Bacitracin ve Trimethoprim-sulphamethoxazole (Bactrim) duyarllk testiAma : A ve B grubu -hemolitik streptokok (BHS)'larn muhtemel tansnda bacitracin ve trimetoprim-sulfametoksazol (SXT)'e duyarllk testi kullanlr. Testin prensibi : BHS trleri bacitracin ve SXT duyarllklarna gre ayrt edilir. Bacitracin gram pozitif bakterilerce retilen bir antibiyotiktir. A grubu BHS'lar (Streptococcus pyogenes) bacitracine duyarl (sensibil) iken dier BHS'lar direnlidir (rezistan). SXT ise sulfametoksazol (23.75 g/disk) ve trimetoprim (1.25 g/disk)'den ibaret bir antimikrobiyal kombinasyonudur. S. pyogenes ve B grubu streptokoklar (S. agalactiae) SXT'ye tipik olarak rezistan iken non A non B grubu BHS'lar duyarldr. Bacitracin ve SXT duyarllk testleri birlikte uygulanrsa A ve B grubu BHS'larn identifikasyon ihtimali artar. Gerekli reajenler : Bacitracin diskleri (0.04 nite) ve SXT diskleri. Bacitracin diskine A diski de denilmektedir. Testin yapl : Bacitracin-SXT duyarllk testi, koyun kanl agar besiyerinin her iki yarsna saf kltr halindeki BHS ekilir. Ekim yaplan besiyerinin bir yarsna 0.04 unitelik Bacitracin diski yerletirilirken dier yarsna SXT diski yerletirilir. Bu kltr, 35-37C'de 18-24 saat inkbe edilir. Bu diskler etrafnda remenin olmad blgeler (inhibisyon zonu) varsa mikroorganizmann o antimikrobiyale duyarl olduu sylenir. Test sonularnn yorumlanmas : Bu iki antimikrobiyal birlikte uygulanarak yaplan duyarllk testi sonular aagdaki ekilde yorumlanr; Bacitracin'eSXT'e Yorum

Duyarl Rezistan Rezistan Duyarl Rezistan Rezistan Duyarl Duyarl A grubu BHS B grubu BHS Non-A, non-B grubu BHS Kural d A grubu BHS

Kalite kontrol : Standart A ve B grubu BHS ekilen koyun kanl agarlara A diski eklenir. Bu disk ile A grubu BHS'larn remesi inhibe olurken B grubunun etkilenmemesi lazmdr. Safrada znrlk testiAma : Safrada znrlk testi Streptococcus pneumoniae'nin ihtimali identifikasyonunu salayan bir testtir. Prensibi : Safra tuzlar, saponin ve dier katyonik deterjanlar gibi yzey aktif ajanlar, bir otolitik enzimi aktive ederek S. pneumoniae' nin yzeyinde deiimlere neden olur. Bu enzim amidaz yapsndadr. Peptidoglikan tabakasndaki muramik asid-alanine ban paralar. Sonuta hcre lize olur. Bu testte safra yerine %2 sodium lauryl sulphate, %10 sodium deoxycholate veya %1 white Dreft kullanlabilir. Sodium deoxycholate, safra asidlerinde bulunan tuzlardan litik zellii en fazla olandr. Bu nedenle safrada znrlk testinde en sk kullanlr. Suda, 6.5 veya daha yksek pH'larda znr, 6.4' altndaki pH'larda solusyonda presipitat oluturur. Prosedr : Bu test iki ekilde yaplabilir; Rapid agar koloni testi : Koyun kanl agarda reyen bir koloni zerine bir ze dolusu %2 sodium deoxycholate eklenir. Bu koloninin yeri plan altndan iaretlenir. Plan agarl taraf stte olacak ekilde 35C'de 30 dk. inkbe edilir. Bu inkbasyon sresi srasnda safrada znen organizmalarn koloni btnl bozulur. Safrada znmeyen organizmalarn kolonileri salam kalr. Konvansiyonel broth kltr testi : Bir tp iine, incelenecek organizmann serum fizyolojik iindeki youn sspansiyonundan 1 ml eklenir. Alternatif olarak, tpe bir gece inkbe edilen Todd-Hewith broth kltrnden 1 ml eklenebilir. Tpe daha sonra 1 damla fenol red solusyonu damlatlr ve 0.1 N NaOH ile pH 7.0'a ayarlanr. Bu karmn reni pembedir. Ntral hale getirilen karmdan 2 tpe 0.5 ml transfer edilir. Bir tpe 0.5 ml %10 sodium deoxycholate konur ve tpn zerine "test" yazarak etiketlenir. Dier bir tpe ise 0.5 ml serum fizyolojik konur ve "kontrol" olarak etiketlenir. Tpler alkalanr ve 35C'de 3 saat inkbe edilir. Safrada znen organizma kapsayan tp, sodium deoxycholate ("test") ile berraklar. Fakat kontrol tp bulank kalr. Organizma safrada znmez ise her iki tp de bulank kalr. Reajenler : 1. NaOH solusyonlar NaOH, 10 N NaOH Distile su 4 gr 10 ml

NaOH, 0.1 N NaOH, 10 N Distile su 1 ml 99 ml

2. Serum fizyolojik : Distile sudaki %0.85 NaCL3. Sodium deoxycholate solusyonlar : Sodium deoxycholate, %10 Sodium deoxycholate Distile su 10 gr 90 ml

Sodium deoxycholate, %2 Sodium deoxycholate, %10 Distile su 1 ml 99 ml

4. Phenol red, % 0.04 Phenol red, % 0.04 Phenol red Distile su 40 mg 100 ml

Optochin'e duyarllk testi Ama : Optochin'e duyarllk testi Streptococcus pneumoniae'nin ihtimali identifikasyonunu salayan bir testtir. Prensibi : Kat disklere (veya P diskine) emdirilmi optochin'e (ethylhydrocuprein hydrochloride) alfa hemolitik streptokoklarla S. pneumoniae' nin ayrdedilmesinde kullanlr. Pnmokoklar (S. pneumoniae ) optokine duyarl iken dier alfa hemolitik streptokoklar rezistandr. Prosedr : zole bir koloninin merkezine bakteriyolojik ine ze batrlr. Koyun kanl agar plana yaylr. Ekim yaplan agar yzeyinin merkezine 5 g optokin kapsayan disklerden bir adet yerletirilir. 35C'de, %5 CO2 de 18-24 saat inkbe edilir. nkbasyondan sonra diskin etrafnda inhibisyon zonu oluup olumad kontrol edilir. Pnmokok olduu dnlen ancak pheli reaksiyon alnan kltrler iin safrada znrlk testi yaplmaldr. Safrada znen trler S. pneumoniae ihtimali var eklinde rapor edilir. Optokin testi sonular aadaki ekilde yorumlanr: Kullanlan disk ap nhibisyon zonu (mm) Yorumu

