Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur ... · Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur Blattentwicklung und Blattevolution bei Gymnospermen am Beispiel

Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur

Blattentwicklung und Blattevolution bei Gymnospermen

am Beispiel Sciadopitys verticillata (THUNB.) SIEBOLD & ZUCC.

Dissertation

zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultt fr Biologie und Biotechnologie

der Ruhr-Universitt Bochum

angefertigt im

Lehrstuhl fr Evolution und Biodiversitt der Pflanzen

vorgelegt von

Diplom-Biologin

Nicole Hille

aus

Dortmund

Bochum 2008

Referent: Prof. Dr. Th. Sttzel

Korreferent: Prof. Dr. R. Tollrian

Das Gras wchst nicht schneller

wenn man daran zieht.

Afrikanisches Sprichwort

fr meine Eltern

INHALTSVERZEICHNIS

i

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS ............................................................................................ i ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..................................................................................... iv ABKRZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................... vi 1 EINLEITUNG ...................................................................................................... 1

1.1 Der pflanzliche Bauplan ........................................................................................................ 1

1.1.1 Das Meristem ............................................................................................................... 1

1.1.2 Bltter & Kurztriebe ..................................................................................................... 3

1.1.3 Ausgangspunkt: Doppelnadel-Problematik ................................................................ 4

1.2 Entwicklungsgenetische Lsungsanstze ............................................................................ 8

1.2.1 Pflanzliche Knox-Gene ................................................................................................ 10 1.2.2 Knox-Expression & der pflanzliche Bauplan ............................................................... 13

1.3 in-situ-Hybridisierung ............................................................................................................ 16 1.4 Ziel der Arbeit ....................................................................................................................... 17

2 MATERIAL & METHODEN ..................................................................................... 19

2.1 Pflanzenmaterial .................................................................................................................... 19

2.1.1 Materialsammlung ....................................................................................................... 19

2.1.2 Anzucht der Keimlinge ................................................................................................ 20

2.2 Morphologisch-anatomische Methoden ............................................................................... 20

2.2.1 Fixierung ...................................................................................................................... 20

2.2.2 Mikrotomtechnik .......................................................................................................... 20

2.2.3 Rasterelektropnenmikroskopie (REM) ......................................................................... 23

2.3 Molekulargenetische Methoden ........................................................................................... 24

2.3.1 Allgemeines . ................................................................................................................ 24

2.3.1.1 Primerdesign ................................................................................................... 24

2.3.1.2 Sequenzanalyse .............................................................................................. 24

2.3.2 Material fr Molekulargenetische Methoden ............................................................... 24 2.3.2.1 Oligonukleotide ............................................................................................... 26

2.3.2.2 Plasmide ......................................................................................................... 27

2.3.2.3 Bakterienstmme ............................................................................................ 27

2.3.2.4 Kits .................................................................................................................. 28

2.3.2.5 Lsungen......................................................................................................... 28

2.3.3 Isolierung von RNA & DNA aus Pflanzen .................................................................... 29

2.3.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsuren .......................................................... 30

INHALTSVERZEICHNIS

ii

2.3.5 cDNA-Synthese ........................................................................................................... 30

2.3.6 PCR - Amplifikation von DNA-Fragmenten .................................................................. 31

2.3.7 Agarose-Gelelektrophorese ......................................................................................... 32

2.3.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen .................................................. 32

2.3.9 Ligation von DNA-Fragmenten..................................................................................... 32

2.3.10 Kultivierung von E. coli .............................................................................................. 33 2.3.11 Prparation von Plasmid-DNA aus E. coli.................................................................. 34 2.3.12 Verdau von DNA mittels Restriktionsendonukleasen................................................. 34

2.3.13 DNA-Fllung (Phenolextraktion)................................................................................. 34

2.3.14 in-vitro-Transkription: Herstellung Digoxigenin-markierter RNA-Sonden .................. 35 2.3.15 Expressionsnachweis im Gewebe in-situ-Hybridisierung ...................................... 36

2.3.15.1 Fixieren & Schneiden des Gewebes ............................................................. 37

2.3.15.2 Prhybridisierung .................... .................................................................... 38

2.3.15.3 Hybridisierung .............................................................................................. 40

2.3.15.4 Waschen nach der Hybridisierung................................................................ 41

2.3.15.5 Detektion des Signals ................................................................................... 41

2.3.15.6 Reaktionsstop ................................................................................................ 42

2.3.16 Heterologe Expression in E. coli ............................................................................... 42

2.4 Dokumentation ...................................................................................................................... 43

2.4.1 Mikroskopie & Bilderfassung ....................................................................................... 43

2.4.2 Digitalfotografie ........................................................................................................... 44

2.4.3 Bildbearbeitung ........................................................................................................... 44

3 ERGEBNISSE ..................................................................................................... 45

3.1 Morphologisch-anatomische Ausgangsbasis ...................................................................... 45

3.1.1 Morphogenese ............................................................................................................ 45 3.1.1.1 Sciadopitys verticillata - Kladodienentwicklung ............................................. 45 3.1.1.2 Abies homolepis - Nadelentwicklung ............................................................. 47

3.1.2 Leitbndelanschluss ................................................................................................... 49 3.1.2.1 Sciadopitys verticillata .................................................................................... 49 3.1.2.2 Abies homolepis ............................................................................................. 50 3.1.2.3 Pinus sylvestris ............................................................................................... 51

3.1.2 Anatomie der Sciadopitys-Kladodien ......................................................................... 52 3.1.3 Untersuchungen an Sciadopitys-Keimlingen .............................................................. 53

3.2 Primerdesign ......................................................................................................................... 60

3.3 Vorwort zu Methodenetablierung .......................................................................................... 63

3.3.1 Nukleinsuregewinnung aus Gymnospermen ............................................................ 63

3.3.2 KNAT1 Arabidopsis thaliana .................................................................................... 64 3.3.3 HBK1 Picea abies ..................................................................................................... 67

3.4 Molekulargenetische Anstze im Sciadopitys-Modell........................................................... 69

3.4.1 Funktionalittstest mit PhyN1 ...................................................................................... 69 3.4.2 Test zur Synthese von cDNA ....................................................................................... 70

3.4.3 SvKnox Suche nach Knox-Genen mit degenerierten Primern ................................. 70

INHALTSVERZEICHNIS

iii

3.4.4 Sondenherstellung fr SvKnox .................................................................................... 75

3.5 Expressionsnachweis fr SvKnox ......................................................................................... 77

3.5.1 in-situ-Hybridisierung Methodisch ........................................................................... 77 3.5.1.1 Fixieren & Schneiden des Gewebes .............................................................. 78

3.5.1.2 Prhybridisierung ........................................................................................... 80

3.5.1.3 Hybridisierung ................................................................................................ 81

3.5.1.4 Waschschritte ................................................................................................. 82

3.5.1.5 Detektion des Signals ..................................................................................... 82

3.5.1.6 Reaktionsstop ................................................................................................. 84

3.5.2 in-situ-Hybridisierung Inhaltlich ................................................................................ 84 3.5.2.1 Expression in vegetativen Knospen ............................................................... 85

3.5.2.2 Expression in Blttern ..................................................................................... 88

3.5.3 Heterologe Expression von SvKnox ............................................................................ 91

3.6 Knox-Suche in Phyllocladus trichomanoides ....................................................................... 92

4 DISKUSSION ...................................................................................................... 94

4.1 Morphologische Ausgangssituation ..................................................................................... 94

4.2 Keimlingsentwicklung ........................................................................................................... 99

4.3 Methodenetablierung ............................................................................................................ 100

4.4 Knox & Sciadopitys ............................................................................................................... 101 4.5 Ursprung des Gymnospermenblattes .................................................................................. 105

4.6 Ausblick ................................................................................................................................ 106

5 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................... 108 6 LITERATURVERZEICHNIS ...................................................................................... 110 7 ANHANG ........................................................................................................... 116

DANKSAGUNG

LEBENSLAUF

ERKLRUNG

ABBLIDUNGSVERZEICHNIS

iv

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abb. 1: Schematische Darstellung zum pflanzlichen Grundbauplan. ....................... 2

Abb. 2: Schematische Darstellung der Triebdifferenzierung bei Gymnospermen. ... 3

Abb. 3: S. verticillata, Theorien zur Doppelnadel-Problematik. .................................. 4

Abb. 4: S. verticillata, Habitus. ................................................................................... 5

Abb. 5: Morphologische Gegenberstellung von S. verticillata & A. homolepis. ....... 7

Abb. 6: Thuja plicata, Schematische Darstellung des Sprossquerschnittes. ............ 8

Abb. 7: Schema zur unterschiedlichen Einflussnahme von KNOX-Transkriptions-

faktoren auf die Wachstumsregulierung. ....................................................... 11

Abb. 8: Schematischer Aufbau eines KNOX-Proteins. ............................................... 12

Abb. 9: Schematische Darstellung zum Scheitelmeristem (SAM). ............................. 14

Abb. 10: S. verticillata, Kladodienentwicklung. ............................................................ 46

Abb. 11: S. verticillata, Langtriebachse mit Schuppenblttern. ................................... 47

Abb. 12: A. homolepis, Nadelentwicklung. .................................................................. 48

Abb. 13: S. verticillata, Leitbndelanschluss der Kladodien. ....................................... 49

Abb. 14: A. homolepis, Leitbndelanschluss eines Nadelblattes. ............................... 50

Abb. 15: P. sylvestris, Leitbndelanschluss eines Kurztriebes. ................................... 51

Abb. 16: S. verticillata, Kladodium im Querschnitt. ...................................................... 52

Abb. 17: S. verticillata, reifer Same. ............................................................................. 54

Abb. 18: Keimungsreihe I: Fotodokumentation der Keimungsreihe K4. ...................... 56

Abb. 19: Keimungsreihe II: Schema & Lichtmikroskopische Aufnahmen (K4). ........... 57

Abb. 20: Keimungsreihe III: Fotodokumentation lterer Keimlinge aus K2. ................. 58

Abb. 21: Mikroskopische Aufnahmen zur Anlage der Primordien am Vegetations-

kegel. ............................................................................................................. 59

Abb. 22: Aminosurenalignment zu Knox-Gensequenzen der Klasse 1. .................... 62

Abb. 23: A. thaliana, cDNA-Synthese von KNAT1 & Klonierungskontrolle durch

Restriktion. ..................................................................................................... 65

Abb. 24: A. thaliana, Primertest mit KNAT1-Fragment. ................................................ 66

Abb. 25: P. abies, Schema zum Primertest fr dP-SvKnox und HBK1-Teilfragment. .. 68

Abb. 26: P. abies, Restriktionskontrolle fr 359 bp-Insert. ........................................... 68

Abb. 27: S. verticillata, Primertest mit PhyN1-Fragment (579 bp) & Kontrolle der

cDNA-Synthese. ............................................................................................. 69

Abb. 28: S. verticillata, cDNA-Synthese mit dP-SvKnox & Klonierungskontrolle. ........ 71

Abb. 29: Schema der ermittelten Sciadopitys-Sequenz im Vergleich zur KNOX-

Proteinsequenz von P. abies (HBK1). ............................................................ 74

ABBLIDUNGSVERZEICHNIS

v

Abb. 30: S. verticillata, Testgel zur Sondenherstellung. ............................................... 75

Abb. 31: S. verticillata, in-vitroTranskription & Dot Blot. ............................................. 77

Abb. 32: Sciadopitys-Gewebe nach Proteinase K-Behandlung. ................................. 80

Abb. 33: Detektionslsung: Gewebe mit Rckstnden des Frbesubstrats. ............... 83

Abb. 34: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Lngsschnitten vegetativer

