Partehartzaile funtzionalak eritasun zeliakoan ...€¦ · Gaixotasun autoimmune konplexu honen genetika ulertzeko xedez, nire tesi proiektuaren helburua genoma osoaren adierazpen

Partehartzaile funtzionalak eritasun zeliakoan: identifikazioa eta asoziazio genetikoa

Jakintza-arloa: Kimika

Egilea: AINARA CASTELLANOS RUBIO

Urtea: 2010

Zuzendariak: JOSE RAMON BILBAO CATALA, LUIS ANTONIO CASTAÑO GONZALEZ

Unibertsitatea: UPV/EHU

ISBN: 978-84-8438-593-6

Hitzaurrea

2010eko Urrian defendatu nuen tesi hau, Jose Ramón Bilbao eta Luis Castaño

doktoreen zuzendaritzapean.

Eritasun zeliakoaren genetikaren inguruan egindako tesia da hau. Gaixotasun

autoimmune konplexu honen genetika ulertzeko xedez, nire tesi proiektuaren

helburua genoma osoaren adierazpen mikromatrizeak oinarri gisa erabilita

eritasun zeliakoaren partehartzaile funtzionalen bilaketa izan da.

Gaixotasunarekiko suszeptibilitatean zerikusia duten geneak identifikatzea

ezinbestekoa da, alde batetik atzean dauden mekanismo patogenikoak

ulertzeko, eta bestaldetik arriskuan dauden pertsonak bereizteko markatzaile

genetikoak definitzeko ere. Markatzaile genetiko berriak identifikatzeak

erantzun autoimmunea hasi baino lehen diagnosi prediktiboa burutzea posible

egingo luke, immunoprebentzioko entsegu klinikoetarako hautagaien

aukeraketa hobetuko delarik.

Tesia egin eta gero Columbia Unibertsitatean egon naiz postdoktoral moduan,

erantzun inmunitarioan inplikaturiko RNA ez kodetzaileak aztertzen. Egun, UPV-

EHUn bueltan nago ikertzailea moduan, Juan de la Cierva kontratu batekin.

Ainara Castellanos

2016

PARTEHARTZAILE FUNTZIONALAK

ERITASUN ZELIAKOAN

IDENTIFIKAZIOA ETA ASOZIAZIO GENETIKOA

Ainara Castellanos Rubio

Leioa, 2010

Tesi hau ondoko funtsek finantzatu dute: Espainiako Berrikuntza eta Zientzia

Ministerioko beka predoktorala (AP-2005-330), Instituto de Salud Carlos III-ko PI-

03-11032, PI-04-1170 eta Eusko Jaurlaritzako GV-06-11030 ikerkuntza-proiektuak,.

“Ancora imparo”

Michelangelo

Eskerronak

Han pasado más de cinco años desde que entré por primera vez por la puerta de la U. de

Investigación del Hospital de Cruces y aunque los primeros meses se me antojaron largos

parece que apenas ha pasado el tiempo desde aquel día. En estos años han sido muchas las

personas que de un modo u otro han contribuido a que esta tesis saliera adelante, este

apartado va dirigido a todas ellas.

En primer lugar me gustaría darle las gracias al Dr. Luis Castaño por darme la oportunidad de

trabajar en el mundo de la investigación y realizar esta tesis doctoral que espero sea tan solo

el comienzo de mi carrera.

Bigarrenik eskerrak eman nahi dizkiot nire tesi zuzendariari, Buliri, denbora guzti honetan zehar

nire pausuak gidatzeagatik beti ere nire ideia propioak garatzen utzi dizkidalarik. Ados jartzen

ez ginenean nirekin eduki duzun pazientziagatik, garagardo barik edo garagardoa eskuan eduki

ditugun elkarrizketa guztiengatik, eta batez ere nigan jarritako konfiantzagatik. Mila esker

zientziarenganako duzun sentimendu hori nirekin konpartitzeagatik.

Eskerrak eman nahi dizkiot ere ikerkuntza unitatean pasatu dudan denbora gehienean zehar

nirekin egon den pertsona oso garrantzitsu bati, nire adiskide eta laguna izan den Izortzeri.

Ikerkuntzari esker pasa ditugun momentu sinestezin guztiengatik, bisitatu ditugun leku guztietan

bota ditugun farra eta barreengatik, milaka une onengatik eta ere hain onak izan ez

direnengatik, beti ere nire arazo guztiak entzuteagatik eta laguntzeko prest egoteagatik, bai

zientzian eta baita bizitzan ere nire ahizpa nagusia izateagatik.

También quiero agradecer a todas las personas que comenzaron siendo compañeros y

acabaron siendo grandes amigos. A Itzi y a Tamara que aunque últimamente os vea menos sé

que puedo contar con vosotras para lo que sea, gracias por ser siempre todo oídos. A los

vecinos del labo de al lado que han estado dispuestos a ayudarme en todo momento; a Bego

que desde que entré por la puerta la primera vez me deleitó con una sonrisa y ha estado ahí

cada vez que la he necesitado para escuchar mis más y mis menos, para animarme y darme

todo tipo de consejos, echaré de menos nuestros minimineos; a Aitzi con la que puedo

pasarme horas hablando sobre ciencia o salir a tomar unos kalimotxos y disfrutar igualmente

de una cosa o de la otra (quizá un poquito más de la segunda), mila esker Aitzibiritxi nirekin

euki duzun pazientziagatik!!; a Unai por no tener jamás un mal gesto y acudir sonriendo

siempre que he gritado “Unaaaaaaai” que no han sido pocas veces y por último a Olaia por

decir siempre lo que piensa, por su sinceridad y por su espontaneidad, la siguiente que sea la

tuya!!

Eskerronak

Eskerrik asko ere, azkenaldian nirekin Little HongKong konpartitu duten Nora eta Leticiari,

laborategian sortutako anbiente onagatik, abestiengatik (And she was born, born…), negar egin

arte botatako barreengatik, haien gogo eta indarra kontagiatzeagatik nire azkenengo epealdi

honetan. Mila esker espazio txiki honetan eraikitako laguntasun handiagatik. Animo neskak!

Gracias también, al resto de compañer@s de la Unidad de Investigación por todos los

momentos pasados y la ayuda que me han prestado a lo largo de estos años. Me gustaría

también dar las gracias a los médicos que han colaborado en este proyecto, especialmente al

Dr. Vitoria. Y por supuesto, agradecer tanto a los enfermos, como a sus familiares ya que sin

su colaboración desinteresada esta tesis nunca podría haber sido llevada a cabo.

Durante estos cinco años he tenido la oportunidad de visitar muchas ciudades en las que he

conocido a mucha gente y he aprendido mucho sobre ciencia y también sobre mí misma. Los

cuatro meses que pasé en Tampere fueron sin duda un punto de inflexión para mí tanto en lo

personal como en lo profesional. Quiero empezar agradeciendo a aquellas personas que

hicieron que mi estancia fuera algo más que cuatro meses dedicándome exclusivamente a la

ciencia. A Natalia por ser mi amiga, por estar ahí cuando no sabía si reírme o llorar, por todos

los momentos buenos que hemos pasado y que sin duda seguiremos pasando, no se que haría

sin tí!! Thank you Brigi for taking me out and cheering me up when I really needed. A Diego y a

Gonzalo por las conversaciones infinitas, porque podemos estar hablando durante horas y

siempre tener algo que decirnos. A Tania por todos los viernes (y también algunos sábados) en

los que acabámos perdiendo la noción del tiempo y casi siempre también de otras cosas… To

Wilco for being always so sweet and smiley and for the long-long messages we have

exchanged afterwards. A Carlos, por recordarme que a veces también hay que tomarse un

tiempo para pararse a pensar en uno mismo.

I also want to acknowledge Celiac Disease Study Group, thanks to Prof Maki for giving me the

chance of visiting his lab and spending there four exciting months in which I learned really a lot.

Thank you Katri Lindfors for guiding my first steps into the world of cell biology, for being always

open to my ideas and of course for travelling to Bilbao for being member of my PhD thesis

tribunal. My acknowledgments also to the girls, for the (early) lunch times, for being always

eager to help me in and outside the lab and to teach (or at least try) me all the secrets of the

Finnish culture, cuisine and language. Gracias a Sergio por las largas conversaciones en las

que acabó por contagiarme parte de su pasión por la transglutaminasa y por acceder, a pesar

de las prisas, a revisar esta tesis.

Eskerronak

En este apartado tampoco podrían faltar aquellos que emprendieron el camino conmigo hace

ya más de una década, mis compañeros y amigos de la Uni. Gracias a Zur, Jan, Pamela, Itxas,

Josu y Jokin, por los momentos que pasamos cuando aún éramos proyectos de Biólogos y por

todos los que han venido después, por los chistes de los que sabíamos que solo podíamos

reírnos nosotros, por los ocapis, por los miles de e-mails para conseguir juntarnos aunque sea

unas horas, por las conversaciones de “que será de nosotros”, por esa empresa que quizá

algún día vea la luz, por los jueves de fiestas de Bilbo y por todas las catástrofes

meteorológicas que hemos vivido juntos.

Tengo también muchísimo que agradecer a mis amigas, Nora, Gema, Jessica, Nagore, Alaitz y

Marta, por algo tan simple pero importante como “estar ahí”. Porque a pesar de que los años

han ido pasando y cada una hemos elegido seguir un camino diferente nunca hemos dejado de

andar en paralelo, porque sé que puedo contar con ellas esté aquí, a miles de kilómetros, o a

cien años luz. Por escucharme siempre que lo he necesitado y ayudarme a seguir cuando

pensaba que no me quedaban fuerzas. Por regalarme su amistad sin nunca pedir nada a

cambio. Ya estáis cogiendo los calendarios chicas, porque espero visita.

Mis agradecimientos también, a todas estas personas que a lo largo de estos años me han

soportado con estoicidad cada vez que me ha dado por hablar de ciencia, de la enfermedad

celiaca o de mi incierto futuro, gracias por la paciencia!!

Gracias Juanan, porque aunque las cosas no salieron como planeábamos has estado a mi lado

desde el primero al último día del desarrollo de esta tesis. Porque por mí aprendiste palabras

como microarray o PCR a pesar de no saber lo que significaban, porque siempre has tenido fe

ciega en mí y jamás me has dejado caer aunque en ocasiones me lo haya merecido.

Y por último quiero dar las gracias a mi familia. A mi ama y a mi aita, por animarme a escoger

este camino al principio, cuando no tenía muy claro lo que quería, por apoyarme a lo largo de

estos años, confiando siempre en mí y dándome fuerzas en cada momento, por alegrarse por

cada uno de mis pequeños triunfos y quitarle peso a lo que yo creía que eran fracasos, por

escucharme con toda su atención a pesar de no entender demasiado de lo que estaba

hablando. Por haberme enseñado lo importante que es en la vida tener y perseguir las

ambiciones, porque todo lo que soy y lo que he conseguido se lo debo a ellos. Y a mi pequeña

hermana, Idoia, porque ella me ha enseñado a mirar el mundo con otros ojos, a no ver solo lo

superfluo, porque siempre que he tenido un problema ha sabido guiarme hacía la solución sin

faltarle jamás una sonrisa, por contagiarme su pasión por la ciencia y por la vida en general

Aurkibidea

LABURDURAK 1

ARGITALPEN ORIGINALEN ZERRENDA 3

PROIEKTUAREN JUSTIFIKAZIOA ETA EREMUA 5

1. SARRERA 9

1.1. Eritasun zeliakoa 9

1.1.1. Ezaugarri klinikoak eta diagnosia 9

1.1.2. Epidemiologia 10

1.1.3. Tratamendua eta terapia berriak. 11

1.2. Eritasun zeliakoaren genetika. 13

1.2.1. HLA geneak 15

1.2.2. Genoma osoko lotura ikerketak eta gene izangai posizionalak 16

1.2.2.1. CELIAC2 locus 17



1.2.2.4. Beste lokus batzuk 18

1.2.3. Izangai funtzionalak 18

1.2.4. Genoma osoko asoziazio ikerketak 19

1.3. Eritasun zeliakoren patogenesia 23

1.3.1. Glutena 24

1.3.2. Transglutaminasa 25

1.3.3. Immunitate adaptatiboa 26

1.3.4. Immunitate innatoa 26

1.3.5. Beste bidezidor desregulatuak 27

1.3.5.1. Komunikazio zelularra. 27

1.3.5.2. Seinaleztapen bidezidorrak: TGFB eta Jak-Stat seinaleztapen

bidezidorrak. 28

1.3.5.3. Apoptosia eta ziklo zelularra. 29

1.3.5.4. Matrize estrazelularra (ECM) 29

1.3.5.5. Ubikitina-proteasoma sistema 30

2. IKERKETAREN HELBURUAK 33

3. MATERIAL ETA METODOAK 37

3.1. Ikerketaren diseinua eta laginak 37

3.1.1. Onarpen etikoa 38

3.1.2. Biopsia laginak 38

Aurkibidea

3.1.2.1. Mikromatrize esperimentuak (I, II) 38

3.1.2.2. Erreplikazio esperimentuak (I, II) 39

3.1.2.3. UBD analisia (III) 39

3.1.3. DNA laginak (I,III) 39

3.1.3.1. Illumina plataforma (I) 39


3.2. Metodoak 40

3.2.1. DNAren erauzketa (I,III) 40

3.2.2. Biopsien kultiboa (I,II) 40

3.2.3. RNAren erauzketa (I-III) 40

3.2.4. Geneen adierazpen profila (I-III) 41

3.2.4.1. Mikromatrize esperimentuak (I,II) 41

3.2.4.2. Erreplikazio esperimentuak (I,III) 41

3.2.5. Gene izangaien eta SNP-en aukeraketa (I,III) 42

3.2.6. SNPen genotipaketa (I,III) 44


3.2.6.2. SNP bakarreko genotipaketa (III) 45

3.2.7. Data-analisia 45

3.2.7.1. Mikromatrize esperimentuak (I,II) 45

3.2.7.2 Bidezidorren analisia (II) 46


3.2.7.4. SNP bakarreko genotipaketa (III) 47

3.2.7.5. Genotipo fenotipo korrelazioa: eQTL (III) 47

4. EMAITZAK 51

4.1. Geneen adierazpen-profila (I-III) 51

4.1.1. Mikromatrize-esperimentuak (I, II) 51

4.1.1.1. Esposizio kronikoa 51

4.1.1.2 . Esposizio akutua 52

4.1.2. Erreplikazio esperimentuak (I, III) 53

4.1.2.1. Mikromatrizeen emaitzen konfirmazioa (I) 53


4.2. Gene izangaien eta SNPen aukeraketa (I, III) 54

4.2.1 Mikromatrize esperimentuak (I) 54

4.2.2. UBD analisia (III) 55

Aurkibidea

4.3. SNP genotipaketa (I, III) 56

4.3.1. Illumina plataforma (I) 56

4.3.2. SNP bakarreko genotipaketa (III) 59

4.4. Analisi funtzionala (II, III) 59

4.4.1. Bidezidor patologiko potentzialak (II) 59

4.4.2. UBDren analisia 66

5. DISKUSIOA 69

6. ONDORIOAK 83

7. BIBLIOGRAFIA 86

Laburdurak

1

LABURDURAK

AGA antigliadina antigorputzak

CD eritasun zeliakoa

cDNA DNA osagarria

CEH kontserbaturiko haplotipo zabalduak

ECM matrize estrazelularra

EGFR epidermiko hazkuntza faktorearen hartzailea

EMA antiendomisio antigorputzak

eQTL pressingon quantitative trait loci

ESPGHAN Europako Gastroenterologia, Hepatologia eta Nutrizio Pediatrikorako Elkartea

FDR false discovery rate

GFD glutenik gabeko dieta

GO gene ontology

GWAS genoma osoko asoziazio ikerketak

HLA giza antigeno leukozitarioa

IEL linfozito intraepiteliala

IFN interferoia

KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

LD lotura desoreka

MHC histokonpatibilitate konplexu nagusia

MICA MHC Class I-like molecule A

MMP matrizeko metaloproteinasa

NFkB kappa B faktore nuklearra

NK natural killer

RMA robust multichip average

RT-PCR alderantzizko transkripzioko PCRa

SAM significance analysis of microarrays

SNP nukleotido bakarreko polimorfismoa

TGA ehunaren transglutaminasaren aurkako autoantigorputzak

TGFB hazkuntza faktore transformatzailea

TIMP metaloproteinasen ehunetako inhibitzailea

TLR toll moduko hartzailea

TNF tumoreen nekrosi faktorea

tTG transglutaminasa

UBD ubiquitin D

Argitalpen originialen zerrenda

3

ARGITALPEN ORIGINALEN ZERRENDA

Tesi proiektu hau, I-III zenbaki erromatarrez izendatutako hurrengo argitalpenetan,

oinarrituta dago. Ikerketa bakoitza (I-III) Ikerketa helburuak atalean definitutako

helburu zehatzei erantzuteko burutu da.

I) Castellanos-Rubio A., Martin-Pagola A., Santín I., Hualde I., Aransay AM.,

Castaño L., Vitoria JC., and Bilbao JR. Combined functional and positional gene

information for the identification of susceptibility variants in celiac disease.

Gastroenterology, 134: 738-746, 2008.

II) Castellanos-Rubio A., Santín I., Martin-Pagola A., Irastorza I., Castaño L., Vitoria

JC., and Bilbao JR. Long-term and acute effects of gliadin on small intestine of

patients on potentially pathogenic networks in celiac disease. Autoimmunity,

III) Castellanos-Rubio A., Santín I., Irastorza I., Sanchez-Valverde F., Castaño L.,

Vitoria JC., and Bilbao JR. A regulatory single nucleotide polymorphism in the

ubiquitin D gene associated with celiac disease. Human Immunology, 71(1):96-9,

2010.

Proiektuaren justifikazioa eta eremua

5

PROIEKTUAREN JUSTIFIKAZIOA ETA EREMUA

Eritasun zeliakoa (CD) prebalentzia altuko gaixotasun autoimmune kroniko da.

Gaixotasun honen desagerpenerako prebentzioa garrantzitsua dela uste da,

horretarako diagnosi goiztiar eta predikzio lanabes eraginkorrak garatu behar

direlarik. Denbora eskalan, sintoma klinikoen agerpena gaixotasunaren progresioko

azken urratsak bide dira. Gaixotasunaren fase aktiboaren aurretik markatzaile

immunologikoak ageri dira zirkulazioan, besteak beste tTG-ren (ehunetako

transglutaminasa) kontrako autoantigorputzak, aurrekari genetikoa duten pertsonen

artean abiarazi eta sistema immuneak eragindako ehunen suntsipen aktiboaren isla

izanik. Beraz, gaixotasunarekiko suszeptibilitatean zerikusia duten geneak

identifikatzea ezinbestekoa da, bai atzean dauden mekanismo patogenikoak

ulertzeko, bai arriskuan dauden pertsonak bereizteko markatzaile genetikoak

definitzeko ere; azken honek diagnosi prediktiboa burutzea posible egingo bailuke

erantzun autoimmunea hasi baino lehen, immunoprebentzioko entsegu

klinikoetarako hautagaien aukeraketa hobetuko delarik.

Gaixotasun autoimmune konplexu honen genetika ulertzeko xedez, proiektu honen

helburua genoma osoaren adierazpen mikromatrizeak oinarri gisa erabilita eritasun

zeliakoaren partehartzaile funtzionalen bilaketa izan da.

1. Sarrera

Sarrera

9

1. SARRERA

1.1. Eritasun zeliakoa

Glutenak eragindako enteropatia (MIM 212750) edo eritasun zeliakoa (CD) glutena

hartzearen ondorioz, suszeptibilitate genetikoa duten pertsonengan garatzen den

gaixotasun kroniko, inflamatorioa da, heste meharreko heste-biloen lautzea

ezaugarri nagusia izanik.

1.1.1. Ezaugarri klinikoak eta diagnosia

Eritasun zeliakoa Samuel Geek lehen aldiz 1890eko hamarkadan 1 aipatu bazuen

ere, glutenaren efektu kaltegarriak ez ziren 60 urte pasatu arte deskribatu 2. Tratatu

gabeko CD klasikoari asoziaturiko sintomak eta zantzuak, hesteetakoak

(beherakoa, abdomeneko laxaketa eta okadak) edota elikagaien malabsortzioaren

ondoriozkoak (hazkunde arazoak eta ahultze psikomotorea) izan daitezke 3.

