gama (IFN-γ) apresentou menor variação nos 3 tempos
avaliados na maioria dos pacientes. O grupo com transfusão apresentou valores
mais elevados ao final da cirurgia quando comparado ao grupo sem transfusão,
porém não houve diferenças significativas entre os grupos em nenhum dos tempos
avaliados (Figura 5).
28
Tabela 4. Dosagens dos marcadores inflamatórios nos grupos com e sem
transfusão no intra-operatório.
Marcadores inflamatórios
Grupo com transfusão (n=15)
Grupo sem transfusão (n=13)
Valor p
IL-6 Pre-op 5,35 (0,83-46,21) 3,05 (0,83-22,81) 0,38
Final da cirurgia 79,36 (5,76-498,9) 7,8 (0,41-92,45) 0,023*
6hs pos-op 145,03 (12,31-577,44) 75,01 (3,53-599,70) 0,4
sCD40L
Pre-op 34,98 (0,75-209,09) 47,86 (3,31-369,76) 0,7
Final da cirurgia 11,06 (0,75-53,59) 36,06 (8,65-318,68) 0,016*
6hs pos-op 22,66 (0,75-527,33) 24,03 (5,57-287,43) 0,61
IL10
Pre-op 0,52 (0,18-2,49) 0,46 (0,18-1,55) 0,56
Final da cirurgia 1,31 (0,79-29,53) 1,42 (0,18-18,76) 0,89
6hs pos-op 5,90 (1,72-101,39) 2,31 (0,89-13,98) 0,022*
L31
Pre-op 10,47 (1,57-39,91) 12,23 (1,57-64,17) 0,73
Final da cirurgia 5,49 (1,57-11,70) 11,52 (1,57-42,99) 0,18
6hs pos-op 7,19 (1,57-62,47) 8,34 (1,57-61,79) 0,93
IFN-Ƴ
Pre-op 2,13 (0,40-24,11) 1,25 (0,40-6,08) 0,17
Final da cirurgia 2,14 (0,40-17,77) 0,40 (0,40-5,07) 0,08
6hs pos-op 3,09 (0,40-11,39) 1,84 (0,40-11,63) 0,36
Os valores estão em pg/ml e são demonstrados como medianas, com valores
mínimo e máximo. Foi utilizado o teste de Mann-Whitney para análise estatísitca.
* p < 0,05
29
Figura 2. Resultados da dosagem de IL-6 em pg/ml nos pacientes com transfusão (A) e sem
transfusão (B) no pré-operatório, ao final da cirurgia e com 6 horas de pós-operatório. (C)
Comparação estatística entre os grupos com transfusão (barras vermelhas) e sem
transfusão (barras verdes) nos 3 tempos utilizando o teste de Mann-Whitney.
(*)p= 0,023
30
Figura 3. Resultados da dosagem de sCD40L em pg/ml nos pacientes com transfusão (A) e
sem transfusão (B) no pré-operatório, ao final da cirurgia e com 6 horas de pós-operatório.
(C) Comparação estatística entre os grupos com transfusão (barras vermelhas) e sem
transfusão (barras verdes) nos 3 tempos utilizando o teste de Mann-Whitney.
(*)p= 0,016
31
Figura 4. Resultados da dosagem de IL-10 em pg/ml nos pacientes com transfusão (A) e
sem transfusão (B) no pré-operatório (1), ao final da cirurgia (2) e com 6 horas de pós-
operatório (3). (C) Comparação estatística entre os grupos com transfusão (barras
vermelhas) e sem transfusão (barras verdes) nos 3 tempos utilizando o teste de Mann-
Whitney. (*)p= 0,022
32
Figura 5. Resultados da dosagem de IL-31 em pg/ml nos pacientes com transfusão (A) e
sem transfusão (B) no pré-operatório (1), ao final da cirurgia (2) e com 6 horas de pós-
operatório (3). (C) Comparação estatística entre os grupos com transfusão (barras
vermelhas) e sem transfusão (barras verdes) nos 3 tempos utilizando o teste de Mann-
Whitney. Não houve diferença significativa entre os grupos nos 3 tempos avaliados.
33
Figura 6. Resultados da dosagem de IFN-γ em pg/ml nos pacientes com transfusão (A) e
sem transfusão (B) no pré-operatório (1), ao final da cirurgia (2) e com 6 horas de pós-
operatório (3). (C) Comparação estatística entre os grupos com transfusão (barras
vermelhas) e sem transfusão (barras verdes) nos 3 tempos utilizando o teste de Mann-
Whitney. Não houve diferença significativa entre os grupos nos 3 tempos avaliados.
34
4.2. Correlações entre citocinas:
Foram feitas as correlações entre as concentrações das citocinas IL-6, IL-
10 e sCD40L dosadas nos 3 tempos (pré-epratório, final da cirurgia e 6 horas de
pós-operatório) nos dois grupos de pacientes (tabela 5). No pré-operatório, a
concentração do sCD40L apresentou correlação negativa com a concentração de IL-
6 e correlação positiva com a concentração de IL-10, demonstrando que antes da
cirurgia e da transfusão, quando a concentração de IL-6 aumenta, as concentrações
de IL-10 e sCD40L diminuem. Já com 6 horas de pós-operatório observamos uma
correlação positiva entre as concentrações de IL-6 e IL-10 nos dois grupos,
evidenciando que após o trauma cirurgico temos o aumento da concentração de IL-
6 juntamente com o aumento da concentração de IL-10.
35
Tabela 5. Correlação entre as citocinas nos 3 tempos avaliados
Grupo com transfusão (n=15) IL-10 pre-op. IL-10 fim cir. IL-10 pos-op. sCD40L pre-op. sCD40L fim cir. sCD40L pos-op.
IL-6 pre-op. r = -0,098 r = -0,200
IL-6 fim cir. r = 0,350 r = 0,434
IL-6 pos-op. r = 0,609* r = -0,231
IL-10 pre-op. r = 0,536*
IL-10 fim crir. r = 0,469
IL-10 pos-op. r = -0,512
Grupo sem transfusão (n=13) IL-10 pre-op. IL-10 fim cir. IL-10 pos-op. sCD40L pre-op. sCD40L fim cir. sCD40L pos-op.
IL-6 pre-op. r = 0,251 r = -0,664*
IL-6 fim cir. r = 0,255 r = -0,291
IL-6 pos-op. r = 0,636* r = -0,264
IL-10 pre-op. r = 0,228
IL-10 fim crir. r = 0,136
IL-10 pos-op. r = -0,264
Análise de correlação de Spermann. * p< 0,05
Abreviações : pre-op., pré-operatório ; fim cir, final da cirurgia ; pos-op, 6 horas de pós-operatório.
