Molekulārās metodes mikrobioloģijā

21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

1

Molekulārās metodes Molekulārās metodes mikrobioloģijāmikrobioloģijā

Teorija Teorija 11..

Genomiskās DNS izdalīšanaGenomiskās DNS izdalīšana

2012./2013. mācību gada 2. semestris

Māris Lazdiņš


2

Lielmolekulāras DNS izdalīšanaLielmolekulāras DNS izdalīšana

1. Bioloģiskā materiāla iegūšana.

2. Audu dezintegrēšana - parasti mehāniska.

3. Šūnu noārdīšana (lizēšana) - mehāniska, ķīmiska.

4. DNS attīrīšana no citiem savienojumiem.

5. DNS izgulsnēšana un šķīdināšana.

6. DNS papildus attīrīšana.


3

Cik daudz materiāla vajag ?Cik daudz materiāla vajag ?

Vienā diploīdā cilvēka šūnā -

6,6 pg (6,6x10-12g) DNS

Vienā E. coli šūnā -

5,0 fg (5,0x10-15g) DNS

Lai iegūtu 50 g DNS, vajadzētu:

~107 cilvēka šūnu (apmēram, 1 - 2 ml asiņu)

~1010 E. coli šūnu (apmēram, 2 ml tipiskas

E. coli naktskultūras, kas

atbilst ~ 6 mg mitro nogulšņu)


4

Cik daudz materiāla vajag ?Cik daudz materiāla vajag ?

Reālais DNS iznākums parasti mazāks, piemēram:

~2 mg DNS no 1 g zīdītājdzīvnieku audiem,

10 - 40 g DNS no 1 g augu materiāla,

5 - 20 g DNS no 1 ml baktēriju kultūras

~20 g DNS no 1 ml cilvēka asiņu.


5

Bioloģiskā materiāla iegūšanaBioloģiskā materiāla iegūšana

• Der jebkuras šūnas un audi, kuros atrodas DNS.

- zīdītāju eritrocīti un trombocīti ir bez kodoliem.

• Jāraugās, lai materiāls būtu tīrs, bez citu organismu vai DNS piesārņojuma.

• No piesārņojuma jāuzmanās arī DNS izdalīšanas laikā,

- reaģenti nedrīkst būtu piesārņoti ar

mikroorganismiem vai citu DNS.


6

Audu Audu homogenizēšana homogenizēšana

vai vai dezintegrēšana.dezintegrēšana.


7

Audu homogenizēšana vai Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana.dezintegrēšana.

Blīvas daudzšūnu struktūras sadala pēc iespējas mazākos gabalos, lai uzlabotu lizējošo šķīdumu piekļuvi materiālam un palielinātu to iedarbības virsmu.

Nav nepieciešama materiāliem atsevišķu šūnu formā:

- baktēriju, raugu kultūras,

- eikariotu šūnu kultūras,

- asinis,

- sperma, amniocīti.


8


Strādājot ar audiem,

- īpaši ar augu materiālu,

homogenizācija ir nepieciešama.

Izmanto - gaļas mašīnas,

- dzirnavas;


9


Sasaldē un homogenizē

- piestā,

- speciālos vibrohomogenizātoros,

- koloidālajās lodīšu dzirnavās.

Var iesaldētus audus homogenizēt ar āmuru.


10


Daži materiālu veidi viegli sagraujami beržot piestā.

Materiālu parasti iesaldē ar šķidru slāpekli un

saberž smalkā pulverī.

Efektivitāti palielina pievienotas:

- kvarca smiltis,

- stikla pulveris,

- alumīnija oksīda pulveris.


11

Nažu dzirnavasNažu dzirnavas..

Materiāls tiek samalts ar rotējošiem nažiem.

Lieto audu gabalu homogenizēšani.


12

Dounča homogenizatorsDounča homogenizators..

(Dounce homogenizer)

Materiāls tiek saberzts starp cilindru un virzuli.

Lieto mīksto audu gabalu homogenizēšani.


13

Potera homogenizatorsPotera homogenizators..

(Potter [Elvehjem ] homogenizer)

Materiāls tiek saberzts starp cilindru un virzuli.

Lieto mīksto audu gabalu homogenizēšani.


14

Lodīšu dzirnavas.Lodīšu dzirnavas.

Materiāls tiek samalts ar lodītēm vibrējošā kapsulā.