Eritasun zeliakoari erlazionaturiko bestelako sintoma atipikoak ere badaude, hala

nola zenbait agerpen neurologiko, osteoporosia, ahoaren mukosaren aftosia,

artikulazioen sintomak eta gibeleko entzimen kontzentrazio altuak 4. Ikuspegi

histologikotik, sentikorra den pertsonak glutena duen dieta hartutakoan, heste

meharreko mukosak aldaketa morfologikoak jasaten ditu, heste-biloen atrofia eta

kripten hiperplasia gertatzen direlarik (1. irudia). Glutenaren eraginez gertatzen

diren aldaketa horiek I-etik III-ra doan Marsh-en sailkapenaren arabera bana

daitezke 5. Hasieran, linfozito intraepitelialen (LIE) infiltrazioa gertatzen da heste-

biloen epitelioan zehar (Marsh I). Infiltrazioari, kripten hipertrofiak jarraitzen dio

(Marsh II), biloak laburtzen doazen heinean. Azkenengo fasean (Marsh III), kriptak

erabat hipertrofiatuta daude, lamina propioa handituta eta heste-biloen atrofia

dagoelarik, azken horren larritasunaren arabera, partziala, ez-osoa edo osoa izan

daitekeelarik. Heste meharreko mukosaren kalteekin batera, glutenak eragindako

autoantigorputzak ere agertzen dira seroan, horien artean endomisio (EMA) eta

ehunetako transglutaminasaren (tTG) kontrako autoantigorputzak 6.

Sarrera

10

1. irudia: Glutenak induzituriko mukosaren aldaketa Marsh sailkapenean oinarrituta.

Ezaugarri patologiko horiek aintzat hartuta, Europako Gastroenterologia,

Hepatologia eta Nutrizio Pediatrikorako Elkarteak (ESPGHAN) finkatu dituen

diagnosirako irizpideak heste meharreko biopsietan azaldutako lesio histologiko

bereizgarrian eta emaitza serologiko positiboetan oinarritzen dira 7.

1.1.2. Epidemiologia

Orain dela hamarkada bat CD gaixotasun ez-ohikotzat jotzen zen, Europako

prebalentzia tasak 1/1000 baino txikiagoak zirelarik 3. Arestiko zenbait ikerketen

arabera, CD-ren prebalentzia %1 ingurukoa da Mendebaldeko Europako

populazioetan 8 taldeen arteko desberdintasunak gora behera. Gainera 1980. eta

1990. urteetan CD-aren haurtzaroko prebalentzia emendatu dela ikusi da, igoera

hori umeen elikatze-ohiturekin erlazionatu delarik 9. Aldi berean, helduen CD-ren

diagnosia ere izugarri igo da 10-12. Guzti horren inguruan, ingurumeneko arrisku

faktoreak edo zenbait infekzio biriko iradoki dira CD-rako arrisku faktore gisa 13.

Garai batean, Europar jatorria duten pertsonen gaixotasuna zela uste bazen ere,

Mendebaldeko, Iparramerikako eta Australiako populazio orokorretan egindako

jarraipen serologikoek, CD-ren prebalentzia 1:100 eta 1:200 artean kokatu dute

14,15. Orain dela gutxi arte, Hegoamerikan 16-18, Afrikako Iparraldean 19,20 eta Ekialde

Hurbilean 21,22, CD kasu gutxi batzuk baino ez ziren ezagun, eta gaixotasun

arrarotzat hartzen zen. Horretaz gain, Ekialde Urrunean (Txina, Japonia, Korea...)

CD-rik ez dagoela uste izan da 23. Orokorrean, populazio-ikerketa berriek CD

gutxietsita zegoela erakutsi dute, eta Mendebaldeko herrialdeen parekoa dela

Sarrera

11

frogatu. Hortaz, glutendun zerealen kontsumoa mundu osoan zabaltzen ari den

honetan, CD osasun publikoko arazo globala bihurtu da, garapen bidean dauden

herrialdeetan ere 15. Generoari dagokionez, emakumezkoek gizonezkoek baino

gehiago jasaten dute, eta adin ugalkorrean dauden gaixoetan, emakume-gizon

arrazoia 3:1-ekoa dela ikusi da 24.

1.1.3. Tratamendua eta terapia berriak.

Egun, eraginkorra den CD-ren tratamendu bakarra bizitza osorako glutenik gabeko

dieta hertsia eramatea da, hau da, gariaren, garagarraren eta zekalearen

produktuen eliminazioa. 3,25. Glutenik gabeko dieta (GFD) betetzea zaila da oso, eta

bizi-kalitatea murrizten du. Hala ere, oker trataturiko edo GFD dieta jarraitzen ez

duten gaixoek konplikazioetarako predisposizioa dute; hala nola, garaiera txikia,

desnutrizioa, osteoporosia, eritasun autoimmune sekundarioak, minbiziak,

antzutasuna eta abortuak 26. Beraz, terapia alternatibo seguru, eraginkor eta

eskuragarrien garapena beharrezkoa da.

CD-ren patogenesiaren ulermenaren aurrerakuntzetan oinarrituta, estrategia

terapeutiko anitz saiatu dira, bai in vitro zein in vivo eredutan, horietariko batzuk

dagoeneko entsegu klinikoko 1. edo 2. fasean daudelarik. Adibideen artean daude,

eraldatutako irinak, (glutenaren epitopo immunogenikoak ezabatuta dituztelarik);

peptido immunodomintzaileen degradaziorako neuropeptidoa exogenoak; heste

meharreko iragazkortasunaren murrizpena, ZOT hartzaile epitelialaren blokeatze

bidez; tTG intestinalaren inhibizioa; HLA-DQ2 antagonistak glutenaren peptidoen

aurkezpena galarazteko; zitokina proinflamatorioen modulazioa/inhibizioa eta ahoko

tolerantziaren indukzioa (2. irudia, 1. taula) 27.

Sarrera

12

2. irudia: Hurbilketa terapeutiko berriak.

Permeabilitatearen

inhibitzaileak (AT-1001)

Eraldatutako edo

pretrataturiko

glutena

Gluten

lotzaileak

Dietako gluten

peptidoakGlutenasak

tTG inhibitzaileak

Linfozitoak blokeatu

(anti-IL-15, anti-CCR9,

anti-47)

DQ2 blokeatu

Peptido analogoak

Tolerantziaren

indukzioa

Hesteko lumena

Hesteko epitelioa

(biloxkak)

Lamina propioa

zelula

zelula

Gluten peptidoa

Peptido desamidatua

TG2

Antigorputzak

Permeabilitatearen


Eraldatutako edo

pretrataturiko

glutena

Gluten

lotzaileak

Dietako gluten

peptidoakGlutenasak

tTG inhibitzaileak



anti-47)

DQ2 blokeatu

Peptido analogoak

Tolerantziaren

indukzioa

Hesteko lumena

Hesteko epitelioa

(biloxkak)

Lamina propioa

zelula

zelula

Permeabilitatearen


Eraldatutako edo

pretrataturiko

glutena

Eraldatutako edo

pretrataturiko

glutena

Gluten

lotzaileak

Gluten

lotzaileak

Dietako gluten

peptidoakGlutenasakGlutenasak

tTG inhibitzaileaktTG inhibitzaileak



anti-47)



anti-47)

DQ2 blokeatu

Peptido analogoak

DQ2 blokeatu

Peptido analogoak

Tolerantziaren

indukzioa

Tolerantziaren

indukzioa

Hesteko lumena

Hesteko epitelioa

(biloxkak)

Lamina propioa

zelula

zelula

Gluten peptidoa

Peptido desamidatua

TG2

Antigorputzak

Sarrera

13

1. taula: Eritasun zeliakoarentzako terapia berri potentzialak.

Gertakari patogenikoa Potential therapy

Dieta glutenaImmunogenizitate baxuagoko eraldatutako edo aurrez

trataturiko gluten anduiak

Lumeneko gluten iraunkorra

Irentsitako gluten peptidoak lotu edo degradatzen duten

terapia intraluminalak (glutenasak, gluten eztekatzaileak,

antigorputz neutralizatzaileak)

Iragazkortasunaren emendioa hesteanZOT hartzeilearen blokeoa (hesteko iragazkortasuna

jeisteko)

tTGk eragindako glutenaren desamidazioa tTG blokeatu

Glutenaren aurkezpena HLA-DQ bidez HLA-DQ ildoaren blokeoa

Zelula immune patogenikoakLinfozitoen blokeoa anti-IL-15, anti-CCR9 eta anti-47

bidez

Tolerantziaren indukzioa glutena immunizatuz/ankilostoma

inokulatuz

1.2. Eritasun zeliakoaren genetika.

Eritasun zeliakoa gaixotasun multifaktorial konplexua da, faktore genetikoak eta

ingurumeneko faktoreak inplikatuta daudelarik. Bikien eta gaixotasuna duten

senideengan burututako ikerketek frogatu bezala, genetikak eragin handia du

gaixotasunaren suszeptibilitatean. Biki monozigotiko eta dizigotikoek ingurumen-

faktore berberak partekatzen dituzten arren, antzekotasun genetiko desberdina

dute (%100 eta %50 batazbeste, hurrenez hurren) gaixotasun konplexuen osagarri

genetikoak ikertzeko oso tresna baliagarriak direlarik. Hortaz, CD-ri dagokionez, biki

monozigotikoen arteko komunztadura-tasa %75-86 artekoa den bitartean, biki

dizigotikoena %16-20 artekoa da. Orokorrean, gaixotasunaren agregazio familiarra

%5-15 ingurukoa dela onartzen da 28,29.

CD-rekin asoziaturiko faktore genetiko nagusiak II motako giza antigeno

leukozitarioaren (HLA) DQ2 eta DQ8 molekulak kodetzen dituzten geneak dira 30.

Hala ere, HLA bera duten anai-arreben arteko gaixotasunaren komunztadura %30

baino ez da, biki monozigotikoena baino askoz baxuagoa. Hortaz, HLA geneak oso

garrantzitsuak izan arren, ez dira CD garatzeko nahikorik. Egungo teorien arabera,

Sarrera

14

efektu xumea duten bestelako aldaera genetiko anitzek elkarrekintzan dihardute CD

bezalako gaixotasun konplexua garatzeko arriskua moldatzen 31.

Azken urteetan, CD-ren suszeptibilitate geneak aurkitzeko ahalegin handiak egin

dira, eta erabili diren hurbilketa metodologikoen artean, lotura genetikoa, gene

izangaien asoziazioa (gene izangai posizionalak edo funtzionalak) eta arestian,

genoma osoaren asoziazio ikerketak (GWAS) daude. Estrategia horiek erabilita,

genoma osoan zehar sakabanatutako gene ugari asoziatu da CD-rekin, eta

horietariko batzuk modu sendoan asoziatu diren arren, zalantzan daude asko, haien

kontribuzioa benetakoa ote den argitzeko sakonago ikertu behar. direlarik. Dena

den, egun eritasun zeliakoaren heredagarritasunaren %40 baino ez dago azalduta

(3. irudia).

3. irudia: Eritasun zeliakoaren heredagarritasuna.

urtea

1970 2000 2010

He

red

ag

arr

iga

su

n %

HLA

genes

Gene izangaien

ikerketak

1.go GWA ikerketa

Lotura erregioak

2. GWA ikerketa

5q3119p132q32

CTLA4

MYO9B

IL-2/IL-21

RGS1

CCR2-CCR3,

IL12A

IL18RAP

SH2B

TAGAP

LPP

TNFRSF14/MMEL1

RUNX3

PLEK

CCR4

CD8/KTELC1

BACH2/MAP3K7

PTPRK/THEMIS

ZMIZ1

ETS1

CIITA/SOCS1

CELC16A

ICOSLG

40

30

urtea

1970 2000 2010

He

red

ag

arr

iga

su

n %

HLA

genes

Gene izangaien

ikerketak

1.go GWA ikerketa

Lotura erregioak

2. GWA ikerketa

5q3119p132q32

5q3119p132q32

CTLA4

MYO9B

CTLA4

MYO9B

IL-2/IL-21

RGS1

CCR2-CCR3,

IL12A

IL18RAP

SH2B

TAGAP

LPP

TNFRSF14/MMEL1

RUNX3

PLEK

CCR4

CD8/KTELC1

BACH2/MAP3K7

PTPRK/THEMIS

ZMIZ1

ETS1

CIITA/SOCS1

CELC16A

ICOSLG

40

30

Sarrera

15

1.2.1. HLA geneak

6p21 kromosoman dagoen histokonpatibilitatearen konplexu nagusia (MHC), gene

kopuru handiena duen genomaren erregioa da, sistema immunean (eta

autoimmunitatean) funtzio garrantzitsuak betetzen dituelarik. Giza antigeno

leukozitarioen edo HLA gene taldeak, zelulen gainazaleko proteina antigeno-

aurkezleak kodetzen ditu eta oso ikertua izan da. HLA eremuaren eta CD-ren

arteko lehenengo asoziazioa (CELIAC1) 1972an aurkeztu zen, HLA-B8 eta HLA-

DR3 arrisku aldagaiak metodo serologikoen bidez identifikatu zirelarik. Bi aldagai

horiek A1-B8-DR3 kontserbatutako haplotipo zabalduaren (CEH) parte dira eta

iparraldeko Europarren %10ean agertzen da 32-34. Urte batzuk beranduago, CD eta

HLA-DQ2-ren arteko asoziazio sendoagoa aurkitu zen, DQ2 heterodimeroaren α

eta β kateak kodetzen dituzten DQA1*05 eta DQB1*02 aleloen konbinazioarekin,

alegia 30. DQ molekulen zeregin nagusia T linfozito laguntzaileei (Th) peptido

antigenikoak aurkeztea da; CD-an, glutenaren peptidoak. HLA-DQ molekuletan

dauden polimorfismoek peptidoen lotura-eremuko aminoazidoak alda ditzakete,

peptidoekiko loturan eta aurkezpenean eragina izanik. DQ2 heterodimeroa bai cis

egoeran (bi aleloak haplotipo berean) zein trans egoeran (alelo bat aitaren

haplotipoan eta bestea amaren haplotipoan) kodetuta egon daiteke. Gainera,

zenbait ikerketen arabera, cis haplotipoaren homozigositateak edo bigarren

DQB1*02 aleloa izateak CD-arekiko suszeptibilitatea emendatzen du 35,36. Bigarren

DQB1*02 alelo hori DQB1*0202 eta DQA1*0201 daraman DR7-DQ2 haplotipoan

hereda daiteke, nahiz eta haplotipo horren presentzia soilak ez du CD-rekiko

arriskurik ematen. HLA geneen dosi efektuaren azalpena in vitro ikerketen bidez

frogatu da, glutenarekiko erreaktiboak diren T zelulen proliferazioa eta zitokinen

bidezko erantzunak, DQ mota eta gene-dosiaren arabera aldatzen direla ikusi

delarik 37. Populazio gehienetan, CD gaixoen %90 baino gehiagok DQA1*05 eta

DQB1*02 aleloek kodetzen duten DQ2 heterodimeroa eramaten du 38. DQ2

heterodimeroa ez duten gaixo gehienek aldiz, DQA1*0301 eta DQB1*0302 arrisku

konbinazioaz osatutako DQ8 heterodimeroa daramate (4. irudia). Gaixoen oso

proportzio txikiak ez du ez DQ2, ez DQ8 molekularik, eta normalean, DQ2 kodetzen

dituen bi alelotariko bat eramaten du 39,40. HLA-DQ2 aldaera arrunta da populazio

orokorrean, eta gutxi gorabehera kaukasiarren %30ean agertzen da. Laburbilduz,

CD garatzeko DQ2 beharrezkoa bada ere, ez da nahikoa 40. Horretaz gain, HLA

Sarrera

16

-katea -katea

-katea-katea

-katea -katea

-katea-katea

erregioan bertan, DQ-ren telomero zein zentromero aldera, arriskua eman

dezaketen bestelako aldaera gehigarriak egon daitezkeela proposatu dute hainbat

taldek, baina erregioko lotura desoreka (LD) altua dela eta, oso zaila izan da

asoziazio berriak frogatzea 41.

4. irudia : HLAren asoziazioa eritasun zeliakoan. Gaixoen gehiengoak DQA1*05 eta

DQB1*02 geneek kodetutako HLA-DQ2 heterodimeroa adierazten du. Bi alelo horiek cis

egoeran DR3-DQ2 haplotipoan edo trans egoeran DR5-DQ7 eta DR7-DQ2 heterozigotoetan egon daitezke. DQ2 ez diren gaixo gehienek DR4-DQ8 haplotipoak kodetzen duen DQ8 heterodimeroa aurkezten dute.

1.2.2. Genoma osoko lotura ikerketak eta gene izangai posizionalak

Lotura genetikoko ikerketek, bi senide gaixo dituzten familiak erabiltzen dituzte,

senide gaixoen artean espero baino proportzio altuagoan konpartitzen diren erregio

kromosomikoak identifikatzeko. Lotura erregio horietan 10-100 gene topa daiteke,

eta beraz beharrezkoa izaten da asoziazio ikerketak egitea gaixotasunean

inplikatutako lokus espezifikoa identifikatzeko. Eritasun zeliakoan egindako

lehenengo genoma osoko lotura ikerketa 1996an argitaratu zen 42 eta ordutik,

gutxienez beste 12 burutu dira 43-54. MHC lokusean izan ezik, lotura ikerketen

emaitzak kontraesankorrak izan dira. Hala ere, HLAz (CELIAC1) gain, hiru erregio

kromosomiko agertu dira CD-ri lotuta behin baino gehiagotan: 5q31-33 (CELIAC2)

43,45,46, 2q32 (CELIAC3) 44,45,52 eta 19p13 (CELIAC4) 48,50,51.

Sarrera

17

1.2.2.1. CELIAC2 locus

CELIAC2 lokusa 5q31-33 kromosoman dago eta Greco-ren taldeak aurkeztu zuen

lehenengo aldiz 43,55. Italiar, Finlandiar, Suediar, Norvegiar, Frantziar eta Erresuma

Batuko populazioetan egindako meta-analisian erregio horrek gaixotasunarekin oso

lotura sendoa erakutsi zuen, HLA eta gero eritasun zeliakoarekin sendoen lotutako

lokusa dela proposatu zelarik 56. Hala ere, erregioan erregulazio immunean eta

inflamazioan parte har dezakeen zitokina-geneen multzoa egon arren

gaixotasunarekin loturiko gene funtzionalik ez da oraindik identifikatu. 5q31-q33

kromosoma beste zenbait gaixotasun autoimmune eta inflamatorioekin asoziatu da,

hala nola Crohn-en gaixotasun eta 1 motako diabetesarekin, inflamazioan duen

papera azpimarraturik 57,58. Talde ugarik aztertu ditu erregio horretako gene-izangai

zehatzak, IL12B edo SPINK geneak kasu, baina ez da asoziaziorik aurkitu 59,60.

Orain dela gutxi populazio Finlandiar eta Hungariarretan egindako ikerketak erregio

horren CD-rekiko lotura sendoa konfirmatu du bi populazioetan, baina ikertutako 11

lokusetatik batek ere ez du asoziazio seinale sendorik erakutsi 61.


CELIAC3 lokusa 2q33 kromosoman dago eta zenbait ikerketek CD-rekin lotu dute

62-64. Lokus horrek, T linfozitoen erregulatzaileak diren CD28, CTLA4 eta ICOS

geneak barneratzen ditu, T zelulen erantzunen alderdi desberdinak erregulatzen

duen 300 kb inguruko bloke batean kokatuta daudelarik. Zelula antigeno

aurkezleetan (APC) dauden CD80/CD86 ligandoen eta ICOS-en ligandoaren bat

egiteak, CD28 eta T zelulen ICOS-arekin, hurrenez hurren, proliferazio eta zitokinen

jariatzerako seinale positiboa eragiten duen bitartean, CTLA4 molekulak T zelulen

aktibaziorako seinale erregulatzaile negatiboa eragiten du. Nahiz eta mapaketa

zehatza egiten saiatu, arriskua ematen duen faktore genetikoa ez da oraindik

ezaguna. CTLA4 eta eritasun zeliakoaren arteko asoziazioa deskribatu da zenbait

populazioetan 65-67. Orain dela gutxi egindako analisian, SNP komun guztietan

oinarritutako CTLA4 haplotipoak eratu eta asoziazio sendoena haplotipoek

aurkezten dutela iradokitu da. Aldaera eta haplotipo horien funtzioari buruzko

informazioa beharrezkoa da asoziazio primarioa CTLA4 genean bertan, alboko

generen batean edo 2 Mb-tara ote dagoen zehazteko 66.