6 mm.lik14 mm ve zerinde 13 mm ve daha az Zon olumam Duyarl pheli Direnli

10 mm.lik16 mm ve zerinde 15 mm ve daha az Zon olumam Duyarl pheli Direnli

Reajen : 5 g'lk optokin diskiKatalaz (Catalase) testi (Mikobakteri vd. bakteriler iin) Ama : Katalaz testi, katalaz enzimi yapabilen bakterilerin ayrdedilmesinde kullanlan bir testtir. Prensibi : Katalaz, hidrojen peroksidi (H2O2) su (H2O) ve oksijene (O2) ayran enzimlerden biridir. ncelenecek bakteri kolonisi zerine H2O2 damlatarak baloncuk (O2) oluup olumad gzlenir. Baloncuk oluuyorsa test pozitiftir. Yani bakteri katalaz enzimini retmektedir. Bu test eritrosit ieren besiyerlerinde yaplmamaldr. nki eritrositlerde katalaz enzimi bulunmakta ve deney sonunda yanl pozitiflik gzlenmektedir. Deney cam slayt zerinde yaplacaksa mikroorganizma kolonisi besiyerinden para koparmamaya itina edilerek alnmaldr. Katalaz testi, zellikle stafilokok ve streptokok cinslerinin birbirinden ayrt edilmesinde yararldr. Stafilokoklar katalaz enzimi pozitif iken streptokoklar bu enzimi retmez. Mikobakteriler de katalaz testi yaplarak idantifiye edilebilir. Mycobacterium gastri dndaki tm mikobakteriler ve isoniazid'e direnli M. tuberculosis trleri katalaz retmektedir. Katalaz reten mikobakteri trleri, daha sonra retilen enzimin kantitesi ve enzimin 68C'de inaktivasyona direnli olma yetenei ile ayrdedilebilir. retilen enzimin kantitesi, Lwenstein-Jensen (LJ) besiyerinde reyen koloniler zerine H2O2 damlattktan sonra oluan O2 baloncuklarnn tpte meydana getirdikleri ykseklik olarak llmektedir. Bu teste semikantitatif katalaz testi denir. Prosedr : Stafilokok ve streptokok katalaz testi : Kltrde reyen kolonilerden bir tanesi dikkatle alnarak temiz bir cam slayt zerine transfer edilir. zerine bir damla %3'lk H2O2 damlatlr. Hidrojen peroksid damlatldktan hemen sonra baloncuk oluuyorsa deney pozitiftir. Katalaz testi, eri agar zerindeki koloniler zerine 1 damla %3'lk H2O2 damlatlarak ta yaplabilir. Yine kabarck oluumu gzlenir ve kabarck varsa katalaz pozitif denir. Mikobakteriler iin semikantitatif katalaz testi : Bu amala sv kltr kullanlabilecei gibi kltrdeki koloniler direkt olarak ta kullanlabilir. Sv kltr kullanlacaksa, incelenecek organizmann sv kltr hazrlanr. 7 gnden sonra kltr svsndan 0.1 ml alnarak LJ besiyerinin dip ksmna ekilir. LJ besiyeri zerinde oluan kolonileri direkt olarak kullanmak istiyorsak, LJ besiyerinin st ksmndan bir ze dolusu bakteri alnarak, ayn ekilde LJ besiyerinin dip ksmna ekim yaplr. Bu kltr, 35C'de 2 hafta inkbe edilir. nkbasyondan sonra tpe 1 ml Tween-peroxide reajeni eklenir ve oda ssnda 5 dk. bekletilir. Oluan baloncuklarn ykseklii llr. Organizmalar "45 mm'den daha fazla baloncuk oluturan" ve "45 mm'den daha az baloncuk oluturan" olmak zere ikiye ayrlabilir. 68C'de katalaz testi : Birka vidal kapa olan tp alnr. Her tpe 0.67 M fosfat buffer'dan 0.5 ml eklenir. Buffer'l tplere bakteri ekilir. Tpler 68C'lik su banyosunda 20 dk bekletilir. Daha sonra tpler oda ssna kadar soutulur. Tplere 0.5 ml Tween-peroxide eklenir ve tpler yeniden gevek olarak kapatlr. Baloncuk oluup olumad gzlenir. Negatif olarak rapor etmeden nce 20 dk. beklenmelidir. Reajenler : H2O2 , %3'lk : bu sv ticari olarak mevcuttur. Tween-peroxide: Bu reajen test uygulamasndan hemen nce hazrlanmaldr. Eit miktarda Tween 80 solusyonu ile Superoxol (%30 H2O2) kartrlr. 10 ml Tween 80 ile 90 ml distile su kartrlarak %10 Tween 80 hazrlanr. 121C'de 10 dk tutarak steril edilir. Koagulaz (Coagulase) testi Ama : Koagulaz reten Staphylococcus aureus'u dier stafilokok trlerinden ayrt etmek amacyla koagulaz testi kullanlr. Prensip : Staphylococcus aureus trleri iki formda koagulaz retir; Birinci formda, S. aureus'un hcre duvarnda bulunur. Buna bal koagulaz (veya Clumping faktr) ad verilir. Lam testi ile tespit edilir. nki broth kltr filtratlarnda bulunmaz. Bal koagulaz, direkt olarak fibrinojen zerine etki eder ve znmez bir fibrin phts oluur. Stafilokoklar da fibrinojen ile birlikte phtlama olayna katlr. kinci form, mikroorganizma tarafndan redii ortama salnr. Buna ekstraselller koagulaz veya serbest koagulaz ad verilir. Kltr filtratnda bulunur ve tp testi ile tespit edilir. Bal koagulazn aksine, ekstraselller koagulaz koagulaz reakting faktr (CRF) ile reaksiyon verir. Koagulaz-CRF kompleksi ortaya kar. Bu kompleks trombin eklinde etki gsteren bir faktr olumasn salar (Stafilotrombin). Stafilotrombin fibrinojenden insolubl fibrin phts meydana gelmesini katalize eder. Koagulaz, Staphylococcus aureus iin bir virlans markr olarak kullanlr. Koagulaz, stafilokok abselerinin etrafn saran bir fibrin tabakas oluturur. Bylece infeksiyon lokalize olarak kalr ve stafilokoklar fagosite edilemez. Testin yapl : Bal koagulaz iin lam testi : Temiz bir lam zerine bir damla %0.85 fizyolojik tuz eriyii (SF) damlatlr. SF ile, besiyerinde reyen bakteri kolonilerinden ze ile alnan bir veya birka emlsiyon yaplr. Otoagltinasyon meydana gelirse devam edilmez, fakat tp testi yaplmaldr. SF iinde agltinasyon yoksa, emlsiyona bir ze dolusu, nceden dile edilmemi etilendiamin tetra asetik asitle muamele edilmi tavan plazmas eklenir. Beyaz, kar tanesi eklinde fibrin presipitatlarnn oluup olumad kontrol edilir. Presipitat meydana gelirse bal koagulaz retimi ynnden test pozitif denir. Negatif veya ge pozitifleen (20-60 saniye) sonular tp testi ile teyid edilmelidir. Yanl pozitiflikten kanmak iin ayrca bir otoagltinasyon kontrol kullanlmaldr. Tpte koagulaz testi : Steril bir tpe 0.5 ml dile tavan serumu konur. Agar besiyerinde reyen kolonilerden bir ze dolusu veya 0.1 ml broth besiyeri svsndan alnarak tpteki tavan serumu ile kartrlr. 35C'deki su banyosunda veya stcda inkbe edilir. Pht oluup olumad her 30 dk.da kontrol edilerek 4 saat bu ileme devam edilir. Phtlama olursa mikroorganizma koagulaz salglyor demektir. Negatif sonu alnrsa tpler bir gece oda ssnda braklarak ge veya zayf retilen koagulaz tespit edilebilir. Reajenler : Tavan plazmasn hazrlamak iin, retici firmann nerdii ekilde nceden EDTA ile muamele edilen tavan plazmas paketleri sulandrlr. Tp testi iin tavan plazmas 1:4 orannda distile su ile dile edilmelidir. Dile ve dile edilmeyen tavan plazmas 0.5 ml miktarda vidal kapakl tplere konmal ve kullanlaca zamana kadar dondurucuda saklanmaldr. Kalite kontrol : Kontrol organizma olarak Staphylococcus aureus ve S. epidermidis kullanlr. Staphylococcus aureus 35C'de 4 saat inkbe edilince pozitif sonu verirken S. epidermidis ile 4 saat sonunda ve gece boyu oda ssnda brakldktan sonra negatif sonu verir. Ayrca tpteki plazmann uygun reaktivite gsterip gstermediini incelemek iin tplere bir damla %5 kalsiyum klorid damlatlp pht oluumu gzlenmelidir. Oksidaz (Oxidase) testi Ama : Oksidaz testi, sitokrom oksidaz (cytochrome oxidase) enzimine sahip olan bakterilerin ayrdedilmesinde kullanlan bir testtir. Prensip : Aerob bakteriler, respirasyon ve enerji elde etmek iin oksidatif fosforilasyon ileminden yararlanrlar. Bu proses srasnda, sitokromlar (heme kapsayan proteinler) bir enzimatik reaksiyon zinciri oluturur. Sonuta okside olan substrattan elde edilen elektronlar molekler oksijene aktarlr ve son rn olarak su meydana gelir. Memeli ve mantar hcrelerinde, oksijenle reaksiyona giren son sitokrom enzimi, sitokrom c oksidaz iken bakterilerde terminal oksidaz olarak etki eden birka sitokrom vardr. Sitokrom oksidaz sisteminin tespit edilmesinin esas, normalde renksiz ancak okside olunca renkli hale gelen reajenlerin besiyerinde kullanlmas temeline dayanr. Bu amala iki reajen kullanlmaktadr: tetrametil para fenilen diamin dihidroklorid (tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride) veya dimetil para fenilen diamin dihidroklorid (dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride). Bu reajenlerin her ikisi de normalde renksizdir, ancak okside olunca pembe veya mavi-siyah renk alrlar. Oksidaz testinde, filtre kadna reajenle damlatlr. zerine bir ze dolusu incelenecek mikroorganizmann kolonisi yaylr. Bakteri sitokrom oksidaz enzimini retiyorsa, renksiz reajeni oksitleyerek pembe veya mavi-siyah renk verir. Testin yapl : Oksidaz testi iin, steril ieler iinde %1'lik tetrametil para fenilen diamin dihidroklorid (ticarette mevcuttur) solusyonu hazrlanr. Steril-plastik petri plann tabanna filtre kad yerletirilir. zerine reajen damlatlr. Plastik bir ine ze veya tahta stik kullanlarak besiyerindeki kolonilerden biri alnr ve bunlar filtre kadna yaylr. (Nikrom inokle inelerinin kullanlmamas lazmdr. nki bu metalle yanl pozitif sonular alnabilmektedir.). 10 sn iinde mavi-siyah veya pembe renk gelimesi pozitif reaksiyon olarak bildirilir. Bu test, reajenin kanl agar veya ukolatams agardaki koloniler zerine direkt olarak dklmesi eklinde de uygulanabilir. Karbonhidratl besiyerlerinde reyen koloniler zerine reajen dklmesi halinde hatal sonular alnr. nki karbonhidrat fermentasyonu sonunda oluan asidler reajenin sensitivitesini bozar. Reajen emdirilmi filtre kad striptler, diskler veya kk miktarda reajen doldurulmu disposibl cam ampller de piyasada mevcuttur.(General diagnostics, Remel ve Difco laboratuvarlar). Baz Gram pozitif koklar, rn. Micrococcus trleri, dimetil sulfoksid (dimethyl sulfoxide, DMSO) kullanlmamas halinde deiken oksidaz testi sonular verir. DMSO, tetrametil para fenilen diaminin hcre iine penetrasyonunu artrmaktadr. Bu mikroorganizmalarla yaplan oksidaz testi iin reajenin aadaki ekilde hazrlanmas lazmdr: Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 0.5 ml

DMSO100 ml

Kalite kontrol : Dimetilli reajenlerin test edilmesi iin Neisseria lactamica ve E.coli kontrol mikroorganizma olarak kullanlr. Neisseria lactamica pozitif, E.coli ise negatif sonu verir. Tetrametilli reajenlerin test edilmesinde ise Pseudomonas aeruginosa ve E.coli kullanlr. Pseudomonas aeruginosa ile pozitif (mavi-siyah renk) oksidaz testi elde eilirken E.coli ile negatif (renk deimez) oksidaz testi elde edilmelidir. BOYALAR VE BOYAMA METOTLARI Prof. Dr. Mustafa Arda Ankara niversitesi Veteriner FakltesiTemel Mikrobiyoloji 1 01. Genel Bilgiler Bakterinin yaps, iinde redikleri ortamdan, ok az bir refraktif indeksle ayrldndan, laboratuvarlarda genel amalar iin kullanlan k mikroskoplaryla iyi grlmeleri zordur. Bu semitransperent yap, ancak boyanarak ve bulunduklar yerle olan kontrastlar artrlarak daha belirgin hale getirilebilirler. Mikroorganizmalar boyandktan sonra, mikroskopta kolay grlebildikleri gibi, byklk, ekil, spor, kapsl, internal strktrleri hakknda da gerekli bilgiler elde edilebilir. Ayrca, boyanma zelliklerine gre de baz mikroorganizmalar (mikobakteriler gibi) identifiye edilebilirler. Bu nedenle, mikroorganizmalar tanmada, boyama ok nemli role sahiptir. Bunun iin ok zel boyama yntemleri ortaya konulmutur. Gnmzde, mikrobiyoloji alannda doal boyalar (karmin, orsein, indigo, knakna, v.s) ok az kullanlmasna karn, sentetik boyalardan ok daha fazla yararlanlmaktadr. lk sentetik boya, anilinden elde edildii iin btn sentetik boyalara anilin boyalar ad verilmitir. Ancak, bunlarn ou anilinden elde edilmedii gibi, anilinle de ilikili deildirler. Boyalar, genellikle, katran distilasyon rn olup benzen derivatlardrlar. Benzen halkasnda bulunan hidrojen atomlar yerine baz element veya radikallerin girmesiyle eitli birleikler meydana gelir. rn, bir hidrojen atomu yerine hidroksil (OH) grubu girerse fenol (karbolik asit) oluur. Dier hidrojen atomu yerine de metil grubu girerse kresol teekkl eder. Hidrojen atomlarnn yerine metil grubun girmesine gre orto-meta ve para kresol meydana gelir. Boyalarn ou organik bileiklerden olup benzen halkas ile birlemi kromofor ve okzokrom gruplarn ierirler. Kromofor grubu ihtiva eden benzen halkasna kromogen halkas denir. Kromogen grubu, birleie boya zellii verir. Ancak, byle birleik renkli olmasna karn henz boya karakterine deildir. nk, bu boyann doku veya lifle balanma yetenei yoktur. Oluan renk mekanik yoldan kolayca giderilebilir. Gerek boya haline geebilmesi iin kromofor grubu yan sra, dier gruplar da (okzokrom) ihtiva etmesi gereklidir. Bunlar bileie elektrolitik dissosiasyon zellii kazandrarak, bileikle tuz oluumunu salar ve kromofor grubunun daha etkili olmasna yardm eder. rn, nitro (NO2) grubu kromofordur. Benzen halkasndaki 3 hidrojen atomu yerine NO2 grubu girerse tirinitro benzen oluur. Sar renkli bir kimyasal birleik olan bu madde henz boya deildir ve elektriksel olarak disosiye olmaz. Ancak, benzen halkasndaki dier hidrojen atomu yerine bir okzokrom grubu (OH gibi) girerse birleik boya haline dnr (pikrik asit) ve boyama kabiliyetini kazanr. Okzokrom grubu, ayn zamanda boyann daha koyu boyanmasn salad gibi boyanacak cisimle tuz tekiline de sebep olur. Boyalarn bileiminde bulunan baz nemli kromofor ve okzokrom gruplar yledir.Kromofor gruplar Okzokrom gruplar