Materiālu parasti iesaldē.

Lieto audu gabalu

homogenizēšani.


15

Ultraskaņas dezintegrēšana Ultraskaņas dezintegrēšana (sonikācija).(sonikācija).

Straujās svārstības vidē veiksmīgi iedarbojas uz šūnām un audu gabaliņiem,

radot spēcīgu nobīdes deformāciju.

Jāuzmanās no pārmērīgas parauga sasilšanas un putošanās - veic ledus vannā.

Šūnu un audu suspensijā, notiek arī DNS fragmentācija.


16

Ultraskaņas dezintegrēšana Ultraskaņas dezintegrēšana (sonikācija).(sonikācija).


17

FreFrennča presse.ča presse.

(French Press )

Šūnas ar lielu spiedienu tiek dzītas cauri ļoti smalkai sprauslai.

Pielieto mikroorganismiem ar šūnapvalku (baktērijas, aļģes, raugi)


18

Homogenizēšana ar stikla daļiņām.

Materiālu vorteksē kopā ar stikla daļiņām.

Lieto audu kultūru, baktēriju suspensijām.


19

DNSDNS kvanti-tēšanakvanti-tēšana


20

DNS koncentrācijas noteikšanaDNS koncentrācijas noteikšana

Izdalītajai un attīrītajai DNS vēlams noteikt koncentrāciju.

To dara spektrofotometriski,

nosakot absorbciju pie 260 nm.

1 OD vienība atbilst ~50 g/ml divpavedienu DNS.

(l=1cm)


21

DNS DNS tīrībastīrības pārbaude pārbaude

DNS preparāta tīrību var pārbaudīt mērot absorbciju pie 280 nm.

Tīrai DNS - OD260/OD280 = 1,8 (1,75)

Proteīnu piemaisījumi vai fenola paliekas šo vērtību samazina.

RNS - palielina. (tīrai RNS - OD260/OD280 = 2.0).


22


Aminoskābju

aromātiskās

sānu grupas

Peptīdsaites


23


Ja paraugā ir proteīnu, RNS u.c. piemaisījumi - kvantitēšana pēc OD260 var izrādīties visai neprecīza.

Ja DNS preparātā ir neliels proteīnu piejaukums, var mērīt arī absorbciju pie 230 nm.

OD260/OD230 < 1.5 norāda uz proteīnu (peptīdsaite) un citu organisku vai neorganisku vielu piesārņojumu paraugā. (normāli vērtībai jābūt 2.0 - 3.0)


24

DNS kvalitātes pārbaudeDNS kvalitātes pārbaude

DNS preparātu analizē elektroforētiski -

pārbauda, kāds ir raksturīgais DNS fragmentu lielums, salīdzinot ar DNS fragmentu garuma standartiem.

Parastā agarozes elektroforēzē var atdalīt DNS fragmentus līdz 16 000 bp.


25


Arī lielākie DNS fragmenti migrē kopā ar 16 kb zonu.

Garākus fragmentus (līdz 10 Mb) var izšķirt ar pulsējošā lauka gelelektroforēzi (PFGE).


26


Liela izmēra dpDNS fragmenti

(> 16 000 bp)

RNS


27


Daļēji hidrolizēta DNS

Stipri hidrolizēta DNS


28


29

Lizēšanas buferos parasti ietver:

Tris - HCl 10 - 100 mM pH 6,5 - 8,0

Savienojums bufersistēmu veidošanai, lai uzturētu noteiktu pH.

Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana


30

TrisTris-bāze-bāze

LD50 / orāli / žurkai = 5 900 mg/kg

kairina ādu, gļotādas Xi

Sintētiska viela (~1940) ar bāziskām īpašībām

(pH ~ 10,5)

Tris(hidroksimetil)aminometāns;Trometamīns; Trizma u.c.

2-Amino-2-(hidroksimetil)--1,3-propāndiols

C4H11NO3

(HOCH2)3CNH2


31


Plaši izmanto bufersistēmu pagatavošanai, (1955)

pH 6,5 - 8,5

titrējot ar dažādām skābēm,

visbiežāk HCl => Tris - HCl Bieži lietotās pH vērtības: 6,7 7,0 7,5 8,0

Gatavo 2M izejas šķīdumu ar vajadzīgo pH


H+


32


Elektroforēzei bieži izmanto:

Tris - borāta (borskābe)

Tris - acetāta (etiķskābe)

Tris - glicīna

Tris - alanīna (aminoskābes) bufersistēmas.



