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MONITORAGGIO EPIDEMIOLOGICO DELLE INFEZIONI POLMONARI
IN PAZIENTI FC
Silvia Campana
Centro Fibrosi Cistica, Dipartimento di Pediatria
Università di Firenze
PROTOCOLLI PER IL CONTROLLO
DELLE INFEZIONI NEI CENTRI FC
Raccomandazioni del Cystic Fibrosis Trust’s Control of Infection Group, UK(J.W. Govan 2001)
•Protocollo delle infezioni nel Day Hospital del Centro FC della Toscana(F. Festini, G. Taccetti, S. Campana, G. Mergni)
•Infection control recommendations for patients with cystic fibrosis:Microbiology, important pathogens, and infection control practices to prevent patient-to-patient transmission. (Saiman et al. 2003 Am J Infect Control)
PROTOCOLLO PER IL CONTROLLO DELLE INFEZIONI
NEL CENTRO FC DI FIRENZE
1) Sommario delle evidenze disponibili al momento
2) Raccomandazioni per:
sorveglianza epidemiologica
limitare la diffusione delle infezioni
limitare le diffusioni crociate
3)Misure di segregazione
(misure dirette ad impedire il contatto tra pazienti colonizzati e non)
PROTOCOLLO PER IL CONTROLLO DELLE INFEZIONI NEL CENTRO FC Di FIRENZE
4)Misure di disinfezione :
eliminazione della contaminazione batterica da locali
dispositivi per spirometria e aerosol terapia
5) Misure di diluizione:
aereazione locali
limitare l’affollamento
lavaggio delle mani
6) Norme comportamentali
norme da osservare strettamente per i pazienti durante la loro permanenza al centro
MONITORAGGIO DELLE INFEZIONI
RESPIRATORIE IN FIBROSI CISTICA• analisi microbiologica di campioni respiratori (ogni tre mesi)
• valutazione della presenza di specifici anticorpi circolanti
anti-P. aeruginosa o anti-B. cepacia per evidenziare il
passaggio da colonizzazione superficiale a cronica
• esecuzione di controlli sull’ambiente e sul personale ospedaliero
• monitoraggio delle infezioni con tipizzazione molecolare di intraspecifica tutti i ceppi batterici isolati
Anticorpi anti-P. aeruginosa
MONITORAGGIO DELLE INFEZIONI OSPEDALIERE: METODI DI TIPIZZAZIONE INTRASPECIFICA
Tipizzazioni fenotipiche (basate su caratteristiche esterne):
sierotipizzazionetipizzazione fagicatipizzazione piocinica
Tipizzazione genomica
random amplification of polimorphic DNA (RAPD)
elettroforesi a campo pulsato (PFGE)
Multilocus restriction typing (MRLT)
BOX-PCR Fingerprinting
indispensabile nel caso di batteri altamente adattabili e variabili quali quelli isolati da pazienti FC
YY
sierotipo 1
sierotipo 2 P. aeruginosa
•L’analisi con endonucleasi di restrizione (REA) permette lo studio dell’intero genoma di un organismo
•Permette di evidenziare piccolissime differenze genetiche fra organismi anche quando non si esprimono a livello del fenotipo
•con tale metodica si riesce all’interno della stessa specie (tipizzazione intraspecifica) a distinguere i singoli microrganismi (diversi per virulenza, patogenicità, etc) P. aeruginosa
DNADNA
TIPIZZAZIONE GENOMICA
INTRASPECIFICA
TIPIZZAZIONE BATTERICA INTRASPECIFICA CON PFGE
•I frammenti di DNA prodotti dagli enzimi di restrizione (15-20) vengono separati tramite elettroforesi
•Data la grandezza dei frammenti di DNA così generati (da 0,2 a 9000 kb ) si utilizza una particolare tecnica elettroforetica: elettroforesi a campo pulsato (PFGE) in cui gli impulsi elettrici generati sono variabili in intensità e direzione
•Tale tecnica induce i frammenti di DNA a riorientarsi più volte
nella migrazione verso una carica positiva che varia di posizione.
•La risoluzione delle bande risulta notevolmente aumentata così
da rendere più semplice il confronto.