Sarrera

18


CELIAC4 lokusa 19p13.1 kromosoman dago 68. Miosina IXB-ren genea (MYO9B)

lokus horretan dagoen gene-izangai indartsuena da, linfozito epitelialen aktinaren

birmoldatzean parte hartzen duen miosina molekula kodetzen baitu. MYO9-ren

funtzioa ez da guztiz ezaguna. Rho-GTPasa aktibatzen duen proteina domeinua

du69 zelulen harteko lotura hertsietan parte hartzen duten geneen antzekoa 70 eta

beraz, gene horren aldakortasunak desegonkortasuna eragin lezake heste-

meharreko hesian, gluten-peptido immunogenikoen sarrera ahalbideturik 71. Hala

ere, erreplikazio-ikerketa guztiek ez dute asoziazio positiborik aurkitu 72-74. Erregio

honetan, beste 140 gene daude, horietariko batzuk immunitatean eta inflamazioan

parte hartzen dutelarik (CYP4F3, HSH2D, IL12RB1, IFI30 eta KIR geneak,

adibidez) eta gene-izangaitzat jo daitezke.

1.2.2.4. Beste lokus batzuk

Aipatutakoetaz aparte, beste zenbait erregiok ere lotura genetikoa erakutsi du

hainbat ikerketetan. Genoma osoko zortzi lotura ikerketen artean berriki burututako

metaanalisiaren emaitzek 10q26.12-qter eta 8q22.2-q124.21 erregioetan lotura

seinaleak iradokitzen dituzte 75. CELIAC5 modura ezaguna den 15q11-q13 erregioa

47 konfirmatzeke dago oraindik. Ikerketa bat baino gehiagotan edo soilik ikerketa

batean (baina 2 baino handiagoko LOD score-arekin) dauden beste lotura erregioak

hauexek dira: 7q22.1-31.32, 9q34.11, 11p11 15q26, 19q13.3, 22q11.21 42-44,46,48,53.

1.2.3. Izangai funtzionalak

Gene izangai funtzionalen ikerketek, gaixoen eta kontrolen artean frekuentzia

desberdinak dituzten aldaera genetikoak bilatzen dituzte, funtzio biologikoaren

arabera, gaixotasunean zeregin garrantzitsua izan dezaketen geneen artean.

Zenbait gene izangai funtzional ikertu dira eritasun zeliakoan, erantzun

immunologikoan garrantzitsuak diren edo funtzio immunologiko ezaguna duten

proteinetan interes berezia jarrita, horien artean bai erantzun innatoan bai erantzun

adaptatiboan parte hartzen duten geneak aztertu direlarik, hala nola, MICA, IFNG,

ICAM-1, PTPN22 edo MIF 76-81. Lotura hertsiekin zerikusia duten geneak ere

aztertu dira, gaixoengan behatzen den epitelioa-hesiaren desegonkortasuna dela

Sarrera

19

eta 81. Beste gaixotasun autoimmune edo inflamatorioekin asoziazioa agertu duten

geneak ere erreplikatu dira CD-an 83-86 (2. taula).

2. taula: Arestiko gene izangaien ikerketak eritasun zeliakoan.

Genea Krom OR ErreferentziaBeste eritasun

asoziatuakCD32 1 1,37 (1,18-1,58) Alizadeh et al. 2007 SLE, T1D

PTPN22 1 1,82 (1,1-2,3) Santin et al. 2008T1D, Graves eritasuna,

RA, SLE

IL23R 1 1,57 (1,06-2,32) Nuñez et al. 2008 IBD, MS

SLC22A5 5 1,39 (1,03-1,88) Chernavksky et al. 2008 Chron-en gaixotasuna

MICA 6 12,5 (4,66-33,11) Lopez-Vazquez et al. 2002

MAGI2 7 1,19 (1,08-1,32) Wapenaar et al. 2008 UC

PARD3 10 1,23 (1,11-1,37) Wapenaar et al. 2008

IFNG 12 1,67 (1,13-2,47) Rueda et al. 2004

CYP4F3 19 1,77 (1,03-3,05) Curley et al. 2006

CYP4F2 19 1,33 (1,06-1,66) Curley et al. 2006

ICAM-1 19 4,2 (2,3-7,5) Abel et al. 2006 IBD

KIRDL5B 19 2,60 (1,21-6,19) Santin et al. 2008

MIF 22 1,33 (1,00-1,76) Nuñez et al. 2008 RA, SLE, PSO

1.2.4. Genoma osoko asoziazio ikerketak

Genoman zeharreko aldaeren informazioaren emendioak eta genotipoko

metodologiaren garapenak, genoma osoaren asoziazio-ikerketak (GWAS)

ahalbidetu dituzte, bertan, genoma osoan zehar barreiaturik dauden milaka

nukleotido bakarreko polimorfismo edo SNP (single nucleotide polymorphism)

aztertzen direlarik. GWAS-ek abantaila garrantzitsuak dituzte; efektu ahulak

dituzten aldaerak detektatzeko eta aldaera kausalak egon daitezkeeneko eremu

genomiko txikiak definitzeko gaitasuna, besteak beste 87.

CD-an egindako lehenengo GWAS-ean, 2007. urtean publikatutakoa, 300.000 SNP

baino gehiago aztertu ziren Erresuma Batuko 778 CD gaixotan eta 1422

kontroletan. Esangarritasun handieneko emaitzak Holandar (508 kasu, 929 kontrol)

eta Irlandar (486 kasu, 560 kontrol) populazioetan erreplikatu ziren. Asoziazio

sendoena 4q27 erregioan aurkitu zen, bertan IL2 eta IL21 izangai biologikoak

daudelarik 88. Asoziazioa, Italiar 89 eta Suediar-Norvegiar 90 populazioetan

erreplikatu da, baita beste gaixotasun autoimmunetan ere, hala nola 1 motako

diabetesa edo artritis erreumatoidea 91,92. 4q27 erregioa lotura-desoreka bloke

baten barnean dago, bertan funtzio ezezaguneko gene bat eta proteina kodetzen

Sarrera

20

dituzten hiru gene daudelarik (KIAA1109-TENR-IL2-IL21). Nahiz eta IL2 eta IL21

funtzio biologiko garrantzitsuak eduki, eta CD-rako izangai interesgarriak izan,

ikerketa gehiago beharrezkoak dira LD bloke horretan benetako arrisku-aldaera

funtzionalak zeintzuk diren zehazteko.

Arrisku-aldaera gehigarriak identifikatzeko jarraipen-ikerketan 1020 SNP

esangarrienak beste 1643 kasu eta 3406 kontroletan genotipatu ziren 93. Zazpi

erregio berri identifikatu ziren (RGS1, CCR2-CCR3, IL12A, IL18RAP, SH2B,

TAGAP eta LPP) eta horietatik seik erantzun immunea kontrolatzen duten geneak

barneratzen zituzten. Geroago zenbait asoziazio erreplikatu da Italiar, Suediar-

Norvegiar eta Espainiar populazioetan 89,90,94,95. Bigarren jarraipen-ikerketa batean,

asoziazio ez horren sendoa zuten 458 SNP genotipatu ziren, eta OLIG3-TNFAIP3

eta REL lokusetan asoziazio ikusi da 96. Bai TNFAIP3 (A20 proteina mailan) bai

REL kappa B faktore nuklearraren (NFkB) seinaleztapen bidezidorrean bitartekari

garrantzitsuak dira, bidezidor hori CD-aren bilakaeran inplikatuta dagoelarik 97.

Berriki, bigarren belaunaldiko GWAS bat burutu da 4.533 kasu eta 10.750 kontrol

erabilita. Ondoren, pGWAS<10-4 zuten 113 SNP eta aurretik ezagunak ziren

lokusetako beste 18 SNP aukeratu eta gainerako 4.918 kasu eta 5.684 kontroletan

genotipatu ziren. Hamahiru erregio berrietan lokalizaturiko aldaerek lortu zuten

genoma osoko esangarritasuna (p konbinatua <10-8) lortu zuten gehienetan funtzio

immunea duten geneak daudelarik (BACH2, CCR4, CD80, CIITA-SOCS1-

CLEC16A, ETS1, ICOSLG, RUNX3, THEMIS, TNFRSF14 eta ZMIZ1). Beste 13

erregiok (CD247, FASLG-TNFSF18-TNFSF4, IRF4, TLR7-TLR8, TNFRSF9 eta

YDJC) asoziazioa iradoki zuten, horiek funtzio immunologikoa duten geneak

barneratzen dituztelarik. Eritasun zeliakoari asoziaturiko 39 lokusetatik 38tan ikertu

zen adierazpen geniko eta genotipoaren arteko korrelazioa, 1.469 odol laginetako

leukozito primarioetan, eQTL esangarriak (Spearman p<0,0028) 20 lokusetan

topatu zirelarik 97. Nahiz eta genoma osoko asoziazio ikerketak suszeptibilitate

erregio berriak identifikatzen oso arrakastatsuak izan, CD-aren

heredagarritasunaren portzentajea txiki bat baino ez da ezaguna (%40 inguru). Are

gehiago, CD-rekin asoziaturiko aldaeren erdia hurbil lokalizaturiko geneen espresio

aldaketekin erlazionatuta dagoen arren, kasu gehienetan ez da aldaera horiekin

inolako funtziorik erlazionatu. Ikerketa gehiago beharrezkoak dira LD blokeetan

Sarrera

21

arrisku geneak topatzeko eta benetako aldaera kausalak identifikatzeko, baita

aldaera horien funtzioa CD-ren patogenesian karakterizatzeko ere. Etorkizuneko

ikerketek kontutan izan beharko dute gaixotasun autoimmuneen suszeptibilitate

genetikoaren osagai garrantzitsu bat erlatiboki arraroak diren (populazioan <%5

frekuentzia) eta efektu fenotipikoa handiagoa duten aldagaiak izango direla 99.

Genoma osoko ikerketa bietan, erregio bakoitzean identifikatu diren SNP

esangarrienak eta intereseko gene izangaiak 3. taulan azaltzen dira.

Sarrera

22

3. taula: Eritasun zeliakoetan egindako GWAS-etan asoziazio seinale esangarrienak erakutsi dituzten erregio genomikoak.

SNP Chr. OR Intereseko geneak

rs2816316 1 0.80 (0.76-0.84) RGS1

rs13003464 2 1.15 (1.11-1.20) REL, AHSA2

rs917997 2 1.19 (1.14-1.25)IL18RAP. IL18R1,

IL1RL1, IL1RL2

rs13010713 2 1.13 (1.09-1.18) ITGA4, UBE2E3

rs4675374 2 1.14 (1.09-1.18) CTLA4, ICOS, CD28

rs13098911 3 1.30 (1.23-1.39)CCR1, CCR2, CCRL2,

CCR3, CCR5, CCR9

rs17810546 3 1.36 (1.29-1.44) IL12A

rs1464510 3 1.29 (1.25-1.34) LPP

rs13151961 4 0.74 (0.70-0.78) IL2, IL21

rs2327832 6 1.23 (1.17-1.28) TNFAIP3

rs1738074 6 1.16 (1.12-1.21) TAGAP

rs653178 12 1.20 (1.15-1.24) SH2B3

rs1893217 18 1.17 (1.12-1.23) PTPN2

Genoma osoko esangarritasuna aurkezten duten lokus berriak

rs3748816 1 0.89 (0.85-0.92) TNFRSF14, MMEL1

rs10903122 1 0.89 (0.85-0.92) RUNX3

rs296547 1 0.89 (0.85-0.92) ?

rs1703578 2 0.88 (0.84-0.92) PLEK

rs13314993 3 1.13 (1.08-1.17) CCR4

rs11712165 3 1.13 (1.08-1.17) CD80, KTELC1

rs10806425 6 1.13 (1.08-1.17) BACH2, MAP3K7

rs802734 6 1.17 (1.12-1.22) PTPRK, THEMIS

rs9792269 8 0.88 (0.84-0.91) ?

rs1250552 10 0.89 (0.86-0.92) ZMIZ1

rs11221332 11 1.21 (1.16-1.27) ETS1

rs12928822 16 0.86 (0.82-0.91)CIITA, SOCS1,

CLEC16A

rs4819388 21 0.88 (0.84-0.92) ICOSLG

Lokus berri iradokitzaileak

rs1272642 1 1.14 (1.09-1.20) PARK7, TNFRSF9

rs6691768 1 0.90 (0.87-0.94) NFIA

rs864537 1 0.91 (0.87-0.94) CD247

rs859637 1 1.10 (1.06-1.14)FASLG, TNFSF18,

TNFSF4

rs6806528 3 1.19 (1.12-1.27) FRMD4B

rs10936599 3 1.12 (1.07-1.16) ?

rs10331180 6 1.21 (1.13-1.29) IRF4

rs6964491 7 1.14 (1.09-1.20) ELMO1

rs2762051 13 1.13 (1.08-1.18) ?

rs4899260 14 1.12 (1.07-1.16) ZFP36L1

rs2074404 17 0.90 (0.86-0.94) ?

rs2298428 22 1.13 (1.08-1.19) UBE2L3, YDJC

rs5979785 X 0.88 (0.84-0.92) TLR7, TLR8

Lehenengo GWAS-ean deskribatutako arrisku aldaerak

Sarrera

23

1.3. Eritasun zeliakoren patogenesia

Azkenaldian, CD-ren patogeniaren ezagutzan nabarmen aurreratu da, HLA-ri

loturiko gaixotasunen artean ondoen ulerturikoa bihurtu delarik. Hala ere, oraindik

ez dira gaixotasunaren garapenean inplikatutako mekanismo patogeniko guztiak

deskribatu.

CD-a T zelulek bideratutako gaitza dela onartuta dago: epitelioa zeharkatuta,

lamina propioraino heltzen diren gluten-peptidoak ehunetako transglutaminasa

entzimak deamidatzen ditu, ondoren, DQ2+ edo DQ8+ diren zelula antigeno

aurkezleek (APC) CD4+ T zelulei aurkezten dizkietelarik. Behin aktibatuta, CD4+ T

zelulek Th1 erantzuna gidatzen dute zelula inflamatorioen bidezko epitelioaren

lamina propioaren infiltrazioa eraginik, kripten hiperplasia eta biloxken atrofiarekin

batera 27. Bestaldetik, erantzun immune innatoaren inplikazioa ere nabarmendu

dute azken ikerketek, gliadinak T zelulen menpekoa ez den beste bide bat

aktibatzeko gaitasuna duelarik 100, 101 (5. irudia).

33-mero peptidoa

31-43 peptidoa Birusa

MCH I aMCH I b

NKR

IEL

GLIADINA

tTG

Desaminatutako

33-mero peptidoa

Makrofagoa/DC

APC

T CD4+ zelula

IL-15

IFN-α

B zelula

AGA eta tTG

antigorputzak

Th1 / Th17

HLA-DQ2/8

IL-15

Lamina

propioa

MMP-1

MMP-3

IFN-γ

ERANTZUN

ADAPTATIBOA

ERANTZUN

INNATOA

Th2

33-mero peptidoa

31-43 peptidoa Birusa

MCH I aMCH I b

NKR

IEL

GLIADINA

tTG

Desaminatutako

33-mero peptidoa

Makrofagoa/DC

APC

T CD4+ zelula

IL-15

IFN-α

B zelula

AGA eta tTG

antigorputzak

Th1 / Th17

HLA-DQ2/8

IL-15

Lamina

propioa

MMP-1

MMP-3

IFN-γ

ERANTZUN

ADAPTATIBOA

ERANTZUN

INNATOA

Th2

5. irudia: Eritasun zeliakoaren mekanismo patogenikoak: erantzun immune adaptatiboa eta innatoa.

Sarrera

24

1.3.1. Glutena

Glutena gari, zekale eta garagarra zerealen endosperman aurki daitekeen eta

alkoholetan solubleak diren glutenina monomerikoz, eta prolaminetan aberatsak

diren glutenina polimerikoz osatuta dago. Eritasun zeliakoa glutenaren proteinekiko

esposizio dietetikoaren ondorioz garatzen da. Glutenaren proteinen prolina-

edukiera altuak, hesteko proteasen degradazioaren aurrean erresistente bihurtzen

du lumenean zati luze gisa (10-50 erresiduo) aurki daitekeelarik. Are gehiago,

gluten zatiak TG2 entzimarentzako substratu egokiak dira. Entzima horrek gluten

peptidoak deamidatzen ditu (glutamina erresiduoak glutamato bihurtu) HLA-DQ2

edo HLA-DQ8 molekulei lotzeko joera emendatu eta glutenarekiko espezifikoa den

CD4+ Th1 T-zelulen erantzuna bultzaturik. MHC-aren bidezko aurkezpenaz gain

glutenak lamina propioan CD8+ T zelulen erantzuna ere abiaraz dezake lamina

propinan, linfozito intraepitelialen artean zabaltzen delarik 27,102.

Glutenak, lamina propioko T zelula gluten espezifikoen aktibazioan parte hartzen

duela argi dago. Hala ere, ez dago argi glutenak sistema immune innatoaren

zelulak estimulatzeko gaitasuna duen. Hesteko biopsia kultiboetan, zelula antigeno

aurkezle primarioetan, eta zelula epitelial eta monozitikoen lerroetan egindako in

vitro ikerketek, ideia hau bermatzen dute. Alfa gliadina molekulan 31. aminoazidotik

43. aminoazidora luzatzen den peptidoa (31-43 peptidoa) xehetasunez ikertu da

sistema immune innatoa estimulatzeko ahalmena dela eta. Peptidoa ez da HLA-

DQ2-ra lotzen eta ez du hestean T zelulen erantzun espezifikorik induzitzen.

Mukosan dituen eraginen artean, apoptosiaren inhibizioa edo epidermiko hazkuntza

faktorea epidermikoaren hartzailearen (EGFR) bidezidor endozitikoa barneratzen

dituena daude, estimuluaren osteko orduetan gertatzen delarik, T zelula CD4+-en

erantzuna baino azkarragoa 101,102. Gliadinarekin inkubaturiko gaixo zeliakoen

hesteko biopsiek MICA, Tγδ eta NK zeluletan espresatzen den NKG2D

hartzailearekin interakzionatzen duen estres molekula, gainespresatzen dutela

behatu da. MICA gaixotasunaren hasierako aldietan erantzun innato zitotoxikoak

eta zitokinen produkzioa aktibatzeko gai da, immunitate innatoa eta adaptatiboa

lotuz 104.

Sarrera

25

1.3.2. Transglutaminasa

Eritasun zeliakoan, glutenak ehuneko transglutaminasaren (tTG) kontrako IgA

autoantigorputzen ekoizpena induzitzen du. TG nonahi adierazten den proteina

multifuntzionala da, eremu extrazelularrean aktiboa egoten dena eta proteinen

arteko lotura kobalente eta itzulezinak katalizatzen dituena, proteina baten

glutamina eta bestearen lisina erresiduoen artean 105,106. Glutenak prolina eta

glutamina ugari ditu, eta beraz HLA-DQ2 edo DQ8-ko ildoari lotzeko oso erresiduo

negatibo gutxi, horretarako glutenetik eratorritako peptidoek TG-ren deamidazioa

jasan behar dutelarik 107. Glutenaren zenbait peptido konkreturen deamidazioak, T

zelulen antigeno efiziente bihurtzen du, zitokinen tokiko ekoizpen masiboa

bultzatzeko gai dena, enterozitoen diferentziazioa eta proliferazioa eraldaturik. Are

gehiago, TG-ak berak eta gliadinaren peptidoen arteko konplexuak eratzen dira,

konplexu horiek, T zelulak estimulatzen dituzten neoepitopoak barnebil

ditzaketeelarik 107. Nahiz eta T zelulak estimulatzeko gai diren 50 epitopo baino

gehiago egon, 33-mero peptido bakar bat da immunogenikoena, partzialki

gainjartzen diren T zelulen hiru epitoporen sei kopia dituelako, ehunetako

transglutaminasak eragindako deamidazioaren ondoren T zelulen estimulatzaile

oso potentea delarik.

a) Protealisiarekiko erresistentzia

b) Epitopoen aukeraketa TG-ren bidez

c) Oligomerizatutako epitopoak

d) HLA-DQ2rekin lotura

a) Protealisiarekiko erresistentzia

b) Epitopoen aukeraketa TG-ren bidez

c) Oligomerizatutako epitopoak

d) HLA-DQ2rekin lotura

6. irudia: Prolina edukiera altuko gliadinaren T zelulen epitopen taldekatzea eragin dezaketen

faktoreak.