36
4.3. Resultados microquimerismo:
4.3.1. Características dos pacientes:
A pesquisa de microquimerismo associados à transfusão foi realizada em
15 pacientes transfundidos no intra-operatório e/ou no pós operatório imediato. Dos
15 pacientes transfundidos durante a cirurgia foi possível avaliar 12 pacientes,
porque os outros não retornaram após a alta para coleta de nova amostra. Além
disso, foram avaliados 3 pacientes que não receberam transfusão no intra-operatório
mas que foram transfundidos no primeiro dia de pós operatório. Para análise do
volume trasnfusndido para cada paciente foram incluídas todas as transfusões
recebidas durante a internação, não apenas no intra-operatório mas tambem no pós
operatório. Foi observada a presença de microquimerismo associado à transfusão
em 13 dos 15 pacientes analisados.
Para descartar outras causas de microquimerismo, como gestação ou
transfusão anterior, foi realizada a reação em cadeia da polimerase (PCR) também
na amostra coletada no pré-operatório, não sendo considerado microquimerismo
associado à transfusão caso o alelo HLA-DR, visualizado na amostra coletada após
a alta, já estivesse presente no pré-operatório (Figuras 4 e 5).
Os alelos HLA-DR correspondentes ao material genômico do doador
apresentaram amplificação com Ct próximo de 20 ciclos. Já os alelos considerados
como microquimerismo apresentaram amplificação com Ct acima de 30 ciclos.
Dos 13 receptores com microquimerismo, em 10 pacientes foi observada
a presença de um único alelo HLA-DR correpondente aos leucócitos do doador
(microquimerismo) e em 3 pacientes foi observada a existência de 2 alelos.
Não houve diferenças entre os grupos com e sem microquimerismo nas
características sexo, idade, peso, altura, tipo de cirurgia realizada, duração da
cirurgia e dosagem de hemoglobina no pré-operatório. Além disso, não houve
diferença quanto ao volume total transfundido para cada paciente, considerando
todas as transfusões de concentrados de hemácias recebidas durante a internação.
Também não houve diferença entre os grupos no intervalo entre a última
transfusão e a coleta da amostra para avaliação do microquimerismo e no tempo de
armazenamento dos hemocomponentes. Nos pacientes com microquimerismo, a
mediana de seguimento foi de 14 dias, variando de 5 a 30 dias. Quanto ao tempo de
armazenamento dos hemocomponentes, a mediana foi de 17 dias, variando de 6 a
22 dias (tabela 6).
37
Tabela 6 . Características dos grupos com e sem microquimerismo associado à
transfusão.
Características Microquimerismo (n=13)
Sem microquimerismo
(n=2)
Valor p
Idade (anos) 77 (40-89) 72,5 (70-75) 0,80a
Sexo masculino (%) 8 (61) 1 (50) 1b
Peso (Kg) 69 (50-98) 69,5 (65-74) 1a
Altura (m) 1,67 (1,52-1,80) 1,57 (1,49-1,65) 0,27a
Cirurgia ortopédica
Artroplastia total de quadril (%) 9 (69) 0 0,14b
Fratura de fêmur proximal (%) 4 (31) 2 (100)
Duração da cirurgia (horas) 4,16 (2-6,5) 3,38 (3,25-3,5) 0,20a
Hb preoperatório (g/dl) 12,3 (8,2-14,9) 11,4 (11-11,8) 0,57a
Transfusão no intra-operatório
Sim (%) 11 (85) 1 (50) 0,37b
Não (%) 2 (15) 1 (50)
Unidades de CH transfundidas
na internação
3 (1-8) 3 (2-4) 0,86a
Tempo entre a última transfusão
e a coleta da amostra (dias)
14 (5-30) 13 (12-14) 0,80a
Tempo armazenamento
hemocomponentes (dias)
17 (6-22) 8,5 (5,5-11,5) 0,17a
Os valores estão demonstrados como mediana com valores mínimos e máximos ou
como valor absoluto com a porcentagem relativa.
(a) teste de Mann-Whitney (b) teste exato de Fisher
38
Figura 7. Resultado de paciente com microquimerismo associado à transfusão.
(A) Amostra pré-operatória com presença de alelos HLA-DR 4 e 15, ambos com Ct próximo
de 20, correspondendo aos leucócitos do receptor. (B) Amostra coletada após a alta
hospitalar com aparecimento do alelo HLA-DR 13 com Ct acima de 30, correspondendo aos
leucócitos do doador (microquimerismo). (C) eletroforese em gel de agarose a 4% dos
produtos de amplificação da amostra (B) com visualização dos 3 fragmentos.
39
Figura 8. Resultado de paciente com microquimerismo associados à transfusão.
(A) Amostra pré-operatória com presença de alelos HLA-DR 7 e 8, ambos com Ct próximo
de 20, correspondendo aos leucócitos do receptor. (B) Amostra coletada após a alta
hospitalar com aparecimento do alelo HLA-DR 1 com Ct acima de 30, correspondendo aos
leucócitos do doador (microquimerismo). (C) Eletroforese em gel de agarose a 4% dos
produtos de amplificação da amostra (B) com visualização dos 3 fragmentos.
40
Figura 9. Resultado de paciente com microquimerismo associado à transfusão.
(A) Amostra pré-operatória com presença de alelos HLA-DR 1 e 15, ambos com Ct próximo
de 20, correspondendo aos leucócitos do receptor. Presença de alelo HLA-DR 8 com Ct
acima de 30. Paciente com antecedente de múltiplas gestações. (B) Amostra coletada após
a alta hospitalar com aparecimento do alelo HLA-DR 9 com Ct acima de 30, correspondendo
aos leucócitos do doador (microquimerismo). (C) Eletroforese em gel de agarose a 4% dos
produtos de amplificação da amostra (B) com visualização dos 4 fragmentos.
41
Figura 10. Resultado de paciente sem microquimerismo associado à transfusão.
(A) amostra pré-operatória e (B) amostra coletada após a alta hospitalar, ambas com
presença de alelos HLA-DR 4 e 11 com Ct proximo de 20, correspondente aos leucócitos do
doador. Ausência de microquimerismo. (C) Eletroforese em gel de agarose a 4% dos
produtos de amplificação da amostra (B) com visualização dos 2 fragmentos.
42
4.3.2. Análise dos marcadores inflamatórios:
Não houve diferença nas dosagens de IL-6, sCD40L, IL-10, IL-31 e IFN-
nos 3 tempos avaliados (pré-peratório, final da cirurgia e 6hs de pós operatório)
entre os grupos com e e sem microquimerismo associado à transfusão (tabela 7).
Porém o grupo sem microquimerismo contém apenas 2 pacientes, o que prejudicou
a análise estatística.
Tabela 7. Dosagem dos marcadores inflamatórios nos grupos com e sem
microquimerismo.