33

Lizēšanas buferos tāpat kā daudzos citos šķīdumos darbam ar nukleīnskābēm parasti ietver:

EDTA 10 - 100 mM koncentrācijā.



34

EDTAEDTAEDTA - Etilēndiamīn-N,N,N',N'-tetraetiķskābe

Etilendiamīn-tetraetiķskābe

C10H16N2O8


35

EDTAEDTA

Etilendiamīn-tetraetiķskābe LD50 / orāli / žurkai = 2 200 mg/kg

Sintētiska viela (~1935) ar maz izteiktām skābes īpašībām.

EDTA skābes formai maza šķīdība ūdenī (~0,5g/l), tādēļ parasti lieto tās sāļus ar vienvērtīgajiem katjoniem.

Visbiežāk izmanto dinātrija sāli (Na2EDTA), kura ūdenī šķīst daudz labāk.


36

EDTAEDTAEDTA Savienojums labi saista divvērtīgo metālu

jonus (Ca++, Mg++), kuri nepieciešami nukleāžu un citu hidrolītisko

enzīmu aktivitātei.

Pievieno arī asins paraugiem uzglabāšanas laikā kā pretrecēšanas līdzekli, jo tas saista asins recēšanai nepieciešamos Ca++ jonus (EDTA vakutaineri).


37

EDTAEDTA

Laboratorijas vajadzībām gatavo 0,5M izejas šķīdumu.

Lai viela pilnībā izšķīstu, ar NaOH šķīdumu titrē līdz pH 8,0

Darba šķīdumos EDTA koncentrācija parasti

1 - 100 mM


38

EDTAEDTAPlašāks pielietojums -

kā ūdens mīkstinātājs un dažādu daudzvērtīgo metālu jonu helators rūpnieciskajos un ūdens attīrīšanas procesos;

EDTA sāļi arī kā pārtikas piede-

va - stabilizators (E385; E386);

Medicīnā kā pretinde saindējo-

ties ar smago metālu sāļiem.


39

Lizēšanas vai ķīmiskās noārdīšanas procesu pamatā veic ar jonisko deterģentu palīdzību.

Bieži tiek izmantots ~ 0,5% SDS

(beigu koncentrācija darba šķīdumā).

! ! !! ! ! Pievieno, kad šūnas labi izjauktas lizēšanas buferī.Pievieno, kad šūnas labi izjauktas lizēšanas buferī.



40

SDSSDS

Nātrija laurilsulfāts SLS (sadzīves ķīmijā)

Nātrija dodecilsulfāts NaC12H25SO4

LD50 / orāli / žurkai = 1 288 mg/kg

kairina ādu, gļotādas Xi


41

Pussintētiska viela, ko pamatā iegūst no eļļas palmu augļu un kokosriekstu eļļas (bagātas ar laurilskābi).

Ūdens šķīdumiem bāziskas īpašības (pH 9-10).

SDS Spēcīgs joniskais deterģents, veido smalki koloidālas sistēmas ar ūdenī nešķīstošām

un hidrofobām vielām.

SDSSDS


42

SDSSDS

Pielietojums:

- Audu un šūnu ķīmiska noārdīšana (P., nukleīnskābju izdalīšana),

- Proteīnu denaturēšana

gelelektroforēzē,

(~1 SDS molekula uz 2 aminoskābju atlikumiem)


43

SDSSDS

SDS Gatavo 10% izejas šķīdumu ūdenī.

Uzglabā istabas temperatūrā, lai SDS nekristalizētos un šķīdums "nesasaltu".

SDS kā deterģents plaši tiek lietots arī sadzīves ķīmijā:

- šampūni,

- tehniskie mazgāšanas līdzekļi,

- šķidrās ziepes.


44

Lizēšanas gaitā nereti tiek izmantota materiāla apstrāde ar :

Proteināzi K Proteolītisks enzīms.

Aktivitāti iespējams divkāršot paaugstinot temperatūru

no 37°C => 50° - 60°C

virs 65°C sākas strauja enzīma denaturācija.



45

Proteināze K

Optimālais pH: 7.5 - 12.0

Aktivitātei netraucē denaturējoši aģenti:

- SDS 0,5 - 1,0 %,

- urīnviela 1 - 4 M.