Knospen 6 Monate alter Keimlinge (I). .......................................................... 86

Abb. 35: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Lngsschnitten vegetativer

Knospen 6 Monate alter Keimlinge (II). ......................................................... 87

Abb. 36: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Lngsschnitten des terminalen

Sprossabschnittes 10 Wochen alter Keimlinge. ............................................ 89

Abb. 37: S. verticillata, in situ-Hybridisierung an Querschnitten von Keimblttern. .... 90

Abb. 38: Heterologe Expression von SvKnox. .............................................................. 91

Abb. 39: P. trichomanoides, cDNA-Synthese mit dP-SvKnox & Klonierungskontrolle. 92

Abb. 40: Schema der ermittelten Phyllocladus-Sequenz. ............................................ 93

Abb. 41: Sciadopitys-Kladodium und Nadelbltter im schematischen Querschnitt. ... 95

Abb. 42: Schema zur Transformationsreihe & Variabilitt triebdifferenzierter

Systeme. ........................................................................................................ 97

Abb. 43: Schema zu genetischen Interaktionen am Scheitelmeristem. ....................... 99

Abb. 44: Schematische Darstellung ausgewhlter Typen von Expressionsmustern

im Scheitelmeristem. ...................................................................................... 104

Abb. 45: Demonstration hypothetischer Expressionsmuster an REM-Aufnahmen

von A. homolepis & P. trichomanoides. ......................................................... 105

---

A1: Aminosurenalignment zu Knox-Gensequenzen der Klassen 1&2. ................. 117

A2: Verifizierung der aus SvKnox abgeleiteten Aminosurensequenz eines

Homodomnen-Proteins der KNOX-Familie & der dazugehrigen

Nukleotidsequenz. ............................................................................................ 118

A3: S. verticillata, Astrablau-Safranin gefrbte Blattquerschnitte. .......................... 119

A4: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Querschnitten von Primrblttern. ...... 120

ABKRZUNGSVERZEICHNIS vi

ABKRZUNGSVERZEICHNIS

AK Antikrper AP Alkalische Phosphatase AS Aminosure(n) BP Brevipedicellus, KNAT1 bp Basenpaare BSA Bovine (Rinder-) Serum

Albumin C Cuticula cDNA komplementre DNA DEPC Diethyl-Pyrocarbonat DIG Digoxigenin DNA Desoxyribonukleinsure DNase Desoxyribonuklease (d)NTP (Desoxy-)Ribonukleosid

Triphosphat dP degenerierter Primer ds DNA doppelstrngige DNA E Epidermis E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat Em Embryo En Endosperm (primres) Es Embryosack FAA (FAE) Formalin-Alkohol-Eisessig for forward (5-3-Orientierung) H Hypodermis Ha Haare HBK Homeobox of KNOX class Hi Hilum HK Harzkanal Hy Hypokotyl IPTG Isopropylthiogalactosid K Kladodium kb Kilobasen KN1 Knotted1 KNAT Knotted-like aus A. thaliana KNOX Knotted1-like homeobox Ko Kotyledon/Keimblatt Kp Kladodienprimordium Ks Knospenschuppe KSp Kladodienspur KT Kurztrieb(achse) LB Leitbndel LS Leitbndelscheide LT Langtrieb(achse) M Marker MIA Multiple Image Alignment mRNA Messenger RNA

NBT/BCIP Nitroblau-Tetrazoliumsalz/

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat

NCBI National Center for Biotechnology Information

Np Nadel(blatt)primordium NSp Nadel(blatt)spur OD Optische Dichte P Primrblatt p. a. per analysis, zur Analyse Pa Papillen PBS Sodium-Phosphat-Puffer PCR Polymerase-Kettenreaktion PFA Paraformaldehyd(-Fixierung) Pp Palisadenparenchym pW Primrwurzel Pwo Pyrococcus woesei Ra Radicula/Keimwurzel REM Rasterelektronenmikroskopie rev. reverse (3-5-Orientierung) RNA Ribonukleinsure (RNS) RNase Ribonuklease rpm Umdrehungen pro Minute S Stomata SAM shoot apical meristem (Scheitelmeristem) Sb Schuppenblatt SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Sp Schwammparenchym SR Stomatareihe Su Suspensor T Testa TALE Three Amino Acid Loop

Extension (PYP) TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer Taq Thermus aquaticus u unit (funktionelle Einheit) . N. ber Nacht UTP Uridintriphosphat VK Vegetationskegel Wh Wurzelhals X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl--D-

galactopyranosid ZSp Zweigspur

EINLEITUNG 1

1 EINLEITUNG

1.1 Der pflanzliche Bauplan

Pflanzen sind ohne die Mglichkeit eines spontanen Standortwechsels im Unterschied zu

Tieren gezwungen, sich den jeweiligen Standortbedingungen mit allen Vor- und

Nachteilen anzupassen. Bei Pflanzen gleicher genetischer Konstitution kann die

phnotypische Ausprgung standortbedingt sehr variabel ausfallen. Im Verlauf der

pflanzlichen Entwicklung wird nur ein grundlegender Bauplan angelegt, der sich aus

Wurzel und Spross (= Sprossachse + Bltter) bzw. den drei universellen vegetativen

Grundorganen Wurzel, Sprossachse und Blatt zusammensetzt (Abb. 1). Die pflanzliche

Entwicklung zeichnet sich durch die Fhigkeit zur kontinuierlichen Anlage neuer Organe

aus, die auf der Aufrechterhaltung der meristematischen Aktivitt in bestimmten

Bereichen des Pflanzenbauplans, den so genannten Meristemen, beruht. Ein Teil dieser

meristematischen Zellen bleibt das Pflanzenleben lang undifferenziert, whrend ein Teil

der Zellen ausdifferenziert und die Anlage lateraler Organe (z. B. Bltter) initiiert. Die

Grundlagen fr ein besseres Verstndnis der Diversitt und Komplexitt im Laufe der

Evolution (z. B. der Bauplne der Landpflanzen) werden unter dem Schlagwort evo-

devo bzw. evodevotics (evolutionary developmental biology) als einer neuen Disziplin,

zusammengefasst (THEISSEN et al, 2000; RAFF, 2000 & RAFF, 2007). Die Anstze liegen

darin die morphologischen Vernderungen im Organismus ber die Zeit mit

verschiedenen Disziplinen und aus verschiedenen Ansatzrichtungen zu betrachten und

zu einer gemeinsamen Aussage zu verbinden. Fr Einblicke in die Evolution und deren

Formenvielfalt ist u. a. das Verstndnis so genannter Entwicklungskontrollgene mit

entscheidend (SINGER & ASHTON, 2007).

1.1.1 Das Meristem

Der grundlegende Pflanzenbauplan wird schon im Zuge der Embryogenese festgelegt

und nicht verndert. Die ersten Organisationsschritte konzentrieren sich auf die

Festlegung der Hauptachsen (apikal-basal, dorsal-ventral, proximal-distal) und die

Formierung der zwei wichtigsten pflanzlichen Meristeme, des Spross- und des

Wurzelmeristems. Das Sprossmeristem ist Ursprung aller oberirdischen vegetativen und

EINLEITUNG 2

generativen Organe, das Wurzelmeristem bringt die unterirdischen Pflanzenteile hervor.

Eine bedeutende Aufgabe der Meristeme liegt in der postembryonalen Organisation der

morphogenetischen Prozesse. Meristeme zeichnen sich durch zwei Eigenschaften aus,

die essentiell fr ein kontinuierliches Wachstum des Pflanzenkrpers sind. Sie bringen

nicht nur immer neue Bltter, Blten und Triebgewebe hervor, sondern sind darber

hinaus auch gleichzeitig zur Selbstorganisation und Selbsterhaltung befhigt.

Im Bereich des Sprossscheitels bzw. des Scheitelmeristems, kurz SAM (shoot apical

meristem), differenziert ein Teil der meristematischen Zellen, mit Determinierung neuer

Organe, aus und wird anschlieend durch neu gebildete undifferenzierte Zellen

kompensiert bzw. wieder aufgefllt. Die Anlage lateraler Organe, wie z. B. Bltter,

unterliegt dabei einem genauen Muster (Phyllotaxis). Die Blattform ist im bergang aus

dem juvenilen zum adulten Stadium sehr variabel. Bltter und Blten sind in ihrem

Wachstum begrenzte Strukturen, whrend z. B. Seitenzweige (z. T.) undeterminiert

bleiben. Histologisch lsst sich das Scheitelmeristem hherer Pflanzen in zwei Zonen

unterteilen. Die zentrale Zone umfasst die sich nur sehr langsam teilenden Initialzellen,

die Ausgangspunkt aller anderen meristematischen Zonen und der Selbsterhaltung sind.

Die periphere Zone zeichnet sich durch eine schnellere Zellteilung aus und bildet den

Ausgangspunkt der Organogenese (JACKSON et al., 1994; HAKE & JACKSON, 1995; ORI et

al., 2000; vergleiche 1.2.2: Abb. 9).

Abb. 1: Schematische Darstellung zum pflanzlichen Grundbauplan. (nach GIFFORD & FOSTER, 1989,verndert). Pflanzenkrper einer stark schematisierten Dikotylen mit Wurzel, Sprossachse und Blttern. Sprossachse und Bltter werden zusammengefasst als Spross bezeichnet. Das Meristem des Sprossscheitels (Scheitelmeristem) dient der Anlage aller oberirdischen Organe, das Wurzelmeristem dient der Anlage von Wurzeln. Seitenverzeigungen gehen aus axillren Meristemen hervor und inserieren jeweils in den Achseln von (Trag-)Blttern.

EINLEITUNG 3

1.1.2 Bltter & Kurztriebe

Die meisten Bltter der rezenten Gymnospermen werden umgangssprachlich als Nadeln

bezeichnet, sind in Gre und Form jedoch variabel. Die nadelfrmigen, lnglichen und

mehr oder weniger stark abgeflachten Bltter finden sich hauptschlich bei Koniferen

(z. B. Pinaceae und Taxaceae). Bei Sprosssystemen unterscheidet man generell solche,

die immer einheitlich aufgebaut sind und daher als nicht triebdifferenziert anzusprechen

sind von triebdifferenzierten Systemen bei denen man zwischen Lang- und Kurztrieben

unterscheidet. Bei Triebdifferenzierung ist das Vorkommen von Blttern an lteren

Zweigen (nach Abwurf der Langtriebbltter) auf die Kurztriebachse beschrnkt. Bei den

Gymnospermen Abies (Abb. 2 A) und Torreya findet man z. B. undifferenzierte

Sprosssysteme. Alle Triebe inklusive ihrer Benadelung sind hier gleich gestaltet.

Abb. 2: Schematische Darstellung der Triebdifferenzierung bei Gymnospermen. A: gleich gestaltete Seitenaustriebe mit terminaler, vegetativer Knospe und spiralig an der Achse stehenden Nadeln. B: Kurztriebe in Form blattartig verbreiterter Kladodien (= Phyllokladien), Schuppenbltter der einzelnen Teilphyllokladien erkennbar. C: von Schuppenblttern eingehllte, reduzierte Kurztriebachsen stehen in Achseln von spiralig angeordneten, schuppenfrmigen Tragblttern des Langtriebes; an lteren Zweigen ausschlielich Kurztrieb-Nadeln vorhanden. D: Schirm im Aufriss; terminale, vegetative Knospe umgeben von sog. Kladodien bzw. Kurztrieben, die in Achseln spiralig angeordneter Schuppenbltter des Langtriebes stehen und umgangssprachlich als Doppelnadeln bezeichnet werden.