Azo- NR2

Nitrozo- NHR

Azoksi - NH2

Thiocaronyl- OH

Nitro- OCH3

minoI

KarbonilBr

EthenylCl

Boyalar, boya moleklnn elektrik yklerine gre, asit, bazik ve ntr olarak blme ayrlr; Asit Boyalar yonize olduklar zaman, molekln porsiyonu negatif elektrikle yklenir. Bunlar da renkli asitlerin tuzlardr (genellikle, sodyum tuzu). Bazen potasyum, kalsiyum veya amonyum tuzlar olabilir. Asit boyalar arasnda, asit fuchsin, safranin, asit pikrik, eosin, v.s bulunmaktadr. Bazik Boyalar yonize olduklar zaman, molekln boya ksm pozitif elektrikle yklenir. Bunlar da renkli bazlarn tuzlardr (genellikle, klorid benzen sulfat, okzalat ve asetat). Bazik boyalardan, metilen mavisi, Jansiyana violet, bazik fuchsin ok kullanlr. Ntr Boyalar Asit ve baz boyalarn uygun oranda karmlarndan elde edilir (Giemsa, Wright, Leishman vs). Bakterilerde asit yapda olan organizasyonlar (zellikle, nkleer sistemi ) ve moleklleri boyamada bazik boyalardan fazla yararlanln. Asit boyalar da sitoplasmay boyamada kullanlr. Boyalar ierdikleri kromoforik gruplara gre snflara ayrrlar. Bunlarn balcalar yledir, Nitro Boyalar Bu tr boyalarda kromofor grubunu, NO2 radikali oluturur ve asit karakterdedirler (pikrik asit, aurantia, martius sars). Azo Boyalar Azo boyalar balca iki ksma ayrlrlar. I- Monoazo boyalar: Bu tr boyalarda, kromofor grubu azo (-N=N- ) ba ile benzen halkasna balanmtr ve asit karakterdedirler. Halkaya, OH grubunun katlmas asit ve NH2 grubunun ilavesi de bazik karakter yaratr (bordo krmzs, brillnat sars-S, krisoidin -Y, fast sars, janus yeili-B, metil oranj, metil krmzs, oranj-G, oranj -II, Sudan-R, Sudan-II ) 2- Diazo ve poliazo boyalar: Moleklde birden fazla azo grubunun bulunmas sonu bu tr boyalar meydana gelirler (azo mavisi, biebrich scarlat, bismark braun-Y, brillant purpurin-R, klorazol siyah-E, kongo krmzs, evans mavisi, sudan siyah -B, sudan krmzs -7B, tripan mavisi, vital krmzs) Antrakinon Boyalar Antrakinon boyalar, anthracen'in oksidasyonu sonu oluurlar ve anthracen derivatlardr (alizarin krmzs-S, purpurin) Tiazol Boyalar Bu grup boyalarda thiazol halkas vardr ve indamine grubu da kromofordur (geranin-G, primulin, titan sars-G, thioflavin-S). Kuinonimin Boyalar Bu tr boyalarda 2 kromofor (indamin ve quinonoid halkas) grubu bulunur. Bu grupta: 1. ndamin boyalar: ndamin'in metile olmu aminoderivatlar olup biyolojik neme sahip deildirler.2. ndofenol boyalar: ndofenoller, indaminlere yakn zelliktedirler (indofenol, indofenol mavisi).3. Tiazin boyalar: Tiazin boyalar, slfr atomuna veya nitrogenlerin biri ile birlemi fenil ve quinanoid halkasna sahiptirler (azur -A, azur -B, metilen azur, meliten mavisi, metilen yeili, metilen violet, thionin, toluidin mavisi-O).4. Oksazin boyalar: Bu boyalarda, tihazin'in slfr, oksijen atomu ile yer deitirmitir (birillant-kresil mavisi, kresil violet asetat, gallocyanin, new bleu -R, nil blue sulfat, resazurin).5. Azin boyalar: Bunlar fenazin derivatlar olup 2 tane benzen veya bir benzen ve bir quinonid halkasna sahiptirler. Aminoazinler (neutral red, neutral violet), safrainler (emethyst violet, azokarmin - G, fenosafranin, safranin -O), indulinler (nigrosin). Fenilmetan Boyalar Bakteriyolojide ok kullanlan boyalar bu grupta bulunur. Bileiminde bulunan metann hidrojen atomlarndan biri veya bir ka yerine metil, etil veya fenil gruplar girer. Eer 3 hidrojen atomu yerine etil grubu girerse, trietil metan, eer 2 hidrojen yerine fenil girerse, difenil metan ve 3 hidrojen yerine fenil grubu girerse, trifenil metan boyalar meydana gelir. 1. Diamino trifenil metan boyalar: Kuvvetli bazik karakterde boyalardr (brillant yeili, fast green FCF, light green-SF).2. Triamino trifenil metan boyalar: Bu boyalar da kuvvetilce bazik ve bazlar da asit karakterdedir (asit fuchsin, anilin mavisi, bazik fchsin, kristal violet, etil green, etil violet, hofmann violet, metil mavisi). 3. Hidroksi trifenil metan boyalar: Bu boyalar genellikle asit karakterde olup indikatr olarak kullanlr (resolik asit)4. Difenil - naftil metan boyalar: Bunlar difenil metan boyalarnn naftil derivatlardr (victoria mavisi -B, victoria mavisi -R, night blue, woolgreen-S). Ksanten Boyalar Bu boyalar xanthene derivatlar olup bir ksm asit ve bir ksm da bazik karakterdedirler. Genellikle indikatr olarak kullanlr. Bu grupta: 1. Pironin boyalar: Bunlar xanthene'nin metile olmu diamino derivatlardr (pyonine -B, pyronine -Y).2. Rodamin boyalar: Pyroninlere benzeyen bu boyalar 2 amino grup ihtiva etmeleri nedeniyle baziktirler (fast asit blue-R, rhodamine-B).3. Fluoran boyalar: Bunlar fluorane derivatlardr (eosin -B, eosin -Y, etil eosin, eritrosine (mavimsi), eritrosine (sarms), fluorescein, merchurochrom 220, phloxine -B, rose bengal).4. Fenolftalein ve sulfoneftalein boyalar: Bu grupta: bromoklorfenol mavisi, bromokresol yeili, bromokreosol purpul, boromo fenolmavisi, bromo fenol krmzs, bromotimol mavisi, klorokresol yeili, klorofenol krmzs, kresolftalein, kresol krmzs, meta kresol purpul, fenolftalein, fenol red, timol mavisi bulunur. Doal Boyalar Doal boyalar bakteriyolojinin ilk zamanlarnda fazla kullanlrd. Bu gn yerini sentetik boyalara brakmtr. Ancak, birka tanesi hala kullanlmaktadr. Balcalar: 1. ndigo: ndigofera cinsi bitki trleri, indican, denen glukozid ihtiva ederler. Bunun fermentasyonu sonu indigo oluur.2. ndigo - karmin: Bu boya indigo desulfonik asitin sodium tuzudur. Asit karakterli olup mavi renklidir.3. Cochineal: Dii insekt Coccus cacti'nin ezilmi ve kurutulmu tozudur.4. Karmin: Cochineal'ien alum veya dier metal tuzlar ile muamelesinden elde edilir. Nukleus boyas olarak nemlidir.5. Orcein: Lecanora tinctoria ve Rocella tinctoria tr likenlerden elde edilir. Bunlar renksiz ve kristal fenolik bileikler ihtiva ederler. Bunlardan biri orcinol olup orceine evrilir. Bu, violet - renkli bileiktir ve hafif asittir.6. Litmus: Bu madde, ayni orcein gibi, baz likenlerin soda veya kire kayma ile ve sonradan da ammonia ve hava ile muamelesi sonunda elde edilir. Litmus'un esas maddesi azolitmin'dir.7.Brazilin: Bu madde brazil aac kabuu ekstraktndan elde edilir. lk elde edildiinde renksiz ve sonra da okside olunca krmz renk alr. 8. Hematoxylin: Gney Amerika 'da yetien legume tr bitkiden elde edilir. Aacn, su ile ekstraksiyonu sonucu meydana gelir ve hava ile temasta hemateine dnr. 02. Boyama Teorileri Boyamay izah iin genellikle, fiziksel ve kimyasal temele dayal grler ileri srlmtr. Ancak bu gnk bilgilere gre, boyama, ne tam fiziksel ne de tam kimyasal bir karaktere sahiptir. Bunlarn her ikisinin de kombinasyonudur. Fiziksel gr: Bu teoriye gre, boyanma reaksiyonu, kapillarite, ozmosis, adsorbsiyon ve absorbsiyon olaylarna dayanr. Boya ile madde arasnda bir bileik gelimeden meydana gelen reaksiyon, bu grn esasn oluturur. Bu nedenle, bakteri, solventler iine braklrsa veya bunlarla muamele edilirse boya tekrar ekstre edilebilir. Kimyasal gr: Hcre iinde bulunan asit ve bazik karakterdeki yaplarn, bazik veya asit boyalarla birleme yetenekleri bulunmaktadr. Bylece boyanma, asit ve bazik skrktrlerle oluan karlkl kimyasal ilikilere dayanmaktadr. 03. Boyama Yntemleri Mikroorganizmalar iyi grebilmek ve ayrntlarn tetkik edebilmek iin bir ok genel ve zel boyama yntemleri ortaya konulmutur. gerektiinde, bunlardan en uygunu seilerek kullanlr. Mikrobiyolojide kullanlan boyama yntemlerini balca 2 gruba ayrmak mmkndr. 1. Basit boyamalar: Bu tarz boyamada, preparatlardaki mikroorganizmalar hakknda ksa sre iinde bilgi edinmek iin tek boya solusyonu kullanlr. Boya, preparata bir defa uygulanr ve bakteriler boyalarn karakterine gre boyanrlar. Bu amala karbol fchsin, kristal violet ve metilen mavisi gibi genellikle bazik boya solusyonlarndan birisi seilir. 2. Bileik boyamalar: Birden fazla boyann itiraki ile yaplan boyama yntemleridir. Bunlar arasnda: a) Diferensiyel boyamalar: Mikroorganizmalar birbirinden ayrmada kullanlr (Gram, Ziehl-Neelsen).b) Strktrel boyamalar: Bakterilerin i ve d yaplar hakknda bilgi edinmek iin kullanlan bileik boyama yntemleridir (spor, kapsl, flagella, ekirdek, lipid, v.s.). 03.01. Basit Boyama Yntemleri 03.01.01. Karbol Fchsin ile Boyama Usulne gre hazrlanm, kurutulmu ve fikse edilmi preparatlar zerine, karbol fchsin solusyonu, filtre kadndan szlerek konur ve 5-10 saniye boyama iin brakldktan sonra, boya dklr ve hafif akan su ile ykanr. Kurutma kad ile (veya havada) kurutulduktan sonra, zerine sedir ya konarak immersiyon objektifi ile baklr. Mikroorganizmalar krmz renkte grlrler. 03.01.02. Kristal Violet ile Boyama Hazrlanan preparat zerine boya solusyonundan (kristal violet) konarak 20-30 saniye kadar bekletilir. Srenin sonunda boya dklr, preparat su ile ykanr, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir. Mikroorganizmalar mor renkte grlrler. 03.01.03. Metilen Mavisi ile Boyama Bu amala Lffler metilen mavisi solusyonu kullanlr. Preparat zerine boya solusyonu konarak 5-8 dakika bekletilir. Boya dklr, ykanr, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir. Mikroplar mavi renkte grlrler. 03.01.04. Negatif Boyama Bu tr boyama ynteminde mikroorganizmalar deil, saha boyanr. Karanlk olan sahada mikroplar renksiz veya parlak olarak grlrler. Bu ama iin nigrosin veya in mrekkebi kullanlr. Lam zerine bir damla boya ve sonra bir damla kltr konarak yaylr ve ince bir froti hazrlanr. Kuruduktan sonra muayene edilir. Bu yntemden kapsl ve spiroketleri grmek iin yararlanlr. 03.02. Bileik Boyamalar 03.02.01. Gram Boyama Teknii Gram teknii, mikrobiyolojide ok kullanlan bir boyama yntemi olup mikroorganizmalarn klasifikasyonunda ve identifikasyonunda da yararlanlr. Bu gn uygulanan teknik, ilk kullanlan Gram (1884) boyasndan biraz deiik ekildedir. Fakat hepsinde de esas ayn kalmaktadr. Laboratuvarda en fazla uygulanan Gram boyama yntemi yledir: a) Preparat hazrlanr, kurutulur ve tespit edilirb) Kristal violet (veya metil violet) solusyonu ile 2-3 dakika boyanr.c) Boya dklr ve preparat zerine lugol solusyonu konarak 1-2 dakika beklenir. Lugol solusyonu dklr.d) Absolut alkolde dekolere edilir (alkol renksiz akncaya dek).e) Su ile ykanr.f) Safranin (veya eosin, sulu fuchsin) ile 5-10 saniye boyanr.g) Su ile ykanarak boya giderilir.h) Kurutma kadnda (veya havada) kurutulur.i) Sedir ya konarak immersiyon objektifi ile muayene edilir.Bu yntemle mor grlen mikroorganizmalar Gram pozitif ve pembe grlenler de Gram negatif olarak deerlendirilirler. Gen kltrlerde bulunan mikroplar, genellikle, kuvvetli Gram pozitif grlmelerine ramen, eski kltrlerde Gram negatiflie doru bir eilim vardr. Gram pozitiflik ve negatiflik zerine birok grler ileri srlmtr. 