Marcadores inflamatórios
Microquimerismo (n=13)
Sem microquimerismo (n=2)
Valor p
IL-6
Pre-op 5,35 (0,83-21,53) 11,39 (7,94-14,85) 0,57
Final da cirurgia 74,38 (9,50-498,90) 91,75 (91,05-92,45) 0,64
6hs pos-op 135,61 (12,31-577,44) 290,91 (161,80-420,02) 0,57
sCD40L
Pre-op 57,25 (1,57-209,09) 25,72 (3,58-47,86) 0,3
Final da cirurgia 23,35 (1,57-53,59) 42,03 (10,74-73,32) 0,64
6hs pos-op 25,39 (1,57-527,33) 39,56 (22,54-56,58) 0,69
IL10
Pre-op 0,56 (0,18-2,49) 0,56 (0,46-0,65) 0,67
Final da cirurgia 1,27 (0,18-29,53) 1,86 (1,08-2,63) 0,77
6hs pos-op 3,24 (1,72-101,1) 4,78 (2,21-7,35) 0,93
IL-31
Pre-op 9,05 (1,57-39,91) 7,95 (1,57-14,33) 0,61
Final da cirurgia 5,85 (1,57-11,70) 9,54 (4,41-14,68) 0,69
6hs pos-op 6,92 (1,57-62,47) 11,33 (7,28-15,38) 0,35
IFN- γ
Pre-op 1,55 (0,40-24,11) 0,82 (0,40-1,25) 0,23
Final da cirurgia 1,84 (0,40-17,77) 1,54 (1,25-1,84) 1
6hs pos-op 2,96 (0,40-11,39) 4,03 (3,5-4,55) 0,49
Os valores estão em pg/ml e são demonstrados como medianas com valores mínimo e
máximo. Foi utilizado o teste de Mann-Whitney para análise estatísitca.
4.3.3. Confirmação pela tipagem HLA-DR dos doadores:
O total de doadores envolvidos nas transfusões dos 13 pacientes com
presença de microquimerismo associado à transfusão foi de 47 indivíduos. Desses,
apenas 11 compareceram para a coleta de amostra para tipagem HLA-DR. Em 5
dos 13 pacientes foi possível confirmar a tipagem HLA-DR visualizada como
microquimerismo com a tipagem HLA-DR de um dos doadores transfundidos. Em
43
outros 5 casos não foi possível realizar esta confirmação porém não compareceram
todos os doadores transfundidos. Em 3 casos nenhum dos doadores envolvidos
compareceu não sendo feita esta análise.
4.4. Pesquisa de anticorpos contra antígenos eritrocitários:
Nenhum dos 15 pacientes que foram avaliados após a alta hospitalar
apresentou evidência de aloimunização eritrocitária. Quatorze pacientes
apresentaram PAI negativo. Um paciente apresentou PAI positivo com a presença
de anti-E, porém este paciente já apresentava este anticorpo na avaliação realizada
antes da cirurgia. O paciente em questão tinha antecedente de transfusão
sanguínea em uma cirurgia anterior.
44
5. DISCUSSÃO:
Sabemos que o trauma cirúrgico leva a uma reação pró-inflamatória,
conhecida como síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS - systemic
inflammatory response syndrome) que é contrabalanceada por um efeito anti-
inflamatório compensatório (CARS - compensatory anti-inflammatory response
syndrome). Assim, já foi demonstrado que após uma lesão tecidual extensa ocorre
uma tempestade de citocinas, com ativação do sistema imune e liberação de IL-6,
IL-8, IL-10 e TNF α entre outros [6, 63-65]. Acredita-se que neste contexto a
transfusão sanguínea alogênica possa exacerbar esta resposta inflamatória,
funcionando como um segundo insulto ao sistema imune [6, 66]. Para melhor
demonstrar este efeito imunomodulatório da transfusão alogênica, escolhemos um
grupo de pacientes que recebeu concentrados de hemácias standard, ou seja, com
maior contaminação por leucócitos e plaquetas, já que a maioria dos estudos da
literatura são realizados com hemocomponentes com menor contaminação. Os
resultados encontrados com relação ao aumento da IL-6 e da IL-10 no pós-
operatório de ambos os grupos eram assim esperados e estão condizentes com a
literatura, reforçando a ideia do trauma por si gerar uma resposta inflamatória
sistêmica. Além disso, o maior aumento de IL-6 ao final da cirurgia e o maior
aumento de IL-10 com 6 horas de pós-operatório nos pacientes transfundidos,
quando comparados aos não transfundidos, fortalece a teoria de que a transfusão
sanguínea age como um segundo estímulo, exacerbando a resposta imune.
Resultados semelhantes já tinham sido descritos para estas
interleucinas com relação à transfusão. Estudos anteriores demonstraram aumento
de IL-6 em pacientes transfundidos em cirurgia cardíaca, como já discutimos [20,
23]. Da mesma forma, um estudo mais recente avaliou pacientes transfundidos em
cirurgia abdominal divididos em um grupo com estratégia transfusional liberal
comparado a um grupo com estratégia restritiva e também evidenciou maior
dosagem de IL-10 no pós-operatório no primeiro grupo, correlacionando o aumento
desta interleucina com a transfusão [62].
Por outro lado, esperávamos encontrar resultados mais exuberantes
com relação às dosagens de citocinas inflamatórias, por utilizarmos concentrados de
hemácias com alta contaminação por leucócitos e plaquetas. Não foram observadas
diferenças significativas entre os grupos nas outras citocinas avaliadas. Porém, é
45
possível que o baixo volume transfusional e o curto período de armazenamento dos
hemocomponentes tenham minimizado possíveis diferenças conforme resultados já
descritos. De fato, o estudo que avaliou 346 pacientes transfundidos em cirurgia
cardíaca evidenciou maior aumento de IL-6 nos pacientes que receberam 4 ou mais
unidades de concentrados de hemácias buffy-coat depletadas quando comparados
aos pacientes que receberam concentrado de hemácias leucodepletadas [20]. Da
mesma forma, van de Watering et al também evidenciou efeito dose dependente ao
avaliar 866 pacientes, encontrando maior mortalidade no grupo que recebeu 4 ou
mais unidades de concentrados de hemácias não leucodepletadas [17].
Além disso, é importante ressaltar que, por comparamos pacientes
transfundidos com pacientes não transfundidos, é possível que as características
intrínsecas de cada grupo interfiram nos resultados encontrados. Observamos que,
apesar das características dos pacientes não apresentarem diferenças significativas
entre os grupos, os pacientes que tiveram necessidade transfusional no intra-
operatório foram aqueles com menor dosagem de hemoglobina sérica no pré-
operatório, com nível de hemoglobina variando de 8,2 g/dl a 14,9 g/dl no grupo com
transfusão contra 11,0 a 15,6 g/dl no grupo sem transfusão, o que pode refletir uma
pior condição clínica; e com maior tempo cirúrgico, variando de 2,00 a 6,50 horas de
cirurgia no grupo com transfusão contra 2,30 a 5,16 horas no grupo sem transfusão,
o que possivelmente levou a maior lesão tecidual com maior volume de
sangramento (tabela 3).
Como resultado ainda não descrito, encontramos diminuição
significativa da concentração de sCD40L ao final da cirurgia nos pacientes
transfundidos em relação aos não transfundidos. O receptor de membrana CD40, da
família do TNF, é encontrado em células apresentadoras de antígenos, nos linfócitos
B e nas células endoteliais, sendo o seu ligante (CD40L ou CD154) expresso
principalmente nos linfócitos T e nas plaquetas. Através da ligação CD40-CD40L
ocorre, por exemplo, a interação das células apresentadoras de antígenos com os
linfócitos T assim como das plaquetas com as células endoteliais. Inicialmente
acreditava-se que a parte solúvel do CD40 ligante (sCD40L) era produzida apenas
por linfócitos T, a partir da clivagem proteica da região externa do receptor CD40L.