EC 3.4.21.64


46

Proteināzes K

Aktivitātei netraucē :

- jonu helatori (EDTA)

(enzīmam vēlami Ca+ joni, bet tā stabilitātei, ne aktivitātei);

- tripsīna un himotripsīna inhibitori.

Enzīmu iespējams izmantot apstākļos, kad

vairums šūnas enzīmu (nukleāžu) zaudējuši aktivitāti.



47

Proteināzi K iegūst no sēnes Tritirachium album līnijas Limber.

Endoproteāze. Serīna proteāze. EC 3.4.21.64

Peptīdsaiti šķeļ karboksil grupas pusē no alifātiskajām, aromātiskajām vai hidrofobajām aminoskābēm.



48

Proteināzi K Parasti izmantotā beigu koncentrācija darba šķīdumos:

0,05 - 1,0 mg/ml

Izejas šķīdumu koncentrācija 20 mg/ml vai 10 mg/ml,

Šķīdina ūdenī vai uzglabāšanas buferī:

20mM Tris-HCl (pH 7.4),

1mM CaCl2

50 % glicerols

Fasē un uzglabā mazos tilpumos - 20o C



49

Proteināze K tiek izmantota arī šūnu struktūru noārdīšanai, lai labāk

izdalītu to sastāvdaļas, piemēram, mitohondrijus.



50

Apstrādi ar Proteināzi K var papildināt vai aizstāt ar joniskā deterģenta CTAB klātbūtni.

Tas ne tikai denaturē proteīnus, bet arī ar tā palīdzību iespējams izgulsnēt nukleīnskābes.



51

CTABCTAB Cetiltrimetilamonija bromīds (Heksadecil-trimetil-amonija

bromīds) cetyltrimethylammonium bromide,

hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB C19H42BrN

Spēcīgs joniskais deterģents, veido smalki koloīdas sistēmas ar ūdenī nešķīstošām un hidrofobām vielām.


52

CTABCTAB

Cetiltrimetilamonija bromīds C19H42BrN

Plaši izmanto arī kā antiseptisko līdzeklis pret baktērijām un sēnēm.

LD50 / orāli / žurkai = 410 mg/kg

kairina ādu, gļotādas, acis Xi Xn

izteikti toksisks ūdenī dzīvojošiem

organismiem


53

CTABCTAB

Cetiltrimetilamonija bromīds C19H42BrN

DNS salīdzinoši labi šķīst CTAB šķīdumos ar lielu sāļu koncentrāciju, šādos šķīdumos labi šķīst arī polifenoli un polisaharīdi.

(parasti izmanto NaCl koncentrācijas > 0,8 M).

Samazinot sāļu koncentrāciju, DNS šķīdība CTAB klātienē samazinās, taču polifenolu un polisaharīdu šķīdību tas praktiski neietekmē.


54

CTABCTAB

DNS nogulsnes šķīdina lielas koncentrācijas (1,2 M) NaCl šķīdumā, atšķaidot izgulsnētās CTAB paliekas un novēršot savienojuma spējas izgulsnēt DNS, kad vēlāk sāļu koncentrācija atkal tiks samazināta.

Samazinot sāļu koncentrāciju (NaCl konc. < 0,5 M), piemēram, pievienojot precipitācijas šķīdumu ar 40 mM NaCl koncentrāciju, DNS tiek izgulsnēta, bet daudzus enzīmus inhibējošie polisaharīdi un polifenoli paliek šķīdumā.


55

CTABCTAB

CTAB mazāk efektīvi izgulsnē RNS, tādēļ ar šo metodi iegūtajiem DNS paraugiem parasti ir mazāk RNS piemaisījumu.

DNS izdalīšana ar CTAB palīdzību īpaši izdevīga apstrādājot augu valsts paraugus, kuriem raksturīgs liels polifenolu un polisaharīdu saturs.


56

CTABCTAB

CTAB izmantošana DNS izdalīšanai tika ieviesta ~ 1980. gadā.

Dažkārt CTAB lizējošiem šķīdumiem papildus pievieno arī β-merkaptoetanolu un/vai polivinilpirolidonu, taču tas ievērojami saīsina pagatavoto šķīdumu derīguma laiku (derīgs 2-3 dienas).

Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight

plant DNA. Nucleic Acids Research 8, 4321–4325.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC324241/


57

Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana Lizēšanas buferī dažreiz lieto arī:

N-Lauroilsarkozīnu (sarkozilu), parasti tā nātrija sāls veidāSodium lauroyl sarcosinate, sarkosyl

Lurilskābes un sarkozīna (N-metilglicīna) veidots amīds.

C15H29NO3 vai

C15H28NNaO3


58


N-Lauroilsarkozīns (sarkozils) vai tā nātrija sālsSodium lauroyl sarcosinate, sarkosyl

Aktīvs deterģents, ja tā koncentrācija lielāka par 1%, traucē proteināzes K darbību.

Mazās koncentrācijās tiek izmantots arī kā transkripcijas iniciācijas inhibitors.

Tiek izmantots dažādos mazgāšanas līdzekļos un šampūnos.

C15H29NO3 vai

C15H28NNaO3


59


Guanidīna hlorīdu (Guanidīna hidrohlorīdu)

Guanidinium chloride GuHCl

"Haotropā" viela, kas veicina NS saistību ar silikātiem (diatomaceous earth).

CH6ClN3

Ļoti spēcīgs proteīnus denaturējošsaģents.


60


Guanidīna tiocianātu Guanidinium thiocyanate GITC

"Haotropā" viela, kas veicina NS saistību ar silikātiem.

C2H6N4S

Tāpat ļoti spēcīgs proteīnusdenaturējošs aģents.


61

Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana Baktēriju lizēšanai iesaka izmantot

- lizocīmu (lysozyme; muramidase )EC 3.2.1.17

vai

- stafolizīnu (stapholysin; lysostaphin )

- ahromopeptidāzi (achromopeptidase)

u. c. enzīmus,

kuri katalizē baktēriju šūnapvalkus veidojošo lielmolekulāro savienojumu hidrolīzi.


62

Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana Lizocīms (lizozīms) (lysozyme; muramidase ) EC 3.2.1.17

Veicina īsto baktēriju šūnapvalku sastāvā ietilpstošo peptidoglikānu (mureīnu) noārdīšanos, katalizējot hidrolīzi glikozīdiskajai saitei starp N-acetilmuramskābi un N-acetilglikozamīnu.

N-acetilglikozamīns N-acetilmuramskābe

(NAG) (NAM)


63

Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana Lizocīms (lizozīms) (lysozyme; muramidase ) EC 3.2.1.17

Dzīvnieku nespecifiskās imūnsistēmas sastāvdaļa, izdalās siekalās, pienā, sviedros, gremošanas traktā.

Lielā daudzumā atrodams putnu olu baltumā, izmanto arī pārtikā kā konservantu E 1105


64

Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana Rauga šūnu hitīna apvalku noārdīšanu veicina citi enzīmi, piemēram,

Zimoliāze (zymolyase) - EC 3.2.1.39,

ko iegūst no Arthrobacter luteus

vai

Gluzulāzi (glusulase) no vīngkiemežu Helix pomatia

zarnu ekstrakta, kas ir glikuronidāzes,

glikuron-sulfatāzes un celulāzes maisījums u.c.


65

Organiskā ekstrakcija.Organiskā ekstrakcija.

Lieto ar buferšķīdumu (ūdeni) piesātinātu fenolu;

Fenola:hloroforma:izoamilspirta maisījumu; (25:24:1)

Hloroformu.

Tās visas ir vielas ar hidrofobām īpašībām, ar kurām var labi denaturēt proteīnus un ekstraģēt hidrofobus piemaisījumus, piemēram, hēma gredzenus u.c.

Ūdens un organisko fāzi ņem tilpuma attiecībās 1:1


66


Tās visas ir vielas ar hidrofobām īpašībām, ar kurām var labi denaturēt proteīnus un ekstraģēt hidrofobus piemaisījumus.


67


Vorteksējot izveido abu fāzu emulsiju, lai palielinātu fāzu saskares virsmu.

Centrifugējot fāzes atdalās, starp tām paliek denaturētu piemaisījumu slānis (šūnapvalku polisaharīdi, proteīni u.c.).

DNS atrodas ūdens fāzē, to atsūc un pārnes uz jaunu stobriņu.

Ūdens fāze

Denaturētiepiemaisījumi

Organiskā fāze


68


!!! Fenola reakcijai jābūt viegli sārmainai vai neitrālai.