1. Gram pozitif mikroorganizmalar, negatiflerden daha dk pH limitlerine sahiptirler. Bu nedenle de bazik boyalara kar affiniteleri fazladr.a) Asit boya ile Gram pozitif grlen mikroplar, boyann alkalinitesi artrlrsa Gram negatif olabilirler.b) Bazik boya ile Gram pozitif grlen mikroplar, boyann asiditesi artrlrsa Gram negatif olabilirler.2. Gram pozitiflerden elde edilen lipoidal maddelerin zellii, Gram negatiflerinkinden farkldr. Birincide sature olmam ya asitleri daha fazladr ve ayni zamanda oksidan maddelere olan ilikisi de yksektir. Kullanlan mordanlarn oksidan olmas, bazik boyalara kar affiniteyi artrr.3. Gram pozitif mikroplarn hcre duvar pepitidoglikan yapsnda olup miktarca ok fazladr. Bu strktr Gram negatiflerde ise ok azdr. Bu tabakann giderilmesi, Gram pozitif mikroplar, Gram negatif hale sokar. Gram pozitiflerde ayni zamanda Magnesium ribonukleate'da fazla bulunur. Bu madde negatiflerde yoktur.4. Alkolle dekolorasyonun gereinden fazla yaplmas Gram negatiflie eilimi artrr.5. Gram pozitiflerde hcre duvarnda teikoik asit vardr. 03.02.02. Asidorezistans Etkenleri Boyama Teknii Tuberkloz etkenleri boyamak iin nceleri kullanlan Ehrlich (1882) metodu sonradan Ziehl-Neelsen tarafndan deitirilmitir. Mikroorganizmalarn etrafnda balmumu tabakasnn bulunmas, bunlarn normal boyama yntemleri ile boyama olanan ortadan kaldrmaktadr. Bu nedenle boya iine fenol konur ve alttan hafife stlarak balmumu tabakas yumuatlr. Bylece boyay kolayca alan balmumu tabakas, asit-alkolde dekolore olmaz ve boyay brakmaz. 1. Ehrlich-Ziehl - Neelsen (EZN) Mikobakterileri boyama yntemia) Preparat hazrlanr, kurutulur ve tespit edilir.b) Lam zerine ve btn lm kaplayacak tarzda karbol fchsin solusyonu konur.c) Preparat alttan 4-5 dakika ve aralkl olarak hafife stlr. Preparatn yanmamasna ve kabarcklarn kmamasna dikkat edilir (preparat zerinden hafif buharlar kabilir).d).Boya dklr ve preparat asit-alkolde (% 95 alkol + % 3 HCI asit) dekolore edilir.e) Su ile ykanr.f) Preparat zerine metilen mavisi solusyonu konur ve 10-15 saniye boyanr.g) Boya dklr ve su ile ykanr.h) Kurutulur ve immersiyonla muayene edilir. Mikobakteriler veya asidorezistens mikroorganizmalar pembe krmz renkte ve dier mikroplar ise mavi renkte grlrler.Modifiye Ziehl - Neelsen yntemi (Stamp boyamas), brucella ve chlamydia etkenlerini boyamada da kullanlabilir. 2. Konrich mikobakteri boyama yntemia) Preparat hazrlanr, kurutulur ve tespit edilir. b) Preparat zerine karbol fchsin konur ve alttan 4-5 dakika hafife stlarak boyanr.c) Boya dklr ve % 10 sodyum slfitle renksiz oluncaya dek dekolore edilir.d) Su ile ykanr ve % 1 malait yeili ile 15-20 saniye boyanr.e) Su ile ykanr, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir.Mikrobakteriler krmz renkte ve dier etkenler yeil renkte boyanrlar. 3. Mikobakterilerin fluorokrom (auramin-O) ile boyanmasBu yntemle auramin-O solusyonu karbol fchsin yerine kullanlr.a) Preparat hazrlanr, kurutulur ve tespit edilir.b) Auramin-O solusyonu ile 15 dakika boyanr.c) Su ile ykanr ve asit - alkolde (alkol % 75'lik + 0.5 NaCL + % 0.5 HC1) dekolore edilir (5 dakika).d) Su ile yaknr ve KMnO4 (1/1000) solusyonu onarak 30 saniye beklenir.e) Su ile ykanr, havada kurutulur ve immersiyonla muayene edilir. Tuberkloz etkenleri sar-parltl olarak grlr. 03.02.03. Spor Boyama Spor oluturan mikroorganizmalarda, vegetatif hcre normal boyalarla boyanmasna karn, sporun etrafnda kaln muhafazalarn bulunmas ve bunlarn geirgen olmamas boyanmalarn imkanszlatrr. Spor boyamak iin balca iki metot bulunmaktadr. 1. Zeihl-Neelsen Tb. boyama yntemi ve 2. Malait yeili ile boyama teknii. Bu son yntemde: a) Preparat hazrlanr, kurutulur ve tespit edilir.b) Malait yeili (% 5) solusyonu ile, alttan stlarak, 5 dakika boyanr.c)Su ile ykanr. Safranin (%0,5) veya fchsin'le 30 saniye boyanr.d) Su ile ykanr, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir.Sporlar yeil ve basiller ise krmz renkte grlrler. 03.02.04. Kapsl Boyama Bakterilerde kapslleri gstermek olduka nemli bir sorun olarak grlmektedir. Kurutarak ve tespit ederek uygulanan kapsl boyama yntemlerinde, genellikle, kapsller bzlmekte ve iyice seilememektedirler. Bu bakmdan natif preparat muayeneleri yapmak daha uygundur. Bu amala negatif boyama yntemleri kullanlabilir. ok temiz ve yasz bir lam zerine bir ze dolusu nigrosin veya in mrekkebi konur ve kat kltr besi yerinden alnan koloni ile suspansiyon yaplr veya sv kltrden bir ze dolusu konarak boya solusyonu ile kartrlr ve zerine lamel kapatlr. Karanlk saha mikroskobunda mikroplar ve etrafndaki kapsl ak renkte grlr. Bu yntemle D. pneumoniae, K. pneumoniae muayene edilebilir. Baz hallerde boyann kendisi kapsll saprofitik mikroplarla kontamine olabilir. Bundan ileri gelecek hatay nlemek iin, boya kullanlmadan nce, tek olarak kontrol edilmelidir. Yukarda bildirilen ve kurutulmadan yaplan lam-lamel aras muayene dnda, preparatlar kurutularak da incelenebilir. a) Temiz bir lm zerine % 6 glukoz solusyonundan konur ve mikroorganizma (veya kltr) ile kartrlr.b) Bu karma bir damla nigrosin (veya in mrekkebi) ilave edilerek homojen bir hale getirilir.c) Dier bir lmn dzgn ksa kenar ile ince bir tabaka halinde yaylr ve havada kurutulur.d) Metil alkolle tesbit edilir.e) zerine metil violet solusyonu konur ve 2 dakika bekletilir.f) Su ile ykanr, kurutulur ve immersiyonla baklr.Bunlarn dnda, Giemsa ve dier boyama tekniklerinden de yararlanlabilir. 03.02.05. Flagella Boyama Flagella ok kk ve ince olmas nedeniyle en iyi elektron mikroskopla ortaya konabilir. Ancak, zel olarak boyanmak suretiyle k mikroskobu ile de grlebilecek hale getirilebilir. Bu ama iin, flagella zerine boya biriktirilerek takriben 10 misli kadar kalnlatrlr ve kolay grnmesi salanr. Flagella iin en uygun yntem modifiye Leifson veya Kodaka tekniidir. Birinci yntem iin: a) ok temiz, yasz ve przsz 4-5 lam zerine nce kalemle alttan halka eklinde birer daire izilir.b) Bu dairelerin iine, formolle inaktivie edilmi ve santrifjle 2 defa ykanarak konsantre edilmi mikrop suspansiyonundan bir ze dolusu konur (suspansiyon iin distile su kullanlr ve en son suspansiyon Brown-1 opasitesinde hazrlanr).c) Bu suspansiyonlarn zerine, zel olarak hazrlanm tannik asitli basik fuchsin'den 1'er ml. konur ve 6,8,10,12 ve 15 dakika sreyle boyama yaplr.d) Boya solusyonu ok hafif akan su ile ykanarak giderilir.e) Metilen mavisi ile 30 dakika boyanr.f) Ykanr, kurutulur ve immersiyonla baklr. yi bir grnt iin bazik fuchsin'le olan boyama sreleri ayarlanabilir. 03.02.06. Lipid Boyama Hcre iindeki lipidleri boyamada, genellikle, sudan siyah kullanlr (Burdon metodu). a) Preparat hazrlanr, kurutulur ve tespit edilir.b) Preparat zerine sudan siyah solusyondan konarak 15 dakikada boyanr.c) Boya dklr ve havada kurutulur.d) Ksilol iinde ykanr ve tekrar kurutulur.e) Safrann (% 0,5 veya sulu fuchsin'le 5-10 saniye boyanr.f) Boya dklr su ile ykanr kurutulur ve immersiyonla baklr.Mikroskop altnda lipid granlleri mavi-siyah veya mavi-gri renkte grlrler. Bakteri protoplasmas ise pembe boyanr. 03.02.07. Polisakkarid Boyama Bakteri ve mantar hcreleri iindeki polisakkarid granlleri, genellikle periodik asit schiff (PAS) ile boyanrlar. Polisakkaridler, periodat vastasyla okside olarak polialdehid haline evrilir. Bu da Schiff'in fchsin-slfit'i ile krmz renk verir. Protein ve nukleik asitler boyanmazlar. Bu boyadan, ayn zamanda, doku iindeki mantar elementlerini gstermede yararlanlr. Polisakkarid boyamada Hotchkiss yntemi genellikle fazla kullanlmaktadr. Buna gre: a) Preparat hazrlanr, kurutulur ve alevde tespit edilir (kesitler iin genel fikzatiflerden yararlanlr ve etil alkol (% 70) iinde ykanr).b) Preparat periodat solusyonu ile 5 dakika muamele edilir ve sonra alkolle (% 70) ykanr.c) Redktan solusyonla 5 dakika muamele edilir ve tekrar alkolde (% 70) ykanr.d) Fuchsin-sulfitle 15-45 dakika boyanr.e) Slfit ykama solusyonu ile 2-3 defa ykanr.f) Sulu malait yeili (% 0.002) ile boyanr.g) Su ile ykanr, kurutulur ve genel metotlara gre baklr. 03.02.08. Nukleer Materyalin Boyanmas Bakterilerdeki nukleer materyali boyamada veya bu sistemi gstermede baz yntemler uygulanmaktadr. Bunlar arasnda en yaygn olan Robinow tekniidir. a) remi kolonileri havi agar bloku kolonili yz ste gelmek zere metil alkol iine 5 dakika braklr.b) Blok karlr ve havada kurutulur.c) Blok tersine dndrlerek temiz bir lamel zerine konur.d) Agar blok kaldrr.e) Lamel zerine yapan mikroorganizmalar havada kurutulur ve lk alkol-merkri-klorid (Schaudin solusyonu) solusyonuna 5 dakika sre ile braklr.f) Suda ykanr ve % 70 alkolde braklr.g) Alkolden karlr ve 60 C de 1 N HCl iinde 10 dakika mddetle tutulur.h) nce eme suyunda ve sonra da distile suda ykanr.i) Sonra, bufferli Giemsa (pH 7) solusyonunuda 37 C de 30 dakika boyanr.j) Suda ykanr, kurutulur ve mikroskopla muayene edilir. 03.02.09. Hcre Duvar Boyama Bakterilerin hcre duvarn boyamada aadaki yntem fazla kullanlmaktadr. a) Bakterilerden yukarda bildirildii gibi impresyon preparat hazrlanr (lm zerinde).b) Bouvin solusyonu ile fikse edilir.c) Sonra, % 5-10'luk tannik asitle 20-30 dakika muamele edilir.d) Kristal violet (% 0,02) ile 1 dakika boyanr.e) Su ile ykanr, kurutulur ve immersiyonla baklr. 03.02.10. Spiroketa Boyanmas Spiroketalar boyamada, Fontana, modifiye Becker ve Levaditi yntemleri kullanlr. 1. Fontana Metodu:a) Preparat, her biri 30 saniye olmak zere, 3 defa fiksatifle muamele edilir.b) Alkolde 3 dakika ykanarak fiksatif giderilir.c) Alkolden karlr, szlr ve alkol giderilir.d) zerine mordan konur ve 30 saniye alttan hafife stlr.e) Distile su ile ykanr ve kurutulur.f) Preparat zerine amonyakl gm nitrat konarak 30 saniye alttan stlr (preparat esmer oluncaya kadar).g) Distile su ile ykanr, kurutulur ve Kanada balsamna yatrlr. Spiroketler esmer-siyah renkte ve mikroskop sahas esmer sar renkte grlr. 2. Modifiye Becker metodu:a) Preparat hazrlanr kurutulur.b) Fikzatif iinde 1-3 dakika braklr.c) Suda 3 saniye ykanr.d) Mordanla 3-5 dakika muamele edilir.e) Suda 30 saniye ykanr.f) Boya solusyonu (basik fuchsinli) ile 3-5 dakika boyanr.g) Suda ykanr ve kurutulur. 