•Si possono separare frammenti di DNA da 10 a 100 volte maggiori
di quelli separabili con l’elettroforesi convenzionale
TIPIZZAZIONE BATTERICA
INTRASPECIFICA CON PFGE
DNA
POTENZIALI FONTI DI INFEZIONI
PER P. AERUGINOSA
Fonti ambientali:
diffuso in natura, nel suolo, nell’acqua le piante
Portatori:
colonizza la cute, l’orecchio esterno, l’intestino crasso di soggetti sani, infezioni gravi negli immunocompromessi e pazienti con fibrosi cistica.
Fonti nosocomiali:
soluzioni di lavaggio, disinfettanti, lavandini, endoscopi, piscine per fisioterapia, spirometri.
La maggior parte dei serbatoi è associata all’UMIDITA’.
Profilo genetico di ceppi di P. aeruginosa isolati da
pazienti FC
1 2 3 4 5 6
Ceppi epidemici di P. aeruginosa in FC
• 55 bambini Liverpool (Lancet 1996; 348: 639-42)
• 22 adulti Manchester (Lancet 2001; 358: 557-58)
• 5 pazienti Liverpool (Lancet 2001; 358: 558-60)
IMPORTANZA DI UNA IMPORTANZA DI UNA SORVEGLIANZA SORVEGLIANZA
BATTERIOLOGICA CON PFGEBATTERIOLOGICA CON PFGE
Sono stati analizzati ceppi di P. aeruginosa provenienti da 80 pazienti che si sono dimostrati genotipicamente diversi eccetto per 5 coppie di pazienti che a due a due mostrano ceppi con lo stesso profilo genetico.
ANALISI CON PFGE DI P.AERUGINOSA
a b a b a b a b 1 2 3 4
a b a b a b 5 6 7 8
•Ceppi di P. aeruginosa isolati da pazienti FC (1-7) analizzati con elettroforesi a campo pulsato (PFGE). Fenotipi diversi delle colonie: mucoidi e rugose (a e b) sono isolati dallo stesso paziente. N° 8 mostra un ceppo di isolamento ambientale.
P. aeruginosa: crescita dello stesso ceppo o ricolonizzazione?
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Lillquist Munck Gibson Taccetti
ricolonizzazionericrescita
%
* A B C B D A * A A A B A B A C B B * D B A B A B
Analisi con PFGE di ceppi di P. aeruginosa ottenuti da episodi isolati dicolonizzazione in 16 pazienti FC
* marker
POTENZIALI FONTI DI INFEZIONI
PER S. AUREUS
•Attualmente tutti i ceppi di S. aureus producono ß-lattamasi
•Negli anni 60 in seguito all’uso di meticillina è stato isolato il primo ceppo di MRSA
•La prevalenza di isolamento di MRSA è progressivamente aumentata in abito nosocomiale (terapie intensive) ed anche nei pazienti con FC
•la trasmissione avviene per contatto diretto paziente-paziente o indiretto attraverso individui sani compreso il personale ospedaliero.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
ANALISI CON PFGE DI MRSA
Ceppi di Staphylococcus aureus meticillino-resistenti analizzati con PFGEisolati da 9 pazienti FC
Campana S., et al J of Cystic Fibrosis. 2004.
B. cepacia complex e genomovars : concetti in espansione
• almeno 9 specie geneticamente
diverse
• all’interno del “complex”, se i test
biochimici consentono
l’identificazione, si attribuisce al
genomovar un nome specifico (ad
es. genomovar II --> B. multivorans),
altrimenti viene usato il termine
genomovar seguito da numerazione
romana.
•
GenomovarsGenomovarsI I (B.cepacia)(B.cepacia)II II (B. multivorans)(B. multivorans)III III (B. cenocepacia(B. cenocepacia))IV IV (B. stabilis)(B. stabilis)V V (B. vietnamiensis)(B. vietnamiensis)VI VI (B. dolosa)(B. dolosa)VII VII (B. ambifaria)(B. ambifaria)VIII VIII (B. anthina)(B. anthina)IX IX (B. pyrrocinia)(B. pyrrocinia)
The present species concept(Wayne et al. 1987, Ursing et al. 1995)
•"..."... The phylogenetic definition of a species generally would The phylogenetic definition of a species generally would include strains with at least 50 - 70% DNA-DNA relatedness ...”include strains with at least 50 - 70% DNA-DNA relatedness ...”