Atualmente sabemos que as plaquetas são a principal fonte do sCD40L encontrado
no plasma. Esta descoberta tem ganhado destaque na literatura por evidenciar o
papel pró-inflamatório e pró-trombótico das plaquetas após uma lesão tecidual.
46
Dessa forma, o sCD40L está sendo estudado em diversos cenários, sendo
relacionado à inflamação vascular, à ativação de células endoteliais e a risco
trombótico [67-71].
Além disso, foi demonstrado que ocorre a liberação dessa molécula
coestimulatória no plasma dos hemocomponentes durante o armazenamento, sendo
a maior quantidade encontrada nos concentrados de plaquetas. Em relação aos
concentrados de hemácias, observamos que a leucodepleção reduz
significativamente a liberação do sCD40L, sendo que nos hemocomponentes não
leucodepletados esta concentração aumenta durante o armazenamento. Existem
estudos que demonstram o envolvimento do sCD40L na fisiopatologia da lesão
pulmonar aguda associada à transfusão (TRALI – transfusion-related agude lung
injury), provavelmente por levar à ativação de neutrófilos e de células endoteliais
[72].
No presente estudo, apesar dos pacientes transfundidos receberem
concentrados de hemácias com maior contaminação por leucócitos e plaquetas, ou
seja, com maiores quantidades de sCD40L, houve redução significativa deste
marcador no grupo transfundido, diferentemente do que aconteceu no outro grupo.
Isto demonstra o seu acentuado consumo após a transfusão. Acreditamos que o
sCD40L tenha se ligado aos seus receptores presentes, por exemplo, em linfócitos e
em células endoteliais, o que levou `a sua redução no sangue periférico. Já foi
demonstrado in vitro que o sCD40L tem a capacidade de estimular a proliferação de
linfócitos T regulatórios e de induzir a liberação de IL-10 [71]. Sendo assim, é
possível explicar o maior aumento de IL-10 com 6 horas de pós-operatório neste
grupo de pacientes, quando comparado ao grupo não transfundido.
Avaliamos também a presença de microquimerismo associado à
transfusão encontrando positividade em 13 dos 15 pacientes. A mediana de
seguimento foi de 14 dias, sendo que foi evidenciado microquimerismo por até 30
dias após a transfusão em um dos pacientes. É uma alta taxa de positividade, porém
realizamos apenas uma avaliação a curto prazo, não sendo possível dizer se
ocorreu persistência dessas células no receptor. Apesar de Lee et al ter
demonstrado em 1999 a eliminação dos leucócitos do doador com até 14 dias após
a transfusão em cirurgia eletiva, existem outros trabalhos que demonstraram a
persistência desses leucócitos por mais tempo, sendo que um estudo demonstrou
microquimerismo por até 24 semanas após a transfusão em um dos pacientes
47
avaliados [47, 73]. Porém, só foi visto microquimerismo a longo prazo em pacientes
transfundidos em grandes traumas como foi observado em soldados feridos em
guerra [46-48]. Além disso, por utilizarmos PCR em tempo real a sensibilidade da
nossa metodologia é maior do que a utilizada por Lee et al em 1999.
Existem ainda outros mecanismos possivelmente envolvidos na
imunomodulação associada à transfusão, como a presença de microvesículas e
exossomas nos concentrados de hemácias. Essas vesículas são derivadas
principalmente de hemácias e plaquetas e são acumuladas nos hemocomponentes
durante o armazenamento. Estudos in vitro demonstraram que a interação dos
exossomas com as células apresentadoras de antígenos induz a proliferação de
linfócitos T, sendo este efeito neutralizado com o bloqueio dos receptores CD40-
CD40L [74]. Dessa forma, estudos futuros devem avaliar a importância deste
mecanismo na liberação de citocinas e na resposta imune após uma transfusão.
Por fim, os resultados obtidos com relação ao perfil de citocinas no pós-
operatório destes pacientes sugere que a transfusão de até 2 unidades de
concentrados de hemácias contaminados com leucócitos e plaquetas pode causar
menor imunomodulação do que o esperado e corroborar a hipótese de que esse
efeito seria mais exuberante apenas em transfusões acima de 4 unidades. Este é
um resultado importante para centros em países em desenvolvimento onde a prática
de leucorredução é menos utilizada.
48
6. CONCLUSÃO:
Concluímos que a transfusão de concentrado de hemácias não
leucodepletados no contexto cirúrgico induz um insulto adicional em um ambiente
onde já existe a ativação do sistema imune pelo trauma. Este duplo estímulo leva a
maior liberação de IL-6 e IL-10 no pós-operatório, com consumo de sCD40L. Além
disso, a sobrevida transitória do leucócito alogênico parece contribuir com este efeito
imunomodulatório. Porém, é dífícil definir o quanto estas alterações se traduzem em
um efeito clínico no receptor.
49
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56
Tabela 8. Resultados dos marcadores inflamatórios em pg/ml por paciente avaliado.
sem transf pre-op final cirurgia 6hs pos-op pre-op final cirurgia 6hs pos-op pre-op final cirurgia 6hs pos-op
1 3.05 38.82 567.89 0.18 0.18 2,31 93.14 34.72 30.03
2 21.53 74.38 90.44 1.41 1.27 4,93 4.74 23.35 24.03
3 0.83 2.44 13.03 0.32 6.65 0,92 87.69 36.06 5.57
4 * * * 0.73 5.94 5,6 * * *
5 * * * 0.20 0.18 1,01 * * *
6 7.94 92.45 161.80 0.65 2.63 2,21 47.86 73.32 56.58
7 2.68 4.86 58.43 1.55 1.42 0,89 369.76 184.26 259.72
8 15.74 46.17 599.70 0.26 9.22 13,98 3.31 10.39 10.68
9 4.79 1.98 12.92 0.46 0.24 1 18.44 55.52 19.66
10 1.42 7.8 56.01 0.34 18.76 2,34 114.55 318.68 287.43
11 0.90 4.48 181.26 0.18 0.38 2,35 10.80 8.65 7.44
12 22.81 37.64 75.01 0.78 6.17 4,43 10.68 13.87 13.63
13 0.86 0.41 3.53 1.19 1.24 2,08 235.18 187.58 137.36
mediana 3.05 (0.83-22.81) 7.80 (0.41-92.45) 75.01 (3.53-599.70) 0.48 (0.18-1.55) 1.42 (0.18-18.76) 2.31 (0.89-13.98) 47.86 (3.31-369-76) 36.06 (8.65-318.68) 24.03 (5.57-287.43)
com transf pre-op final cirurgia 6hs pos-op pre-op final cirurgia 6hs pos-op pre-op final cirurgia 6hs pos-op
1 9.93 * 154.45 1.04 * 5.15 57.25 * 145.07
2 2.81 5.76 14.31 0.27 1.37 6.65 3.53 4.96 22.79
3 3.15 97.89 368.16 0.56 2.62 101.10 61.47 28.33 14.58
4 12.81 80.59 28.90 0.18 1.33 2.47 7.04 0.90 25.39
5 4.66 20.71 37.05 0.47 11.22 1.72 147.15 22.73 26.76
6 46.21 * 209.41 1.13 * 101.39 25.33 * 1.00
7 2.71 267.61 577.44 1.16 29.53 7.70 161.94 51.94 51.54
8 14.85 91.05 420.02 0.46 1.08 7.35 3.58 10.74 22.54
9 17.25 250.86 99.17 0.50 0.79 2.17 10.68 6.14 2.40
10 8.22 18.10 423.59 0.49 0.92 10.13 1,57 1,57 1,57
11 5.35 498.90 421.04 0.61 7.98 3.24 12.27 53.59 27.33
12 1.94 78.12 * 0.18 1.30 * 34.98 8.24 *
13 16.62 11.01 120.12 0.52 0.89 2.42 209.09 30.28 19.60
14 0.83 * 12.31 2.49 * 1.88 54.86 * 527.33
15 4.72 9.50 135.61 2.32 0.99 14.85 162.63 11.38 16.56
mediana 5.35 (0.83-46.21) 79.36 (5.76-498.90) 145.03 (12.31-577.44) 0.52 (0.18-2.49) 1.31(0.79-29.53) 5.90 (1.72-101.39) 34.98 (1,57-209.09) 11.06 (1,57-53.59) 22.66 (1,57-527.33)
IL-6 IL-10 sCD40L
Abreviações: sem transf, sem transfusão; com transf, com transfusão; pre-op, pré-operatório; pos-op, pós-operatório.