03.02.11. Mantar Boyama Mantar ynnden muayene, ya direk veya doku kesitlerinde mantar elementleri gstermek eklinde uygulanr. 1. Direk muayene (Laktofenol pamuk mavisi ile):a) Lam zerine bir damla alkol konur.b) zerine ine ile alnm mantar elementi konur ve yaylr.c) Alkoln umas beklenir.d) Bir damla boya solusyonu (laktofenol pamuk mavisi) konur ve ze ile hafife yaylr.e) zerine lamel kapatlr ve hafife bastrlr ve yaylma salanr.f) Boyann etkilemesi iin 10 dakika beklenir ve mikroskop altnda muayene edilir. 2. Doku kesitlerinde mantar boyama:a) Kesitler distile suya braklr.b) Taze hazrlanm % 1'lik periodik asit solusyonu ile 5 dakika muamele edilir.c) Hafif akan suda 15 dakika ykanr ve distile suda alkalanr.r) Funchsin slfit ile 15 dakika boyanr.e) Hafif akan suda 5 dakika ykanr ve distile suda hafife alkalanr.f) Sulu malait yeili ile (veya % 0.1 light green ile) bir dakika boyanr.g) Alkol iinde dehidre edilir, benzolde berraklatrlr ve Kanada balzamna yatrlr. 03.02.12. Riketsiya Boyama Riketsiyalar boyamada Castenada ve Macchiavello boyama yntemleri genellikle kullanlr. 1. Castenada metodu:a) Preparat hazrlanr, kurutulur ve 10 N HCl asit iinde 2 dakika fikse edilir.b) Distile suda ykanarak asit giderilir.c) Formaldehid buffer iinde 1/10 sulandrlm azur II ile 20 dakika boyanr.d) Distile su ile iyice ykanr.e) Safrann (% 0.25) ile 6-8 saniye boyanr.f) Su ile yaknr, kurutulur.Riketsialar mavi, protoplasma ve nukleus ise krmz renkte grlr. 2. Macchiavello metodu:a) Preparat hazrlanr ve havada kurutulur.b) ve pH. 7.2 - 7.4 olan distile su iinde hazrlanm % 0.25 bazik fuchsin ile hafife stlarak 4 dakika boyanr.c) Boya hemen % 0.5 sitrik asitle ykanarak giderilir.d) Su ile ykanr.e) Metilen mavisi (% 1) ile birka saniye boyanr.f) Su ile ykanr, kurutulur ve immersiyonla baklr. Riketsialar krmz ve dokular mavi grlr. 03.02.13. Klamidia Boyama Klamidia'lar Giemsa, Castenada, Macchiavello boyama yntemleriyle grlebilir. Ayrca, Stamp boyama teknii de uygulanabilir. Bu son teknik: a) Preparat hazrlanr, kurutulur ve tespit edilir.b) Karbol fchsin (1/10) ile 10 dakika boyanr.c) Asetik asit (% 0.5) ile ykanarak boya giderilir.d) Su ile ykanr. e) Malait yeili (% 1) ile birka saniye boyanr.Klamidia'lar krmz renkte ve noktacklar halinde (tek tek veya kmeler) grlr. 04. Boya Solusyonlar 04.01. Metilen Mavisi 1. Stok solusyon : Metilen mavisi 1.5 g ; alkol (% 95) 100 cc. Metilen mavisi bir havana konur, zerine konan azar miktarlardaki alkolde ezilerek eritilir. Bir ieye alnan boya solusyonu, 4-5 saat alkalanr ve 24 saat bekletildikten sonra filtre kadndan szlr ve ielerde saklanr. 2. Kullanma solusyonu (Lffler) : Metilen mavisi (stok) solusyon 33 cc ; distile su (% 0.01 KOH 'li) 100 cc. nce distile su iine % 0.01 orannda KOH konur ve kartrlr, sonra da 30 cc stok metilen mavisi solusyonu katlr ve iyice kartrlr. Bir gn bekletildikten sonra filtre kadndan szlerek cam kapakl ielerde muhafaza edilir. 04.02. Jansiyana Moru 1. Stok solusyon : Jansiyana moru 5 g ; alkol ( % 95) 100 cc. Bir havana konulan jansiyana moruna azar azar alkol ilave edilerek ezilir ve erimesi salanr. Buradan bir ieye konarak 4-5 saat alkalanr ve 24 saat bekletildikten sonra filtre kadndan szlr ve cam kapakl ielerde saklanr. 2. Kullanma solusyonu (karboll) : Jansiyana moru (stok) solusyon 10 cc ; distile su (% 1 asit fenikli) 100 cc. nce fenol distile suda eritilir ve sonra boya ilave edilir. yice kartrldktan sonra 24 saat bekletilir ve szlr, cam kapakl ielerde saklanr. 04.03. Fksin Boyas 1. Stok solusyon : Bazik fuksin 3 g ; alkol (% 95) 100 cc. Bazik fuksin havanda alkolle ezilip eritildikten sonra bir ie ierisinde 4-5 saat alkalanr ve 24 saat bekletildikten sonra filtre kadndan szlr ve cam kapakl ielerde saklanr. 2. Kullanma solusyonu (karbol fuksin) : Bazik fchsin (stok sol.) 10 cc ; distile su ( % 5 fenollu) 100 cc. Ayn dierleri gibi hazrlanr veya hep birlikte hazrlanabilir (Ziehl-Neelsen). Bazik fchsin 10 g ; alkol 100 cc ; distile su (% 5 fenoll) 1000 cc. Bazik fuksin havanda alkolle ezildikten ve fenoll suyun yars ilave edilip kartrldktan sonra bir ieye aktarlr. Geriye kalan su tekrar havana konup iyice ykandktan sonra ieye alnr. 24 saat bekletildikten sonra filtre kadndan szlr ve ielerde muhafaza edilir. Sulu fuchsin solusyonu ; Bazik fchsin (stok) 10 cc ; distile su 100 cc ; fuksin distile su ile iyice kartrlr ve filtre kadndan szlr. 04.04. Malait Yeili Malait yeili 1 g ; distile su 100 cc. Malait yeili havana konur, distile su azar azar ilave edilerek ezilir ve ieye alnr. Sonra suyun bir ksm tekrar havana ilave edilerek havan ykanr ve tekrar ieye alnr. Bir gn bekletildikten sonra szlr ve ielerde saklanr. 04.05. Safranin Boyas Safranin 0.5 g ; alkol (% 95) 10.0 cc ; distile su 100.0 cc. Safrann alkolle eritilir ve sonra distile su ilave edildikten sonra ieye konur ve bir gn sonra filtre edilir. 04.06. Bismarck Brown Bismarch brown (Y) 0.2 g ; distile su 100.0 cc. Boya damtk su iinde eritilir, szlr ve ielerde saklanr. 04.07. Brillant Yeili Brillant yeili 1.0 g ; sodyum hidroksit 0.01 g ; distile su 100.0 cc. nce distile su iinde sodyum hidroksit eritilir. Sonra brillant yeili havanda NaOH 'li distile su ile ezilerek eritilir ve szlr. 04.08. Krisoidin Boyas Krisoidin 1 g ; distile su 100 cc. Boya, scak distile su ile kartrlarak eritilir ve scakken szlr. 04.09. Pikrik Asit Pikrik asit 0.75 g ; distile su 100.0 cc. Boya distile su iinde alkalanarak eritilir. Ertesi gn filtre kadndan szlr. 04.10. Eosin Boyas Eosin 1 g ; distile su 100 cc. Boya distile suda alkalanarak eritilir ve sonra szlr. 04.11. Nigrosin Nigrosin 10 g ; distile su 100 cc. Nigrosin distile su iinde 1/2 saat kaynatlr. ine 0.5 cc formalin (% 40'lk) koruyucu olarak katlr. ift szge kadndan szlr ve 5 cc miktarlarnda az kapal tplerde muhafaza edilir. 04.12. Auramin-O Auramin-O 0.3 g ; fenol (sv) 3.0 cc ; distile su 100.0 cc. nce, fenol distile suya katlr ve hafife stlr ve sonra auramin-O katlarak alkalanr, eritilir ve filtre edilerek, koyu renkli ielerde saklanr. 04.13. Metil violet - 6B Metil violet 6 B 5 g ; distile su 1000 cc. Boya distile suya azar azar katlarak ve alkalanarak eritilir. Filtre kadndan szldkten sonra ielerde saklanr. 04.14. Flagella Boya Solusyonu Tannik asit 10 g ; NaCl 5 g ; Bazik fuchsin 4 g. Maddeler birbirleriyle iyice kartrlr. Karmdan 1.9 g. alnarak 33 cc alkol (% 95'lik) ilave edilir ve iyice erimesi salanr. Distile su ile 100 cc ye tamamlanr. Solusyonun pH 's 5.0 'e ayarlanr. Boya kapakl ielerde 3 - 5 C 'de muhafaza edilir. 04.15. Lipid Boya Solusyonu Sudan siyah-B (toz) 0.3 g ; alkol (% 70) 100.0 cc. Boya, alkol iinde ara sra alkalanarak eritilir. Boya solusyonu bir gece bekletilir. Az kapal iede muhafaza edilir. 04.16. Polisakkarid Boya Solusyonu (Hotchkiss Metodu) 1. Periodat solusyonu : Periodik asit 0.8 g ; distile su 20 cc ; Sodium acetat (0.2 M) 10 cc ; etilalkol 70 cc. Maddeler birbirine katlarak eritilir ve karanlk yerde muhafaza edilir. 2. Redkten solusyon : KI 10 g ; Sodyum thiosulfat (penta hidrate) 10 g ; distile su ; 200 cc. Karm hazrlandktan sonra 300 cc etil alkol ile 5 cc HCI (2N) ilave edilir. Slfr presipite olur. 3. Fuchsin - slfit solusyonu : Bazik fchsin 2 g ; distile su (scak) 400 cc.Scak su iinde bazik fchsin eritilir ve 50 C 'ye kadar ltlr ve filtre edilir. Buna, HCI (2N) 10 cc ; Potasyum metabislfit 4 g katlr, kartrlr, az kapatlarak bir gece bekletilir. Karma Charcoal (dekolarizan) 1 g ilave edilir ve iyice kartrlr ve hemen filtre edilir. Tekrar 10 cc veya daha fazla 2 N HCl katlr (preparat kuruyunca pembe olmas gerekir). 4. Slfit ykama solusyonu : Potasyum metabislfit 2 g ; HCl (konsantre) 5 cc ; distile su 500 cc. Maddeler distile suya katlarak eritilir (solusyon taze hazrlanr). 04.17. Spiroketa Boyas I. Fontana yntemi 1. Tespit solusyonu : Asetik asit 1 cc ; Formalin 2 cc ; distile su 100 cc. 2. Mordant : Fenol 1 g ; Tannik asit 5 g ; distile su 100 cc. 3. Amonyakl gm nitrat: Amonyak solusyonu (% 10), % 0.5 gm nitrat solusyonuna bir presipitat oluup hemen eriyinceye kadar katlr. Bundan sonra gm nitrat damla damla katlarak, presipitasyon olumas ve erimesi beklenir. Presipitat erimeyinceye kadar devam edilir. II. Modifiye Becker yntemi Boyama solusyonu : Bazik fuchsin (alkolde satre) 45 cc ; Shunk'un mordan-B (% 95 veya % 100 etanol 16 cc + anilin oil 4 cc) 18 cc ; Distile su 100 cc. Maddeler distile su iinde sraya gre eritilir. 04.18. Mantar Boyama Metodu Fenol kristal 20 g ; laktik asit 20 cc ; gliserin 40 cc ; distile su 20 cc ; pamuk mavisi (veya metil mavisi) 0.0075 g. Fenol, distile su iinde hafife stlarak eritildikten sonra dier maddeler katlr. Deoksiribonkleaz testi Ama : Aerob bakteri trlerinde DNAse aktivitesini tespit etmek amacyla DNAse test agar kullanlr. Prensip ve sonularn yorumu : DNAse aktivitesini tespit etme iin birka metod vardr: hidroklorik asit presipitasyon, toluidin mavisi ve methyl green metodlar. Hidroklorik asid (HCl) metodu : asit karsnda DNA'nn presipite olmas fakat DNAse aktivitesi sonucu aa kan oligonkleotidlerin znmesi temeline dayanan bir testtir. DNAse test agara mikroorganizma ekilir. nkbe edilir. nkbasyon sonunda besiyerindeki koloniler zerine 1 N HCl dklr. Mikroorganizmann DNA's paralanmam ise asit eklenince presipite olur. Presipite olan DNA'nn etrafnda opak alanlar ortaya kar. Ancak mikroorganizmann DNA's paralanm halde ise asit etkisiyle oligonkleotidler zlr ve bakteri kolonisinin etrafnda berrak bir zon ortaya kar. Toluidin mavisi ve methyl green metodu : Bunlar metakromatik boyalardr. Toluidin mavisi DNA'ya balannca maviye boyanma grlr. Mikroorganizmann DNAse aktivitesi varsa kolonideki DNA'y oligonkleotidlere paralar. Bunlar toluidin mavisi ile pembeye boyanr. Ayn ekilde, methyl green boyas da DNA'ya balannca onu yeile boyar. DNA hidrolize olunca boyay brakr ve koloniler renksiz hal alr. Toluidin mavisi birok gram pozitif bakteri trleri iin toksik bir maddedir. Bu nedenle, DNAse retme kabiliyeti olan bakterileri incelemek iin HCl hidrolizi veya methyl green metodlarnn kullanlmas nerilmektedir. Reajen bileimi ve hazrlanmas : Aadaki maddeler kartrlr, kaynayncaya kadar stlr, 121C'de 15 dk. sterilize edilir ve steril petri plaklarna datlr. DNA Papaik sindirilmi soya unu Pankreatik sindirilmi kazein NaCl Agar Distile su 2 g 5 g 15 g 5 g 15 g 1 lt