Ja reakcija ir skāba, DNS sāk šķīst organiskajā fāzē, kā rezultātā var rasties lieli DNS zudumi.

Fenolam ir tendence oksidēties par benzoskābi, kura paskābina organisko fāzi.

Vēlams fenolu līdzsvarot ar nedaudz sārmainu Tris buferšķīdumu un pievienot kādu antioksidantu (piemēram, oksihinolīnu.)


69


Fenola sagatavošana.

Pārdestilētu fenolu izkausē 50-60 oC ūdens vannā.

Pievieno tādu pašu tilpumu 1M Tris-Cl pH 8,0 un abas fāzes sajauc, maisot uz magnētiskā maisītāja (~15 min).Šajā procesā organiskās fāzes tilpums palielināsies.

Ļauj fāzēm atdalīties maisījumu nostādinot.

Novāc ūdens/buferšķīduma fāzi.


70



Pievieno tādu pašu tilpumu 0,1 M Tris-Cl pH 8,0 un abas fāzes sajauc, maisot uz magnētiskā maisītāja (~15 min).

Ļauj fāzēm atdalīties maisījumu nostādinot.

Pārbauda ūdens fāzes pH.Ja pH < 8,0 atkārto fenola līdzsvarošanu ar 1M Tris-Cl pH 8,0.


71



Kad buferšķīduma pH vairs nav būtiski samazinājies, pievieno oksihinolīnu (tā beigu koncentrācija organiskajā fāzē 0,1%) un, ja nepieciešams, vēl

citus komponentus (hloroformu, izoamilspirtu).

Iegūto maisījumu uzglabā zem 0,1 M (vai citas koncentrācijas) Tris-Cl pH 8,0.


72


Hloroformu izmanto:

lai denaturētu proteīnus un ekstraģētu hidrofobus savienojumus;

maisījumā ar fenolu, arī lai palielinātu organiskās fāzes blīvumu.


73


Izoamilspirtu izmanto:

lai palielinātu organiskā maisījuma virsmas spraigumu, kas novērš:

- putošanos apstrādes gaitā;- uzlabo ūdens un organiskās fāzes atdalīšanas iespējas.


74

DNS izgulsnēšanaDNS izgulsnēšana

Lai atbrīvotos no dažādiem:

- neorganiskiem sāļiem,

- deterģentiem,

- fenola/hloroforma paliekām,

- mazmolekulārajiem org. savienojumiem;

un palielinātu DNS koncentrāciju,

veic DNS izgulsnēšanu no šķīduma.


75


Izmanto lielmolekulāro NS īpatnību -

to šķīdība jūtami samazinās

50 - 60 % spirtu šķīdumos,

īpaši monovalento katjonu

(Na+, K+, Li+) klātbūtnē.


76


Li+ jonu klātbūtnē labāk izgulsnējas RNS molekulas.

Šo īpašību dažās metodēs izmanto, lai DNS paraugus atbrīvotu no lieliem RNS piemaisījumiem.

Izgulsnēšanai lieto 96o vai 100o etanolu tilpuma attiecībās 2:1 vai (pirmais skaitlis - spirta tilpums)

Izopropanolu tilpuma attiecībās 0,6:1 - 1:1


77


Var arī izgulsnēt tikai ar lielām ( virs 1M) monovalento katjonu (Na+, K+, Li+) koncentrācijām,

visbiežāk lieto NaCl.

taču šajā gadījumā grūtāk DNS atbrīvot no sāļu paliekām.

NaCl un LiCl parasti sagatavot 5M izejas šķīdumu veidā.


78


DNS efektīvāk izgulsnējas no koncentrētiem DNS šķīdumiem, kuros DNS pavedieni viegli sastop viens otru, saķeras kopā un veido lielus precipitātus.

Optimālā gadījumā visa genomiskā DNS saķeras vienā lielā kamolā, kuru var izcelt no šķīduma ar stikla āķīti vai piesūcot pipetes uzgalim.


79


Lai DNS veiksmīgi izgulsnētu no ļoti atšķaidītiem šķīdumiem, dažkārt papildus pievieno:

- attīrītu RNS,

- glikogēnu u.c.


80

DNS savākšanaDNS savākšana

Ja veidojas daudzi sīki DNS precipitātu fragmenti vai tos vispār nevar saskatīt, paraugs jācentrifugē.