A

C D

B

EINLEITUNG 4

Bei Pinus sylvestris als Vertreter mit Triebdifferenzierung findet man, sptestens an im

zweiten Jahr unbenadelten Langtriebachsen, stark gestauchte 2-nadelige Kurztriebe. Die

Kurztriebachse selbst ist nicht sichtbar in eine Niederblattscheide eingehllt, erkennbar

sind bei Pinus ausschlielich die Kurztriebnadeln (Abb. 2 C). In der Gattung Phyllocladus

kommen Kurztriebe in Form blattartig verbreiterter, photosynthetisch aktiver

Flachsprosse vor an deren Randbereichen die eigentlichen Bltter bis auf kleine

Schuppenbltter reduziert sind (Abb. 2 B). Ein weiteres Beispiel fr eine Langtrieb-

Kurztrieb-Differenzierung findet sich in der Gattung Sciadopitys mit charakteristisch

schirmfrmig angeordneten nadelartigen Kurztrieben, die auch als Doppelnadeln

bezeichnet werden (Abb. 2 D).

1.1.3 Ausgangspunkt: Doppelnadel-Problematik

Fr ein evolutives Verstndnis ist die Betrachtung von als sehr ursprnglich geltenden

Taxa mit Hilfe klassischer botanischer Methoden interessant. Im Zusammenhang mit der

Suche nach neuen Erkenntnissen fr ein besseres Verstndnis von der Funktion und

Evolution der Gymnospermenbltter scheint eine weitere Betrachtung von Sciadopitys

verticillata (THUNB.) SIEBOLD & ZUCC., als einem sehr ursprnglichen und damit sicherlich

phylogentisch aussagekrftigen Taxon, viel versprechend. Die Natur der Doppelnadeln

bzw. der Organcharakter der photosynthetisch aktiven Flachsprosse (Kladodien) bei

S. verticillata war wiederholt Thema verschiedener Arbeiten (ROTH, 1962; TROLL, 1937;

SCHNEIDER, 1913; GBEL, 1913, STRASBURGER, 1872; MOHL, 1871; ENGELMANN, 1868;

DICKSON, 1866). So lassen sich zur Klrung der morphologischen Natur der nadelartigen

Kladodien bzw. der Blattentwicklung und deren mgliche phylogenetische Folgen grob

zwei Ansichten trennen (Abb. 3).

Abb. 3: S. verticillata, Theorien zur Doppelnadel-Problematik. A: Verwachsungstheorie-ENGELMANN(1868); VON MOHL (1871); STRASBURGER (1872) & SCHNEIDER (1913); Vegetationspunkt des Kurztriebes erschpft sich in der Bildung der beiden kongenital verwachsenen Blattanlagen, die basal-interkalar in gemeinsamer Basis wachsen (Pfeil), Hauptanteil der Doppelnadel: Blattgewebe. B: Phyllokladientheorie- DICKSON (1866); TROLL (1937); ROTH (1962); der Vegetationskegel des Sprosses/phylloiden Stengels (DICKSON, 1866) baut die gesamte Doppelnadel auf, Hauptanteil der Doppelnadel: Achsengewebe; terminale Doppelspitze gedeutet als zwei Blattrudimente des Kurztriebes.

EINLEITUNG 5

Die entsprechenden Untersuchungen zum Organcharakter der Sciadopitys-Kladodien

befassen sich stets mit der Frage welcher Anteil Blatt und welcher Anteil Sprossachse

ist. Gegenwrtig lsst sich als Ausgangsbasis stark vereinfacht festhalten, dass die

Zuordnung der Doppelnadeln rein anatomisch und morphologisch ber ihre Stellung klar

zu Gunsten des Sprosscharakters zu treffen ist (z. B. ROTH, 1962). Die Doppelnadeln

sind demnach, aktuell als photosynthetisch aktive Flachsprosse anzusehen, weil sie in

der Achsel von Tragblttern inserieren und sind folglich auch als nicht blatthomolog zu

betrachten (Abb. 4).

Abb. 4: S. verticillata, Habitus. A: Solitrpflanze im Botanischen Garten Marburg. B: mit Schuppenblttern besetzter Langtrieb, der terminal die charakteristisch schirmfrmig angeordneten Kladodien (K) bzw. Doppelnadel-artigen Kurztriebe trgt. C: Aufsicht auf vegetative Knospe im Zentrum des Schirms. Vegetationskegel und junge Blattanlagen unter Knospenschuppen (Ks) geschtzt verborgen. D: Vegetative Knospe in lateraler Ansicht, spiralig angeordnete Schuppenbltter (Sb) des Langtriebs durch gestauchte Internodien terminal gehuft, Kladodien aus Schuppenblattachseln entfernt (Pfeil).

EINLEITUNG 6

Inwiefern an diesen Doppelnadel-artigen Kurztrieben bzw. Kladodien noch Blattanteile

vorhanden sind ist spekulativ. Im Kontext dieser Arbeit interessiert besonders, ob eine

Umgestaltung eines kompletten Kurztriebes bzw. einer Kurztriebachse hin zu einer

Struktur, die dann insgesamt als Blatt anzusprechen ist, nicht nur mglich sein kann,

sondern darber hinaus, ob dies (noch) nachweisbar ist. Letzteres hiee stark

vereinfacht, dass in Teilen, die Blatt sind, hauptschlich blattspezifische Gene aktiv sind

und in Sprossen demnach eher die Aktivitt sprossspezifischer Gene zu erwarten ist.

Die umgangssprachliche Bezeichnung Doppelnadel fr die Sciadopitys-Kladodien ist mit

Sicherheit nicht zuletzt das Resultat der sehr blatthnlichen Umgestaltung der

Kurztriebe. Wie weit die hnlichkeit der angesprochenen Kladodien mit normalen Nadeln

morphologisch, anatomisch und morphogenetisch (bereits) geht, bleibt allerdings offen.

Einzig das Vorkommen von Tragblttern schliet die Deutung als Blatt aus und besttigt

gleichzeitig den Sprosscharakter. Wrden die Tragbltter der Kladodien komplett

reduziert werden und fehlen, knnte man ihnen aufgrund ihrer Lage und

Entstehungsweise sowie ihres blattartigen anatomischen Aufbaus (STRASBURGER 1872;

ROTH, 1962) ohne weiteres reinen Blattcharakter zusprechen und sie fr ganz

gewhnliche Nadelbltter halten. Aufgrund dieser Tatsache gibt der bei Sciadopitys

gefundene Sachverhalt Anlass dazu, die nadelartigen Kurztriebe als ein einzelnes

Stadium (Momentaufnahme) einer Transformationsreihe anzusehen, bei der ein axillrer

Kurztrieb sekundr in ein typisches Blatt umgewandelt wird. Als mgliche Folge wren

die umgewandelten Kurztriebe morphologisch nicht mehr von Blttern zu unterscheiden.

Die im Fall von Sciadopitys nur hypothetisch anzunehmende Reduktion von Tragblttern

kommt in anderen Pflanzenfamilien durchaus vor. Eine Reduktion bis zum vollstndigen

Fehlen (Ablast) ist von den Tragblttern der Blten bei Asteraceen und Eriocaulaceen

(Syngonanthus) bekannt. Innerhalb der Familie der Asteraceae ist die Reduktion von

Tragblttern der Einzelblten (Spreuschuppen) im Bereich des Bltenstandes in einigen

Gattungen verbreitet und ein auf Gattungsniveau bestimmungsrelevantes Merkmal. Man

findet Reduktionen aber auch bei den mnnlichen Teilzapfen der Gymnospermengattung

Cephalotaxus, sowie bei den Teilkladodien von Phyllocladus. Bei Phyllocladus sind

Tragbltter soweit reduziert, dass man sie nur noch in frhen Entwicklungsstadien

nachweisen kann. Tragblattreduktionen sind also weder ungewhnlich, noch auf

bestimmte Pflanzengruppen begrenzt.

Ausgehend von der Datenlage lsst sich im Fall von Sciadopitys als gedanklicher

Ausgangspunkt fr weitere Untersuchungen gegenwrtig eine Zwischenstellung

annehmen. Vorstellbar ist auerdem, dass dies als die Folge einer standortbedingten

EINLEITUNG 7

Vernderung und einer daraus resultierenden Anpassung deutbar ist. Es gibt zahlreiche

Beispiele dafr, dass wieder bentigte Organe auf anderem Wege durch analoge

Bildungen ersetzt werden. Es ist aber nicht zwangslufig mglich, eine auf demselben

Weg identisch wieder gewonnene Struktur von einer nie verloren gegangenen zu

unterscheiden. Dies kann auch als Grundgedanke dienen die Entstehungsweise von

Blttern (einiger anderer als ursprnglich immergrn gefhrter Taxa) vor dem

Hintergrund umgewandelter Kurztriebe neu zu hinterfragen. Morphologisch und

anatomisch hat die Nadel von Abies (z. B. A. homolepis) hnlichkeit mit dem Kladodium

von Sciadopitys (Abb. 5). Bis auf das Fehlen einer dem Tragblatt vergleichbaren Struktur

ist auch die Ontogenie sehr hnlich. So stellt sich die Frage, ob es Nadelbltter gibt, die

sich in dieser Weise phylogenetisch von Kladodien herleiten lassen und ob Abies ein

solches Beispiel ist oder nicht. Sind Bltter also phylogenetisch mehrfach unabhngig

voneinander einmal direkt und einmal ber Umwege (transformierte Spross(-Systeme))

entstanden?

Die Beantwortung der Frage nach dem Organcharakter ist nicht immer einfach, sollte

aber dennoch stets inhaltlich erfolgen. Bei Sichtung der Rohdaten ist abzuwgen in wie

weit die Mglichkeit besteht, dass die Morphologie durch Funktionalitt berlagert wird

und histologisch mglicherweise das Funktionelle berwiegt. Beispiele fr derartige

funktionelle berlagerungen finden sich u. a. in den Podocarpaceen-Gattungen

Acmopyle und Falcatifolium (KNOPF, persnliche Mitteilung) sowie in den Cupressaceae

(z. B. Thuja). Am Beispiel der Gymnosperme Thuja zeigt sich, dass die Form einer der

Abb. 5: Morphologische Gegenberstellung von S. verticillata & A. homolepis. A: S. verticillata, terminales Ende eines Kladodiums im Bereich der ausgebuchteten Spitze (Pfeil), Oberseite des Kladodiums mit Lngsfurche (oben) und zwei Stomatareihen (SR) auf der Kladodien-Unterseite (unten). B: A. homolepis, Nadelspitze mit terminaler Ausbuchtung (Pfeil), adaxiale Seite ohne Lngsfurche (oben), abaxial (unten) mit deutlich sichtbaren, lngsverlaufenden Stomatareihen.

EINLEITUNG 8

Selektion unterliegenden Struktur immer mit deren Funktion in Einklang steht, wobei

letztere sogar die Morphologie dominieren kann. Dies ist besonders deutlich, wenn

bekannte und klar erkennbare morphologische Grundstrukturen durch funktionelle

Anpassungen berformt werden. Ein Beispiel findet sich im anatomischen Aufbau der

Kantenbltter von dorsiventral abgeflachten und plagiotrop ausgerichteten Zweigen bei

z. B. Thuja plicata oder Platycladus orientalis (Cupressaceae). Hier ist das blicherweise

auf der morphologischen Blattoberseite lokalisierte Palisadenparenchym durch die

Ausrichtung der Zweige und entsprechend dem Lichteinfall im Bereich der

morphologischen Blattunterseite und dort besonders im Bereich der Licht exponierten

Kante des Blattes ausgebildet (Abb. 6 & TETZLAF, 2005). Schwieriger wird es, wenn die

funktionelle berformung soweit geht, dass die morphologische Grundstruktur dadurch

noch strker oder gar vollstndig verschleiert wird. Es bietet sich also ber den

morphologischen Ansatz hinaus an, die Nachweisbarkeit angenommener Organe ber

den Einsatz von Genen zustzlich zu berprfen.