Sarrera

26

Eritasun zeliakoan TG-ak jokatzen duen papera ezaguna da oso, baina

transglutaminasaren kontrako autoantigorputzek (TGA) zerikusirik ba ote duten

gaixotasunean karakteristikoa den hesteko lesioarekin, edo gertakari bat baino ez

ote diren auzitan dago. Zenbait prozesu biologikotan, hala nola ziklo zelularrean,

apoptosian, angiogenesian eta hesteko permeabilitatean, TGA-ren eragina ikusi da,

T zelulek gidatzen dituzten mekanismoetaz aparte, antigorputz horiek

gaixotasunaren progresioan paper garrantzitsua jokatzen dutela iradokirik 108,109.

1.3.3. Immunitate adaptatiboa

Gaixo zeliakoen heste meharraren suntsipenean erantzun immune zelular zein

humorala aktibatuta daude. Gliadinaren peptidoak sistema immune adaptatiboak

ezagutzen duten antigeno gisa jokatzen du. Peptido horiek APC-ren HLA-DQ2 eta

HLA-DQ8 heterodimeroei lotzeko gaitasuna dute, eta ondorioz CD4+ T zelulei

aurkeztu 110,111. Gaixo zeliakoen mukosako T linfozito gliadina-espezifikoak Th1-

motakoak dira batez ere, eta IFN-γ (gamma interferoia) zitokina proinflamatorioa

jariatzen dute 112,113. Zitokina horretaz gain beste Th1-motako zitokinak, IL-18 eta

IFN-α, adibidez, ere emendatuta daude 114-116. Orain dela gutxi, IL-6 eta TGF-β

zitokinen presentzian, IL-17 zitokinaren familiako kideak ekoizteko gai diren CD4+ T

zelula laguntzaileen lerro berria (Th17) karakterizatu da, eta dirudienez, orain gutxi

arte IL2/IFNy-bidezidorrari egotzi zaizkion hainbat efektu patogenikoren erantzule

izan daiteke 116. Gainera, CD aktiboaren mukosan, Th1 eta Th17 erantzunek aldi

berean eragiten dutela dirudi, beste zenbait gaixotasun inflamatoriotan bezala 118-

120.

1.3.4. Immunitate innatoa

Erantzun immune innatoa, patogenoen kontrako lehenengo defentsa-lerroa da,

infekzioen hasierako faseetan aktibatzen delarik. CD-ren hasierako urratsetan

sistema immune innatoaren inplikazioaren aldeko frogak gero eta ugariagoak dira.

Sistema innatoak T linfozitoen menpekoa ez den eran erantzun diezaioke

gliadinari, T zelulen aktibaziorako beharrezkoa den ingurumen proinflamatorioa

Sarrera

27

eratu dezakeelarik. Ildo horretan, in vivo egindako indukzio-ikerketen arabera α-

gliadinatik eratorritako p31-43 peptidoa gaixotasunaren sintomak eragiteko gai da,

bai eta biopsia-kultiboetan zenbait aldaketa karakteristiko eragiteko ere 120-123.

Peptido hori CD mukosan erantzun immunea aktibatzeko gai bada ere, ez dirudi T

zelulen bidezko erantzuna estimulatzen duenik 124,125. Dirudienez, gliadinaren 31-43

peptidoaren toxikotasuna, erantzun immune innatoa aktibatzeko duen gaitasunean

oinarritzen da. Orain dela gutxi egindako bi ikerketek, TLR4 eta MyD88 deskribatu

dituzte zereal proteinen erantzun innatoaren hartzaile primario gisa. MyD88,

monozito, makrofago eta zelula dendritikoetan Toll moduko hartzaileen (TLR)

seinalearen transduktore nagusia da 27. Glutenak eragindako linfozito intrepitelialen

aktibazio immune innatoa MICA molekularen adierazpena induzitzen du heste-

meharreko epitelioan, MICA-k NKG2D hartzailearen ligandoa da natural killer (NK),

T zeluletan eta CD4+ eta CD8+ T zeluletan. Epitelioko MICA-k, gainadierazitako

interleukina (IL)-15-arekin batera NKG2D aktibatzen du linfozito intrepitelialean,

linfozitioek mediaturiko zitotoxizitate antigeno-espezifikoa abiarazirik. Azkenaldian,

IL-21-a azaldu da immunitate innatoaren beste gidari modura, gehienetan IL-15-

ekin batera 101,126.

1.3.5. Beste bidezidor desregulatuak

1.3.5.1. Komunikazio zelularra.

Eritasun zeliakoan, glutenaren aurrean epitelioaren zeharreko iragazkortasun

parazelularra emendatuta dagoela deskribatu da. Dirudienez, emendaturiko heste

meharreko iragazkortasuna aldaketa biologiko goiztiarra da, autoimmunitatea hasi

aurretik gertatzen dena. Zenbait ikerketak erakutsi duenez, gliadinak eragin zuzena

du heste meharreko hesi funtzioan 127. Gaixoen heste meharrean behatzen den

hesi funtzioaren asaldura larriak zelulen arteko loturen egiturazko aldaketen ondorio

bide dira 128, gliadinak eragindako lotura hertsi zein adherens motakoen zenbait

proteinaren ekoizpen mailaren aldaketak ikusi dira, hala nola, okludina, klaudinak,

zonulina edo kaderina 129-132. Zonulinaren aurkikuntzak heste meharreko

epitelioaren iragazkortasunaren bidezidorra ulertzen lagundu du. Eritasun zeliakoan

zonulina gainadierazita dago, eta bere inhibidoreak (AT-1001) heste meharreko

zonulinak eragindako iragazkortasuna blokeatzen duela erakutsi da 133. Entsegu

Sarrera

28

klinikoek erakutsi dutenez inhibidore horrek heste meharreko iragazkortasunaren

emendioa ekiditen du eta gaixo zeliakoen sintomak hobetzen dira 27. Hortaz,

komunikazio zelularraren bidezidorrak eritasun zeliakoaren garapenean duen

garrantzia konfirmatu da.

1.3.5.2. Seinaleztapen bidezidorrak: TGFB eta Jak-Stat seinaleztapen bidezidorrak.

Beta hazkunde faktore transformatzailearen (TGF) familiaren zenbait partaide, eta

TGF1 isoforma bereziki, maiz ikertu dira inmunologian. TGF1 zitokina

multifuntzionala da, egoera autoimmuneen kontrolean zeregin garrantzitsua

duelarik, eta haien artean heste meharreko erantzun inflamatorioak daude. Bere

ekoizpen maila altuak glutenak eragindako erantzun proinflamatorioak ekiditen

dituen bitartean 134, TGF1-en gabeziak eritasun autoimmunea ekar dezake,

gertakari immunologikoak bultzatzen dituzten T zelulen funtzio erregulatzailea

eraginez; adibidez, eritasun zeliakoan garrantzitsuak diren linfozitoen aktibazio eta

diferentziazioa, zelulen atxikipen molekulen adierazpena, edota apoptosia eta MHC

molekula eta zitokinen ekoizpena 68,135. Hala ere, CD dutenen mukosa aktiboan

TGFB1-en adierazpen altua detektatu du gure taldeak, 4 orduko gliadinaren

esposizioaren aurrean 117, TGFB1 beraren defektu kuantitatiboa ezeztaturik.

Dirudienez heste meharreko inflamazioa eragiten duen akatsa dago bidezidorrean,

seguraski beherago seinaleztapen jauzian. Zenbait autorek IL-15-ari atxikitu dio

inhibizio hori baina ikerketa gehigarriak behar dira TGF1-en bidezko zitokinen

ekoizpen, proliferazio eta zitotoxizitatea bezalako bezalako T-zelulen ekintzen

inhibizioa nola ekidin daitekeen ezagutzeko 118. TGF-k eta INF-k kontrako

efektuak dituzte zenbait funtzio zelularretan, INF-ren ekoizpena gaixo zeliakoen

heste meharreko inflamazio kronikoaren funtzesko ezaugarria delarik. Jak-Stat

bidezidorra INF-ren bidez aktibatzen den bide nagusia da, bere efektu biologikoak

STAT1-en aktibitatean eta zelula barneko SOCS-1-en mailan oinarritzen direlarik; bi

gene horiek gainadierazita daude zeliako aktiboetan 136-138. Jak-Stat seinaleztapen

bidezidorraren partehartzea konfirmaturik dago eritasun zeliakoan.

Sarrera

29

1.3.5.3. Apoptosia eta ziklo zelularra.

Heste meharreko arkitektura eta funtzioa mantentzeko enterozitoen proliferazioa

eta apoptosiaren arteko koordinazio estua behar da, prozesu bi horien

desregulazioa gaixo zeliakoetan ikusten den mukosaren hondamenaren ezaugarri

nagusia delarik 129,139. Egoera fisiologiko normalean, zelula apoptotikoak heste

biloxken muturrean kokatzen dira eta kriptako zelula heldugabeen kopuru berdinez

ordezkatuak izaten dira. Eritasun zeliakoan, apoptosi goiztiarra gertatzen da kripta-

biloxka ardatz osoan zeharreko enterozitoetan, eta aldi berean, mukosa zapalaren

proliferazio-konpartimenduaren handitze nabarmena ikusten da. Zenbait hipotesiren

arabera, apoptosi-tasaren handitzea da CD-an gertatzen den heste biloxken

atrofiaren erantzule nagusia, ziklo zelularraren aktibitatearen bikoiztea glutenak

eragindako enterozito-galeraren aurreko erantzuna izanik 140-142. Arestiko bi

ikerlanek zelulen apoptosi eta proliferazioa neurtu dituzte eritasun zeliakoan

gaixoen biopsien kultiboak erabilita. Emaitzen arabera gliadinak HLA I ezagutzen

dituzten CD8+ T zelulak aktibatzen ditu enterozitoen apoptosia eragin eta heste

meharreko epitelioaren lesioan parte harturik 143. Bestaldetik, ehunetako

transglutaminasaren kontrako autoantigorputzek zelula epitelialen proliferazioan

eragina dutela ere ikusi da 139. Hala ere, ikerketa gehiagarriak beharrezkoak dira bi

bidezidor horien eragina eritasun zeliakoaren patogenian zein den ezagutzeko.

1.3.5.4. Matrize estrazelularra (ECM)

Gaixo zeliakoen mukosaren aldaketa morfologiko nabarmenak zitokinek eragindako

matrize extrazelularraren degradazioarekin lotu dira. ECM osatzen duten molekulak

ikertu dira, matrizean ikusten diren aldaketak bere osagaietan islatu behar direla

hipotetizaturik, baina ez da aldaketarik ikusi laminina, fribronektina, tenaszina edo

kolagen IV-aren banaketan 144-146. Beren funtzioa dela eta, matrizeko

metaloproteinasak (MMP-ak) eta bere inhibitzaileak (TIMP-ak) ikertu dira eritasun

autoimmuneetan. CD-aren kasuan, bai adierazpen patroiak, bai polimorfismo

genetikoak aztertu dira eta MMP-en adierazpen maila altuak aurkitu arren147,148 ez

da gene horien aldaeren eta eritasunaren arteko asoziazio argirik aurkitu 146,149.

Seguraski, matrize estrazelularraren endekapena ez da eritasunaren bultzatzailea,

hesteko mukosaren aldaketa morfologikoak mantentzen laguntzen duen gertakaria

baizik. Zitokinek eragindako MMP-en profila, matrize estrazelularraren galeraren

Sarrera

30

ezaugarria da, eta kaskada immunologikoan ehunaren suntsipena bultzatzen duten

gertakarien artean azkenetariko urratsa 146,149.

1.3.5.5. Ubikitina-proteasoma sistema

Ubikitina-proteasoma sistemaren funtzio nagusia proteina intrazelularrak

degradatzea da, eta horien artean inflamazioa, ziklo zelular eta geneen

adierazpena erregulatzen dutenak daude 150-152. Ubikitina-proteasoma sistema

horretan parte hartzen duen bidezidor garrantzitsuenetarikoa NFkB jauzia da.

Zelulen estimulazioaren ondorioz NFkB aktibatu egiten da, immunitatean eta

inflamazioan parte hartzen duten zenbait itu-generen transkripzioa bultzaturik, hala

nola zitokinak, kimiozinak eta apoptosi eta proliferazioaren erregulatzaileak 97,153.

NFkB gaixo zeliakoen heste meharreko mukosan modu konstitutiboan adierazten

da eta beraz, garrantzitsua izan daiteke eritasunaren inflamazio-prozesua

mantentzen eta abiarazten ere. Are gehiago, gaixoen mukosan gainadierazita

dauden gene askok, MMP3 edo iNOS kasu, adierazpena induzitzen duten kB

lotuneak dituzte 97. NFkB-ren aktibazioa bultzatzen duten mekanismoak

erregulazio-maila desberdinetan gertatzen dira; beraz, transkripzio faktore horrek

autoimmunitatean dituen eragin patogeniko desberdinak ez bide dira transkripzio

faktore beraren aldaketen ondorioak, bere aktibitatearen erregulazioan gertatutako

akatsen batena baizik 154,155.

Antigenoa prozesatzeko ibilbide bakarra jarraitzen duten glutenaren peptidoen

kontrako erantzun immune desegokiak bultzatzen du gaixotasun zeliakoa 156. Mota

I-eko MHC molekulak T linfozito zitotoxikoei aurkezten dizkieten peptido

antigenikoak sortzeko prozesatze proteolitikoan, ubikitina-proteasoma sistemak

paper zentrala jokatzen du. Dirudienez IFN-k kontrolatzen duen jauzi

proteolitikoak, (immunoproteasoma eta proteasomaren aktibatzailea aktibatzen

dituena) peptido antigeniko egokien kantitate handiagoak sortzen ditu, mota I-eko

MHC antigeno aurkezpena emendatu 157,158 erantzun zelular autoimmunean parte

hartzen duelarik.

2. Helburuak

Helburuak

33

2. IKERKETAREN HELBURUAK

Ikerketa honen helburu nagusia eritasun zeliakoren patogenesia deszifratzen

laguntzea da.

Horretarako, hauexek dira helburu espezifikoak:

I) Irizpide funtzionalak eta posizionalak erabilita asoziazio ikerketarako itu-geneak

identifikatzeko estrategia bat diseinatu eta frogatzea (I ikerketa).

II) Gaixotasunaren patogenesian garrantzitsutzat jo diren sare biologikoetan

gliadinak gaixo zeliakoen hesteko mukosan dituen ondorioak ezagutzea (II

ikerketa).

III) UBD genearen inplikazioa zehaztea gaixotasun zeliakoaren patogenesian, sare

biologiko patologiko potentzialetako partaideen adibide modura. (III ikerketa)

3. Material eta metodoak

Material eta metodoak

37

3. MATERIAL ETA METODOAK

3.1. Ikerketaren diseinua eta laginak

Eritasun zeliakoa ESPGHAN-en irizpideen arabera diagnostikatu zen, anti-gliadina

(AGA), anti-endomisio (EMA) eta anti-transglutaminasa antigorputzen

determinazioa eta heste meharreko biopsia barne.

Lan honetan, hesteko mukosan gertatzen diren dietaren glutenarekiko esposizio

kronikoan (I-III ikerketak) eta, gliadinak eragindako efektu akutuan -in vitro

estimulazio modelo bat erabilita- (I,II ikerketak) geneen adierazpen profila ikertu da.

Denbora luzeko efektuak edo efektu kronikoak aztertzeko glutena hartzen ari

ziren, diagnostikatu berriak eta klinikoki aktiboak ziren gaixo zeliakoen biopsiak

(CD-ri asoziaturiko antigorputzak eta hesteko biloxken atrofia eta kripten hiperplasia

zituztenak), bi urtez baino gehiago glutenik gabeko dieta (GFD) hertsia jarraitzen ari

ziren gaixoen (asintomatikoak, antigorputzik gabekoak eta hesteko epitelio

normalarekin) biopsiekin konparatu ziren. Esposizio akutuko esperimentuak

egiteko, tratamenduan zeuden gaixoen hesteko biopsien zatiak, gliadina eta

gliadinarik gabe inkubatu ziren 3.2.2. sekzioan azaltzen den modura (7. irudia)

4 h.inkubazioa

10 µg/mlgliadina

zatiketa

CD-ren diagnosia

GFD >2 urte

1. biopsia 2. biopsia

glutenaren sarrera

erantzun akutuaerantzun kronikoa

4 h.inkubazioa

10 µg/mlgliadina

zatiketa

CD-ren diagnosia

GFD >2 urte

1. biopsia 2. biopsia

glutenaren sarrera

erantzun akutuaerantzun kronikoa

7. irudia: Esposizio kroniko eta akutuaren ikerketa-diseinua.


38

3.1.1. Onarpen etikoa

Burututako ikerlan guztiak 03-11032, 04-1170 eta 06-11030 ikerketa proiektuen

parte dira, tokiko Etika Batzordeak onartuak. Lagin guztiak 2003 eta 2007 artean

bildu ziren, gaixoen edota haien gurasoen baimena edukita.

3.1.2. Biopsia laginak

Duodeno distaleko bi biopsia hartu ziren gaixo bakoitzeko, portu bikoitzeko hesteko

kapsula pediatriakoa erabilita; lagin bat errutinazko azterketa patologikoa egiteko

erabili zen eta bestea ikerketa honetarako. Guztira, diagnostikatu berriko 45

gaixoren eta GFD-ean zeuden 60 gaixoren biopsiak erabili ziren.

3.1.2.1. Mikromatrize esperimentuak (I, II)

Esposizio kronikoko esperimentuan, diagnostikatu berriko 9 gaixoren biopsiak,

GFD-ean gutxienez bi urte zeramatzaten 9 gaixoren biopsiekin alderatu ziren.

Esposizio akutuko esperimentuan trataturiko 9 gaixoren biopsiak, bi zatitan banatu

eta gliadinarekin eta gliadinarik gabe inkubatu ziren 3.2.2 sekzioan azaltzen den

modura. Esperimentu hauetan erabilitako laginen emaileen HLA genotipoa eta datu

immunologiko eta histologikoak (bai diagnosian, bai jarraipenean) 4. taula agertzen

dira.

4. taula: I ikerketan erabilitako biopsia laginen datu klinikoak.

Lagina ID DQ2 DQ8 Adina (u) Histologia -Tgase Denbora

GFD (u)

Histologia -Tgasa

Pat1DX/Pat1FU - + 2,1 M3c POS 2 M0 NEGPat2DX/Pat2FU + - 4,1 M3c POS 2 M0 NEGPat3DX/Pat3FU + - 2,9 M3b POS 2,3 M1 NEGPat4DX/Pat4FU + - 2,2 M3c POS 2,4 M0 NEGPat5DX + - 3 M3c POS 2,3 M0 NEGPat6DX + - 1,8 M3b POS 2,1 M1 NEGPat7DX + - 1,3 M3c POS 2,1 M1 NEGPat8DX + - 2,1 M3c POS 2,2 M0 NEGPat9DX + + 3,1 M3c POS 2 M0 NEGPat10FU + + 2,9 M3c POS 2,1 M0 NEGPat11FU + - 2,3 M3c POS 2,4 M1 NEGPat12FU + - 2,9 M3c POS 3,6 M0 NEGPat13FU - + 1 M3c NEG

(1) 2,2 M0 NEGPat14FU + - 2,2 M3c POS 2,2 M0 NEG

HLA Diagnostikoa Jarraipena


39

3.1.2.2. Erreplikazio esperimentuak (I, II)

Esposizio kronikoan adierazpen diferentziala agertu zuten geneak erreplikatzeko

diagnostikatu berriko 6 gaixoren biopsiak GFD-ean zeuden 6 gaixoren biopsiekin

konparatu ziren. Esposizio akuturako, GFD-ean zeuden 6 gaixoren biopsiak bi

zatitan banatu eta gliadinarekin eta gliadinarik gabe inkubatu ziren. Mikromatrize

esperimentuetan eta erreplikazio esperimentuetan erabilitako laginak desberdinak

ziren.

3.1.2.3. UBD analisia (III)

UBD-ren gainadierazpena berresteko 30 biopsia-bikote erabilil ziren. Diagnosiko

biopsiak, GFD-ean bi urtez egon eta gero lortutako biopsiekin konparatu ziren.

3.1.3. DNA laginak (I,III)

3.1.3.1. Illumina plataforma (I)

Illumina plataforman egindako asoziazio genetikoko ikerketan 264 gaixo zeliako

(152 emakumezkoak eta 112 gizonezkoak; batazbesteko adina diagnosian 3,2 urte;

0,7-13,7 bitartean) eta populazio orokorreko 214 heldu osasuntsuren (110

emakumezkoak eta 104 gizonezkoak) laginak erabili ziren.


UBD genearen asoziazio ikerketarako 468 gaixo zeliako (318 emakumezkoak eta

150 gizonezkoak, batazbesteko adina diagnosian 4,7 ± 3,4 urte) eta populazio

orokorreko 459 heldu osasuntsuren (254 emakumezkoak eta 205 gizonezkoak)

laginak erabili ziren.