Bieži pēc genomiskās DNS sablīvēšanas,

īpaši ja DNS ir daudz,

rodas problēmas ar tās izšķīdināšanu.

Labi izšķīst tikai īsie DNS fragmenti.


81

DNS attīrīšanaDNS attīrīšana

Lai atbrīvotos no palikušām

- neorganisko sāļu,

- izopropanola,

- fenola paliekām,

veic DNS nogulšņu mazgāšanu ar 700 (800) etanolu.

Šādā etanola koncentrācijā DNS nešķīst,

bet neorganiskie sāļi un citi mazmolekulārie savienojumi daļēji saglabā šķīdību.


82


DNS pārnes stobriņā ar 700 (70%) etanolu,

maisa invertējot (vai vorteksējot),

pārnes uz nākošo stobriņu.

Pēc tam atsūc etanola paliekas, var nedaudz pažāvēt (10-15 min.) telpas apstākļos.


83


Sablīvētu, kārtīgi izkaltētu genomisko DNS vairs

nevar izšķīdināt pat vārot !!!

DNS šķīdina dest. ūdenī vai

TE buferī.

TE 10 mM Tris-HCl, pH 7,5;

1 mM EDTA


84

DNS šķīdināšanaDNS šķīdināšana

DNS šķīšanas ātrums atkarīgs no fragmentu garuma, sablīvētības pakāpes un lielmolekulāru piemaisījumu daudzuma.

Pareizi izdalīta genomiskā DNS pilnībā izšķīst tikai pēc 12 - 24 stundām.

Genomiskās DNS šķīdumu iesaka glabāt 4oC


85

DNS uzglabāšanaDNS uzglabāšana

Iesaldēšana un atkausēšana rada DNS fragmentāciju.

Izdalīto DNS var fasēt mazos tilpumos,

lai novērstu atkārtotu iesaldēšanu un atkausēšanu.


86

DNS papildus attīrīšanaDNS papildus attīrīšana

Ja grib atbrīvoties no RNS piemaisījumiem DNS preparātā,

to var darīt ar RN-āžu (ribonukleāžu) palīdzību.

No RN-āzes savukārt atbrīvojas ar atkārtotu fenola (gloroforma) ekstrakciju un DNS pārgulsnēšanu.


87

RibonukleāzesRibonukleāzes

- enzīmi, kas katalizē RNS molekulu hidrolīzi.

Dažas RN-āzes šķeļ RNS molekulas pēc noteikta nukleotīda un tiek lietotas aptuvenas RNS nukleotīdu secības noteikšanai,

tomēr pārsvarā šķelšana ir nespecifiska vai vairāk saistīta ar RNS telpiskajām struktūrām.


88


RNāze A (pankreātiskā) EC 3.1.27.5

Iegūst no liellopu aizkuņģa dziedzera.

Endoribonukleāze, kas pazīst pirimidīna nukleotīdus un šķeļot veido fragmentus ar fosfātgrupu 3' galā un hidroksilgrupu 5' galā.

Izmanto DNS preparātu atbrīvošanai no RNS piemaisījumiem.


89


RNāze A

Vēlams lietot molekulārās bioloģijas tīrības klases enzīmu,

kurš speciāli attīrīts no DN-āzēm un svešas DNS piemaisījumiem.

RN-āze A ir termoizturīga, šo īpašību izmanto, lai to atbrīvotu no, parasti, termo nestabilajām DN-āzēm.


90


RNāze A

Izejas šķīdumu gatavo ūdunī vai TE buferī ar koncentrāciju 10 vai 1 mg/ml.

Pēc izšķīdināšanas 10 - 30 min. tur vārošā ūdens vannā.

Fasē nelielos tilpumos un glabā -20oC.

Darba šķīdumos parasti lieto koncentrācijas

50 - 5 µg/ml.


91


Papildus attīrīšanai var lietot

jonapmaiņas vai

gelfiltrācijas hromatogrāfijas kolonnas.

Var lietot ultracentrifugāciju CsCl2 gradientā vai pārgulsnēšanu ar PEG (polietilēnglikolu).


92

......


93

Diferenciālā šūnu lizēšana.

Pielieto, lai:

1. no asins paraugiem iegūtu tikai kodolainās šūnas;

2. no šūnām iegūtu tikai genomisko DNS (kodolus).