1.2 Entwicklungsgenetische Lsungsanstze

Blickt man zurck auf die vielen morphologisch-anatomisch geprgten Arbeiten mit

ihrem groen Beitrag zur Basis der Grundlagenforschung, zeigt sich, dass sich viele

evolutionsbiologische Fragestellungen/Fragen zur Biodiversitt hervorragend ber rein

anatomisch-morphologisch gewonnene Erkenntnisse lsen lassen. Die Erfahrung zeigt,

dass auf diese Weise gewonnene Ergebnisse sich meist auch genetisch zustzlich

sttzen lassen. Fr die Flle in denen ber einen gewissen Punkt hinaus (z. B. durch

funktionelle berlagerung) rein morphologisch-anatomisch keine zufrieden stellenden

Abb. 6: Thuja plicata, Schematische Darstellung des Sprossquerschnitts. Das eigentlich auf der morphologischen Blattoberseite zu erwartende Palisadenparenchym ist bei den gezeigten Kantenblttern auf der morphologischen Blattunterseite und dort in stark Licht exponierten Bereichen zu finden.

EINLEITUNG 9

Antworten (mehr) zu erwarten sind, bietet es sich an bereits bestehende Ergebnisse mit

Entwicklungsgenetik zu kombinieren. Der bei Sciadopitys in Form der geschilderten

Kurztriebe vorliegende Sachverhalt ist also ein Fall fr den weiterfhrende genetische

Untersuchungen lohnend erscheinen.

ltere Angaben aus der Literatur und historischen Zeichnungen, bei denen subjektive

Einflsse des Autors nie gnzlich auszuschlieen sind, bieten in Kombination mit (aktuell)

erfassten Rohdaten (REM, Digitalfotografie etc.) diesbezglich keine richtige Klrung. So

werden auch definitive Aussagen zum Ansatz der vermuteten Transformationsreihe

dieser Kladodien nicht plausibler oder nachvollziehbarer. Ausgehend von der aus

morphologischer Sicht stellungsbedingten Sprossnatur der Kladodien, erscheint es

interessant diese unter Zuhilfenahme so genannter Organidentitts- oder

Entwicklungsgene erneut zu betrachten. Entwicklungsgene sind in der Lage anhand

ihres Expressionsmusters oder ber Nachweis des von ihnen kodierten Transkriptions-

faktors die Organidentitt z. B. in Gewebeschnitten anzeigen zu knnen. Ein solcher

Versuchsansatz macht schon vor Erscheinen der Organanlagen Einblicke mglich.

Hinweise zu einem derart frhen Zeitpunkt knnten essentiell sein, wenn es wie hier mit

Sichtbarwerden junger Organanlagen fr Aussagen zur Identitt mglicherweise schon

zu spt ist. Die Kombination aus Histologie und Genetik bzw. die Methode des

Expressionsnachweises im Gewebe (siehe 1.3) findet in den letzten Jahren verstrkt fr

Angiospermen, und zunehmend auch fr Untersuchungen an einzelnen Gymnospermen-

Taxa Anwendung (z. B. SUNDS-LARSSON, 1998; GUILLET-CLAUDE et al., 2004 & BELMONTE

et al., 2007). Je nach Auswahl der eingesetzten Entwicklungsgene werden so Aussagen

zur pflanzlichen Morphogenese inklusive der Organdifferenzierung mglich. Die relativ

groe Diskrepanz in der Anzahl der molekulargenetisch untersuchten Angiospermen und

damit einhergehenden verffentlichten Sequenzen im Vergleich zu Gymnospermen

erklrt sich erstens durch die in Angiospermen anteilmig groe Zahl wirtschaftlich

hochinteressanter Nutzpflanzen wie z. B. Zea mays (Mais). Zweitens steigern ein im

Vergleich zu Gymnospermen oftmals sehr viel krzerer Generationswechsel (z. B.

Arabidopsis) und ein (methodisch) einfacherer Gewebeaufschluss (Vorkommen weniger

stark verholzter Strukturen z. B. im Knospenbereich, etc.) die Attraktivitt der

Angiospermen fr genetische Anstze. Ein kompletter Generationszyklus (Aussaat bis

Ausreifen der neuen Samengeneration) dauert bei A. thaliana gerade einmal ca.

sechs bis acht Wochen. Die Samen von S. verticillata bentigen allein fr die Keimung

schon fast doppelt so lange (3 bis 4 Monate). Die Sciadopitys-Keimlinge bilden innerhalb

ihres ersten Lebensjahres zustzlich zu den beiden Kotyledonen nur zwei weitere Bltter,

die Primrbltter, aus (http://www.schirmtanne.de/sciadopitys_verticillata.php).

EINLEITUNG 10

Gensequenzen einer aus molekularer Sicht scheinbar eher unpopulren Gymnosperme

wie Sciadopitys, gerade in Bezug auf Entwicklungsgene (!), sind in Gen-Datenbanken

aktuell nicht vorhanden.

1.2.1 Pflanzliche Knox-Gene

Knox-Gene gehren zur groen Gruppe der Homobox-Gene. Homobox-Gene bzw.

von ihnen kodierte Homodomnen-Proteine wurden im tierischen Organismus, speziell

Drosophila, erstmals entdeckt (GEHRING, 1987). Der Name ergibt sich aus einer Mutation,

die homologe Strukturen betraf. Ein klassisches Beispiel ist eine Mutation im

Antennapedia-Gen, die zur Folge hat, dass anstelle von Antennen Beine ausgebildet

wurden (MC GINNIS & KRUMLAUF, 1992).

Bekannt und benannt wurden pflanzliche Knox-Gene im Zusammenhang mit der

Entdeckung des knotted1 (kn1)-Gens aus einer Mutante von Zea mays. Kn1, das erste

aus einer Pflanze isolierte Gen, das ein Homobox-Motiv enthlt wird bei normaler

Expression nur im Scheitelmeristem und sehr jungen Teilen der Sprossachse, nicht

jedoch in Blttern exprimiert (HAKE et al., 1989; VOLLBRECHT et al., 1991). In der

berexpressions-Mutante (gain-of-function) zeigte sich eine ektopische Expression in

Blttern (HAKE & ORI, 2002), die knotenartige Auswchse im Bereich der Blattspreiten zur

Folge hatte (SMITH et al., 1992). Das Kn1-Gen wird seitdem fr die Isolierung immer

neuer Vertreter der Knox (knotted1-like homeobox)-Gen-Familien aus Mais und vielen

anderen Spermatophyten wie beispielsweise den Angiospermen Arabidopsis (STM:

LONG et al., 1996; KNAT: LINCOLN et al., 1994) und Oryza (OSH1: MATSUOKA et al., 1993)

oder der Gymnosperme Picea abies (SUNDS-LARSSON et al., 1998) etc. genutzt. Das

Gen ist damit Ausgangspunkt einer Vielzahl von Arbeiten zu verschiedenen durch

Knox-Gene gesteuerte morphogenetische Prozess (Abb. 7). Die Knox-Gene bieten sich

im Zusammenhang mit der angesprochenen Morphogenese-Thematik als Werkzeuge

fr die Analyse von Meristemfunktion und die daraus resultierende Diversitt pflanzlicher

Bauplne besonders an. Sie eignen sich in vielen Fllen als hervorragende Zeiger

morphogenetischer Ereignisse (SINHA et al., 1993; LINCOLN et al., 1994). Die Produkte

dieser regulatorischen Gene sind, abhngig von deren rumlichen und zeitlichen

Expressionsmustern, in vielen Bereichen der Organentwicklung beteiligt. Ihnen kommt

demnach als Transkriptionsfaktoren eine wichtige (regulatorische) Kontrollfunktion

speziell bei der spezifischen Zelldifferenzierung zu (z. B. HAKE & JACKSON, 1995). Neben

KNOX gehren auch die Familien BELL, HD-Zip, PHD-finger, GLABRA2 und PALE zur

groen Gruppe der Homobox-Gene (CHAN et al., 1998).

EINLEITUNG 11

Allen gemeinsam ist ein als Homodomne bezeichneter 61 Aminosuren umfassender

konservierter Bereich, der von der Homobox kodiert wird. Funktionell ist die

Homodomne ber das helix-turn-helix-Motiv fr die Protein-DNA-Interaktion

verantwortlich (VOLLBRECHT, 1991 & GEHRING et al., 1994). Homodomnen-Proteine

funktionieren als DNA-abhngige Transkriptionsregulatoren (GEHRING et al., 1994). Als

Transkiptionsfaktoren stellen sie nur eine Komponente in einer langen Signalkaskade

(vom Kern ausgehend) dar. Sie regulieren ber sequenzspezifische DNA-Bindungen

andere Gene, aktivieren und/oder unterdrcken (JAYNES & O FARRELL, 1989)

Transkriptionsenzyme, Signalmolekle bzw. -proteine. Neben der Regulation anderer

Transkriptionsfaktoren verfgen sie ber die Fhigkeit zur Autoregulation, indem sie an

regulatorische Sequenzmotive ihrer eigenen Gene binden und so ihre eigene Expression

steuern (HAYASHI & SCOTT, 1990). Die hnlichkeit in der Aminosurensequenz der

Homodomne und weitere ebenfalls mehr oder weniger stark konservierte

Proteinmotive auerhalb der Homodomne sind ausschlaggebend fr die Unterteilung

in die oben angefhrten sechs verschiedenen Homobox-Gen-Familien. Darber hinaus

dienen die zustzlichen, konservierten Domnen der Festlegung der verschiedenen

Homobox-Gene selbst (CHAN et al., 1998).

Abb. 7: Schema zur unterschiedlichen Einflussnahme von KNOX-Tanskriptionsfaktoren auf die Wachstumsregulierung (nach HAY et al., 2004; verndert). KNOX greift regulierend in das Hormongleichgewicht ein und so mglicherweise indirekt auf die Zellwandstruktur (Gibberilinsure und Auxin aktivieren die Expression der Zellwand-lsenden Proteine, der Expansine). KNOX reguliert direkt die Biosynthese der Zellwand wodurch die Zelldifferenzierung unterdrckt wird. KNOX aktiviert die Cytokinin-Biosynthese, die ihrerseits die Zellteilung aktiviert. KNOX unterdrckt die Gibberilin-Biosynthese, die mglicherweise die Anordnung des Cytoskelets reguliert, dass die Zelldifferenzierung kontrolliert. Vernderte Zellteilung und Regulierung der Expression der KNOX-Gene knnten zusammenhngen.

EINLEITUNG 12

Die Proteine der Knox-Familie zeigen einen ihnen eigenen, gleichen Aufbau (Abb. 8).