Son pH= 7.3

Opsiyonel olarak Toluidin mavisi100 mg

veya DNAse reajen, 1 N HCl : Konsantre HCl Distile su 2.8 mL 97.2 mL

Testin yapl : Mikroorganizma DNAse test agar'a ekilir. 35C'de 18-24 saat inkbe edilir. Daha sonra koloniler zerine 1 N HCl gllenir. Metakromatik boyanrsa besiyerine dahil olmaz. Kalite kontrol : Kontrol mikroorganizma olarak Serratia marcessens kullanlr. DNAse besiyerine ekilip 35C'de 24 saat inkbe edilir. nkbasyon sonunda 1 N HCl eklenir ve berrak bir zon meydana gelirse DNAse testi pozitiftir denir. Ayn organizma toluidin mavisi veya methyl green metodu iin de kullanlabilir. Toluidin mavisi eklenince koloni etrafnda parlak pembe bir zon meydana gelirse DNAse testi pozitif, besiyeri berrak mavi renkte kalrsa DNAse testi negatiftir denir. Methyl green metodunda pozitif reaksiyon koloni etrafnda rengin kaybolmas ile ve negatif reaksiyonda besiyeri yeil kalr. Safral-esklinli agar (Bile-Esculin agar) Ama : Bile-Esculin (BE) agar D grubu streptokoklar enterokok trlerinden ayrt etmede kullanlr. Bu ayrdetme ilemi %40 safra varlnda reme yeteneine ve esklini eskuletin ve dextrose'a hidrolizleyebilme zelliine dayanr. Prensip ve sonucun yorumu : Bu besiyeri, %40 safrada reme yetenei olan bakteriler iin selektif bir besiyeridir. Bir ok gram negatif basiller, stafilokok trleri, D grubu streptokoklar ve enterokok trleri bu besiyerinde rer. Son iki mikroorganizma esklini hidrolize ederek eskuletin oluturur. Eskuletin, ferrik sitrat ile reaksiyon vererek kahverengi-siyah bir rn oluturur. Bu zellik ile dier streptokoklardan ayrt edilmeleri salanr. Besiyeri karm ve hazrlanmas : Aagdaki maddeler kartrlr. Kaynayncaya kadar stlr. 121C'de 15 dk. sterilize edilir. Tplere datlr ve eri pozisyonda katlamaya braklr.Karmlar Miktar