3. īpašos gadījumos (piemēram spermatozoīdu DNS atdalīšanai no somatisko šūnu DNS u.c.).


94


1.1.

Tikai nelielai asins šūnu daļai ir kodoli.

Lielā eritrocītu un trombocītu masa,

asins plazmas proteīni,

hemoglobīns u.c. savienojumi

rada tikai papildus piesārņojumu.


95


1.1.

Izmantojot bezkodolu šūnu palielinātu jūtību pret osmotisko šoku,

tās var noārdīt pirmās un savākt tikai kodolaino šūnu nogulsnes.

Asinīm pievieno vismaz 1 tilpumu (parasti vairāk) mazas sāļu koncentrācijas buferšķīdumu, lai radītu hemolīzi.


96


1.1.

Plaši tiek izmantots TE buferis.

Pēc centrifugēšanas nogulsnes mazgā

(atkārtoti resuspendē) TE buferī.

Šo procedūru atkārto līdz nogulsnes vairs tikai viegli sārtas. (dažkārt izmanto vienkārši H2O)

Tad tās resuspendē nelielā tilpumā līzes bufera un izdala DNS.


97


1.1.

Kodolainās šūnas no asinīm var sakoncentrēt arī ar centrifugācijas palīdzību.

Plazma

Kodolaino šūnu slānis

Eritrocīti

Tālākai apstrādei savāc kodolaino šūnu slāni.


98


Pielieto, lai:

1. no asins paraugiem iegūtu tikai kodolainās šūnas;

2. no šūnām iegūtu tikai genomisko DNS (kodolus).

3. īpašos gadījumos (piemēram spermatozoīdu DNS atdalīšanai no somatisko šūnu DNS u.c.).


99


2.2.

Izmanto, lai iegūtu tikai kodolā esošo DNS.

Šūnas ārējā, vienā slānī esošā membrāna, noārdās vieglāk nekā organellas aptverošais divkāršais membrānu slānis.

Izmantojot šo parādību var lizēt šūnu, nebojājot organellu (kodolu, mitohondriju u.c.) membrānas.


100


2.2.

Pēc tam organellas atdala, lietojot diferenciālo centrifugāciju.

Lielos un blīvos šūnu kodolus var viegli sedimentēt ar neliellu RCP. (~500g).

Šādos apstākļos mitohondriji netiek izgulsnēti.

Tālāk tiek apstrādāti tikai šūnu kodoli.


101


2.2.

Selektīvai ārējo membrānu lizēšanai lieto nejoniskos deterģentus, kuru iedarbība nav tik agresīva.

Bieži tiek izmantots Tritons X-100

alpha-[4-(1,1,3,3-tetramethyl butyl) phenyl]-omega-hydroxypoly (oxy-1,2-ethanediyl)


102


2.2.

Rezultātā atbrīvojas no

- citoplazmatiskajiem iedzimtības faktoriem,

- citoplazmatiskajiem proteīniem un citiem savienojumiem.


103

DNS izdalīšana.DNS izdalīšana.

Patreiz tiek piedāvāts liels skaits komerciālo komplektu DNS izdalīšanai un attīrīšanai.

http://www.thermoscientificbio.com/fermentas/

http://www.fermentas.com


104

DNS izdalīšana.DNS izdalīšana.

Izveidotas arī automātiskas un pusautomātiskas iekārts, kuras pielieto rutīnas medicīniskās analīzēs vai tieslietu medicīnā.

"-" lielas izmaksas un neliels DNS iznākums.

"+" standartizēta procedūra ar labu atkārtojamību.


105

DNS izdalīšanaDNS izdalīšana

Iepriekš aprakstītās metodes ļauj iegūt vidēja izmēra genomisko DNS,

kas piemērota bakteriofāgu un kosmīdu bibliotēku veidošanai, PCR veikšanai,

nav piemērota izteikti lielmolekulāras DNS iegūšanai.


106


Jebkuras manipulācijas ar DNS -

- fenola ekstrakcija,

- precipitācija,

- šķīdināšana

rada DNS mehānisku fragmentāciju.


107


Lai to novērstu,

visas manipulācijas veic ar agarozes gabaliņos ieslēgtu

DNS (paraugu).

Pēc PFGE vēlamā garuma DNS fragmenti tiek izdalīti no gela un iekonstruēti atbilstošā vektorā


108

......

Documents

Molekulārās metodes mikrobioloģijā