Strukturell zeichnen sich alle KNOX-Proteine neben ihrer nahe dem C-Terminus

lokalisierten Homodomne durch den Besitz zwei spezieller, konservierter Motive

N-terminal (upstream) der Homodomne aus. Dabei handelt es sich um die ELK- und

die KNOX-Domne (BRGLIN, 1997). Die ELK-Domne (VOLLBRECHT et al., 1991) ist ein in

allen Mitgliedern der Knox-Familie hochkonservierter Bereich, der nach seinen ersten

drei Aminosuren benannt ist. Funktionell ist das ELK-Motiv an

Protein-Protein-Bindungen beteiligt (BRGLIN, 1997). Das Sequenzelement der

ELK-Domne kommt nur bei Vertretern pflanzlicher TALE-Proteine vor (SUNDAS-

LARSSON et al., 1998). Als KNOX-Domne wird ein ca. 100 Aminosuren umfassender,

stark konservierter Bereich N-terminal von ELK bezeichnet. Das Motiv ist ebenfalls

wichtig fr Protein-Protein-Interaktionen (MLLER et al., 2001). Ein kleiner, weniger

konservierter Bereich zwischen der KNOX- und ELK-Domne wird als GSE-Box

bezeichnet (BRGLIN, 1997). Die Homodomne beinhaltet drei -Helix-Motive. Aufgrund

des Vorkommens von drei zustzlichen Aminosuren (PYP) im Bereich (loop) zwischen

dem Helix I- und dem Helix II-Motiv wird sie zur Familie der so genannten TALE (three

amino acis loop extension) Superclass gezhlt. Zur TALE-Familie der Homodomnen

in Pflanzen zhlt neben KNOX auch BEL-like (BELL) (BERTOLINO et al., 1995;

BRGLIN, 1997). Das dritte -Helix-Motiv (Helix III) (GEHRING et al., 1994;

KERSTETTER et al., 1994), die sogenannte recognition helix, ist fr die Erkennung und

den sequenzspezifischen Kontakt mit DNA zustndig. Als sequenzspezifische

DNA-Bindeproteine regulieren Homodomnen-Proteine die Expression spezifischer

Gruppen von Zielgenen (AFFOLTER et al., 1990 & HAYASHI & SCOTT, 1990). Obwohl die

verschiedensten Homodomnen strukturidentisch sind, knnen sie unterschiedliche

DNA-Bindungsbereiche erkennen (KERSTETTER et al., 1994).

Knox-Gene werden abhngig von bestimmten Aminosureresten innerhalb der

Homodomne, Intronposition(en) und Expressionsmustern in zwei unterschiedliche

Klassen, Knox-Gene der Klasse 1 und Klasse 2 eingeteilt (KERSTETTER et al., 1994;

Abb. 8: Schematischer Aufbau eines KNOX-Proteins. (Darstellung nach SAKAMOTO et al., 2001;verndert). KNOX-Protein mit den fr nahezu alle pflanzlichen KNOX-Proteine typischen Motiven der KNOX, ELK- und Homodomne, sowie der GSE-Box. Die zur TALE-Gruppe zhlende Homodomne setzt sich aus drei -Helices, mit Helix-turn-Helix-Motiv fr die DNA-Bindung inklusive eines charakteristischen PYP-Motivs (PYP-loop) zusammen.

EINLEITUNG 13

REISER et al., 2000). Ein Vorkommen bestimmter Klassen von Knox-Genen ist nicht nur fr

mono- und dikotyle Angiospermen (s. o.), Moose (CHAMPAGNE & ASHTON, 2001) und

Farne (SANO et al., 2005), sondern auch fr Gymnospermen durch SUNDAS-LARSSON

et al. (HBK, 1998) gezeigt worden. Die Homodomne beider Klassen zeigt einen hohen

Grad an bereinstimmung, hauptschlich im Helix III-Motiv. Vermutlich interagieren sie

mit hnlichen DNA-Sequenzen, aber schon kleinste Strukturvernderungen (auerhalb

der Helix III und im N-terminalen Abschnitt der Homodomne) fhren dazu, dass sich

das DNA-Bindeverhalten und/oder die Protein-Interaktion fr beide Klassen

unterscheiden (CHAN et al., 1998). Whrend Klasse 1-Gene hauptschlich fr die

Identittsgebung und Meristemregulation zustndig sind (vergleiche 1.2.2), zeigen

Klasse 2-Vertreter ein sehr vielfltigeres Einsatzfeld, ggf. agieren sie erst in spteren

Stadien der Entwicklung (CHAN et al., 1998). Sowohl Klasse 1 und Klasse 2-Gene, als

auch die Knox-Familie selbst sind Monophyla (BRGLIN, 1997; BARATHAN et al., 1999;

REISER et al., 2000). Untersuchungen an Pflanzenlinien vor Beginn der Landpflanzen

(z. B. der Grnalgen Acetabularia acetabulum, SERIKAWA & MANDOLI, 1999) kamen zu

dem Ergebnis, dass die Duplikation der beiden Klassen erst vor 500 Millionen Jahren,

nach Formierung der Landpflanzen-Linie, auftrat (HAKE et al., 2004). Laut SINGER &

ASHTON (2007) kann man fr Klasse 1 festhalten, dass eine heterologe Expression ihrer

Gene bzw. die resultierenden Phnotypen die Vermutung nahe legen, dass man den

Klasse 1-Genen nur entfernt verwandter Pflanzenvertreter wie Arabidopsis, Picea und

Ceratopteris durchaus eine homologe Funktion zusprechen kann (z. B.

HARRISON et al., 2005).

1.2.2 Knox-Expression & der pflanzliche Bauplan

Die pflanzliche Entwicklung zeigt gravierende Unterschiede zur Entwicklung von Tieren.

Pflanzliche Organe knnen zeitlebens neu gebildet werden. Der Grund liegt im

Vorhandensein spezieller, unbegrenzt teilungsfhiger Zellen, deren Zellverbnde als so

genannte Meristeme erhalten bleiben. In Tieren kann man dies allenfalls auf totipotente

Stammzellen mit selbst erhaltenden Eigenschaften bertragen.

Fr die Bildung aller oberirdischen Pflanzenteile hat das eingangs erwhnte

Scheitelmeristem eine besondere Bedeutung. Es ist ber die Fhigkeit zur

Selbsterhaltung eine essentielle Quelle fr meristematische Zellen bzw. Wachstum. Zwei

weitere sehr wichtige Aufgaben kommen dem Scheitelmeristem als Ursprungszentrum

von lateralen Organen wie Blttern, sowie weiteren axillren Meristemen und als

Schaltzentrale im Zuge der Primordien(an)ordnung bzw. Phyllotaxis zu (MC STEEN &

HAKE, 1998; Abb. 9 A). Die im Bereich des Scheitelmeristems bei Anlage neuer

EINLEITUNG 14

Organprimordien ablaufenden Prozesse sind sehr komplex. Die Ablufe/Muster werden

zustzlich zur Gen-abhngigen Expression noch ber An- und Abwesenheit von

Hormonen beeinflusst. HAY et al. (2004) beschreibt, dass sich die verschiedenen Gene

nicht nur wechselseitig beeinflussen, sondern auch die Hormonaktivitt regulierend auf

die Aktivitt der KNOX-Proteine im Apex Einfluss nimmt. Verallgemeinert lsst sich

sagen, dass die Knox-Expression (eines Klasse 1 Gens wie z. B. Kn1 oder Stm) auf das

Sprossmeristem beschrnkt ist und whrend der Blattentwicklung fehlt (seltener nur stark

herunterreguliert ist). Die Meristemzellen, die den Ursprung einer neuen Blattanlage

bilden (Plastochron 0/P0 Stadium, vgl. Abb. 9 B), verlieren die Expressionsttigkeit schon

vor ersten (sichtbaren) Anzeichen einer Blattanlage (HAKE et al., 2004).

Die Genprodukte beeinflussen zwar die Anlage von Blttern, sind im Blatt selber aber

nicht zu finden (SMITH et al., 1992; JACKSON et al., 1994). Die Expressionsmuster fr

einfache und zusammengesetzte Bltter knnen variieren. Das Expressionsmuster ist

also allgemein eher mit dem Entwicklungsstadium des Blattprimordiums und nicht

zwangslufig mit der endgltigen Blattmorphologie korreliert (BARATHAN et al., 2002 &

HAKE et al., 2004). So wichtig es fr die Blattidentitt ist die Expression bestimmter Gene

in Blttern abzuschalten, so wichtig ist aber auch, dann bestimmte Gene anzuschalten

Abb. 9: Schematische Darstellung zum Scheitelmeristem (SAM). Expressionsmuster eines Klasse 1Knox-Gens wie Kn1 oder Stm im vegetativen Meristem (nach MC STEEN & HAKE 1998, JACKSON et al., 1994 & HAY et al., 2004, jeweils verndert). Das SAM bernimmt die Aufgabe der Selbsterhaltung, Bildung von Blttern und axillren Meristemen sowie Phyllotaxis. Zellen der zentralen Zone dienen der Selbsterhaltung des SAM und teilen sich weniger hufig. Zellen des peripheren Bereichs teilen sich hufig und sind Ausgangspunkt fr die Organogenese (nur Zellen im Bereich des (Blatt-)Primordiums differenzieren aus). P0-P2 stehen fr die (ontogenetischen) Zeitintervalle, Plastochrone, zwischen der Anlage der Blattprimordien mit P1 als jngstem Primordium bzw. jngstem Blatt. P0 steht fr den Bereich wo das nchste Primordium zu erwarten ist und die Expression des eigentlich im gesamten Meristem exprimierten Klasse 1-Gens unterdrckt ist/fehlt. Axillre Meristeme entstehen in Blattachseln. A: Schematischer Querschnitt durch SAM. B: SAM, in lateraler Ansicht, keilfrmig angeschnitten.

EINLEITUNG 15

(MC STEEN & HAKE, 1998). Pflanzliche Zellen geben ber ihr Wuchsverhalten Antwort auf

Umweltbedingungen, erkennbar anhand ihrer Anpassungsfhigkeit und Koordination

ihrer Aktivitt. Die wichtigste funktionelle Gemeinsamkeit aller Knox-Gene in der

Morphogenese der Pflanzen liegt in der Kontrolle der Zelldifferenzierungsprozesse und

der Formierung bestimmter Muster im pflanzlichen Bauplan. Die undifferenzierten

Meristemzellen differenzieren nach speziellen Mustern aus und bringen so laterale

Organe hervor. Mustervariationen sind Form gebend, indem sie im Zuge der vegetativen

Entwicklung Einfluss auf die Anlage von Blattformen, Leitbndelanschlsse und

Phyllotaxis nehmen. Die unterschiedliche Genexpression ist im Hinblick auf verschiedene

Wuchsformen ein entscheidender evolutiver Mechanismus (HAKE & JACKSON, 1995).

Ein Verstndnis der entstehenden Expressionsmuster bzw. von ektopischer Expression

wird erleichtert, wenn man auf mutationsbedingte Phnotypen (mit verndertem

Zellschicksal und anderem Teilungsverhalten) zur Illustration der Entwicklungsschritte

zurckgreift. Ein hoher Expressionslevel in transgenen Pflanzen bedingt einen Wechsel

hin zum Meristem und niedrigere Level verndern die entstehenden Zelltypen. Durch

(nicht letale) rezessive Wildtyp-Mutanten und spezielle induzierte Transformanten (Mono-

und Dikotyle sind kompatibel, SINHA et al., 1993) werden Aussagen und Analysen des

Gens und seiner Genprodukte mglich. Rezessive Mutationen informieren ber die Rolle

des Genproduktes in der frhen Entwicklung (bezogen auf das Meristem). Eine

dominante berexpression bzw. die so genannten gain-of-function-Phnotypen,

machen ber ihr dosisabhngiges Erscheinungsbild Vernderungen im Bauplan

vorhersehbar (HAKE & JACKSON, 1995). Klasse 1 wird im Scheitelmeristem exprimiert. Die

Expression von Klasse 2 ist nicht so klar definiert (KERSTETTER et al., 1994,

SERIKAWA et al., 1996 & SERIKAWA et al., 1997). Ihre Expression ist nicht auf bestimmte

Gewebe beschrnkt, sondern abhngig von Ort (Zelltyp) und Zeit der Expression in der

Pflanze sehr variabel, sie kommt in den meisten Geweben, jedoch nie im Meristem vor.