40

3.2. Metodoak

3.2.1. DNAren erauzketa (I,III)

DNA, 150 µl izoztutako odoletik erauzi zen ABI PRISM™ 6100 Nucleic Acid Prep

Station (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) erabilita. Odolaren digestioa,

zelulen lisia, purifikazioa eta garbiketak fabrikatzailearen protokoloak jarraituta

burutu ziren.

3.2.2. Biopsien kultiboa (I,II)

Esposizio kronikoaren efektuak ikertzeko, biopsiak berehala izoztu ziren eta

nitrogeno likidoan gorde, RNA erauzi arte. Erantzun akutuan erabilitako laginak

trataturiko gaixoenak ziren; biopsiak bi zatitan banatu ziren eta bakoitza 4 orduz

inkubatu zen RPMI medioan (Gibco), 37ºC eta %5 CO2-tan, 10 μg/ml gliadinarekin

(SIGMA, St Louis, Mo., USA) edo gabe 159. Ondoren, laginak izoztu ziren eta

nitrogeno likidoan mantedu, RNA erauzi arte.

3.2.3. RNAren erauzketa (I-III)

Izozturiko laginak plastikozko kirtenekin (Kontes, Vineland, NJ, USA) apurtu ziren

1,5 ml-ko mikrozentrifuga saiodietan, eta QIAshredder zutabetan (QIAGEN Gmbh,

Hilden, Germany) homogeneizatu. RNA osoa, RNeasy Micro Kit-arekin (QIAGEN)

erauzi, DNase I-ekin tratatu eta -80ºC-tan gorde zen erabili arte. RNA, UV

espektrofotometriaz kuantifikatu zen, eta mikromatrizeetan erabilitako laginen

kasuan RNA 6000 Nano Assay-a erabili zen Bioanalyzer sistema batean (Agilent,

Santa Clara, California, USA), RNAren kalitatea aztertzeko.


41

3.2.4. Geneen adierazpen profila (I-III)

3.2.4.1. Mikromatrize esperimentuak (I,II)

Geneen adierazpen profila Human U133 Plus 2.0 matrizea (Affymetrix, Santa Clara,

CA) erabilita deskribatu zen. Esposizio kronikoaren esperimentuan, 2 µg RNA

osoarekin harizpi bikoitzeko DNA osagarria (cDNA) eta biotinilaturiko RNA

osagarria sintetizatu ziren, One-Cycle cDNA synthesis kit eta IVT labeling kit (biak

Affymetrix-ekoak) erabilita. Erantzun akutuaren esperimenturako, Two-Cycle cDNA

synthesis kit-a erabili zen, 200 ng RNA osotik hasita. Matrizeen hibridazioa,

garbiketa, eta tindaketa pausuak fabrikatzailearen protokoloen arabera egin ziren.

Ehun-laginen prozesatze, RNA erauzketa, eta matrizeen hibridazio eta garbiketa

baldintzak, normalizaziorako prozedurekin batera eskuragarri daude ArrayExpress

datubasean (http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae/; esperimentu zenbakiak E-

MEXP-1828 eta E-MEXP-1823, esposizio kroniko eta akuturako, hurrenez hurren)

3.2.4.2. Erreplikazio esperimentuak (I,III)

Geneen adierazpenaren erreplikazio analisiak, RT-PCR-aren bidez burutu ziren.

Gene bakoitzarentzako prestatutako hasle eta zundak (esposizio kronikoan: IFNG,

UBD, EPHX1, TAP1, ACAA2, CD47, RNASE4, ACOT7, HIP1R, NOD27 eta

PSME2; esposizio akutuan: HDAC4, TMEM37, PDZK1, TREH, RAB6IP2, ALDBO,

SSX2IP, SLC38A1, SLC25A6 eta APOC2) erosi ziren (Assay-on-Demand) Applied

Biosystems-en. RT-PCR erreakzio hirukoitzak burutu ziren 7900 Real Time PCR

System (Applied Biosystems) batean, 8 ng RNA eta erreakzio bakarreko entzimen

nahastura (QuantiTect Probe RT-PCR kit - QIAGEN) erabilita. RPLPO gene

endogenoaren adierazpena aldi berean kuantifikatu zen esperimentu bakoitzean

eta jarritako RNA kantitatearen kontrol modura erabili zen. Gene bakoitzaren

adierazpen erlatiboa, Ct metodo zehatza erabilita kalkulatu zen 160.


42

3.2.5. Gene izangaien eta SNP-en aukeraketa (I,III)

Asoziazio ikerketarako gene izangaiak aukeratzeko, ikerlan batean baino

gehiagotan identifikaturiko erregio kromosomikoak eta, nahiz eta behin bakarrik

identifikatu, lod score >2 zuten erregioak hautatu ziren 42-44,46,48,53 . MHC erregioko

6p21 kromosoma analisi horretatik kanpo utzi zen bere konplexutasun genetikoa

dela eta. Polimorfismoen aukeraketa gaixotasunean edota estimulu baten aurrean

(gliadina) ikusten diren adierazpen-maila desberdinak ez direla soilik SNP ez-

sinonimoen ondorioa kontutan hartuta egin zen. Erabilitako 4 SNP bilaketa tresnak

{FastSNP (http://fastsnp. ibms.sinica.edu.tw), PupaSuite

(http://pupasuite.bioinfo.cipf.es/), SNPselector (http://snpselector.duhs.duke.edu/),

and TAMAL (http://neoref.ils.unc.edu/tamal/)} 161-164 SNP erregulatzaileak

lehenesteko egokitu ziren: transkripzio faktoreen lotura-uneetan, CpG irletan, exoi-

introi lotura-guneetan, promotoreetan, moztitsasketa guneetan eta DNA triplex

egituretan kokaturikoak, hain zuzen (8. irudia). Halaber, NCBI b5 giza genomaren

muntaian mapaketa bakarra zuten eta alelo txikienaren frekuentzia Kaukasiarretan

%5 baino altuagoa zeneko {dbSNP 125en agertzen diren genotipoen emaitzen

arabera (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/SNP/index.html)} SNPak soilik aukeratu ziren.


43

GENE EXPRESSION PROFILINGGENEEN ADIERAZPEN PROFILA

SNP SELECTION TOOLS

http://fastsnp.ibms.sinica.edu.tw

http://pupasuite.bioinfo.cipf.es/

http://snpselector.duhs.duke.edu/

http://neoref.ils.unc.edu/tamal/

CpG Island

Exonic Splicing enhancer

Intronic enhancer

Promoter

Regulatory

Splice site

Splicing regulation

TFBS

Triplex DNA

SNP AUKERAKETA TRESNAK





CpG irlak

Moztitsasketaren areagotzaile exonikoa

Areagotzaile intronikoa

Promotorea

Erregulatzailea

Moztitsasketa gunea

Moztitsasketaren erregulazioa

TFBS

Triplex DNA

LINKAGE REGIONS

2q33

5q33.1-35.3

7q22.1-31.32

9q34.11

11p11

15q26

19p13.3

19q13.42-13.43

22q11.21

LOTURA ERREGIOAK

2q33

5q33.1-35.3

7q22.1-31.32

9q34.11

11p11

15q26

19p13.3

19q13.42-13.43

22q11.21

ASSAY DESIGN TOOLSASSAY DISEINU TRESNAK

” (362)SNP “erregultazaileak”(362)

(361)Genotipatutako SNPak

Biopsiak

(1.340)Funtzionalki inplikaturiko geneak

(76)Gene izangaiak

GENE EXPRESSION PROFILINGGENEEN ADIERAZPEN PROFILAGENE EXPRESSION PROFILINGGENEEN ADIERAZPEN PROFILA

SNP SELECTION TOOLS





CpG Island


Intronic enhancer

Promoter

Regulatory

Splice site

Splicing regulation

TFBS

Triplex DNA






CpG irlak



Promotorea

Erregulatzailea

Moztitsasketa gunea


TFBS

Triplex DNA

SNP SELECTION TOOLS





CpG Island


Intronic enhancer

Promoter

Regulatory

Splice site

Splicing regulation

TFBS

Triplex DNA






CpG irlak



Promotorea

Erregulatzailea

Moztitsasketa gunea


TFBS

Triplex DNA

LINKAGE REGIONS

2q33

5q33.1-35.3

7q22.1-31.32

9q34.11

11p11

15q26

19p13.3

19q13.42-13.43

22q11.21

LOTURA ERREGIOAK

2q33

5q33.1-35.3

7q22.1-31.32

9q34.11

11p11

15q26

19p13.3

19q13.42-13.43

22q11.21

LINKAGE REGIONS

2q33

5q33.1-35.3

7q22.1-31.32

9q34.11

11p11

15q26

19p13.3

19q13.42-13.43

22q11.21

LOTURA ERREGIOAK

2q33

5q33.1-35.3

7q22.1-31.32

9q34.11

11p11

15q26

19p13.3

19q13.42-13.43

22q11.21

ASSAY DESIGN TOOLSASSAY DISEINU TRESNAKASSAY DESIGN TOOLSASSAY DISEINU TRESNAK

” (362)SNP “erregultazaileak”(362)” (362)SNP “erregultazaileak”(362)

(361)Genotipatutako SNPak (361)Genotipatutako SNPak

Biopsiak

(1.340)Funtzionalki inplikaturiko geneak (1.340)Funtzionalki inplikaturiko geneak

(76)Gene izangaiak (76)Gene izangaiak

8. irudia: Asoziazio ikerketan azterturiko SNP- ak aukeratzeko algortimoaren diagrama.


44

3.2.6. SNPen genotipaketa (I,III)


Illumina GoldenGate assay-erako (Illumina Inc., San Diego, CA) diseinatu ezin ziren

SNPak HapMap 21 proiektuaren (http://www.hapmap.org/) araberako ordezko edo

tag SNP-ekin odezkatu ziren. Hirurehun eta hirurogeita bat SNP-en pool-ak

GoldenGate Custom Panel (Illumina) gisa erosi ziren, eta DNA laginen genotipaketa

eta plaken prozesamendua fabrikatzailearen protokoloen arabera (http://www.

illumina.com/downloads/GOLDENGATEASSAY.pdf) burutu ziren (9. irudia).

Assayen arteko errepikakortasuna frogatzeko, lagin berdina jarri zen

genotipaketako 5 esperimentutan.

9. irudia: Illumina GoldenGate assay-aren eskema.

DNA aktiboa sortu

Oligonukleotidoetara DNA

gehitu, hibridatu

DNA GENOMIKOA (250 ng erabilera bakarrarentzeko, 2 µg erabilera anitzentzako)

1.go eguna 2. eguna 3. eguna

Luzatu, ligatu, garbitu

PCR ziklo unibertsala 1536plex-ean

PCR produktua gehitu,

tindaturiko harizpia eluitu,

hibridaziorako prestatu

Sentrix®Array Matrizea edo

BeadChip-arekin hibridatu

Array Matrix edo BeadChip-a

garbitu eta lehortu

Irudia lortu

Genotipoak eta erreportak sortu

DNA aktiboa sortuDNA aktibatua sortu

DNA aktiboa sortuDNA oligonukleotidoetara

gehitu, hibridatu

DNA aktiboa sortu


gehitu, hibridatu











garbitu eta lehortu

Irudia lortu


DNA aktiboa sortuDNA aktiboa sortu


gehitu, hibridatu


gehitu, hibridatu







DNA GENOMIKOA (250 ng erabilera bakarrarentzeko, 2 µg erabilera anitzentzako)DNA GENOMIKOA (250 ng erabilera bakarrarentzeko, 2 µg erabilera anitzentzako)

1.go eguna1.go eguna 2. eguna 3. eguna



Luzatu, ligatu, garbituLuzatu, ligatu, garbitu











garbitu eta lehortu

Irudia lortu


DNA aktiboa sortuDNA aktibatua sortu

DNA aktiboa sortuDNA oligonukleotidoetara

gehitu, hibridatu

http://www.hapmap.org/


45

3.2.6.2. SNP bakarreko genotipaketa (III)

Genotipaketa TaqMan allelic discrimination assay komertziala erabiliz egin zen ABI

Prism 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems) batean

fabrikatzailearen gomendioak jarraituz.

3.2.7. Data-analisia

3.2.7.1. Mikromatrize esperimentuak (I,II)

Gene Chip Operating Software-aren v1.2 programa (Affymetrix) erabilita,

mikromatrize bakoitzaren emaitzak normalizatu ziren zunda multzo bakoitzaren

seinalearen batazbesteko intentsitate-balioa 50era doituta, eta irudi gordinen

artxiboak .CEL artxibotara prozesatu ziren, azken horiek geneen adierazpen

profilak konparatzeko erabili zirelarik. Gainerako analisi guztiak MUSC ArrayQuest

plataforma (http://proteogenomics.musc.edu/ma/arrayQuest; Hegoaldeko

Carolinako Medikuntzako Unibertsitateko DNA analisientzako tresna) erabilita

burutu ziren. Behin proiektua sortuta, erabiltzaileak bere .CEL artxiboak igotzen ditu

eta analisirako metodoa aukeratzen du metodoen liburutegitik. Analisia R

programazio hizkuntza erabiltzen duten eta Bioconductor software paketeak

dituzten urrutiko ordenagailuetan burutzen da 165. Ikerketa honetarako 12. eta 25.

metodoak aukeratu ziren. Laburbilduz, 12. metodoak hibridazio datuak

normalizatzen ditu Robust Multichip Average (RMA) erabilita eta adierazpen

diferentziala duten geneak identifikatzen dira, ezarritako fold-change, t-test eta

False Discovery Rate (FDR) mugen arabera; parametro guztiak erabiltzaileak doi

ditzake zentzuzko emaitza lortzeko, adierazpena aldatuta duten geneen kopuruari

dagokionez, adibidez. Erantzun akutuko esperimentuan 1,3ko fold-change muga

eta 0,01eko p-balio muga ezarri ziren. Hogeita bostgarren metodoa Significance

Analysis of Microarrays (SAM) protokoloan oinarritzen da, hibridazio datuak RMA

bidez normalizatu, eta adierazpen diferentziala duten geneen aukeraketa FDR-ean

oinarrituta dagoelarik; azken metodo hau soilik esposizio kronikoan erabili zen FDR

muga 0.05ean ezarrita. Gainera, adierazpen diferentziala zuten geneekin

erlazionatutako KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) bidezidorrak

identifikatu ziren, eta bidezidor bakoitzaren multzokatze ez-hierarkikoa eta gene


46

guztien heatmap-ak, bidezidor bakoitzaren geneen heatmap-ekin batera irudikatu

ziren bi metodoekin.

3.2.7.2 Bidezidorren analisia (II)

Sare patologiko potentzialen aukeraketa adierazpen diferentziala zuten geneekin

asoziaturiko KEGG bidezidorretan oinarritu zen. KEGG bidezidorretan sailkaturik

egon ez arren sare patologikoetan parte hartzen duten bestelako geneak gehitzeko,

adierazpen diferentziala zuten geneak Gene Ontology (GO) terminoen arabera

aukeratu ziren CIPF Ikerketa Zentruak (Valencia, Espainia) prestaturiko Babelomics

v3.1 plataforman dagoen FatiGO tresnarekin (http://babelomics.bioinfo.cipf.es/) 166.

Argitaraturiko artikuluetan sare biologiko horiekin erlazionatuta dauden geneak ere

kontutan hartu ziren. Sare patologikoetan parte hartzen duten KEGG bidezidorren

p-balioa PLAGE software-a erabiliz kalkulatu zen

(http://dulci.biostat.duke.edu/pathways) 167 (egun ez dago erabilgarri)


Assay genotipoaren konfidantza balioaren muga aleloen seinalearen informazioa

onartzeko 0,25ean ezarri zen. Laginen %10ean baino gehiago zalantzazko

genotipoa zuten SNPak baztertu ziren. Assay-en arteko errepikakortasuna

frogatzeko, lagin bera jarri zen genotipaketako 5 esperimentutan. Genotipaketaren

emaitzen analisia PLINK v0.99r asoziazio analisiarako tresna sorta

(http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/) 168 erabili zen. Gaixotasunarekiko

asoziazio-ikerketa burutu baino lehen, lagin kopuru osoa kontutan hartuta alelo

txikiaren maiztasuna 0,01 baino baxuagoa zuten eta Hardy-Weinberg oreka

(p<0,001), bai kasuetan bai kontroletan, betetzen ez zuten SNPak ere baztertu

ziren. Cochran-Armitage kasu/kontrol joera-test genotipikoa erabili zen markatzaile

bakoitzaren gaixotasunarekiko asoziazioa analizatzeko, p-balioak {zuzendu gabe

eta Bonferroni zuzenketaren ostean (test kopurua= SNP kopurua= 330)}, odds

ratioa, eta %95eko konfidantza tarteak kalkulatu ziren. Gene bakarrean dauden

markatzaile anitzen asoziazio-analisirako, PLINK-en sliding-window aukera erabili

zen. Ikerketa honetan indibiduo bakoitzaren haplotipoak inferitu ziren espektazio

maximizazio algoritmoarekin, sliding window-etan, SNP-ak banaka gehituta (gene

bakoitzean 2 SNP-etik hasita eta genotipatutako SNP guztiak barneratu arte).


47

Ondoren, kasu/kontrol asoziazio-analisia burutu zen haplotipo bakoitzarekin, p-balio

asintotikoak kalkulatu zirelarik.

3.2.7.4. SNP bakarreko genotipaketa (III)

Frekuentzia aleliko eta genotipikoak kasu eta kontroletan Fisher’s test zehatza eta

2 test genopitipikoa eta eredu errezesiboa erabilita kalkulatu ziren hurrenez

hurren, EPI-INFO v6.0 programarekin (Centers for Disease Control, Atlanta, GA,

AEB).

3.2.7.5. Genotipo fenotipo korrelazioa: eQTL (III)

CD aktiboan genearen adierazpenaren eta SNP-aren genotipoaren arteko erlazioa

R Korrelazio-Koefizientearen arabera aztertu zen

(http://www.fon.hum.uva.nl/Service/Statistics/Correlation_coefficient.html) bai

adierazpen maila bai SNP-aren genotipoa eskuragarri zuten laginetan.

4. Emaitzak

Emaitzak

51

4. EMAITZAK

4.1. Geneen adierazpen-profila (I-III)

4.1.1. Mikromatrize-esperimentuak (I, II)

4.1.1.1. Esposizio kronikoa

Diagnostikatu berriko eta GFD-ean zeudeneko gaixoen biopsien mikromatrizeen

emaitzen multzokatze hierarkiko gainbegiratugabeetan egoera biak ondo bereizten

ziren, taldeak erlatiboki homogenoak eta uniformeak direla adieraziz, indibiduo

bakoitzaren hondo genetikoa gora behera (10. irudia).

10. irudia: Diagnosikatu berriko CD gaixoak (gorria) eta GFD-ean zeuden gaixoak (urdina) modu independentean taldekatzen ziren a) 1.go esperientua b) 1. esperimentua gehi 2. esperimentua.

Ondorioz, FDR-ean oinarritutako aukeraketa parametro zorrotzak erabili ziren

adierazpen diferentziala zuten geneak identifikatzeko: p-balioa 0,01ean eta FDR

mugak 0,025, 0.05 eta 0,1ean finkatu ziren, modu horretan, hurrenez hurren, 1453,

1647 eta 3305 sekuentzia lortu zirelarik adierazpen diferentzialarekin (25. MUSC

metodoa). Azkenik 0,05 arteko FDR aukeratu zen, horren emaitza 1647 sekuentzia

zirelarik (material gehigarria 1), 117 KEGG bidezidorretan sailkaturik: 47

metabolismokoak, 14 degradaziokoak, 13 (bio)sintesikoak eta 2 karbono-ziklokoak;

gainerako 41 bidezidorrak, seinaleztapen, gaixotasun, komunikazio, hartzeileekiko

elkarrekintza eta ziklo zelularra eta apoptosiari zegozkielarik. Adierazpen

Emaitzak

52

diferentziala zuten 1647 transkritoen artean, %45,3 (746) azpiadierazita, eta %54,7

(901) gainadierazita zeuden diagnostikatu berriko taldean, trataturiko taldearekin

konparatuta. UBD geneak, II ikerketan analizaturiko bidezidor patologiko

potentzialetan inplikaturiko fold-change altuena (22,13) aurkeztu zuen.