*Não avaliado
57
Tabela 9. Resultados dos marcadores inflamatórios em pg/ml por paciente avaliado.
sem transf pre-op final cirurgia 6hs pos-op pre-op final cirurgia 6hs pos-op
1 6,56 1,57 1,57 0,40 0,40 3,50
2 1,57 5,85 5,13 1,55 0,40 0,40
3 26,15 11,52 4,05 3,50 0,40 0,40
4 * * * * * *
5 * * * * * *
6 14,33 14,68 15,38 1,25 1,25 3,50
7 64,17 42,99 61,79 1,25 5,07 7,32
8 3,69 6,92 14,68 6,08 3,50 11,63
9 12,23 25,11 8,34 1,25 1,25 1,25
10 13,63 22,69 25,97 0,40 1,55 1,84
11 1,57 1,57 4,23 0,40 0,40 0,40
12 1,57 1,57 3,32 0,40 0,40 4,03
13 45,22 40,42 25,11 0,40 0,40 0,40
mediana 12,23 (1,57-64,17) 11,52 (1,57-42,99) 8,34 (1,57-61,79) 1,25 (0,40-6,08) 0,40 (0,40-5,07) 1,84 (0,40-11,63)
com transf pre-op final cirurgia 6hs pos-op pre-op final cirurgia 6hs pos-op
1 13,98 * 41,11 1,25 * 6,58
2 4,05 4,77 12,05 4,03 5,58 4,55
3 9,05 8,70 6,21 24,11 17,77 9,98
4 4,77 4,41 8,34 2,41 3,50 11,39
5 39,91 9,05 9,58 3,23 0,40 2,41
6 21,3 * 3,32 2,96 * 2,41
7 28,04 9,76 8,17 1,25 1,84 2,96
8 1,57 4,41 7,28 0,40 1,84 4,55
9 3,32 1,57 1,57 2,41 2,96 1,25
10 7,99 5,49 5,31 9,50 6,08 6,58
11 4,41 11,70 6,92 1,25 3,50 3,23
12 15,03 3,69 * 0,4 0,40 *
13 26,32 5,85 5,13 2,13 0,40 0,40
14 10,47 * 62,47 0,40 * 0,40
15 24,76 5,49 7,10 0,95 0,95 1,84
mediana 10,47 (1,57-39,91 5,49 (1,57-11,70) 7,19 (1,57-62,47) 2,13 (0,40-24,11) 2,14 (0,40-17,77) 3,09 (0,40-11,39)
IL-31 IFN-Ƴ
Abreviações: sem transf, sem transfusão; com transf, com transfusão; pre-op, pré-operatório; pos-op, pós-operatório.
*Não avaliado
58
9. Anexos:
Anexo I
Reduction in sCD40L levels may predict an anti-inflammatory effect after leukocyte-
containing allogeneic blood transfusion in surgical patients
Running head: anti-inflammatory effect of transfusion
Mariana Magnus1, Fernanda Niemann1, William Belangero2, Simone Gilli1, Sara T Olalla Saad1.
1 Department of Hematology and Transfusion Medicine Center, 2 Department of Orthopedics,
University of Campinas, Campinas, SP, Brazil
Corresponding author: Mariana Magnus, Hematology and Transfusion Medicine Center, University
of Campinas.
Rua Carlos Chagas, 480. Campinas, SP, Brazil. 13083-878
Phone: +55 19 3521 8603
Email: [email protected]
The Authors have no conflicts of Interest to declare.
Financial support: This work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq/MCT), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP) # 2011/51959-0
59
Abstract
Background: Red blood cell (RBCs) transfusion has been associated with complications in
trauma and surgical patients. Leukocytes and platelets, present in blood components, seem to be
a main cause of transfusion-related immunomodulation. Despite evidence of deleterious clinical
effects of allogeneic blood transfusion, the actual mechanism involved is unclear.
Study Design and Methods: A prospective observational study was conducted to evaluate
transfusion-associated microchimerism and immune responses of 28 patients undergoing elective
orthopedic surgery divided into a leukocyte-containing RBCs transfused and a non-transfused
group. Inflammatory markers IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17, IL-21, IL-22, IL-23, IL-
25, IL-31, IL-33, interferon-γ (IFN-γ), soluble CD40 ligand (sCD40L), Tumor necrosis factor (TNFα)
were measured in both groups at three time points: preoperative period, end of surgery and 6hs
hours after the postoperative period; microchimerism presence was detected by polymerase chain
reaction (PCR) analysis using quantitative allele-specific HLA DR assays to reveal non-recipient
alleles in transfused patients.
Results: Higher IL-6 levels (p = 0.023) and significant sCD40L reduction (p = 0.016) when surgery
ended, and higher IL-10 levels (p =0.022) after 6hs hours of postoperative period were
demonstrated in transfused compared to non-transfused patients. Microchimerism was
documented in 13 out of 15 patients after leukocyte-containing RBC transfusion and median
evaluation time was 14 days after transfusion (range 5-30 days). Comparing patients with and
without microchimerism, there was no difference in gender, age, number of units transfused or
inflammatory markers after transfusion.
Conclusion: Leukocyte-containing RBC transfusion is associated with early inflammatory
response followed by anti-inflammatory response in trauma surgery patients and reduction in
sCD40L levels after transfusion may predict an anti-inflammatory effect.
Key words: blood transfusion; transfusion-related immunomodulation; microchimerism;
leukocytes.