•““...It is recommended that a distinct genospecies that cannot ...It is recommended that a distinct genospecies that cannot be differentiated from another genospecies on the basis of any be differentiated from another genospecies on the basis of any known phenotypic property not be named until they can be known phenotypic property not be named until they can be differentiated by some phenotypic property...”differentiated by some phenotypic property...”
•La definizione filogenetica di specie prevede che si La definizione filogenetica di specie prevede che si possano includere nella stessa specie organismi possano includere nella stessa specie organismi che abbiano almeno il 70% di omologia del DNAche abbiano almeno il 70% di omologia del DNA
•I vari genomovar di I vari genomovar di B. cepaciaB. cepacia hanno un grado di hanno un grado di omologia inferiore al 70% pertanto appartengono a omologia inferiore al 70% pertanto appartengono a specie diversespecie diverse
POTENZIALI FONTI DI INFEZIONI
PER B. CEPACIA
•Gli ultimi studi tassonomici identificano 9 genomovar o specie genomiche (omologia genetica maggiore del 70% analizzata con studi di ibridazione del DNA)
•Genomovar VI si isola solo da pazienti FC
•I genomovar I, II, III, IV, VII, VIII e IX sono isolati da fonti umane ed ambientali (isolamento prevalente dal suolo, campi di cipolle, rizosfera del mais)
•Uso in agricoltura quale biopesticida e fertilizzante.
Profilo genetico di ceppi di B. cepacia isolati da pazientiFC(1-6) e da pazienti oncologici (7-8-9) eseguita con PFGE
PAZIENTI FC PAZIENTI ONCOLOGICI
ANALISI CON PFGE DI B. CEPACIA
GenomovarGenomovar
I I (B.cepacia)(B.cepacia)
II II (B. multivorans)(B. multivorans)
III III (B. cenocepacia(B. cenocepacia))
IV IV (B. stabilis)(B. stabilis)
V V (B. vietnamiensis)(B. vietnamiensis)
VI VI (B. dolosa)(B. dolosa)
VII VII (B. ambifaria)(B. ambifaria)
VIII VIII (B. anthina)(B. anthina)
IX IX (B. pyrrocinia)(B. pyrrocinia)
CanadaCanada**
(n = 445)(n = 445)
0.20.2
9.79.7
82.982.9
3.83.8
1.61.6
--
--
--
--
USA USA * *
((n = 606)n = 606)
2.62.6
37.837.8
50.050.0
0.20.2
5.15.1
2.02.0
0.70.7
--
--
* Speert * Speert et alet al (2002), (2002), LiPuma LiPuma et al et al (2001) (2001), ,
Campana et al Pediatr. Pulmonol (2003)
PREVALENZA DI B. CEPACIA COMPLEX (%)
ItalyItaly
(n = (n = 178)178)
12.312.3
5.65.6
6363
7.87.8
0.60.6
--
0.60.6
0.60.6
4.54.5
RISULTATI DELL’ANALISI CON PFGE ( 133 ceppi di B. CEPACIA ISOLATI DA
18 Centri FC Italiani )
76 (57%) degli isolati sono divisi in 19 gruppi
57 (43%) degli isolati producono un profilo genetico singolo
6 gruppi contengono 2 ceppi– ogni coppia proviene dallo stesso Centro FC 8 gruppi contengono da 3 a 8 ceppi provenienti dallo stesso centro5 gruppi contengono isolati provenienti da più di un centro
Scelta della tecniche di tipizzazione genetica
studi epidemiologici su bassa scala
random amplification of polimorphic DNA (RAPD)
elettroforesi a campo pulsato (PFGE)
studi epidemiologici su larga scala
Multilocus restriction typing (MRLT)
BOX-PCR Fingerprinting
Tecniche di tipizzazione geneticaSymilarity % Ceppi di B. cepacia
T. Coenye et al. J Clin Microbiol 2002
COME SI EVIDENZIA UN CLONE EPIDEMICO?
•In base al tipo di approccio metodologico si può arrivare a conclusioni diverse •importanza della scelta del metodo di genotipizzazionein base al tipo di studio