Aufgrund fehlender mutationsbedingter Phnotypen ist die Klasse 2-Funktion nicht so

klar beschreibbar wie die der Klasse 1-Gene (SERIKAWA et al., 1997).

Neben verschiedenen Modellen zur Blattentwicklung existieren fr Monokotyle und

Dikotyle eigene Modelle zur Knox-Gen-Expression in der Embryo-, Smlings- und

Infloreszenzentwicklung. Die Expression der Knox-Gene selbst ist auf vielfltigste Weise

und auf verschiedensten Leveln reguliert (HAKE et al., 2004). Bezogen auf den eingangs

erwhnten universellen Bau der Kormophyten (Abb. 1) bergen also die Expressions-

muster von Knox-Genen Hinweise auf die Organidentitt und die Mglichkeit untersuchte

EINLEITUNG 16

Strukturen einem der drei vegetativen Grundorgane im pflanzlichen Bauplan zuzuordnen

und Aussagen ber die Homologieverhltnisse zu machen.

Gegenwrtig nimmt erstens die Zahl der diesbezglich untersuchten Gymnospermen

(gemessen an der Vielzahl von Untersuchungen an Angiospermen) immer weiter zu.

Zweitens ist mit der Arbeit von HIRAYAMA et al. (2007) auch der erste Schritt

unternommen umgestaltete Organe mit Sonderfunktion wie Phyllokladien (blattartige

Flachsprosse) nher zu untersuchen, bei denen die Zusammensetzung aus den

Grundorganen nicht immer hinreichend klar ist. Untersuchungen zu derartigen

innovativen Organen (z. B. aus der Angiospermengattung Ruscus und der

Gymnospermengattung Phyllocladus) die zur morphologischen Differenzierung

beitragen sind wichtig. Whrend die Zusammensetzung fr Phyllocladus in diesem

Zusammenhang einfach ist (RIEGER, 2002; BELL, 1991 & TOMLINSON et al. 1987), bleibt

Ruscus laut HIRAYAMA et al. (2007) morphologisch ein Problem. Mit Hilfe dieser

Versuchsanstze, knnte es einerseits mglich sein eine intermedire Organidentitt von

z. B. Phyllokladien zu belegen (vergleiche HIRAYAMA) und andererseits auch die

Wahrscheinlichkeit vermuteter Transformationsreihen fr die blattartigen Kurztriebe bei

Sciadopitys zu berprfen.

1.3 in-situ-Hybridisierung

Die in-situ-Hybridisierung ist ein Verfahren mit dem die mRNA eines bestimmten Gens

(im Gewebeschnitt) sichtbar gemacht wird und anhand dessen die fr das Gewebe oder

die Zelle typische Proteinexpression ggf. inklusive des zeitlichen Verlaufes

nachvollziehbar wird (MHLHARDT, 2003).

Die ursprnglich im Zuge zytologischer Prparationen etablierte Methodik der

in-situ-Hybridisierung beruht auf der spezifischen Bindung einer markierten Sonde

(Nukleinsure-Probe) im Gewebeschnitt unter selektiven Bedingungen. Fr die Botanik

wurde diese Methodik erst spter angepasst, um als diagnostisches Werkzeug zur

Detektierung von Pflanzenpathogenen, Genomanalysen von Pflanzengenen oder fr

Expressionsstudien der mRNA und ihrer Proteinen im Gewebe eingesetzt zu werden.

Allen bestehenden Hybridisierungsvarianten liegt zu Grunde, dass die gewhlte Sonde

an eine komplementre Sequenz im Gewebe unter Bildung einer stabilen Hybride bindet

und anschlieend histologisch detektierbar ist. Im Rahmen dieser Arbeit kommen so

genannte Antisense-mRNA-Transkripte zum Einsatz, die im pflanzlichen Gewebeverband

die genaue, temporre Expression der Sense-mRNA-Zielsequenz lokalisieren. Die

EINLEITUNG 17

verwendeten Sonden (Riboproben) lassen sich sowohl radioaktiv als auch nicht

radioaktiv (Fluoreszenzfarbstoff oder Antikrper, Bindungsproteine) markieren. Die

Sensitivitt beider Detektionsvarianten ist mittlerweile vergleichbar hoch. Auch geringe

Kopienzahlen von mRNA (auch in einzelnen Zellen) sind detektierbar. Ein sehr gngiger

Marker ist hierbei Digoxigenin, kurz DIG, ein Steroid aus Blten und Blttern der

Digitalis-Pflanze. Es ist im Vergleich zum Biotin-Marker sensitiver. In der Regel werden

Marker an UTPs gekoppelt und sind ber einen enzymgebundenen Antikrper (z. B.

Alkalische Phosphatase) gegen das verwendetet Marker-Molekl (z.B. Anti-DIG) unter

Entstehung eines chromogenen Substrates (z. B. BCIP/NBT) sichtbar und nachweisbar.

Das Verfahren bietet den Vorteil, dass sowohl eine gleichzeitige Ko-Lokalisation

verschiedener RNAs in ein und derselben Probe unter Einsatz verschiedener Marker, als

auch die gleichzeitige Detektion von RNA und dazugehrigem Protein mglich ist

(ZACHGO, 2002). Durch Einsatz der Doppelmarkierung (double labeling) zeigte

JACKSON (2002), dass Kn1-mRNA und das zugehrige Protein an unterschiedlichen

Orten lokalisierbar waren und Proteine ber Plasmodesmata wandern knnen.

1.4 Ziel der Arbeit

ber die reine Anwendung der klassischen morphologisch-anatomischen Methodik

hinaus erscheint es viel versprechend, diese mit genetischen Versuchsanstzen zu

kombinieren, um neue und/oder zustzliche Hinweise und untersttzende Aussagen zur

Funktion und Evolution der Gymnospermenbltter zu ermglichen. Stellenweise liefern

die erfassten Rohdaten zur Morphogenese allein keine eindeutigen Aussagen zum

Organcharakter. Fragen zu Makroevolution knnten daher erst durch Kombination

molekularer Daten besser beantwortet werden. Die Palobotanik bzw. Vergleiche mit

fossilen Funden aus der Anfangszeit der Gymnospermen sind insofern problematisch,

als man nicht sicher sein kann wie komplett die Angaben zu Relikt- und Ur-Habitaten

sind. Auerdem lassen fossile Funde viel Spielraum fr Spekulationen. Aussagen ber

die Homologie oder Analogie rezenter Strukturen (z. B. ber vergangene

standortbedingte Anpassungen) sind nur schwer mglich.

Vor diesem Hintergrund erscheint eine Methodenetablierung zum Expressionsnachweis

von Genen direkt im entscheidenden Gewebeverband eines so ursprnglichen

Gymnospermen-Taxons wie der Japanischen Schirmtanne, S. verticillata, angebracht.

Selbst in kladistischen Analysen unter Verwendung verschiedenster

(morphologischer/genetischer) Parameter und der ber die Jahre stndig wechselnden

Zuordnung zu den verschiedensten Gymnospermen-Familien (FARJON, 2005) entsteht

EINLEITUNG 18

hufig der Eindruck eines Mischorganismus, dessen Zuordnung sich als verwirrend

erweist. Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher erstens die allgemeine Etablierung der

angesprochenen genetischen Methoden wie z.B. die in-situ-Hybridisierung, inklusive der

Adaption an Sciadopitys, am Lehrstuhl zu realisieren. Zweitens soll ber eine

Methodenetablierung fr ein ursprngliches Gymnospermen-Taxon, mit S. verticillata als

Modellgymnosperme, im Speziellen eine Knox-Gen-Sequenz aus S. verticillata

vergleichbar mit dem HBK-Gen aus P. abies (SUNDS-LARSSON et al., 1998) identifiziert

werden und entsprechende Primer fr ein Klasse 1 Knox-Gen erstellt werden.

Bei den Doppelnadeln bzw. Kladodien von Sciadopitys ist morphologisch eindeutig,

dass es sich um einen Spross handelt. Unklar ist, welchen Anteil Sprossachse und

mglicherweise vorhandene Bltter an Kladodien haben. Die Frage ist, ob sich die

Sprossnatur genetisch belegen lsst. Gelingt es, so schliet sich als nchstes die Frage

an, ob andere Gymnospermennadeln, die morphologisch sehr hnlich, aber durch die

Stellung eindeutig als Bltter anzusehen sind, nicht ebenfalls umgewandelte Sprosse

sind. Fhrt die Studie zum Erfolg, bedeutet das, dass mglicherweise eine

polyphyletische Entstehung des Gymnospermenblattes belegt werden kann. Fhrt sie

nicht zum Erfolg, bedeutet es, dass in manchen Fllen die Auflsung morphologischer

Verfahren hher sein kann, als die genetischer Techniken.

MATERIAL & METHODEN

19

2 MATERIAL & METHODEN

2.1 Pflanzenmaterial

2.1.1 Materialsammlung

Die Sammlung und Probenentnahme erfolgten jeweils angepasst an die Erfordernisse

der verschiedenen Versuchsanstze. Das Material fr Entwicklungsreihen wurde in

regelmigen, etwa 1-wchigen Intervallen gesammelt. Die Proben fr die genetischen

Anstze wurden punktuell, d. h. im mglichst optimalen Entwicklungsstadium frisch und

zeitnah zum Versuchsbeginn entnommen. Zustzlich wurde das fr die Hybridisierung

gesammelte Material unmittelbar nach Entnahme und eventuell ntiger

Prparation/Fixierung gekhlt aufbewahrt. Material fr die Isolierung von RNA oder DNA

wurde direkt nach Entnahme in flssigem Stickstoff oder Trockeneis Schock gefroren

und anschlieend bei -80 C gelagert. Knospen (vegetative und generative) und Bltter

stammen hauptschlich aus dem Freiland des Botanischen Gartens Bochum (BGBO).

Samen und junge weibliche () Zapfen von S. verticillata wurden grtenteils im Freiland

des Botanischen Gartens in Marburg (BGM) gesammelt (Tab. 1).

Tab. 1: bersicht des verwendeten Pflanzenmaterials.

Art Pflanzenteil Herkunft

Abies homolepis SIEBOLD &

ZUCC.

Nadeln & Triebe

vegetative Knospen

BGBO, Freiland

BGBO, Freiland

Arabidopsis thaliana L. Bltter/Grundblattrosette BGBO, Freiland

Phyllocladus trichomanoides D.

DON. var. trichomanoides

Phyllokladien

vegetative Knospen

BGBO, Freiland

BGBO, Freiland

Picea abies (L.) H. KARST. var.

abies

Nadeln

vegetative Knospen

BGBO, Freiland

BGBO, Freiland

Pinus sylvestris L. Langtriebe & Kurztriebe/Nadeln BGBO, Freiland

Sciadopitys verticillata

(THUNB.) SIEBOLD & ZUCC.

Kladodien & Langtriebe

vegetative & generative Knospen

junge Zapfen & Samen (versch. Stadien)

reife Zapfen & Samen

angekeimte Samen & Keimlinge

BGBO, Freiland

BGBO, Freiland

BGM, Freiland

BGBO/BGM, Freiland

BGBO, Warmhaus

MATERIAL & METHODEN

20

2.1.2 Anzucht der Keimlinge

Die Anzucht der keimfhigen Samen aus Marburg erfolgte im Botanischen Garten

Bochum unter Warmhaus-Bedingungen bei 22 C, mit Lftung ab 26 C. Ausgest wurde

in ein Torf-Sand-Gemisch (inklusive Drainageschicht) mit einer dnnen Abschlussschicht

aus reinem Sand. Um die Substratoberflche abzudunkeln und vor Austrocknung zu

schtzen wurde das Pflanzgef bis zum Auflaufen der Samen abgedeckt. Gewssert

wurde einmal tglich, direkt auf das Substrat ohne die Keimlinge selbst zu benetzen. Im

Zeitraum von Ende Oktober bis Mrz wurde von 6.00 bis 22.00 h zustzlich beleuchtet

(OSRAM L 58/77, Fluora). Die entnommenen Samen bzw. Keimlinge wurden mit Hilfe von

RNAse-freiem Wasser von Substratresten gereinigt. Bei Schdlingsbefall wurde mit

Confidor WG70 (BAYER) als 0,03 %ige Lsung und/oder Mesurol Schneckenkorn

(BAYER) behandelt.