60
Introduction
The administration of blood products is associated with well described adverse effects, for
example, the risk of viral infection transmission, transfusion-related acute lung injury (TRALI) and
febrile nonhemolytic transfusion reactions.
Recently more restrictive transfusion polices have been used in critical care units and surgery
settings. Over the last 30 years, a variety of deleterious effects potentially attributable to blood
transfusion have been described andallogeneic blood transfusion (ABT) in particular, is believed to
be associated with increased risk of cancer recurrence[1-3], postoperative infection[4-6] and short-
term mortality. [7-10] To explain all these clinical findings, there has been increasing interest in the
idea that ABTs cause an effect on the recipient’s immune system known as transfusion-related
immunomodulation (TRIM). Despite TRIM being a real biologic phenomenon, the mechanism and
clinical significance of this syndrome remains controversial.
One possible mechanism of TRIM lies in the donor and recipient HLA partial compatibility,
potentially leading to the persistence of a small number of donor leucocytes in the recipient
circulation after blood transfusion. This transfusion-associated microchimerism (TA-MC) can lead
to the release of cytokines and can also promote the downregulation of the immune response of
the recipient. TA-MC has been described in trauma patients after 2 years of transfusion and in
elective surgery patients during short-term periods.[11-13]
In addition, leukocyte-containing blood products accumulate cytokines released during storage
and after transfusion the interaction between donor and recipient leukocytes results in the
production of many cytokines that induce an immunomodulatory effect in the recipient. [7, 8]
Previous studies have shown increased level of inflammatory mediators such as IL-6 and IL-10 in
the plasma of surgery patients after blood transfusion and the impairment in balance between
proinflamatory and antiinflamatory cytokines could possibly explain the worse outcome in these
patients. [14-16]
In the present study, we investigated whether intraoperative blood transfusion affects the release
of inflammatory mediators in patients undergoing elective orthopedic surgery and the association
of these cytokines with the presence of transfusion related microchimerism.
Materials and Methods
This is a prospective observational study at The University of Campinas Hospital. Patients
scheduled for elective orthopedic surgery (hip arthroplasty or proximal femoral fracture) were
61
enrolled in the study after providing written informed consent. Exclusion criteria included
individuals under the age of 18, preexisting infectious or autoimmune disease, corticosteroids or
imunossupressive drug use during the previous 30 days and cancer diagnosis in radio or
chemotherapy treatment.
All patients were operated by the same surgery team and used the same anesthetic protocol.
Intraoperative transfusions were supervised by the anesthesiologist according to the hospital
transfusion protocol that includes evaluation of bleeding amount, change in heart rate, blood
pressure and hemoglobin levels during surgery.
All transfusions were non-leukodepleted packed red cells stored in citrate-phosphate dextrose
adenine-1 (CPDA-1).
Inflammatory Markers. Peripheral blood samples were collected at the following time points:
preoperatively, at the end of surgery and 6 hours postoperatively. Blood samples were
immediately centrifuged and aliquoted; the serum sample was stored at -80°C. The
concentrations of cytokines were measured using two multiplex immunoassay: Bio-Plex Pro
Human Th17 Cytokine Painel, BioRad Laboratories Inc. USA and ProcartaPlex Multiplex
Immunoassay from eBioscience, according to the recommendations of the manufacturer. The
evaluated cytokines were: IL-1B, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL12p70, IL-17, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25,
IL-31, IL-33, interferon-γ (IFN-γ), soluble CD40 ligand (sCD40L), Tumor necrosis factor (TNFα).
Microchimerism. Samples were collected from patients who had received blood transfusion during
surgery or in the early postoperative days. DNA samples were obtained from peripheral blood
samples using phenol-chlorophorm protocol extraction. Identification of transfusion related
microchimerism was performed using quantitative real-time PCR in a ABI 7500 Sequence
Detector System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) with SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems). DNA lysates were amplified for the HLA-DR panel consisting of DR1, DR3,
DR4, DR7, DR8, DR9, DR10, DR11, DR12, DR13, DR15 and DR16 using sequence-specific
primers. [11, 17]. After that, the amplification product was visualized on 4% agarose gel.
Microchimerism was identified in two different populations according to Ct value: a major HLA-DR
type with a relatively low Ct (patient’s cells) and a minor population with a higher Ct (microchimeric
cells). The post transfusion sample was compared with the pre transfusion sample for each patient
to exclude any other cause of microchimerism such as pregnancy or transplantation. Additionally,
HLA-DR types of donors were performed to confirm the survival of donor leukocyte subpopulations
in transfused patients.
62
Statistics
Patient characteristics and cytokine values were compared in the transfused and non-transfused
groups using the Wilcoxon signed-rank test for quantitative variables and Fisher’s exact test for
qualitative variables. Correlations were described as Sperman’s rank correlation coefficient (r). In
all analysis p < 0.05 was considered as statistically significant.
Results
Patient Characteristics. 15 patients were transfused during surgery and 13 were not. Comparison
of both groups showed no significant difference in age, gender, weight, height, type of orthopedic
surgery, surgery duration and in preoperative hemoglobin levels. Furthemore, median hemoglobin
levels before surgery were 11.8g/dl (range 8.2-14.9g/dl) in the transfused group versus 12.7g/dl
(range 11-15.6g/dl) in the non-transfused group and median surgery time was 4 hours (range 2-
6.5 hours) in the transfused group versus 3.5 hours (range 2.3-5.16 hours) in the non-transfused
group(Table 2). Transfused patients received 1 to 2 units of nonleukodepleted packed red cells
during surgery. The storage length of transfused units varied from 6 to 21 days, mean of 11 days.
Inflammatory Markers.IL1β, IL2, IL4, IL12, IL17, IL21, IL22, IL23, IL25, IL31, IL33, IFN-γ, TNFα
levels were low in both groups at all time points analyzed (data not shown), with no statistical
differences. However, significant differences were obtained for IL-6, IL-10 and soluble CD40 ligand
(sCD40L) levels. Detection sensitivity for each cytokine is listed in Table 1. The serial changes in
the circulating levels of IL-6, IL-10 and sCD40L in the two patient subgroups are summarized in
Table 3. IL-6 exhibited a postoperative increase in the two groups and at the end of surgery IL-6
levels were higher in the transfused group than in the non-transfused patients (P=0.023). IL-10
also increased progressively after surgery in both groups and a higher level was observed in the
transfused compared to the non-transfused group after 6hs of postoperative period (P=0.022).
sCD40L was higher from baseline at all three time points in the two groups and decreased after
surgery, with lower levels in the transfused group compared to the non-transfused group at the
end of surgery (P=0.016). (Figure 1). Correlation analysis using Spearman test showed that in the
pre-operative period, sCD40L correlated positively with IL10 (r=0,536, p<0,05) and correlated
negatively with IL6 ( r=-0,664 p<0,05) , confirming the anti-inflammatory effect (Table 5).