Beef extract 3 gr

Jelatinin pankreatik hidrolizat 5 gr

Esculin 1 gr

Oxgall 40 gr

Ferric citrate 1 gr

Agar 15 gr

Distile su 1 litre

Son pH=7.0

Reajen emdirilmi ticari stript'ler de mevcuttur. Prosedr : Steril bakteriyolojik bir ine iyi izole bir koloninin merkezine dokundurulur. BE agarn eri yzeyine ekilir. 35C'de inkbe edilir. Her gn kltrde reme ve esklin hidrolizine bal siyahlama olup olmad konrol edilir. Genellikle 48 saat iinde siyahlama meydana gelir. Besiyerinde reme varsa safraya tolerans gsterir. Kalite kontrol : Kontrol mikroorganizma olarak Enterococcus faecalis ve Streptococcus viridans grubundan bir bakteri kullanlr. Enterokoklar 35C'de 24 saatte siyah renkte koloni oluturarak rerken viridans grubu streptokok remez. CAMP (Christie, Atkins, Munch-Peterson) testi Ama : Lancefield B grubu streptokoklarn (Streptococcus agalactiae) identifikasyonu iin CAMP testi kullanlr. B grubu streptokoklar sr matitlerinin etkenlerinden biridir. Prensip ve sonucun yorumu : CAMP faktr, B grubu streptokoklar tarafndan retilen difzibl, sya dayankl ekstraselller bir protein olup Staphylococcus aureus'un spesifik bir beta hemolizini ile bir araya gelince agardaki koyun eritrositlerini tam hemolize uratr. Bu protein, koyun ve sr eritrositlerini hemoliz iin stafilokoklarn beta toksini ile sinerjistik olarak etki eder. Tavan, at ve insan eritrositleri zerine sinerjistik etkisi yoktur. Staphylococcus aureus ATCC 25923 beta hemolizin oluturmaktadr ve CAMP testinde kullanlr. Bu test, orijinal almay yapan ve yaynlayan aratrmaclarn ismi ile anlmaktadr. Prosedr : Koyun kanl agar zerine dz bir hat boyunca beta toksin reten S. aureus tr ekilir. Bu ekim izgilerine dik dorultuda, stafilokok ekim izgisine dokundurmamaya dikkat ederek, incelenecek mikroorganizma 2-3 cm uzunlukta ekim yaplr. Her plaa 4-5 organizma ekilebilir. Plaklar 37C'de 18-24 saat inkbe edilir. nkbasyon sonunda, streptokok ve stafilokoklarn reme yaplar incelenir. Birbirlerine yakn olduklar yerde ok ba eklinde hemoliz meydana gelirse "CAMP testi pozitif" denir. S. aureus'un beta lizini ile S. agalactiae'nn ekstraselller rn birlikte hareket ederek byk bir beta hemoliz oluturur. Kalite kontrol : Kayun kanl agara kontrol organizmas olarak S. aureus ATCC 25923 ekilir. Streptokok olarak Streptococcus agalactiae veya S. pyogenes kullanlr. Streptokok izgilerine dik a yapacak ekilde streptokok ekilir. nkbasyondan sonra aagdaki sonular grlr. Streptococcus agalactiae "ok ba" eklinde hemoliz grlr. (CAMP pozitif) Streptococcus pyogenes "ok ba" hemoliz grlmez.(CAMP negatif) % 6.5 sodyum klorr (NaCl) agar ve broth Ama : %6.5 NaCl agar, yksek tuz younluunda reme yetenei olan bakterilerin ayrmnda kullanlr. Besiyeri hazrlanrken agar katlmazsa broth besiyeri elde edilir. Prensip ve sonucun yorumu : % 6.5 NaCl agar, yksek konsantrasyonda protein, NaCl ve agar kapsar. Baz Gram pozitif koklarn ve Gram negatif basillerin % 6.5 NaCl'de remeleri, bu bakterilerin identifikasyonunu salayan karakteristik bir zelliktir. reme kontroln yapmak amacyla % 6.5 NaCl agar yannda sodyum klorrsz bir besiyerine de bakteri ekilmelidir. Her iki besiyerinde de ayn oranda reme varsa, organizma NaCl'e tolerandr, yani test sonucu pozitiftir. Buna karlk NaCl'l agarda az veya reme yok iken NaCl'sz besiyerinde daha fazla reme kaydedilirse test sonucu negatif olarak bildirilir. Besiyeri bileimi ve hazrlanmas : Aadaki maddeler kartrlr, kaynayncaya kadar stlr ve 121C'de 15 dk. sterilize edilir. Petri plaklarna veya vida kapakl tplere tevzi edilir ve plastik torbalar iinde saklanr. Besiyeri bileimi miktarlar

Sr kalbi infzyonu Peptik sindirilmi hayvani doku NaCl Agar (opsiyonel) Distile su 500 gr 10 gr 65 gr 15 gr 1 lt.

Son pH=7.4

Prosedr : ncelenecek mikroorganizma iki besiyerine ayr ayr ekilir. Bir besiyeri % 6.5 NaCl'l iken dierinde tuz bulunmamaktadr. 35C'de 24-72 saat inkbe edildikten sonra reme kontrolleri yaplr. Kalite kontrol : Kontrol organizmas olarak Enterococcus faecalis ve viridans grubu bir streptokok tr kullanlr. 35C'de 24 saat inkbe edildikten sonra reme kontrol yaplnca enterokoklar tuzlu besiyerinde iyi rerken viridans streptokoklarn remedii grlmelidir. Mannitol tuz agarAma : Mannitol tuz agar (MTA), mikst bakteri floras kapsayan klinik rneklerden stafilokoklarn izolasyonu iin kullanlan seici ve ayrc bir besiyeridir. Prensibi ve yorumlanmas : MTA; sr eti ekstresi, NaCl, D-mannitol, agar ve bir pH indikatr ihtiva eder. Besiyerinin selektivitesi (seicilii) iinde bulunan yksek tuz konsantrasyonuna (%7.5 NaCl) baldr. Stafilokok trleri (ve bazen tuza toleran mikrokoklar ve streptokoklar) bu yksek tuz konsantrasyonunda reyebilirken bir ok Gram negatif ve pozitif mikroorganizmalar reyememektedir. Besiyerinin ayrt ettirici zellii ise D-mannitol'e baldr. Staphylococcus aureus MTA'da rer ve mannitol fermentleyerek (etraf sar bir zonla evrili) sar renkte koloniler olutururlar. Birok koagulaz negatif stafilokok trleri ve mikrokoklar mannitol fermentlemez. Bu nedenle evresi krmz veya pembe zonla evrili kk, krmz renkte koloniler olutururlar. Koloni ve besiyerinin rengi, besiyerinin pH'na bal olarak, fenol kmzsnn (phenol red) aktivitesine baldr. pH 8.4'de fenol krmzs krmz renkte iken 6.8 de sar renktedir. Sar bakteri kolonilerine koagulaz testi yaplmaldr. S. aureus'larn egg-yolk lipaz aktivitesini tespit etmek iin besiyerine egg-yolk eklenebilir. Bu enzim tuzda znmeyen ya asidlerini serbestletir. Bu asidler, besiyerinde opasite zonlar oluturmak zere S. aureus kolonilerinin etrafnda presipitatlara neden olur. Koagulaz retmeyen stafilokok trleri, bu enzimi de retemez. Bu nedenle presipitatn etrafnda opasite zonu olumaz. Besiyeri bileimi ve hazrlanmas : Aadaki maddeleri kartrn, kaynayncaya kadar stn, 121C'de 15 dk. steril edin ve petri plaklarna tevzi edin. Bileikler Miktar

Sr eti ekstresi Pankreatik sindirilmi kazein veya peptik sindirilmi hayvani doku NaCl D-mannitol Phenol red Agar Distile su Egg-yolk, steril (opsiyonal) 1 gr 10 gr 75 gr 10 gr 25 gr 15 gr 1 lt 20 ml

Son pH= 7.4

Prosedr : Klinik materyal MTA besiyerine ekilir. 35C'de 24-48 saat inkbe edilir. CO2 altnda inkbe edilmemelidir. Kalite kontrol : Kontrol organizma olarak S. aureus 25923 ve S. epidermidis 12228 kullanlr. Bakteriler ekildikten sonra 35C'de 24-48 saat inkbe edilir. S. aureus'lar besiyerinde 48 saatte remeli ve kolonileri etrafnda sar zonlar oluturmaldr. S. epidermidis ise besiyerinde 48 saatte remeli ve kolonileri etrafnda krmz zonlar oluturmaldr.Novobiocin'e duyarllk testi Ama : Novobiocin duyarllk testi, Staphylococcus saprophyticus'u idrar yolu numunelerinden elde edilen dier koagulaz negatif stafilokoklardan ayrdedilmesini salayan bir testtir. Prensibi : Staphylococcus saprophyticus, novobiocin varlnda reyebilir (novobiocin rezistandr). Novobiocin, Streptomycete trleri tarafndan retilen bir antimikrobiyaldir. drar yolundan izole edilen pheli bakteri besiyerine uygun ekilde ekilir ve zerine 5 g'lk novobiocin disklerinden bir tane konur. nkbasyondan sonra novobiocin diski etrafnda 16 mm ve daha az bir inhibisyon zonu olumas bakterinin Staphylococcus saprophyticus olduunu gsterir. Stafilokoklardan S. cohni, S. xylosus ve S. sciuri de novobiocine rezistandr. Ancak bu trler idrar yollarndan nadiren izole edilir. Prosedr : Koyun kanl agarn bir yarsna incelenecek mikroorganizma ekilir. noklumun ortasna 5 g'lk bir novobiocin diski yerletirilir. 35C'de 18-24 saat inkbe edilir. nkbasyondan sonra disk etrafnda remenin inhibe olduu zon olup olmad aratrlr. Reajen : 5 g novobiocin diski Kalite kontrol : Kontrol organizma olarak S. saprophyticus ve S. epidermidis kullanlr. Bakteriler ekildikten sonra 35C'de 18-24 saat inkbe edilir. S. saprophyticus novobiocine rezistan sonu vermeli (inhibisyon zonu 16 mm veya daha az olmaldr). S. epidermidis ise novobiocine duyarl kmaldr (inhibisyon zonu 17 mm veya daha fazla olmaldr). Kovacs'n indol deneyi Kovacs ayrac ; Amil veya isoamil alkol (saf)150 ml

Paradimetil aminobenzaldehid10 g

HCL (kesif)50 ml

24 saatlik sv kltre 0.5 ml Kovacs ayrac ilave edilir. alkalanr. ndol mevcudiyetinde krmz-meneke renk meydana gelir.

ndol testi Ehrlich ayrac ile de yaplabilir. Ehrlich' in indol deneyiEhrlich ayrac: Paradimetil-aminobenzaldehit2 gr