4.1.1.2 . Esposizio akutua

Biopsia berdineko zati biak (esperimentu akutuan gliadinarekin eta gliadinarik gabe

inkubaturikoak) elkarrekin taldekatzeko joera zeukaten, lagin bakoitzeko hondoko

antzekotasunak gliadinaren ondorioz sortutakoak baino sendoagoak zirela adieraziz

(11. irudia). Horren ondorioz, muga malguagoak ezarri ziren, fold-change-ean

oinarriturikoak. P-balioa 0,01ean ezarriz, fold-change balioa 2tik 1,2ra aldatuz joan

zen (12. MUSC metodoa), horrela adierazpen diferentziala zuten sekuentzia

kopurua 11tik 137ra aldatu zelarik. Fold-change-a 1.3an finkatuta 96 transkritoko

zerrenda lortu zen (material gehigarria 2). Gutxi gorabehera geneen herena

esperimentu kronikoan ere identifikatuak zeuden eta bi egoeretan komunak direla

esan daiteke, gainerako 62ak, aldiz, erantzun akutuko espezifikoagoak direlarik.

Laurogeta hamasei sekuentzia horiek 26 KEGG bidezidorretan parte hartzen dute,

gehienak metabolismo, degradazio eta biosintesiarekin erlazionatuta daudelarik.

11.irudia: Biopsia bereko zati biak (gorria gliadinarekin inkubaturikoa, urdina gliadinarik gabe inkubaturikoa) elkarrekin taldekatzeko tendentzia aurkezten zuten.

Emaitzak

53

4.1.2. Erreplikazio esperimentuak (I, III)

4.1.2.1. Mikromatrizeen emaitzen konfirmazioa (I)

RT-PCRa erabiliz erreplikatu ziren 21 geneetatik, 18k (%85,7) mikromatrizeetan

aurkeztutako joera bera jarraitu zuten (5a eta 5b taulak)

5a taula: Aukeratutako geneen RT-PCRa erabiliz egindako erreplikazio esperimentuen eta mikromatrizeen emaitzen fold-change-aren konparaketa diagnostiko/tratamenduko ehun lagin independenteetan.

Ikurra Genearen izena Unigene Affymetrix RT-PCR

ACAA2 Acetyl Co-A acyltransferase 200136 0.61 0.89

BACH Brain acyl-CoA hydrolase 126137 1.72 1.45

CD47 CD47 antigen 446414 1.53 1.76

EPHX1 Epoxide hydrolase 89649 0.21 0.13

HIP1R Huntingtin interacting protein-1-related 524815 1.58 0.65

IFNG Interferon gamma 856 3.74 3.21

NOD27 Nucleotide-binding oligomerization domain 528836 3.25 2.46

PSME2 Proteasome activator subunit 2 434081 1.66 1.04

RNAse4 Ribonoculease, Rnase A family 4 283749 0.43 0.71

TAP1 Transporter 1, ATP-binding cassette 352018 2.73 2.81

UBD Ubiquitin D 44532 14.14 7.69

5b taula: Aukeratutako geneen RT-PCRa erabiliz egindako erreplikazio esperimentuen eta mikromatrizeen emaitzen fold-change-aren konparaketa 10 µg gliadinarekin/gliadinarik gabe inkubaturiko ehun lagin independenteetan.

Ikurra Genearen izena Unigene Affymetrix RT-PCR

ALDOB Aldolase B 530274 0.53 0.36

APOC2 Apolipoprotein C-II 75615 0.55 0.31

HDAC4 Histone deacetylase 4 20516 1.39 ND

PDZK1 PDZ domain containing 1 143293

444751

0.52 1.55

RAB6IP2 RAB6 interacting-protein 2 400431 1.40 1.94

SLC25A16 Solute carrier family 26 member 16 180408 1.33 0.56

SLC38A1 Solute carrier family 38 member 1 533770 1.42 1.97

SSX2P Synovial sarcoma X breakpoint-2 interacting protein 22587 0.54 0.31

TMEM37 Transmembrane-protein 37 26216 0.41 0.35

TREH Trehalase (brush border membrane glycoprotein) 129712 0.39 0.00018

Emaitzak

54


UBDren adierazpena emendatuta agertu zen (batazbesteko fold-change=8,30; KT

5,22-11,39; p-balioa=0,0022) diagnostikatu berriko gaixoen biopsien %90ean

(27/30), gene horren gainadierazpena konfirmaturik eritasun zeliako aktiboan (12.

irudia).

12. irudia: UBDren gainadierazpena ikusten da eritasun aktiboa duten gaixoen

biopsietan. Marra horizontalak batazbesteko balioa adierazten du.

4.2. Gene izangaien eta SNPen aukeraketa (I, III)

4.2.1 Mikromatrize esperimentuak (I)

Hogeita hamalau gene esperimentu bietarako komunak ziren, beraz, azkenean

1340 geneetako zerrenda sartu zen SNP-en aukeraketa-algoritmoan. Aldatutako

1340 geneak CD-rekin lotura sendoa aurkezten zuten 9 erregioekin gurutzatzean,

hasierako izangaien zerrenda 76 geneetara murriztu zen. Horretaz gain,

aukeraturiko lotura guneetan kokatzen ziren eta izangai funtzional desberdinen

transkripzio faktore gisa aurresan ziren bi gene gaineratu ziren (13. irudia). SNP

erregulatzaileen aukeraketaren emaitza 71 geneetan kokaturiko 362 SNP izan zen,

horietatik 305 Illumina GoldenGate assay-arekin (Illumina Inc.) genotipatzeko

diseina zitezkeelarik. Diseinatu ezin ziren zenbait SNP HapMap proiektuko 50 tag

0,1

1

10

100

Fo

ld-c

ha

ng

e(a

kti

bo

ak/t

rata

tua

k)

p-balioa= 0,0022

0,1

1

10

100

0,1

1

10

100

Fo

ld-c

ha

ng

e(a

kti

bo

ak/t

rata

tua

k)

p-balioa= 0,0022

Emaitzak

55

SNPekin (r2>0,8) eta 6 proxy-kin (SNP izangaitik hurbileneko SNPa) ordezkatu

ziren

13. irudia: Aurretik gaixotasunarekin lotura erakutsi duten erregioetan kokaturik eta CD gaixoen biopsietan aldaturiko adierazpen maila zuten geneak. Azpimarratutako geneetan ez zen SNP “erregulatzailerik” topatu eta beraz genotipaketa proiektutik baztertu ziren. Letra beltzez adierazitako biak aldaturiko zenbait generen transkripzio faktore gisa aurresan ziren.

4.2.2. UBD analisia (III)

Erabilitako lau tresna bioinformatikoek zeregin funtzionala edo erregulatzailea

egotzi zioten rs11724 SNP-ari (chr6: 29629298), eta beraz kasu-kontrol asoziazio

ikerketa egiteko aukeratu zen.

Emaitzak

56

4.3. SNP genotipaketa (I, III)

4.3.1. Illumina plataforma (I)

Assay genotipoaren konfidantza balioaren muga aleloen seinalearen informazioa

onartzeko 0,25ean ezarri zen. Hirurehun eta hirurogeita bat SNP-en emaitza

gordinetan kalitate-kontrol parametroak aplikatzean, 6 SNP baztertu ziren laginen

%10ak baino gehiagok zalantzazko genotipoa zeukatelako. Lagin guztiak genotipo-

seinale onargarria zuten SNP-en %95 baino gehiagorentzat. Lagin berdineko 5

errepliken arteko konkordantzia %100 izan zen analizaturiko 355 SNP-entzat.

TaqMan assay-en bidez egindako genotipoaren erreplikazioa %100ean

konkordantea izan zen. SNP bakoitzeko frekuentzia alelikoak kalkulatu ziren eta

lagin guztiak kontutan harturik alelo txikienaren maiztasuna 0,01 baino baxuagoa

zuten SNP-ak (4 SNP) ez ziren kontutan hartu ondorengo analisietan. Hogeita bat

SNP ez zeuden Hardy-Weinberg orekan (p<0,001) eta horiek ere baztertu ziren.

Analisian sartutako 330 SNP-en frekuentzia alelikoak, kasu zein kontrolen asoziazio

test-en emaitzekin batera agertzen dira 3. taula gehiagarrian. Sei gene

desberdinetan kokaturiko 10 SNP esangarrienak (zuzendu gabeko p<0,005) 6.

taulan adierazita daude. Haplotipoen analisiaren bidez ez zen gainerako gene

izangaietan asoziaziorik detektatu (emaitza osoak erakutsi gabe) eta espero bezala,

markatzaile bakarreko analisian asoziazioa aurkezten zuten SNP-en aleloak,

asoziaturiko haplotipoetan ere agertzen ziren. SNP bakarraren asoziazioarekin

konparatuta esangarritasun handieneko haplotipoak (2 eta 3 SNP-etako

haplotipoak) CUTL1 eta YIPF5 geneetan aurkitu ziren (7.taula).

6. taula: SNP esangarrien asoziazio analisiaren emaitzak. Emaitza osoak taula gehigarri gisa eskuragarri daude.

Lotura gunea

Gene ikurra Adierazpen

aldaketa SNP ID Koordenatua

1 Mota

2 Alelo 1/2

1 aleloaren frek Kasuak Kontrolak P Pc

3 OR (%95 KT)

2q33 ALS2CR13 gora rs12619019 203284685 Reg G/C %18 %11 0.0015 0.387 1.78 (1.23-2.60)

SERPINE2 behera rs6747096 224688347 Reg G/A %16 %29 2.38·10

-5 0.008 0.48 (0.34-0.67)

5q33.1-35.3 YIPF5 behera rs11954744 143521596 IE A/T %13 %21 0.0016 0.419 0.56 (0.40-0.80)

rs6887645 143527572 IE A/G %13 %21 0.0022 0.518 0.58 (0.41-0.81)

7q22.1 CUTL1 behera rs365836 101403286 Reg G/A %24 %33 0.0016 0.409 0.64 (0.48-0.86)

9q34.11 PPP6C gora rs1048251 124990052 Reg T/G %53 %40 3.02·10-4

0.095 1.65 (1.27-2.14) rs7019234 124993318 Reg G/A %53 %40 3.08·10

-4 0.097 1.64 (1.27-2.13)

rs459311 125031764 CpG T/G %52 %39 1.38·10-4

0.044 1.70 (1.31-2.20) rs458046 125032202 Reg T/A %52 %39 1.35·10

-4 0.043 1.70 (1.31-2.20)

PBX3 TF

4 rs7040561 125608532 Reg T/A %15 %6 6.55·10

-5 0.021 2.60 (1.63-4.13)

1 NCBI b35 eta dbSNP 125ean oinarrituta

2 Reg: erregulatzailea, IE: areagotzaile intronikoa, Prm: promotorea, CpG: CpG irla

3 Test anizkoitzentzako zuzenduta (330 test) Bonferroni zuzenketa erabiliz

4 TF: Transkripzio Faktorea

7. taula: Haplotipoen asoziazio analisiaren emaitzak, markatzaile bakarreko esangarritasuna emendatzen zuten haplotipoak baino ez dira ageri.

Frekuentzia Genea Markatzailea Haplotipoa kasuak kontrolak

Chi-karratua P balioa

CUTL1 rs365836 - rs442030 GG %7,1 %18,8 19,36 1,08 · 10-5

AG %87,4 %74,2 17,62 2,69 · 10-5

rs365836 - rs442030 – rs17135072 GGG %6,8 %17,4 19,03 1,29 · 10

-5

AGG %84,7 %72,6 15,57 7,97 · 10-5

YIPF5 rs11954744 - rs4361555 AT %11,0 %19,4 11,61 6,66·10-4

rs4478353 - rs6887645 CA %11,1 %19,4 11,43 7,23 ·10

-4

rs4329041 - rs4478353 - rs6887645 CCA %10,8 %19,0 11,23 8,04 ·10

-4

Emaitzak

59

4.3.2. SNP bakarreko genotipaketa (III)

Alelo eta genotipoen banaketak alelo txikiaren (rs11724*C) gaixotasunarekiko

asoziazioa erakutsi zuen (8. taula).

8. taula: rs11724-rako asoziazio analisiaren emaitzak 468 gaixo eta 459

kontrolez osaturiko lagin taldean.

CD KTRL p-balioa OR (%95 KT)

n=468 n=459

C 413 359

G 523 559

CC+CG 329 282

GG 139 177

0,02

0,004

1,23 (1,02-1,49)

1,49 (1,12-1,97)

4.4. Analisi funtzionala (II, III)

4.4.1. Bidezidor patologiko potentzialak (II)

Esposizio kronikoko esperimentuan ustezko sare biologiko patologikoetan parte

hartzen zuten 11 KEGG bidezidor eta 9 GO termino agertzen ziren adierazpen

diferentziala zuten geneen zerrendan. Sare desberdinetako KEGG bidezidor

guztiak modu esangarrian aldatuta zeuden (p<0,01) denbora luzeko

esperimentuan. Horietariko 3 bidezidor eta 6 GO termino gliadinaren inkubazioaren

ondorioz aldaturiko 96 transkritoen zerrendan agertzen ziren (9. taula eta 14.-18.

irudiak)

CD KTRL p-balioa OR (%95 KT)

n=468 n=459

C 413 359

G 523 559

CC+CG 329 282

GG 139 177

0,02

0,004

1,23 (1,02-1,49)

1,49 (1,12-1,97)

Emaitzak

60

9. taula: Ustezko sare biologiko patologikoekin eralzionaturiko KEGG bidezidor eta GO termino bakoitzean aldaturiko adierazpena zuten gene kopurua (p-balioak PLAGE tresna erabiliz lortu ziren). Bidezidor eta GO terminoen izenak jatorrizkoak dira.

Sare patologiko potentzialak Aldaturiko gene kopurua

KEGG bidezidorra Kronikoa Akutua GO terminoa

Komunikazio zelularra

Tight junction, p=0,007 8 1 Adherens junction, p=0,0041 8 1 Gap junction, p=0,0011 11 Communication 189 5

Seinaleztapen bidezidorrak

Jak-Stat signaling pathway, p=0,0004 11

TGF signaling pathway, p=0,0003 9

Intracellular signalling 77 2

Ubikitina-proteasoma sistema

Proteasome, p=0,0037 8 Ubiquitin mediated proteolysis, p=0,0044 4 Antigen processing and presentation, p=0,0007 12 Proteolysis 62 1 Ubiquitin cycle 43 22

Regulation of NFB cascade 12 1

Ziklo zelularra eta apoptosia

Cell cycle, p=0,001 15 1 Apoptosis, p=0,0014 7 Cell cycle 64 4 Cell death 34

Matrize estrazelularra p=0,001

8

ECM component 15 Integral to plasma membrane 103

Emaitzak

61

CDC2

MAPK1

PLCB3

GRB2

GNAI1

EDG2

EDG2

RAF1

PRKG2

MAP3K2

ADCY9

MAGI1

PPP2R3A

EPB41L3

JAM1

PPP2R3A

GNAI1

ACTB

ACTB

MYH14

ZAK

ACTB

ACTB

IQGAP1

MAPK1

INSR

ERBB2

PTPRF

PTPRF

PTPRF

SSX2IP

SSX2IP

SSX2IP

ACVR1B

DIAGNOSIA GFD

MAPK seinalizazio

bidezidorra

PTPRF

katenina

IQGAP1

kaderina

adherens

junction

Aktina zitoeskeletoa

JAM1

konexinak

MAPK1

Cdc2

gap

junctionMAGI1

tight

junction

PLCB3

MYH14

SSX2IP

ACTB

ERBB2

GRB2

PPP2R3A

EPB41L3

**

CDC2

MAPK1

PLCB3

GRB2

GNAI1

EDG2

EDG2

RAF1

PRKG2

MAP3K2

ADCY9

MAGI1

PPP2R3A

EPB41L3

JAM1

PPP2R3A

GNAI1

ACTB

ACTB

MYH14

ZAK

ACTB

ACTB

IQGAP1

MAPK1

INSR

ERBB2

PTPRF

PTPRF

PTPRF

SSX2IP

SSX2IP

SSX2IP

ACVR1B

DIAGNOSIA GFDDIAGNOSIA GFD

MAPK seinalizazio

bidezidorra

PTPRF

katenina

IQGAP1

kaderina

adherens

junction

Aktina zitoeskeletoa

JAM1

konexinak

MAPK1

Cdc2

gap

junctionMAGI1

tight

junction

PLCB3

MYH14

SSX2IP

ACTB

ERBB2

GRB2

PPP2R3A

EPB41L3

**

14. irudia: Zelulen arteko komunikazioan (lotura hertsiak, gap eta adherens motakoak) parte hartzen duten gene gainadierazi (gorriz) eta azpiadierazien (urdinez) bero-mapa eta irudi eskematikoa. ** aldaketa esperimentu akutuan ere ikusi zen.

Emaitzak

62

P P

ACVR1B

TGF BMP2/8B

BMPR1A

MAPK1

INF

INFR2

IFN

JAK2/3

STAT1

Smads

RANTES P PI3KApoptosia

MAPK seinalizazio

bidezidorra

ACVR1B

BMP8B

BMP2

BMP2

BMPR1A

IFNG

E2F5

MAPK1

ID3

IFNAR1

IFNGR2

GRB2

STAT1

STAT1

STAT1

STAT1

STAT1

IL15R

JAK3

IFNG

CCND2

CCND2

PIK3R3

JAK2

SOCS1

JAK2

STAT1

ID3

E2F5

IL15RA

GRB2

Ziklo zelularra

CCND2

SOCS1

INFR1

DIAGNOSIA GFD

P P

ACVR1B

TGF BMP2/8B

BMPR1A

MAPK1

INF

INFR2

IFN

JAK2/3

STAT1

Smads

RANTES P PI3KApoptosia

MAPK seinalizazio

bidezidorra

ACVR1B

BMP8B

BMP2

BMP2

BMPR1A

IFNG

E2F5

MAPK1

ID3

IFNAR1

IFNGR2

GRB2

STAT1

STAT1

STAT1

STAT1

STAT1

IL15R

JAK3

IFNG

CCND2

CCND2

PIK3R3

JAK2

SOCS1

JAK2

STAT1

ID3

E2F5

IL15RA

GRB2

Ziklo zelularra

CCND2

SOCS1

INFR1


15. irudia: Seinaleztapen intrazelularra (Jak-Stat eta TGF seinaleztapen bidezidorretan) parte hartzen duten gene gainadierazi (gorriz) eta azpiadierazien (urdinez) bero-mapa eta irudi eskematikoa.

Emaitzak

63

a) b)

16. irudia: a) Apoptosi eta b) ziklo zelularrean parte hartzen duten gene gainadierazi (gorriz) eta azpiadierazien (urdinez) bero-mapa eta irudi eskematikoa. ** aldaketa esperimentu akutuan ere ikusi zen.

FasL

CASP10 CASP8

CASP3

CFLARPI3K

Heriotza zelularraBiziraupena

BIRC3

p53

BCL12L14

PIK3R3

GST2/4

[Ca++]

PPP3C

CAPN5

GZMB

GZMB

PRF1

perforina

TMEM37DIAGNOSIA GFD

CAPN5

CASP8

CASP8

PIK3R3

PPP3C

BIRC3

CASP3

CASP10

**

FasL

CASP10 CASP8

CASP3

CFLARPI3K

Heriotza zelularraBiziraupena

BIRC3

p53

BCL12L14

PIK3R3

GST2/4

[Ca++]

PPP3C

CAPN5

GZMB

GZMB

PRF1

perforina

TMEM37DIAGNOSIA GFDDIAGNOSIA GFD

CAPN5

CASP8

CASP8

PIK3R3

PPP3C

BIRC3

CASP3

CASP10

**

Mitosia

G1

G0S

G2

DIAGNOSIA GFD

CDC14

ATR

BUB3

CCND2

CCND2

CDC25C

CDC25B

CDC2

CCNB1

BUB1

PTTG

CDC7

E2F3

E2F3

E2F5

CDC25C

CDC2

CCNB1

BUB3

CDC25B

CCND2

CDC14BBUB1

PTTG1

ATR E2F3CDC2/7

E2F5

Mitosia

G1

G0S

G2Mitosia

G1

G0S

G2


CDC14

ATR

BUB3

CCND2

CCND2

CDC25C

CDC25B

CDC2

CCNB1

BUB1

PTTG

CDC7

E2F3

E2F3

E2F5

CDC25C

CDC2

CCNB1

BUB3

CDC25B

CCND2

CDC14BBUB1

PTTG1

ATR E2F3CDC2/7

E2F5

Emaitzak

64

17. irudia: Matrize estrazelularraren hartzaileekiko bidezidorrean parte hartzen duten gene gainadierazi (gorriz) eta azpiadierazien (urdinez) bero-mapa eta irudi eskematikoa.