Microchimerism. Blood samples were collected after transfusion to investigate the evidence of
microchimerism in 15 patients. Twelve patients were transfused during surgery (transfused group)
and 3 patients were transfused after surgery, in the first or second postoperative day. In a total of
15 patients, 13 demonstrated evidence of transfusion related microchimerism (Figure 2). The
63
median time of blood sampling was 14 days after transfusion (range 5-30 days), calculated from
the time the last unit have been transfused. Comparing patients that did and did not demonstrate
evidences of microchimerism, there was no difference in gender, age, type of orthopedic surgery,
number of units transfused or time of sample collection (days after transfusion) (Table 4).
Furthermore, there was no significant difference in IL-6, IL-10 and sCD40L levels at all time points
in both subgroups.
We requested the blood donors involved in the transfusions of these 13 patients to collect samples
for HLA typing. In a total of 42 blood donors, 11 attended the service. It was possible to confirm
the survival of donor leukocyte subpopulations in 5 patients.
Discussion
The mechanisms involved in transfusion related immunomodulation (TRIM) are still uncertain. In
this study we demonstrated that allogeneic blood transfusion during orthopedic surgery is
associated with increased inflammatory markers, corroborating data reported in patients
undergoing cardiac and abdominal surgery. [14, 16], Those studies compared different transfusion
strategies as, for example, liberal versus restrictive transfusion protocol or buffy-coat depleted
versus leukocyte-depleted red blood cells. To our knowledge, this is the first study to evaluate
early inflammatory profiles and microchimerism in patients submitted to transfusion with RBC
highly contaminated with leukocytes and platelet, during surgery procedure. The non-
leukodepleted RBCs contained 3 X 109 leukocytes/unit and were not irradiated.
Interesting, the cytokine profile levels of our results compared to the literature reporting data
obtained from patients transfused with buffy-coat or leuko-depleted RBCs were similar. Thus, our
findings confirmed, in transfused patients, higher concentrations of pro and anti-inflammatory
cytokines as interleukin-6 and interleukin-10, consistent with the literature. We believe that
transfusion of low number of non-leukodepleted RBCs, with a low storage length may reduce the
impact of granulocytes and platelets contamination. In fact, Bilgin et al [14] conducted an elegant
study in a large group of patients and showed that significant abnormalities in cytokine levels were
detected only in patients who had received at least 4 buffy-coat depleted RBC units. Moreover,
another study [16] showed a strong positive correlation between peak pos-operative Il10 values
and mean of storage length of transfused RBC. However, we cannot rule out the intrinsic
characteristics of our transfused group, who showed lower levels of pre-operative hemoglobin and
a slightly longer surgery time, which could lead to higher tissue lesion.
64
There is evidence that blood transfusion might be associated with higher risk of postoperative
infection [4-6, 9], cancer recurrence [1-3] and multiple-organ failure [10, 18] however, there is no
consensus whether leukocyte-containing transfusion induces a proinflammatory effect or
immunossuppression[7, 8]. Allogeneic blood transfusion might initially work as a proinflammatory
sign that induces an anti-inflammatory response as consequence, explaining our findings of higher
levels of IL-6 at the end of surgery and of IL-10 after 6 hours of postoperative period in transfused
group compared with non-transfused. It is interesting to point out that, despite transfused
patientshaving received RBC containing platelets, which release sCD40L during storage[19, 20], a
lower concentration of sCD40L at the end of surgery was detected in these group, compared to
the non-transfused group.
sCD40L is the extracellular domain of CD40 ligand (CD40L or CD154) that is generated via
proteolytic cleavage from the surface of CD40-expressing cells. CD40 is the receptor for CD40L
and is a membrane glycoprotein belonging to the tumor necrosis factor (TNF) superfamily which is
expressed on the surface of immune cells including monocytes, B cells, dendritic cells and
activated T cells as on the surface of non-immune cells such as endothelial cells. [21, 22]CD40L
(or CD154) is mostly expressed by antigen-presenting cells as activated T cells and activated
dendritic cells (DC) or by activated platelets. CD40/CD154 interaction plays a role in the
regulation of humoral and cellular immune response, resulting in the enormous production of
cytokines, however, the crucial mechanism triggering the sCD40L production and its role in the
immune response remains unclear. sCD40L seems to maintain the ability to bind to CD40,
inhibiting the CD40/CD 154 interaction and working as a natural CD40 antagonist[22-24]. Taking
these findings together with our results, we may speculate that at the end of surgery, transfused
patients had a higher inflammatory response due to the interaction between donor antigen-
presenting cells and recipient T cells by CD40/CD154 costimulatory pathway, resulting in higher
consumption of sCD40L and in higher IL-6 release. Conversely, the partial HLA compatibility of
donor and recipient may lead to allograft tolerance, here demonstrated by the presence of short-
term transfusion associated microchimerism, triggering an anti-inflammatory stimulus with higher
IL-10 production and immunossuppression.
In summary, this study shows a higher reduction in sCD40L at the end of surgery of patients
transfused with non-leukodepleted RBCs compared with non-transfused ones. Since platelets
secrete sCD40L during storage [25, 26]), this is an unexpected and interesting result and may
indicate that non-leukodepleted RBC transfusion causes a higher consumption of this soluble
ligant. Moreover, leukocyte-containing RBC transfusion is associated with an early inflammatory
65
response followed by an anti-inflammatory response in trauma surgery patients and the reduction
in sCD40L level, after transfusion, may predict an anti-inflammatory effect.
Acknowledgments; We would like to thank Mrs Tereza Sueko Salles, Mrs Maria Helena Medola
and Dr. João Agostinho Machado-Neto for their important technical teachings. We would also like
to thank Dr Patricia Favaro for her valuable comments and Mrs Raquel Foglio for English review.
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68
Figure and legends:
Figure 1. : The cytokine interleukin (IL)-6, (IL)-10 and soluble (s)CD40L concentrations (pg/ml) in
patients measured preoperatively (pre op), at the end of surgery and after 6 hours. The
comparisons are made between patients who received blood transfusion and patients who did not
receive blood transfusion during surgery. Results are presented as median and 95% confidence
interval.
0 2 6
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
T im e p o in ts
IL6
(p
g/m
L)
N o n -tra n s fu s e d g ro u p
T ra n s fu s e d g ro u p
*
0 2 6
0
5 0
1 0 0
1 5 0
3 0 0
T im e p o in ts
sC
D4
0L
(p
g/m
L)
N o n -tra n s fu s e d g ro u p
T ra n s fu s e d g ro u p
*
0 2 6
0
5
1 0
5 0
1 0 0
1 5 0
T im e p o in ts
IL1
0 (
pg
/mL
)
N o n -tra n s fu s e d g ro u p
T ra n s fu s e d g ro u p*
69
Figure 2. Evidence of transfusion related microchimerism. (A): Amplification plot for sample
collected before transfusion. (B): Amplification plot for sample collected 31 days after transfusion.
The major alleles are DR8 and DR15 (patient’s cells) and the minor allele is DR11 (donor’s cells).
(C): The amplification product of (B) visualized on 4% agarose gel.