2.2 Morphologisch-anatomische Methoden

2.2.1 Fixierung

Das gesammelte Pflanzenmaterial (siehe 2.1) wurde in FAA, einem Gemisch aus

Formalin, Ethanol und Eisessig, unmittelbar nach dem Sammeln fr mindestens 72 h

fixiert und anschlieend in Ethanol (70 %) berfhrt (kurz waschen) und gelagert.

Prpariert wurde unter einer Stereolupe Stemi SV11 von ZEISS bei bis zu 40 facher

Vergrerung in Ethanol (70 %).

FAA (100 ml)

Ethanol (70 %, vergllt)

Formalin (37 %)

Eisessig (99-100 % ige Essigsure)

90 ml

5 ml

5 ml

2.2.2 Mikrotomtechnik

Fr die Herstellung von Serienschnitten in Paraffintechnik wurden die anatomisch zu

untersuchenden Prparate entwssert und fr mindestens 24 h in Ethanol (70 %)

inkubiert (2.2.1). Die berfhrung in HISTOWAX (HISTOLAB PRODUCTS AB) erfolgte

mittels tertirem (tert.) Butanol (Schmelzpunkt 25 C) als Intermedium (GERLACH, 1984)

bei 37 C im Wrmeschrank. Die Prparate wurden dabei fr mindestens 24 h in

folgenden Lsungen (I-VI) belassen:

MATERIAL & METHODEN

21

Lsung I: 20 ml tert. Butanol, abs. + 50 ml Ethanol (96 %), vergllt + 30 ml Aqua dest.

Lsung II: 35 ml tert. Butanol, abs. + 50 ml Ethanol (96 %), vergllt + 15 ml Aqua dest.

Lsung III: 55 ml tert. Butanol, abs. + 45 ml Ethanol (96 %), vergllt

Lsung IV: 100 ml tert. Butanol, abs. + Eosin

Lsung V: 100 ml tert. Butanol, abs.

Lsung VI: 100 ml tert. Butanol, abs.

Um die Objekte auch im Wachsblock sichtbar zu machen und im weiteren Arbeitsverlauf

besser ausrichten zu knnen, wurde dem tertiren Butanol der Farbstoff Eosin

beigemischt. Das Eosin lst sich im Verlauf des Frbevorganges durch Alkohol wieder

heraus. Die entwsserten Proben wurden mit reinem tertirem Butanol in Glasdosen mit

Rillendeckel bertragen und der Glasbehlter mit Wachskugeln aufgefllt. Die Proben

wurden bei 63 C fr zwei bis drei Tage im verschlossenen Gef gelagert. Zum

Verdampfen wurden die Deckel entfernt und die Gefe fr zwei bis drei weitere Tage im

Wrmeschrank belassen.

Einbetten:

Das Einbetten der Proben in Wachs (Schmelzpunkt HISTOWAX bei ca. 58 C) erfolgte

nach GERLACH (1984). Nach dem Einbetten wurden die Wachsblcke zugeschnitten und

mittels eines Rotationsmikrotoms MOD 1130/Biocut (REICHERT JUNG) mit automatischem

Objektrckzug 10 m dicke Serienschnitte der Objekte angefertigt. Im Anschluss wurden

die fertigen Schnittbnder mit Eiweiglycerin (Glycerin/Hhnereiwei 1:1, nach

MAYER; GERLACH 1984, S. 99 f) auf Objekttrger geklebt und bei ca. 40 C fr 1 bis 2 h

getrocknet. Um ein Zerreien der Schnitte whrend des Schneidens zu verhindern bzw.

zu verringern, wurden die entsprechenden (Paraffin-) Blcke mit Glycerin behandelt. Es

ist hilfreich, die entsprechend angeschnittenen Blcke entweder fr ca. 24 h in Glycerin

einzulegen oder die Schnittflche whrend des Schneidens wiederholt mit Glycerin zu

bestreichen. Ein Zerreien ist gehuft bei kompakten Knospen und stark cutinisierten

Strukturen (z. B. Nadeln) zu erwarten, da hier das Eindringen des Wachses in das Objekt

erschwert wird. Auch verholzte Objekte erwiesen sich nach einer Behandlung mit

Glycerin als besser schneidbar.

Frben:

Das Frben der Schnitte erfolgte mittels einer Safranin-Astrablau-Frbung nach

GERLACH (1984, S. 128 f) und wurde wie folgt modifiziert. Dem Frben der Schnitte ging

das Entfernen des Wachses mittels Roticlear (ROTH), anstelle von Histol, voraus.

Anschlieend wurden die Schnitte als Vorbereitung auf das Anfrben ber eine

absteigende Alkoholreihe auf die wssrige Safranin-Astrablau-Frbung vorbereitet:

MATERIAL & METHODEN

22

Roticlear I 10 min.

Roticlear II 10 min.

Roticlear/Isopropanol (abs.), 1:1 5 min.

Isopropanol (abs.) 5 min.

Etahnol (96 %) 5 min.

Ethanol (70 %) 2 min.

Ethanol (50 %) 2 min.

Aqua dest. 2 min.

Anfrben der Schnitte:

Astrablau (0,5 g in 2 % iger Weinsurelsg.) 5 min.

Aqua dest. kurz waschen



Safranin (1 % w/v) 5 min.




Verholzte Zellwnde (Lignin) werden mit Safranin rot, reine Cellulose(wnde) mit

Astrablau blau angefrbt. Um einer Pilzinfektion vorzubeugen, ist dem Astrablau eine

Messerspitze Phenol zugesetzt. Eine bleibende berfrbung der Schnitte ist durch

Differenzieren nach Augenma zu vermeiden:

Aqua dest. + 3 Tropfen HCl (5 %)

Im Anschluss an das Differenzieren erfolgte die Entwsserung und berfhrung in

Roticlear, um die Serienschnitte fr das Eindecken vorzubereiten:

Ethanol (70 %) kurz waschen

Ethanol (96 %) kurz waschen

Isopropanol (abs.) 2 min.

Roticlear I 5 min.

Roticlear II 5 min.

Roticlear III 5 min.

Fr die Herstellung von Dauerprparaten wurden die Schnitte mit ENTELLAN NEU

(MERCK) eingedeckt. Zustzlich wurden mit einem Handmikrotom (ALLMIKRO) einzelne

MATERIAL & METHODEN

23

Gewebeschnitte von frischem Pflanzenmaterial (bzw. 24 h FAA-fixierten Proben) fr die

Fluoreszenzmikroskopie hergestellt.

2.2.3 Rasterelektronenmikroskopie (REM)

Die in 70 %igem Ethanol aufbewahrten und prparierten Proben wurden vor der

rasterelektronenmikroskopischen Untersuchung fr 12 h zur chemischen Entwsserung

in FDA (Formaldehyd-Dimethyl-Acetal; FLUKA) berfhrt. Darber hinaus fungiert FDA als

Intermedium bei der Critical-Poit-Trocknung (GERSTERBERGER & LEINS, 1978) und wurde

im Verlauf des Trocknungsvorganges durch das eigentliche Trocknungsmedium CO2

ersetzt, welches im flssigen Aggregatzustand (50 bar/10 C) vorliegt und dessen

Kritischer Punkt bei 42 C/73 bar erreicht wird. Verwendet wurde ein Critical Porint Dryer

CPD 030 der Firma BALZERS/BAL TEC AG.

Fr die Prparation der Vegetationskegel von S. verticillata erwies es sich als vorteilhaft

die Objekte nach der Trocknung (unmittelbar vor dem Aufkleben) nachzuprparieren. Je

nach Prparatgre erfolgte das Aufbringen der Objekte auf die massiven

Aluminiumzylinder entweder mit Leit-C (NEUBAUER CHEMIKALIEN) oder Leit-Tabs der Firma

PLANO. Zur Vorbereitung auf das Rasterelektronenmikroskop werden Objekte mit Hilfe

eines Sputtergertes SCD von BALZERS mit einer dnnen Schicht Gold belegt. Fr

Gymnospermenknospen erwies sich eine Besputterungszeit von ca. 5 min. als optimal.

Abhngig von der jeweiligen Oberflchenstruktur der Objekte musste teilweise

nachtrglich erneut besputtert werden.

MATERIAL & METHODEN

24

2.3 Molekulargenetische Methoden

2.3.1 Allgemeines

Spezielle Abwandlungen bzw. Varianten der angegebenen Protokolle und

Arbeitsschritte, sowie genauere Angaben zu jeweils speziell verwendeten Primern etc.

werden im Folgenden eher allgemein behandelt. Die betreffenden Arbeitsschritte

werden, im Zuge der Methodenetablierung fr Gymnospermen, im entsprechenden

Ergebnisteil aufgegriffen und Objekt bezogen(er) besprochen.

2.3.1.1 Primerdesign

ber die Suche in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), kurz NCBI, wurden bekannte Gensequenzen aus-

gewhlter Pflanzen ermittelt. Zum Erstellen degenerierter Primer wurden entsprechende

Gensequenzen aus Angio- und Gymnospermen ausgewhlt und in einem Alignment

unter Anwendung des Programms VectorNTI (INVITROGEN) verglichen. Hergestellt wurden

abhngig vom jeweiligen Versuchsansatz auch spezifische Primer. Die Synthese der

Primer aus der angegebenen Basensequenzen erfolgte durch die Firma MWG BIOTECH

(http://www.mwg-biotech.com).

2.3.1.2 Sequenzanalyse

Die zur Verifizierung von Klonierungsprodukten ntige Sequenzierung der DNA wurde

von der Firma MWG BIOTECH (http://www.mwg-biotech.com) durchgefhrt. Ein

anschlieender Abgleich der erhaltenen mit bereits vorhandenen Sequenzen erfolgte

ber die Datenbank-eigene BLAST-Funktion von NCBI (Blast Search:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast).

2.3.2 Material fr molekulargenetische Methoden

Die in diesem Kapitel verwendeten Lsungen und Medien werden, sofern nicht allgemein

im Abschnitt Lsungen erlutert, im jeweils zugehrigen thematischen Versuchsabschnitt

bzw. Methodenteil direkt aufgefhrt. Smtliche Lsungen fr die in-situ-Hybridisierung

oder andere RNase-sensitive Schritte wurden mit Diethyl-Pyrocarbonat (0,1 %)-

behandeltem Aqua dest. (DEPC-H2O) und Chemikalien in p.a.-Qualitt (frisch) angesetzt.

Die entsprechenden Lsungen und entsprechendes Material (Glasware etc.) wurden

autoklaviert bzw. sterilisiert. Die verwendeten Chemikalien, Verbrauchsmaterialien,

Enzyme etc. sind in Tabelle 2 aufgefhrt.

MATERIAL & METHODEN

25

Tab. 2: Verwendete Materialien.