Alkol (%95)190 ml

HCL (kesif)40 ml

Triptofan ihtiva eden sv basiyerine ekilen bakterinin 48 saatlik kltrne 1 ml eter konur. yice alkalanr. Eterin yzeye kmas iin birka dk beklenir. Ayratan 0.5 ml tpn kenarndan yavaa ilave edilir ve eterle besiyeri arasnda bir halka tekili salanr. Bakteri indol husule getirmise, indol eterde eridiinden, konsantre bir ekilde yzeyde toplanr. Ayra ilavesiyle ater tabakasnn altnda parlak krmz bir halkann husule geldii grlr. Rengin husule gelmemesi indoln bulunmadn gsterir.ndol testi Kovacs testi ile de yaplabilir. Beta-laktamaz testi Ama : -laktamaz testi, bakteride -laktamaz enziminin olup olmadn gsterir. -laktamaz enzimi, -laktam halkasna sahip antibiyotiklere balanan ve halkay paralayan bir enzimdir. Neticede antibiyotik aktivitesi kaybolur. -laktamaz enzimi salglayan bakteriler beta-laktam antibiyotiklere rezistandr. -laktamaz enzimi; kltrde reyen kolonilerde, BOS sedimentinde ve kltr supernatantnda tespit edilebilir. Prensibi : Penisilinler ve sefalosporinler, molekler yaplarnda -laktam halkas antibiyotiklerdir. Penisilin ve sefalosporinlere rezistans mekanizmalarndan biri -laktamaz salglanmasdr. -laktamaz retimi metodla tespit edilebilir; 1. Hzl asidimetrik metod : -laktam halkasnn almasndan sonra penisilinden daha asidik olan penicilloic asid olumas prensibine dayanr. ncelenen mikroorganizma tarafndan retilen asidi tespit iin indikatr olarak fenol red kullanlr. 2. Kromojenik sefalosporin metodu : Kromojenik sefalosporin, doal durumunda sar olan ancak -laktam halkas paralannca krmzya dnen bir bileiktir. Kromojenik sefalosporin metodu asidimetrik metoddan daha duyarldr. 3. yodometrik metod : Genellikle kullanlmaz. Prosedr : Hzl asidimetrik metod : % 0.5 fenol red solusyonu hazrlanr. Bu solusyondan 2 ml alnarak 16.6 ml steril distile suya eklenir. Daha sonra buna 20x106 nite penisilin G ilave edilir (Parenteral kullanylan ve citrate buffer'l penisilin G tercih edilir). Bu karm bir tpe aktarldktan sonra pH' 8.5 olana kadar damla damla 1 M NaOH damlatlr. Bu solusyondan 0.05-0.1 ml alnarak deney tpne veya mikropleyt kuyucuklarna eklenir. Bir gece inkbe edilen incelenecek mikroorganizmadan McFarland no:4'e uyan bir sspansiyon hazrlanr. Tpteki fenol red-penisilin substrat zerine eklenir. -laktamaz retiliyorsa solusyonun rengi 15 dk iinde sarya dner. Piyasada penisilin ve bromkrezol menekesinden hazrlanan kat striptlerden ibaret asidimetrik sistemler de vardr. Bu kat striptler slatlarak zerine mikroorganizma srlr. Renk menekeden sarya dnerse test pozitiftir. Kromojenik sefalosporin metodu : 1 lt dimetil slfoksid iinde 10 mg kromojenik sefalosporin -nitrosefin -(Glaxo) zlr. 0.1 M fosfat buffer (pH=7.0) ile dile edilerek son konsantrasyon 500 gr/ml'ye ayarlanr. 0.1 ml alnarak kk bir tpe veya mikrodilsyon plaklarna datlr. Bir gecelik bakteri kltrnden McFarland no: 4 standardnda hazrlanan sspansiyon ile kartrlr. 10 dk iinde krmz renk oluursa test pozitiftir. Piyasada nitrosefin emdirilmi kat diskler mevcuttur (Cefinase, BBL). Steril su ile slatlan disk zerine birka koloni bakteri yaylr. 5-10 dk iinde krmz renk meydana gelirse test pozitiftir. Tavsiyeler : Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus, Haemophylus trleri, ve bir ok Bacteroides trlerindeki beta laktamaz tespit amacyla kromojenik sefalosporin metodu, en duyarl testtir. Bacteroides trleri iin sadece bu metod kullanlmaldr. Teraptik amalarla, Enterobacteriaceae ailesi, nonfermentatif Gram negatif basiller ve bir Bacteroides trleri dndaki aerob bakteriler iin beta laktamaz testlerinin yaplmas tavsiye edilmemektedir. Kalite kontrol : Her test iin pozitif ve negatif kontroller kullanlmaldr. Pozitif kontrol olarak ampisiline rezistan H. influenzae veya -laktamaz reten S. aureus'un stok kltrleri kullanlabilir. Negatif kontrol olarak ampisiline duyarl H. influenzae veya S. aureus ATCC 25923 kullanlr. Methyl Red - Voges-Proskauer broth Ama : Metil Red - Voges-Proskauer (MR-VP) broth, Enterobacteriaceae ailesindeki bakterilerin asetilmetil karbinol (acetoin) ve glikozun fermentasyonu ile gl asitler retmeleri esasna gre cins ayrmnda kullanlan bir besiyeridir. MR-VP broth protein, glikoz ve fosfat buffer ierir, ve MR testi ve VP testi iin kullanlr. Prensip ve sonularn yorumlanmas : Enterobacteriaceae ailesi, metabolik zelliklerine gre mikst asit retenler ve butilen glikol retenler olmak zere ikiye ayrlr. Mikst asit retenler, rn. E. coli laktik asit, asetik, formik ve sksinik asit dahil olmak zere byk miktarda organik asit retirler. Klebsiella ve Enterobacter trleri gibi butilen glikol retenler daha az miktarda organik asit ve zellikle 2,3-butanediol olmak zere daha fazla miktarda ntral bileikler retirler. MR testi, mikst asit reticilerinin ayrdedilmesinde kullanlr. ndikatr olarak metil red kullanlr. Metil red, inkbasyon sonunda MR-VP broth'una eklenir. pH=4.4'de indikatr krmz iken pH=6.0'da sarya dner. MR testi pozitif mikroorganizmalar byk miktarda asit rettii iin krmz reaksiyon verirken MR-negatif mikroorganizmalar sar renk oluturmaktadr. VP testi, butilen glikol retimine araclk eden acetoin veya asetil metil karbinol varln tespit eder. Bu testte, uygun inkbasyondan sonra MR-VP broth'a eklenen iki reajen (alfa-naftol ve %40 KOH) kullanlr. Broth-reajen karm daha sonra atmosferik oksijen etkisinde kartrlr. Besiyerinde asetoin varsa ak havada oksidlenir ve KOH ile diasetillenir. Daha sonra, besiyerinde alfa-naftol varken, diasetil ile peptonda bulunan guanidine komponentleri reaksiyona girer. Bylece krmz renk oluur.(alfa-naftol bir katalist olarak etki eder ve rengi kuvvetlendirir). Krmz renk gelimesi, pozitif VP testi sonucunu gsterir. MR-VP testi, butilen glikol reticileri tarafndan glikozun 2,3-butanediol'e metabolize olduundan emin olmak iin 30C'de 5 gn inkbasyondan sonra okunacak ekilde dzenlenmiti. Bununla birlikte, MR-VP broth'unun hacmi her tpte 0.5-1 ml'ye azaltlarak ve besiyerine youn bir bakteri sspansiyonu ekleyerek broth 35C'de 18-24 saat inkbe edilirse geleneksel test ile edeerde sonular alnabilir. Kk hacimli broth, incelenecek mikroorganizmann atmosferdeki oksijenle karlamasn ve asetoin retimini artrr. (MR-VP broth inceleme srasnda aerob artlarda inkbe edilir.). Enterobacteriaceae cinslerinin taranmas amacyla geleneksel testlerin yerine kullanlmak zere direkt ve indirekt VP testleri gelitirilmitir. Direkt VP testi, laktozu hzl fermente eden kolonileri doru olarak tespit ederken laktozu yava fermente eden veya fermentasyon yapmayan koloniler ile yanl negatif sonular verebilmektedir. Direkt test uygun deilse indirekt VP testi kullanlr. Bu testlerin her ikisi de 15 dk iinde sonu verir. Besiyeri bileimi ve hazrlanmas : Pankreatik sindirilmi kazein ve peptik sindirilmi hayvani doku D-Glikoz Dipotasyum fosfat Distile su 7 g 5 g 5 g 1 lt

Final pH=6.9

1. stteki nmaddeler kartrlr. 2. Kaynayncaya kadar stlarak eritilir. 3. Her tpe 1 ml olacak ekilde datlr. 4. 121C'de 15 dk sterilize edilir. Reajenler : Metil red reajeni : Alkol iinde metil red zlr. zerine distile su eklenir. Oda ssnda veya buzdolabnda saklanr. Metil red Etil alkol, %95 Distile su 50 mg 150 mg 100 ml

Voges-Proskauer reajenleri : VP-1 Alfa-naftol Etil alkol, absolute 5 gr 100 ml

VP-2 Potasyum hidroksid Distile su 40 gr 100 ml

KOH zeltisi, distile su ile 100 ml ye tamamlanr. Prosedr : ncelenecek mikroorganizma, her biri 1 ml MR-VP broth ieren iki tpe eklenir. 35C'de 1-3 gn inkbe edilir. Metil red testi : Broth kltrne 5 damla metil red reajeni damlatlr. Krmz renk oluup olumad incelenir. Pozitif MR testi (krmz renk) mikst asit fermentasyonunu gsterir. Voges-Proskauer testi : VP-1 reajeninden 0.06 ml alnarak broth kltre eklenir, tp alkalanr. VP-2 reajeninden 0.2 ml alnarak buna ilave edilir. Reajenler bu sra ile eklenmelidir. Tp yavaa alkalanr. Tpler 15 dk dik vaziyette bekletilir. Krmz renk oluup olumad incelenir. Krmz renk pozitif VP testini gsterir ve butilen glikol olutuunu gstermektedir. Negatif sonu vermeden nce 45 dak daha beklenir. Reajenlerin eklenmesinden sonra 1 saat iinde maksimum renk deiimi olmaldr. 1 saatten uzun beklemelerde besiyeri bakr rengine dner, bunu gznnde bulundurmaldr. Bu renk alfa-naftol ile KOH'in reaksiyonu sonunda meydana gelir. (Not: piyasada reajen emdirilmi striptler de mevcuttur). Kalite kontrol : Kontrol mikroorganizmalar olarak E. coli ve E. cloacae kullanr. MR-VP broth'a ekildikten sonra 35C'de aerob artlar altnda 48 saat inkbe edilir. nkbasyon sonunda E. coli MR pozitif (krmz renk) ve VP negatif (krmz renk olumaz) ve E. cloacae MR negatif (krmz renk olumaz) ve VP pozitif (krmz renk) meydana gelmelidir. Rapid direkt Voges-Proskauer testi : 13x100 mm'lik bir tpe 2 damla kreatin damlatlr. Bu solusyon iine, MacConkey agarda reyen laktoz pozitif (krmz-pembe) kolonilerden eklenir. Bu amala triple sugar iron (TSI) agarn eri yzeyinde asit oluturan kolonilerde kullanlabilir. (Eer bu ksm krmz ise test iin kullanlmamaldr). Kreatine-laktoz pozitif mikroorganizma solusyonu zerine 3 damla alfa-naftol reajeni (%95 etil alkolde %5'lik alfa naftol zeltisi hazrlanr.) damlatlr ve alkalanr. zerine 2 damla KOH zeltisi (distile suda %40'lk KOH) damlatlr ve tekrar alkalanr. 15 dk iinde pembe-krmz bir renk meydana gelirse VP testi pozitiftir. Pozitif sonulara gvenilebilir ancak negatif sonularn aagdaki indirekt VP testi ile dorulanmas gerekir. ndirekt Voges-Proskauer testi : Sadece 1 koloni mikroorganizma 0.2 ml MR-VP broth iine inokle edilir. 35C'de 4-6 saat inkbe edilir. 2 damla kreatin reajeninden (kreatinin sudaki %0.5 solusyonu) damlatlr ve alkalanr. 3 damla alfa-naftol zeltisinden (%95 etil alkoldeki %5 alfa-naftol) damlatlr ve tekrar alkalanr. 2 damla KOH (sudaki %40 KOH) ve alkalanr. 15 dk iinde pembe-krmz renk meydana gelmesi pozitif sonucu gsterir.