ITGA9/B5

integrina

laminina

LAMA1/B2/B3

MMP3/12/28

TIMP2

CD36

Kolageno hartzaileaitsasketa zelularra

DIAGNOSIA GFD

HMMR

CD47

CD47

ITGA9

CD36

CD36

CD36

LAMA1

LAMB2

LAMB3

ITGB5

ITGB5

CD47

Matrize Extrazelularra

P4HBPLOD2

ITGA9/B5

integrina

laminina

LAMA1/B2/B3

MMP3/12/28

TIMP2

CD36

Kolageno hartzaileaitsasketa zelularra


HMMR

CD47

CD47

ITGA9

CD36

CD36

CD36

LAMA1

LAMB2

LAMB3

ITGB5

ITGB5

CD47

Matrize Extrazelularra

P4HBPLOD2

Emaitzak

65

IKK komplexua

RAB6IP2

IkB

UBD

P

proteasoma

ubikitina

PSMA1/4/5/6

PSMB1/2

PSMD/13/14

PSME1/2

NFkB

SUMO1

immunoproteasome

degradazio

proteolitikoa

TAP1/2

garraio

besikula

garraioaER

Antigeno aurkezpena

DIAGNOSIA GFD

APC7

APC4

UBE1

CDC27

PSMB1

PSMA6

PSMB2

PSMA5

PSMD14

PSMA1

PSMA1

PSMA1

PSMA4

TAP1

PSMA1

PSMA1

TAP2

CALR

CALR

CALR

HSP70

HSP70

HSP90

HSP90

HSP90

HSP70/90

CALR

PSMD13

iNOSMMP3

TAP1/2

TGM2

APC

Ziklo

zelularra

APC4/7

CDC27

UBE1

aktibazioa

IKK komplexua

RAB6IP2

IkB

UBD

PP

proteasoma

ubikitina

PSMA1/4/5/6

PSMB1/2

PSMD/13/14

PSME1/2

NFkB

SUMO1

immunoproteasome

degradazio

proteolitikoa

TAP1/2

garraio

besikula

garraioaER

Antigeno aurkezpena


APC7

APC4

UBE1

CDC27

PSMB1

PSMA6

PSMB2

PSMA5

PSMD14

PSMA1

PSMA1

PSMA1

PSMA4

TAP1

PSMA1

PSMA1

TAP2

CALR

CALR

CALR

HSP70

HSP70

HSP90

HSP90

HSP90

HSP70/90

CALR

PSMD13

iNOSMMP3

TAP1/2

TGM2

APC

Ziklo

zelularra

APC4/7

CDC27

UBE1

aktibazioa

18. irudia: Ubikitina proteasoma sisteman parte hartzen duten gene gainadierazi (gorriz) eta azpiadierazien (urdinez) bero-mapa eta irudi eskematikoa.

Emaitzak

66

4.4.2. UBDren analisia

Korrelazio esangarria zegoen (p-balioa=0,0014) rs11724 genotipo eta UBDren

mRNA kantitatearen artean, adierazpen mailarik altuena arrisku aleloarentzako

homozigotoak ziren indibiduoetan agertzen zelarik (19. irudia).

19. irudia: UBDren adierazpen-maila erlatiboa rs11724 genotipoaren arabera.

0

20

40

60

80

rs11724 genotipoa

GC CCGG

UB

Dre

n a

die

razp

en

erl

ati

bo

a

R = 0,7623, p <= 0,002142

0

20

40

60

80

rs11724 genotipoa

GC CCGG

UB

Dre

n a

die

razp

en

erl

ati

bo

a

R = 0,7623, p <= 0,002142

5. Diskusioa

Diskusioa

69

5. DISKUSIOA

Eritasun zeliakoa prebalentzia altua duen, sistema immuneak gidaturiko enteropatia

konplexua da. HLA-DQ2-rekin sendoki asoziatuta egon arren, beste faktore

genetiko ezezagun eta ingurumeneko faktore ere inplikaturik daude. Azken

urteetan, zenbait gene izangaien asoziazio ikerketak, genoma osoko lotura

azterketak, mikromatrizeetan oinarritutako adierazpen profilen esperimentuak eta

arestian, GWA estrategiak erabili dira CD-ren suszeptibilitate genetikoa aztertzeko.

Lan honen helburua genoma osoko adierazpenaren analisiaren ahalmen handia

ustiatzea izan da, gene funtzionalak eta bidezidor biologikoak identifikatzeko, modu

horretan eritasun zeliakoaren patogenesiaren ulermena handiturik. Hesteko

mukosaren biopsien genoma osoko adierazpen profilen analisiak aurretik burutu

izan dira CD-an 169-171 gaixotasunaren progresioaren mekanismo funtzionalen

ezagueran lagundu dutelarik. Ikerketa horietan eritasunaren patogenesian

garrantzitsuak izan daitezkeen gene eta bidezidorrak deskribatu diren arren,

aurkikuntzen ekarpena genetikan txikia izan da eta sare biologiko patologikoen

sakoneko ikerketak ere falta dira.

Adierazpenean aldaketa erakusten zuten geneetan gaixotasunarekin asoziatuta

dauden aldagaiak aurkitzeko asmoarekin, polimorfismoak aukeratzeko hiru

urratseko aukeraketa estrategia diseinatu zen eritasunaren suszeptibilitatean parte

hartzen bide duten SNP-ak identifikatzeko (I ikerketa). Familietan egindako zenbait

genoma osoko lotura ikerketak CD-rako suszeptibilitate geneak barneratu

ditzaketen hamar erregio genomiko baino gehiago identifikatu ditu. Aukeraketa

estrategiaren lehenengo pasua gaixotasunarekin lotura sendoa erakutsi duten

erregioetan kokaturiko geneak aukeratzea izan zen. Era horretan, adierazpen

diferentziala erakusten zuten 1340 generen zerrenda 76 gene izangaien zerrenda

bihurtu zen. Teorian behintzat, behatutako adierazpen aldaketan zerikusia izan ahal

zuten SNP erregulatzaileak identifikatzeko, tresna bioinformatioak erabili ziren.

Azken pausua genotipaketako assay-a diseinatzea izan zen, 71 genetan kokatutako

330 SNP-en emaitzak analizatzea posible izan zelarik.

Diskusioa

70

Estrategia hori erabilita zenbait asoziazio seinale topatu zen, asoziazio seinalerik

esangarriena SERPINE2 genearen 3. exoian kokatutako rs6747096 SNP ez-

sinonimoari zegokiolarik. SNP hori moztitsasketa gune batetik 10 bp-tara ur gora

kokatzen da eta balio erregulatzaile altua du. SERPINE2 genea matrize

estrazelularraren ekoizpenean garrantzitsua dela deskribatu da 172, bidezidor hori

CD-an duen paper patologiko potentzialagatik II ikerketan aztertu delarik. Gene

horrek azpiadierazpena bat dator CD aktiboaren ezaugarria den eta diagnosian

ikusten den biloxken atrofian parte hartzen duen matrize estrazelularraren

galerarekin 173 . SERPINE2 genea CELIAC3 lotura erregioan kokatzen da 2q33

kromosoman, erregio hori genoma osoko zenbait lotura ikerketetan erreplikatu da

eta GWAS-ean ere asoziaturik agertzen da. Erregio horretako CTLA4 genea

autoimmunitate gene orokortzat hartzen da 174 eta CD-rekin ere asoziazioa

proposatu bada ere 63 ez da beti erreplikatu eta erregioa CD28/CTLA4/ICOS T

linfozitoen multzo erregulatzaileraino handitu da, gaixotasunarekin asoziaturiko

haplotipoak proposatu direlarik 64,66. 2q33 erregio genomikoan lokalizaturiko aldaera

asoziatuen edo haplotipoen emaitza funtzionalik ere ez dago, baina pentsa

daitekeenez, gene desberdinak egon daitezke inplikaturik eritasun autoimmune

bakoitzean.

I ikerketan topaturiko hurrengo 5 SNP esangarrienak 9q34.11 lotura erregioan,

elkarrengandik 0,5 Mb-tara dauden bi gene desberdinetan daude. Lotura erregio

hori azken genoma osoko lotura ikerketan baino ez da identifikatu, 2,47ko LOD

balioarekin 53. rs7040561 aldaera, zelula-mota desberdinen garapen eta

transkripzioaren erregulazioan zerikusia duen pre-B-cell leukemia homeobox

transcription factors familiako 175 PBX3 (pre-B-cell leukemia homeobox 3) genearen

aldaera intronikoa da. PBX3 transkripzio faktorea, esposizio kronikoan eta akutuan

adierazpen diferentziala duten 101 eta 6 generekin, hurrenez hurren, bategiteko

gaitasuna duela aurresan da, eta beraz, gene honen erregulazioaren aldaketek

bidezidorrean behera dauden geneen adierazpena alda dezakete. Erregioan

dagoen beste genea, PPP6C (protein phosphatase 6, catalytic subunit), ziklo

zelular mitotikoaren G1/S trantsizioan inplikaturiko proteina fosfatasa da 176, 4 SNP

esangarri barneratzen dituelarik (rs1048251, rs7019234, rs459331, eta rs458046),

HapMap-eko lagin Kaukasiarretan dagoen korrelazio sendoa ikusita (r2=1) espero

zitekeen modura. PPP6C, KEGG ziklo zelular bidezidorrean zuzenean inplikaturiko

Diskusioa

71

beste geneekin batera, gainadierazita dago zeliako aktiboen mukosan, glutenak

bultzatutako enterozitoen galera konpentsatzeko gertatzen bide den kripten zelulen

proliferazioaren emendioa nolabait azaldurik 177.

I ikerketako gainerako SNP esangarriak asoziazio seinale xumeagoa aurkeztu

zuten eta lotura erregio desberdinetan dauden 3 gene desberdinetan kokatuta

daude. YIPF5 genea (Yip 1 domain family member 5) 5q33.1-35.3 erregioan dago,

bertan Crohn-em gaixotasunarekin asoziaturiko zitokinen kluster bat topatu

daitekeelarik. Hala ere, erregio honetako zitokina geneetako zenbait polimorfismo

ikertu den arren, ez da CD-rekin asoziaziorik topatu 53,178. Ikerketa honetan, YIPF5

geneko 2 SNP (rs11954744 eta rs6887645) CD-rekin asoziazioa aurkeztu zuten.

Oraintsuko 5q33-31 erregioaren mapaketa sakoneko ikerketa batean, YIPF5

geneak asoziazio alelikoaren zantzuak aurkitu dira populazio Finlandiar eta

Hungariarrean 61. Gene hori, ehun guztietan adierazten diren Rab-guanosine

triphosphatase interacting factor proteinen familiako kidea da eta hazkuntza faktore

transformatzaile-β1-ek induzitzen du. TGFβ1-en seinaleztapen bidezidorra

azpiadierazita dago diagnosiko biopsietan eta erantzun autoimmuneen

garapenarekin erlazionatuta egon daiteke. Bestaldetik, rs365836 CUTL1 (cut-like 1,

CCAAT displacement protein) genean dago. Zelula epitelialen diferentziazioaren

inhibitzaile transkripzionala da eta hazkuntza faktore transformatzaile-β-ren

seinaleztapenaren itua 179. CUTL1 genoma osoko zenbait lotura ikerketetan

identifikatu den 7q22.1 erregioan dago, eta erregio horretan ez dira orain arte ez

asoziaturiko aldaerarik ez gene izangaik identifikatu. Hiru SNP horiek ez zuten

esangarritasuna mantendu proba anizkoitzen zuzenketa egin eta gero, baina

haplotipoen analisiak bi geneen asoziazioaren alde egin zuen. Bukatzeko,

asoziaturiko rs126190109 SNP-a ALS2CR13 genean kokatzen da. Gene hau 2q33

erregioan lokalizatzen da ere, SERPINE2-tik 21Mb-tara, eta alboko esklerosi

amiotrofikoarekin (MIM#205100) erlazionatu da; eritasun neurodegeneratibo arraro

horrek zeliakiarekin tTGren aurkako autoantigorputzen ekoizpena konpartitzen du

180.

Laburbilduz, I ikerketak geneen adierazpena eta lotura datuak konbinatzearen

efizientzia ikertu du CD-ren suszeptibilitate-geneen bilaketan. Hala ere, ikerketa

honetan asoziaturiko SNPak Erresuma Batuko laginetan egindako genoma osoko

Diskusioa

72

asoziazioarekin alderatuta 181, 10 SNP-etik 9 SNP-tan ez zen asoziazioa

erreplikatu, eta SERPINE2 geneko rs6747096 SNP-ak mugako asoziazioa erakutsi

arren, efektua alderantzizko norabidean zegoen. Desadostasun horiek azaltzeko

hurrengo aipa daiteke: GWAS-aren kasuan, Hunt-en taldeak inputazioa erabili zuen

(rs365869rako izan ezik) tipatu gabeko SNP-en genotipoak simulatzeko; inputazioa

erreferentzia panel batean oinarritzen da eta ez du beti ikertzen den populazioa

zehazki ordezkatzen genoma osoan zehar, zenbait erregiotan akatsak egiteko

probabilitatea altuagoa izan daitekeelarik. Inputazio akats horien ondorioz gerta

daitezkeen aleloen maiztasunen fluktuazio txikiek eragin izugarria izan dezakete

benetako asoziazioa detektatzerako orduan, eta are gehiago gaixotasunaren

suszeptibilitatean efektu xumea duten geneetan. Horregatik, gomendagarria da

zuhur jokatzea SNP-en inputazioa erabilita lortutako emaitzekin. Beste alde batetik,

heterogeneitate genetikoa ere hartu behar da kontutan, populazioen arteko

desberdintasunak direlako, gutxienez parte batean, CD-an egindako ikerketen

arteko sendotasun ezaren erantzuleak. Adibide modura populazio Europear

desberdinetan CTLA4-ICOS (2q33) erregioko aurkikuntza kontraesankorrak edo

GWASean asoziaturiko SNP gehienen erreplikazio eza populazio Espainiarrean 95.

Espainiar populazioan egindako erreplikazio ikerketa batek ere ez zituen

SERPINE2, PPP6C eta PBX3 geneetako arrisku aldaerak konfirmatu 182.

Erreplikazio faltak mota I-eko errore bati atxikitu ahal zaio, seguraski hasierako

populazioaren tamaina txikiaren edo agian populazio estratifikazioaren ondorioz.

Ikerketa gehigarriak beharrezkoak dira gaixotasunarekin gene horiek duten

asoziazioa guztiz konfirmatu edo baztertzeko.

Genoma osoko adierazpen analisiak sare biologiko patologiko potentzialetan

funtzionalki inplikaturi dauden geneak identifikatzeko baliogarriak izan daiteke eta

beraz, gaixotasunaren patogenesiaren ulermenean lagungarria suertatu. Nahiz eta

transglutaminasak deamidatutako peptidoen aurkako erantzun immune aberrantea

izan gaixotasunaren oinarrizko hasierako gertakaria, badaude gaixotasun

nabarmenaren ezaugarri histologiko eta anatomikoetan parte hartzen duten

bestelako bidezidor biologiko batzuk. Ezaguna denez, erantzun immunearen

geneetaz aparte, gaixotasunaren garepenean parte har dezaketeen bestelako

geneak ere badira, sistema immunearen bidezko gliadinaren ezaguera ahalbidetu

eta eritasunaren prozesua bultzaturik, edo hasierako erantzuna emendatu eta

Diskusioa

73

mantenduta gaixotasunaren larritasunean eta progresioan eraginik. II ikerketa CD-

ren garapenean parte hartzen dutela proposatu diren zenbait sare biologikotan

oinarritu da. Gaixotasunaren patogenesian zeregin bideratzailea duten prozesuak

identifikatzeko baliogarria da, eta emaitzen analisi sakona lagungarria izan daiteke

ere ustezko suszeptibilitate lokusak aurkitzeko.

Jakina denez, gaixo zeliakoetan, hestearen epitelioan zeharreko iragazkortasun

parazelularra emendatua dago glutenaren ondorioz, eta hori zelulen harteko loturen

aldaketei leporatu zaio 128. Adierazpen genomikoaren analisien emaitzak gliadinak

eragindako enterozitoen arteko komunikazio zelularraren haustura bortitzarekin

bateragarriak dira, adierazpen diferentziala duten geneek, tight junction, adherens

junction edo gap junction izeneko KEGG bidezidorretan parte hartu, edo cell

communication GO terminoa (GO:0007154) dutelarik. Bidezidor horietan

azpiadierazita dauden gene gehienek loturen arkitekturaren mantentzean zeregin

garrantzitsua dute, aldiz, gainadierazita daudenak inhibitzaile edo erregulatzaile

negatiboak direlarik. Are gehiago, dirudienez komunikazio zelularreko aldaketak

gliadinaren aurreko erantzun fisiologiko dira 130. Erantzun kronikoko esperimentuan,

aldatutako geneen %24k sare biologiko horretan parte hartzen du, erantzun

akutuan %6k baino ez. CD-an gertatzen den aldaketa epiteliala gaixotasunaren

patofisiologian gertakari goiztiarra dirudi, baina beste gertakari primarioen ondorioz

gerta daiteke eta beraz larriagoa da gaixotasunaren fase aurreratuetan.

Iragazkortasun epitelialean parte hartzen duten zenbait gene analizatu da CD-

rekiko asoziazioaren bila. MYO9B, 19q13 lotura erregioan, askotan ikertu da, baina

emaitzak ez dira konsistenteak izan 183. Arestiko ikerketa batek asoziazio ahula

topatu du PARD3 eta MAGI2 geneekin bai CD-an bai hesteko gaixotasun

inflamatorioan 82.

TGF signaling eta Jak-Stat signaling KEGG bidezidorretako eta intracellular

signaling cascade GO terminoa (GO:007242) zituzten geneak “seinaleztapen

bidezidorrak” sare biologikoan sailkatu ziren. Hazkuntza faktore transformatzailea-

-k (TGF) eta -interferoiak (IFN) kontrako eragina dute zenbait funtzio

zelularretan. TGF-k serina treonina hartzaile baten bitartez seinalizatzen du, azken

horrek Smad 2 eta 3 transkripzio faktoreak fosforilatu eta aktibatzen dituelarik. IFN-

Diskusioa

74

k Jak-Stat seinaleztapen bidezidorra aktibatzen du, bertan Jak proteinek zitokinen

menpeko seinaleak igortzen dizkietelarik Stat proteinei, horiek nukleora traslokatu

eta DNA sekuentzia espezifikoetara batzen direlarik 136,138,184. TFG1 zitokina

multifuntzionalak inguruko giroaren arabera erantzun autoimmuneak inhibitu edo

abiarazi ahal ditu eta hesteko mukosaren zelula immuneen funtzioaren

erregulatzaile gakoa da. CD gaixo aktiboen hesteko mukosaren adierazpen profilak

gaixotasun autoimmuneak eragin ditzakeen TGFB1-en gabezia antzematen du.

Horretarako, linfozitoen aktibazioa eta diferentziazioa, zelulen atxikipenaren

molekulen adierazpena, T zelulen funtzio erregulatzailea, MHC molekula eta

zitokinen adierazpena zein apoptosia bezalako fenomeno immunologikoak

bultzatzen ditu 135,185. Bestaldetik, IFNG CD-ko hesteko mukosaren inflamazio

kronikoaren seinale nagusia da. Mikromatrize esperimentuek aurreko emaitzak

erreplikatzen dituzte, hala nola, bidezidor horren geneen gainadierazpena eta

INFG-ren aktibazioaren emendioa. Orokorrean, gliadinarekiko esposizio kronikoak

TGFB seinaleztapen jauziaren eta IFNG-k gidatutako prozesuen areagotzea dakar.

Kontutan izan behar da bidezidor konplexu horietan gertatutako aldaketek eragina

dutela CD-an eraldatuta agertzen diren eta ur behera dauden beste geneen

adierazpenean. Nahiz eta bidezidor hauetako zenbait gene ikertu diren, ez da

gaixotasunarekiko asoziaziorik deskribatu 186-188, berriro ere bidezidor konplexuen

analisi sakonaren garrantzia hobetsiz gene bakarreko analisien aurrean.