I. Chemikalien:

Acrylamid

BCIP/NBT (SIGMAFAST)

Borsure

Bromphenolblau

BSA, Fraktion V

CaCl2

Chloroform

Coomassie Brilliant Blue R250

Denhardts Lsung

DEPC

Dextransulfat (Natriumsalz)

EDTA (Titriplex)

Eosin

Essigsure (100 %)

Essigsureanhydride

Ethanol p.a

Ethidiumbromid

Formaldehyd (37 %)

Formamid

Glucose

Glutathion

Glycin

Glycerin

HCl (36-38 %)

HCl (2M, Lsg.)

IPTG

Isopropanol

KCl

Lithiumchlorid

MgCl2.6 H20

-Mercaptoethanol

Methanol

NaCl

Na2HPO4.2 H2O

NaH2PO4.H2O

NaOH (Pellets)

NaOH (4M, Lsg.)

Natriumacetat

OrangeG

Paraformaldehyd (16 %)

Polyvinylalkohol

Roti-Histol

SDS

APPLICHEM

SIGMA ALDRICH

APPLICHEM

SIGMA-ALDRICH

APPLICHEM

J. T. BAKER, BAKER ANALYZED

J.T. BAKER, BAKER ANALYZED

SIGMA-ALDRICH

APPLICHEM

APPLICHEM

APPLICHEM

MERCK

WALDECK DIVISION CHROMA

VWR LABORHANDEL

SIGMA-ALDRICH

MERCK

APPLICHEM

J. T. BAKER, BAKER ANALYZED

VWR-NORMAPUR

J.T. BAKER

MERCK

APPLICHEM

J.T. BAKER


APPLICHEM

APPLICHEM




APPLICHEM

MERCK

J. T. BAKER





RIEDEL-DE HAEN


APPLICHEM

ELECTRON MICROSCOPY SCIENCE

MERCK

ROTH

APPLICHEM

MATERIAL & METHODEN

26

Select Pepton

Triethanolamin

Tris

TrisHCl

Trypton

Tween 20

x-Gal

BD BIOSCIENCE

FLUKA/BIOCHEMIKA

APPLICHEM

APPLICHEM

APPLICHEM

APPLICHEM

APPLICHEM

II. Verbrauchsmaterial:

Agar

Agarose

Ampicillin

Entellan

Histowax

Paraplast Plus

PROTRAN BA85 , 0,45 m / 82 mm

POLYSINE Microscope Slides, precleaned;

BD BIOSCIENCE

BIOZYM

APPLICHEM

MERCK

HISTOLAB PRODUCTS AB

TYCO HEALTHCARE/KENDALL

WHATMAN

ESCO/ERIE SCIENTIFIC COMPANY

III. Enzyme & Sonstiges

PWO-Polymerase (1 u/l)

Taq-Polymerase (5 u/l)

T4-DNA-Ligase (1u/l)

T7-Polymerase (1u/l)

ProteinaseK-Lsg. (20mg/ml)

RevertAid H Minus M-MuLV Reverse Transkriptase (200u/l)

RNaseA (10 mg/ml)

Restriktionsendonukleasen

*

Yeast tRNA

GeneRuler TM 100bp DNA LadderPlus (0,5 g/Spur)

Hefe-Extrakt

DIG RNA Labeling Mix (DIG UTPs)

Nukleasefreies H2O, Molecular Biology Grade

SDS-Marker (MW-SDS-70L, 66 kDa)

PEQLAB

PEQLAB

FERMENTAS

FERMENTAS

APPLICHEM

FERMENTAS

APPLICHEM

NEW ENGLAND BIOLABS (NEB)

*

INVITROGEN (LIFE TECHNOLOGIES)

FERMENTAS

BD BIOSCIENCE

ROCHE

EPPENDORF

SIGMA-ALDRICH

2.3.2.1 Oligonukleotide

Die in dieser Arbeit verwendeten spezifischen und degenerierten Primer (dP) sind in

Tabelle 3 aufgelistet.

Tab. 3: Verwendete Primer.

Primer Sequenz

dP-SvKnox for1

dP-SvKnox for2

dP-SvKnox rev1

5-CCRGARYTMGAYCARTTYATGGARGCWTAC 3

5-AAGAARAARAAGAAAGGDAARCTYCC 3

5-GGRAGYTTHCCTTTCTTYTTYTTCTT 3

MATERIAL & METHODEN

27

dP-SvKnox rev2

Knat1 for

Knat1 rev

PaHbk1 for

PaHbK1rev

PhyN1 for

PhyN1 rev

SvSondeKnox for1

SvSondeKnox for2

SvSondeKnox rev1

SvSondeKnox rev2

SvGST for

SvGST rev

5-ATRAACCAATTRTTKATTTGYTTYTGATCYARCCC3

5GGAATTCCATGGAAGAATACCAGC 3

5GGGGTACCCCTTATGGACCGAGACG -3

5-CCTCGAGGGTACCCATGGAGCACCTGAATGCAG -3

5-GCGGCCGCGAGCTCGTTAGCAATCCAAATGATAGCC 3

5CGAATTGGGTACCGATGATCATGGGGAGGTGAT 3

5GCTGGAGCTCGATGTTGGGCTTCTGAGTGA 3

5CCGAGCTCGAAGATTGCAGCACTGGTGAA 3

5CTCAAGCTTAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTTC 3

5CCGAGCTCAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTTC 3

5CTAAGCTTGAAGATTGCAGCACTGGTGAA 3

5CAGTGAATTCCCGGAGTTAGATCAATTTATGGA 3

5GCCCTCGAGAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTT 3

2.3.2.2 Plasmide

Fr die Klonierung von erstellten PCR-Fragmenten kamen folgende Plasmide zum

Einsatz:

Tab. 4: Verwendete Plasmide.

Plasmid Quelle

pBlueskript SK +

pCR II TOPO

pJET 1.2

pGEM-11Zf

pGEX-4T1

STRATAGENE

INVITROGEN

FERMENTAS

PROMEGA

GE HEALTHCARE

2.3.2.3 Bakterienstmme

Zur Amplifikation von DNA und zur heterologen Expression wurden verschiedene

Stmme von E. coli verwendet: Tab. 5: Verwendete Bakterienstmme.

Stamm Genotyp Quelle

DH5*

TOP10

BL21(DE3)

F-80dladacZM15, rec A1, end A1, gyrA96, thi-1, hsd R17, (rK-mK-), sup E44, rel A1, deo R, (lac ZYA-arg F) U169 F- mcr A (mrr-hsd RMS-mcr BC) 80lac ZM15 lacX74 rec A1 deo R ara D139 (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) end A1 nup G F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3)

HANAHAN, 1983

INVITROGEN

INVITROGEN

*nur fr Amplifkation der Vektoren verwendet

MATERIAL & METHODEN

28

2.3.2.4 Kits

Im Rahmen dieser Arbeit wurden fr verschiedene molekularbiologische Arbeiten

unterschiedliche Kits verwendet. Die verwendeten Kits sind in Tabelle 6 aufgelistet.

Tab. 6: Verwendete Kits.

Methode Produkt (Hersteller)

Isolierung von Nukleinsuren

Aufreinigung von Nukleinsuren

cDNA-Synthese

Gelelution/Extraktion

Ligation

Sondenherstellung/Markierung

Detektion

- Rneasy Plant Mini Kit for Isolation of Total RNA from Plant

Cells and Tissue and Filamentous Fungi (QIAGEN)

- DNeasy Plant Mini Kit for Isolation of Total DNA from

Plant Cells and Tissue (QIAGEN)

- FastPlasmid Mini Kit (EPPENDORF)

- RNA-Clean up Kit (MACHERYNAGEL)

- Revert Aid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit

(FERMENTAS)

- Perfectprep Gel Cleanup Kit (EPPENDORF)

- GeneJet PCR Cloning Kit (FERMENTAS)

- TA Cloning Kit (INVITROGEN)

-Transcript AidTM T7 High Yield Transcription Kit

(FERMENTAS)

- DIG Nucleic Detection Kit (ROCHE)

2.3.2.5 Lsungen

Verwendung fanden folgende Puffer und Stammlsungen. Weitere, aus den

Stammlsungen angesetzte Lsungen, sind direkt in den jeweiligen Versuchsablufen

aufgefhrt.

DEPC-H2O, 1000 ml:

1 ml DEPC auf 1000 ml Aqua dest.,

ber Nacht rhren (Abzug!),

im Anschluss autoklavieren!

Dextransulfat:

10 g Dextransulfat in 15 ml

DEPC-H2O

DNA-Probenpuffer (4x):

40 % (w/v) Saccharose

0,1 % (w/v) OrangeG

DNA-Probenpuffer (5x):

50 % (w/v) Glycerin

0,1 % (w/v) Bromphenolblau

NTE, pH 8,0:

0,5 M NaCl

10 mM Tris-HCl

1 mM EDTA

Puffer 1, pH 7,5:

100 m Tris-HCl

150 mM NaCl

MATERIAL & METHODEN

29

Puffer 2, pH 9,5:

100 mM Tris-Base

100 mM NaCl

50 mM MgCl2

PBS (10x):

1,3 M NaCl

0,07 M Na2HPO4

0,03 M NaH2PO4

DEPC-H2O ad 1000 ml

Proteinase K-Puffer:

20 mM Tris-HCl, pH 7,0

2 mM CaCl2

Salze (10x):

3 M NaCl

0,1 M Tris

0,05 M EDTA

0,5 M NaH2PO42 H2O

0,5 M Na2HPO4

SSPE (20x), pH 7,4:

3M NaCl

20 mM EDTA

200 mM NaH2PO42 H2O

TBE (1x), pH 8:

90 mM Trisbase

90 mM Borsure

2, 5 mM EDTA

2.3.3 Isolierung von RNA & DNA aus Pflanzen

Die Isolierung der Gesamt-RNA aus Pflanzenmaterial (vergleiche 2.1, Tab. 1) erfolgte

mittels RNeasy Plant Mini Kit von QIAGEN (Tab. 6). Hierzu wurde das Pflanzenmaterial in

flssigem Stickstoff pulverfein gemrsert. Die Isolierung erfolgte nach Angaben des

Herstellers inklusive aller Optionalschritte und unter Verwendung des RLT-Puffers.

Eingesetzt wurden max. 100 mg des Gewebepulvers. Nach Zugabe von 450 l RLT-

Puffer wurden die Zellen unter vortexen und zustzlicher 1 bis 3 min. Inkubation bei

56 C unter Zuhilfenahme eines Mini-Pistills lysiert. Zum Scheren der DNA und zur

weiteren Homogenisierung bzw. Reduktion der Viskositt wurde die Probe durch einen

Filter (QIASHREDDER) zentrifugiert (2 min./13.000 rpm). Der wssrige berstand wurde

mit 0,5 Volumen Ethanol (100 %) versetzt. Die Probe wurde komplett auf einen Filter

gegeben und durch Zentrifugation (15 sec./10.000 rpm) an eine Silica-Gelmembran

gebunden. Die Membran wurde im Anschluss dreimal gewaschen: mit 700 l RW1-Puffer

und Zentrifugation fr 15 sec. bei 10.000 rpm, mit 500 l RPE-Puffer inklusive einer

Zentrifugation fr 15 sec. bei 10.000 rpm und 500 l RPE fr 2 min. Durch 1 min.

Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit wurde die Membran getrocknet. Die RNA

wurde mit 30 l RNase freiem H2O eluiert.

Fr die DNA-Isolierung aus Pflanzenmaterial wurde das DNeasy Plant Mini Kit der Firma

QIAGEN (Tab. 6) verwendet. Nach Herstellerangaben wurde das Stickstoff-gemrserte

Gewebepulver (max. 100 mg frisch oder 20 mg trocken) mit 400 l des mitgelieferten

A1-Puffers und 4 l RNAse (100 mg/m

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