A
C
B
70
Table 1
Table 1. Evaluated cytokines
pg/ml
IL-1B 0.26
IL-2 0.37
IL-4 1.73
IL-6 1.61
IL-10 0.19
IL-12p70 0.76
IL-17A 1.73
IL-17F 1.51
IL-21 14.93
IL-22 4.13
IL-23 9.81
IL-25 0.93
IL-31 3.14
IL-33 5.63
IFN-γ 0.79
sCD40L 1.51
TNF-α 1.35
LLOQ = low limit of quantitation
Table 2.
Table 2. Patient characteristcs.
characteristics transfused group (n=15) non-transfused group (n=13) p- Value
age (years) 70 (40-93) 69 (47-89) 0.58a
gender
male 8 (53) 7 (54) 1b
female 7 (47) 6 (46)
weight (Kg) 69 (50-98) 70 (50-101) 0.91a
height (m) 1.67 (1.52-1.80) 1.60 (1.49-1.80) 0.39a
orthopedic surgery
hip arthroplasty 9 (60) 7 (54) 1b
proximal femur fracture 6 (40) 6 (46)
duration of surgery (hours) 4 (2-6,5) 3.5(2.3-5.16) 0.38b
Hb preop (g/dl) 11.8 (8.2-14.9) 12.7 (11-15.6) 0.069b
Data are reported as number (%) or median (range). a Wilcoxon rank sun test b Fisher’s exact test
71
Table 3. Inflammatory Markers measured at three time points: preoperatively (preop), end of surgery and 6 hours postoperatively (6hs).
Non- transf preop end of surgery 6hs preop end of surgery 6hs preop end of surgery 6hs
1 3.05 38.82 567.89 0.18 0.18 2,31 93.14 34.72 30.03
2 21.53 74.38 90.44 1.41 1.27 4,93 4.74 23.35 24.03
3 0.83 2.44 13.03 0.32 6.65 0,92 87.69 36.06 5.57
4 * * * 0.73 5.94 5,6 * * *
5 * * * 0.20 0.18 1,01 * * *
6 7.94 92.45 161.80 0.65 2.63 2,21 47.86 73.32 56.58
7 2.68 4.86 58.43 1.55 1.42 0,89 369.76 184.26 259.72
8 15.74 46.17 599.70 0.26 9.22 13,98 3.31 10.39 10.68
9 4.79 1.98 12.92 0.46 0.24 1 18.44 55.52 19.66
10 1.42 7.8 56.01 0.34 18.76 2,34 114.55 318.68 287.43
11 0.90 4.48 181.26 0.18 0.38 2,35 10.80 8.65 7.44
12 22.81 37.64 75.01 0.78 6.17 4,43 10.68 13.87 13.63
13 0.86 0.33 3.53 1.19 1.24 2,08 235.18 187.58 137.36
median 3.05 (0.83-22.81) 7.80 (0.33-92.45) 75.01 (3.53-599.70) 0.48 (0.18-1.55) 1.42 (0.18-18.76) 2.31 (0.89-13.98) 47.86 (3.31-369-76) 36.06 (8.65-318.68) 24.03 (5.57-287.43)
Transf preop end of surgery 6hs preop end of surgery 6hs preop end of surgery 6hs
1 9.93 * 154.45 1.04 * 5.15 57.25 * 145.07
2 2.81 5.76 14.31 0.27 1.37 6.65 3.53 4.96 22.79
3 3.15 97.89 368.16 0.56 2.62 101.10 61.47 28.33 14.58
4 12.81 80.59 28.90 0.18 1.33 2.47 7.04 0.90 25.39
5 4.66 20.71 37.05 0.47 11.22 1.72 147.15 22.73 26.76
6 46.21 * 209.41 1.13 * 101.39 25.33 * 1.00
7 2.71 267.61 577.44 1.16 29.53 7.70 161.94 51.94 51.54
8 14.85 91.05 420.02 0.46 1.08 7.35 3.58 10.74 22.54
9 17.25 250.86 99.17 0.50 0.79 2.17 10.68 6.14 2.40
10 8.22 18.10 423.59 0.49 0.92 10.13 0 0 0
11 5.35 498.90 421.04 0.61 7.98 3.24 12.27 53.59 27.33
12 1.94 78.12 * 0.18 1.30 * 34.98 8.24 *
13 16.62 11.01 120.12 0.52 0.89 2.42 209.09 30.28 19.60
14 0.80 * 12.31 2.49 * 1.88 54.86 * 527.33
15 4.72 9.50 135.61 2.32 0.99 14.85 162.63 11.38 16.56
median 5.35 (0.80-46.21) 79.36 (5.76-498.90) 145.03 (12.31-577.44) 0.52 (0.18-2.49) 1.31(0.79-29.53) 5.90 (1.72-101.39) 34.98 (0-209.09) 11.06 (0-53.59) 22.66 (0-527.33)
IL-6 IL-10 sCD40L
* = not measured, non-transf = non-transfused group, Transf = transfused group
72
Table 4
Table 4. Characteristics of patient with and without evidence of transfusion related
microchimerism.
characteristics Microchimerism (n=13) No microchimerism (n=2) p- Value
Age (years) 77 (40-89) 72,5 (70-75) 0,80a
male patients 8 (61) 1 (50) 1b
weight (Kg) 69 (50-98) 69,5 (65-74) 1a
height (m) 1,67 (1,52-1,80) 1,57 (1,49-1,65) 0,27a
orthopedic surgery
hip arthroplasty 9 (69) 0 0,14b
proximal femur fracture 4 (31) 2 (100)
duration of surgery (hours) 4.16 (2-6.5) 3.38 (3.25-3.5) 0.20a
Hb preop (g/dl) 12.3 (8.2-14.9) 11.4 (11-11.8) 0.57a
intraoperative transfusion
yes 11 (85) 1 (50) 0.37b
no 2 (15) 1 (50)
Units of PRBCs transfused 3 (1-8) 3 (2-4) 0.86a
time from last transfusion to blood sampling (days) 14 (5-30) 13 (12-14) 0.80a
Data are reported as number (%) or median (range). PRBCs, packed red blood cells. a Wilcoxon rank sun test. b Fisher’s exact test
Table 5
Table 5. Significative correlations between biomarkers of patients with and without transfusion.
Transfused group (n=15) IL-10 preop IL-10 end surg IL-10 posop sCD40L preop sCD40L end surg sCD40L posop
IL-6 preop r = -0.098 r = -0.200
IL-6 end of sutgery r = 0.350 r = 0.434
IL-6 6hs posop r = 0.609* r = -0.231
IL-10 preop r = 0.536*
IL-10 end surg r = 0.469
IL-10 posop r = -0.512
non-transfused group (n=13) IL-10 preop IL-10 end surg IL-10 posop sCD40L preop sCD40L end surg sCD40L posop
IL-6 preop r = 0.251 r = -0.664*
IL-6 end of sutgery r = 0.255 r = -0.291
IL-6 6hs posop r = 0.636* r = -0.264
IL-10 preop r = 0.228
IL-10 end surg r = 0.136
IL-10 posop r = -0.264
Preop = preoperative, end surg = end of surgery, posop = 6 hs of postoperative.
r = Spearman’s rank correlation coefficient . * p< 0,05