Heste meharreko arkitektura eta funtzioaren mantentzea enterozitoen apoptosia eta

proliferazioaren arteko koordinazioaren menpean dago, eta bi prozesu hauen

desregulazioa da, hain zuzen ere, CD-an ikusten den ehun kaltetuaren ezaugarririk

nabarmenetarikoa. Sare biologiko hori eraikitzeko, apoptosis eta cell cycle KEGG

bidezidorrak alde batetik eta, cell cycle (GO:007049), programmed cell death

(GO:0012501) eta apoptosis GO terminoak bestetik erabili ziren. Egoera

fisiologikoan, apoptosia biloxken muturrean baino ez da gertatzen zelulak kriptetako

zelula heldugabeek ordezkatzen dituztelarik. CD-an, enterozitoen gehiago sartzen

dira apoptosi goiztiarrean, biloxka-kripta ardatz osoan zehar, aldi berean, gaixo

zeliakoen mukosak proliferazio konpartimenduaren emendio esangarria gertatzen

delarik. Uste denez, apoptosi-tasaren emendioa biloxken atrofiaren erantzule

nagusia da, ziklo zelularraren aktibitatea bikoitza glutenak eragindako enterozito

galeraren aurrean sortutako erreakzio orekatzailea delarik 140-142. Adierazpen

Diskusioa

75

profilaren esperimentuek apoptosia bideratzen duten mekanismo desberdinetako

geneen adierazpen aldaketa erakusten dute, batez ere kaspasen jauzian parte

hartzen duten geneena. Ziklo zelularrean parte hartzen duten geneen

gainadierazpenaren joera ere ikusten da. 4 orduko gliadinarekiko inkubazioaren

ostean ikusten den apoptosi eta ziklo zelularreko geneen adierazpen aldaketek

prozesu horien desregulazioaren hasiera goiztiarra iradokitzen dute. Hala ere,

desregulazio horiek oinarri genetikoa ote duten zalantzan dago, bidezidor horietan

parte hartzen duten geneen asoziazio genetikoa faltan dagoelako.

CD-ren mukosaren aldaketa morfologikoak zitokinek bultzatutako ECM-ren

endekapenari leporatu zaizkio, eta CD mukosako adierazpen profilak ECM-aren

degradazioa bermatzen du aldatutako geneak ECM-receptor interaction KEGG

bidezidorreko eta ECM (GO:0005578), ECM structural constituent (GO:0005201)

eta Integral to plasma membrane (GO:0005887) GO terminoetako kideak direlarik.

Erantzun kronikoan, adierazpen aldaketa zuten 100 gene baino gehiago (%75a

azpiadierazitak) eta erantzun akutuko 10 gene, ECM edo mintz plasmatikoko kideak

dira, matrize estrazelularreko alterazioak konfirmaturik eta gainera, gaixotasunaren

garapenaren hasieran gertatzen direla iradokirik. Zenbait zitokinen eta matrizeko

metaloproteinasen gainadierazpena, ECM-ren galeraren ezaugarririk nabarmenena

dira, eta ehunaren suntsipena dakarten gertakari immunologikoen jauziaren azken

urratsa 129,146. Hala ere, metaloproteinasa geneen asoziazio argirik ez da aurkitu

129,146-148.

Ubikitina-proteasomaren zeregin zentrala proteina intrazelularrak degradatzea da,

inflamazioaren kontrolean, ziklo zelularrean eta geneen adierazpenean parte

hartzen dutenak kasu 150-152. CD biopsien adierazpen genetikoaren profilak

ubikitina-proteasoma sistemaren desregulazio nabarmena erakusten du, antigeno

aurkezpenarekin eta NFkB aktibazioarekin lotuta. Proteasoma MHC mota I-ek

aurkezten dituen antigenoen hornitzaile nagusia da 189, II ikerketako emaitzek

antigen processing and presentation KEGG bidezidorrean parte hartzen duten

zenbait geneen adierazpen aldaketa erakusten dute. Uste denez, gainadierazita

dagoen eta IFN-k kontrolatzen duen jauzi proteolitiko hau, peptido antigeniko

egokiak kantitate altuagoan sortzen ditu, MHC mota I-eko antigenoen aurkezpena

emendaturik 190 bai eta seguraski ere, erantzun autoimmune zelularrak bultzaturik.

Diskusioa

76

Ubikitina proteasoma sistema inplikatuta dagoen beste bidezidor garrantzitsua

NFkB seinaleztapen bidezidorra da. Zelulen estimulazioak zenbait seinalizazio

gertakari eragiten du, hala nola NFkB-ren inhibitzaileen fosforilazioa,

poliubikitinazioa eta degradazio proteasomikoa dakarrena, bukaeran immunitatean

eta inflamazioan parte hartzen duten itu-geneen (zitokinak, kimiozinak, eta zelulen

proliferazioan eta apoptosiaren erregulatzaileak) transkripzioa bultzaturik 153.

Aldaturiko adierazpena duten zenbait genek proteasome edo ubiquitin-mediated

proteolysis KEGG bidezidorretan parte hartzen dute edo GO:0006508 (proteolysis),

GO:0006512 (ubiquitin cycle) edo GO:0043122 (regulation of I-kappaB/NFkB

cascade) GO terminoak daramatzate. Gliadinarekiko espozizio luzeak

ubikitinazioan eta degradazio proteasomikoan parte hartzen duten geneen

gainadierazpena dakar. NFkB-ren aktibazio konstitutiboa deskribatu da tratatu

gabeko gaixoen mukosan, CD-an gertatzen den prozesu inflamatorioan (bai

hasierako faseetan bai iraunkortasunean) funtzio zentrala izanik. Mukosa

inflamatuan gainadierazitako gene askok kB lotura guneak dauzkate 97, hala nola

iNOS, RANTES, TAP1/2, MMP3 eta transglutaminasa ere, eta horrela agertzen dira

mikromatrize esperimentuan. Dirudienez, transkripzio faktore horri leporatutako

efektuak akats erregulatzaileren baten ondorio direla eta ez transkripzio faktorean

bertan dagoen polimorfismo genetiko baten ondorioa. Seinaleztapen bidezidorraren

ur gora dauden geneak gaixotasun autoimmuneekiko arrisku genetikoaren

erantzuleak izan daitezke, NFkB kaskadaren kide diren eta CD-rekin asoziatuta

dauden TNFAIP3 eta REL geneekin gertatzen den moduan 96.

Laginen adierazpen genomikoaren profilak CD prozesu konplexu, multifaktoriala

dela konfirmatzen du, elkarrekintzan dauden eta hesteko mukosaren zelula

populazio mota guztietan (immuneak eta epitelialak) eragina duten prozesuen

ondorioa. Sare biologiko horien desregulazioa azaltzen duen polimorfismo nagusirik

ez da deskribatu eta lokus desberdinetako aldaketa genetikoen konbinazioa da

seguraski gaixotasuna ekartzen duten prozesu biologiko anitzen alterazioen

erantzulea. Nahiz eta gene bakarreko ikerketak analisi genetiko edo funtzionalak

egiteko izangaiak aukeratzeko baliagarria izan, aukeraketa sinplista izaten

jarraitzen du, partehartzaile desberdinen arteko elkarrekintzak kontutan izan barik. II

ikerketak eritasun zeliakoren ehunetako kaltearen garapenean garrantzitsuak izan

daitezkeen sare biologiko desberdinen parte hartzea berreraikitzen du. Genoma

Diskusioa

77

mailako adierazpen aldaketen araketa sakona bidezidor mailan azpiko aldaketa

genetikoa eta interbentzio-itu posibleak identifikatzeko lagungarria izan daiteke.

II ikerketako ezaguerarekin, III ikerketaren helburua gaixotasunarekiko erlazionatuta

dauden aldaturiko geneetan fokatzea izan da, izangai potentzialak identifikatzeko

asmoz. Lehenago esan bezala, ubikitina-proteasoma sistema bidezidor

garrantzitsua da CD-n. Bidezidor horretako geneen artean, gainadierazpen

nabarmenena ubiqutin D-an aurkitu zen. IFN-k eta TNF-k induzitutako proteina

interesgarria da, proteina honek ubikitina moduko modifikatzaile gisa jokatzen du

proteasomaren bidezko degradazio proteiko azkarra eraginik 152. Horretaz gain,

UBD izangai CD suszpetibilitaterako izangai egokia da NFkB bidezidorraren

aktibazioan parte hartzen duelako eta kaspasen menpeko apoptosia eragiten duela

ko 191, CD-ren garapen eta progresioan garrantzitsuak diren bi prozesu gako loturik.

Are gehiago, genea MHC erregioan dago, bertan CD-rako suszeptibilitate lokus

gehigarri baten presentzia geroz eta onartuagoa dagoelarik 41. Gaixotasunarekin

asoziatutako polimorfismo erregulatzaile baten identifikazioak, eta genearen

adierazpen mailak itu ehunean duen genotipoarekiko korrelazioak, UBD-ren aldaera

horren gaixotasunaren garapenean inplikazio funtzionala iradokitzen dute. UBD-ren

aktibazioaren ondorioak ondo egokitzen dira ehunaren suntsitzearen patogenesi

ereduarekin: IFNG adierazpenaren emendia gaixo aktiboen mukosan

gaixotasunaren ezaugarria da, eta UBD-ren gainadierazpena zitokina

proinflamatorio horren ondorioa izan daiteke. Bestaldetik, UBD-k IkK-ren

familiakideen ubikitinazioa eta degradazio proteasomikoaren emendioan parte har

dezake, NFkB-ren aktibitatea eta ur beherako efektuak gehiturik. UBD-k apoptosia

bultzatzen duten kaspasen jauziaren aktibazioan ere parte hartzen du. Bi

seinaleztapen bidezidor horiek CD aktiboan desregulatuak daude 97,141, eta UBD

alterazio horiek eragiten dituzten faktoreen artean egon daiteke. Bukatzeko,

rs11724 aldaerak UBD adierazpenaren erregulazioan parte hartzen duela dirudi,

gaixotasunaren suszeptibilitatean eraginik.

Genoma osoko analisi teknikak, cDNA mikromatrizeak barne, tresna baliogarriak

dira gaixotasunen patogenesiaren ikuspegi molekularrak eta zelularrak ikertzeko.

Ikerketa hauetan, gliadinarekiko esposizio kroniko eta akutuaren ondorioz

Diskusioa

78

gertatutako adierazpen profilak analizatu dira ehunaren suntsitzean inplikaturiko

bidezidorrak definitzeko eta suszeptibilitate gene izangai potentzialak

identifikatzeko. Geneen adierazpen profilak CD-rekin lotura erakutsi duten

erregioekin gurutzatu eta gero transkripzioan eragin dezaketen SNP-ak lehenestea

ikuspuntu berria da. Nahiz eta topaturiko asoziazio seinaleak ez diren erreplikatu,

ikertutako 76 gene izangaietatik hamabi GWAS-ean CD-rekin asoziaturiko SNP-en

inguruan kokatzen dira, estrategiaren baliagarritasuna adierazirik. Baliteke, gene

horien genotipaketa ikerketa sakonagoa eginda eta lagin kopuru handiagoa erabilita

asoziazio seinale indartsuagoak topatzea, batez ere aldaera arraroak ere kontutan

hartuz gero inplikaturiko lokusetan. II ikerketari dagokionez, giza jatorriko laginen

artean aldakortasuna egon arren, bi egoera antagonikoen itu ehunaren

erabilgarritasuna: aktiboa (diagnosian) eta latentea (GFD tratamenduan) posible

egiten du prozesu patogenikoari lotuta dauden aldaketetan fokatzea. Gainera,

gaixotasuna sortzen duen ingurumen faktore nagusia ezaguna izanik, molekula

toxikoaren efektuaren in vitro behaketa egin daiteke. Zentzu horretan, eritasun

zeliakoa giza gaixotasun immuneak ikertzeko eredu bikaina eta bakarra da. Guzti

horrek posible egin du gaixoatasunaren patogenesian inplikaturiko mila gene baino

gehiagoren adierazpen profilen alterazioak definitzea eta sare biologiko patologiko

potentzialetan sailkatzea, bidezidor mailako gertakarien sekuentziaren ikuspegi

orokor eta errealistagoa lorturik. Datu horiek oso baliogarriak izan dira asoziazio

ikerketetarako geneak aukeratzean. UBD genearen adierazpenaren emendioak eta

rs11724 SNP erregulatzailearen asoziazioak, bi gertakarien korrelazioarekin batera,

modu sendoan iradokitzen du gene honen inplikazioa CD-ren patogenesian. Hau

dela eta, nahiz eta GWA ikerketek CD-rako arriskua handitzen duten hainbat

aldaera identifikatu dituzten, lotura desorekan oinarritutako asoziazio mapaketak ez

du gaixotasunaren suszeptibilitatean parte hartzen duten geneak benetan zeintzuk

diren definitzeko gaitasuna, are gutxiago asoziaturiko DNA polimorfismoek nola

eragiten duten geneen funtzioan azaltzeko 88,93. Beraz erpin bakoitzaren inguruan

dauden ustezko izangaiak modu independenteean aztertu behar dira benetako

eragileak konfirmatzeko. GWA ikerketetaz aparte, gene-gene eta gene-ingurumen

elkarrekintzak analizatzeko tresnen garapena, bidezidor mailako aldaketa

genetikoak kontutan hartzen dituzten tresnekin batera beharrezkoak dira eritasun

zeliakoren patogenesia deszifratzeko.

Diskusioa

79

Ikerketa honek leiho txiki bat ireki du eritasun zeliakoaren garapenaren paisaia

konplexura eta lan gehigarriak beharrezkoak dira gaixotasun konplexuen biologia

guztiz argitzeko.

6. Ondorioak

Ondorioak

83

6. ONDORIOAK

1. Eritasun zeliakoarekin lotura sendoa erakutsi duten erregioetan kokatzen

diren zenbait genek, gliadinak eragindako adierazpen aldaketak erakusten

dituzte, gaixotasunaren patogenesian inplikazio funtzionala dutela iradokiz.

2. Geneen adierazpena eta lotura erregioen informazioa gurutzatzea tresna

baliogarria da CD-ren suszeptibilitate gene izangaiak identifikatzeko.

3. Gaixo zeliakoen hesteko biopsien genoma mailan gliadinak eragindako

adierazpen profilen azterketak berretsi du CD gaixotasun konplexu, eta

multifaktoriala dela, eta hesteko mukosa osatzen duten zelula populazio

guztietan (immuneak eta epitelialak) eragiten duten prozesu

elkargurutzatuen ondorioa.

4. UBD-ren kasuan frogatu den bezala eraldatutako bidezidorretan dauden

gene edo izangai funtzional-posizionalen aldaera erregulatzaileek

adierazpen diferentziala azal dezakete eta gaixotasunaren arriskuarekin

asoziaturik egon daitezke.

7. Bibliografia

Bibliografia

86

7. BIBLIOGRAFIA

1. Dicke WK. Coeliakie. MD Thesis (1950).

2. Gee S. On the celiac disease. St.Bart Hosp Rep 24, 17-20 (1888).

3. Feighery, C. Fortnightly review: coeliac disease. BMJ 319, 236-239 (1999).

4. Maki, M. & Collin, P. Coeliac disease. Lancet 349, 1755-1759 (1997).

5. Marsh, M. N. Gluten, major histocompatibility complex, and the small intestine. A molecular and immunobiologic approach to the spectrum of gluten sensitivity ('celiac sprue'). Gastroenterology 102, 330-354 (1992).

6. Stenman, S. M. et al. Secretion of celiac disease autoantibodies after in vitro gliadin challenge is dependent on small-bowel mucosal transglutaminase 2-specific IgA deposits. BMC Immunol 9, 6 (2008).

7. Maki, M. The humoral immune system in coeliac disease. Baillieres Clin Gastroenterol 9, 231-249 (1995).

8. Dube, C. et al. The prevalence of celiac disease in average-risk and at-risk Western European populations: a systematic review. Gastroenterology 128, S57-S67 (2005).

9. Ivarsson, A. et al. Epidemic of coeliac disease in Swedish children. Acta Paediatr 89, 165-171 (2000).

10. Collin, P. et al. High incidence and prevalence of adult coeliac disease. Augmented diagnostic approach. Scand J Gastroenterol 32, 1129-1133 (1997).

11. Bode, S. & Gudmand-Hoyer, E. Incidence and prevalence of adult coeliac disease within a defined geographic area in Denmark. Scand J Gastroenterol 31, 694-699 (1996).

12. Murray, J. A. et al. Trends in the identification and clinical features of celiac disease in a North American community, 1950-2001. Clin Gastroenterol Hepatol. 1, 19-27 (2003).

13. Plot, L. & Amital, H. Infectious associations of Celiac disease. Autoimmun.Rev 8, 316-319 (2009).

14. Cataldo, F. & Montalto, G. Celiac disease in the developing countries: a new and challenging public health problem. World J Gastroenterol 13, 2153-2159 (2007).

Bibliografia

87

15. de Kauwe, A. L. et al. Resistance to celiac disease in humanized HLA-DR3-DQ2-transgenic mice expressing specific anti-gliadin CD4+ T cells. J Immunol 182, 7440-7450 (2009).

16. Galvao, L. C., Gomes, R. C., & Ramos, A. M. [Celiac disease: report of 20 cases in Rio Grande do Norte, Brazil]. Arq Gastroenterol 29, 28-33 (1992).

17. Rabassa, E. B., Sagaro, E., Fragoso, T., Castaneda, C., & Gra, B. Coeliac disease in Cuban children. Arch Dis Child 56, 128-131 (1981).

18. Sagaro, E. & Jimenez, N. Family studies of coeliac disease in Cuba. Arch Dis Child 56, 132-133 (1981).

19. al Tawaty, A. I. & Elbargathy, S. M. Coeliac disease in north-eastern Libya. Ann Trop.Paediatr 18, 27-30 (1998).

20. Suliman, G. I. Coeliac disease in Sudanese children. Gut 19, 121-125 (1978).

21. Khuffash, F. A. et al. Coeliac disease among children in Kuwait: difficulties in diagnosis and management. Gut 28, 1595-1599 (1987).

22. al Hassany, M. Coeliac disease in Iraqi children. J Trop.Pediatr Environ Child Health 21, 178-179 (1975).

23. Fasano, A. & Catassi, C. Current approaches to diagnosis and treatment of celiac disease: an evolving spectrum. Gastroenterology 120, 636-651 (2001).

24. Feighery, C. et al. Diagnosis of gluten-sensitive enteropathy: is exclusive reliance on histology appropriate? Eur J Gastroenterol Hepatol. 10, 919-925 (1998).

25. Di Sabatino, A. & Corazza, G. R. Coeliac disease. Lancet 373, 1480-1493 (2009).

26. Lerner, A. New therapeutic strategies for celiac disease. Autoimmun.Rev 9, 144-147 (2010).

27. Schuppan, D., Junker, Y., & Barisani, D. Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterology 137, 1912-1933 (2009).

28. Bardella, M. T. et al. Gluten sensitivity in monozygous twins: a long-term follow-up of five pairs. Am J Gastroenterol 95, 1503-1505 (2000).

29. Greco, L. et al. The first large population based twin study of coeliac disease. Gut 50, 624-628 (2002).

30. Sollid, L. M. et al. Evidence for a primary association of celiac disease to a particular HLA-DQ alpha/beta heterodimer. J Exp Med 169, 345-350 (1989).

Bibliografia

88

31. Chakravarti, A. Population genetics--making sense out of sequence. Nat.Genet 21, 56-60 (1999).

32. Falchuk, Z. M., Rogentine, G. N., & Strober, W. Predominance of histocompatibility antigen HL-A8 in patients with gluten-sensitive enteropathy. J Clin Invest 51, 1602-1605 (1972).

33. Keuning, J. J., Pena, A. S., van Leeuwen, A., van Hooff, J. P., & va Rood, J. J. HLA-DW3 associated with coeliac disease. Lancet 1, 506-508 (1976).

34. Price, P. et al. The genetic basis for the association of the 8.1 ancestral haplotype (A1, B8, DR3) with multiple immunopathological diseases. Immunol Rev 167, 257-274 (1999).

35. Louka, A. S. et al. HLA in coeliac disease families: a novel test of risk modification by the 'other' haplotype when at least one DQA1*05-DQB1*02 haplotype is carried. Tissue Antigens 60, 147-154 (2002).

36. van Belzen, M. J. et al. Defining the contribution of the HLA region to cis DQ2-positive coeliac disease patients. Genes Immun. 5, 215-220 (2004).

37. Vader, W. et al. The HLA-DQ2 gene dose effect in celiac disease is directly related to the magnitude and breadth of gluten-specific T cell responses. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 12390-12395 (2003).

38. Sollid, L. M. Molecular basis of celiac disease. Annu.Rev Immunol 18, 53-81 (2000).

39. Karell, K. et al. HLA types in celiac disease patients not carrying the DQA1*05-DQB1*02 (DQ2) heterodimer: results from the European Genetics Cluster on Celiac Disease. Hum Immunol 64, 469-477 (2003).

40. Spurkland, A., Sollid, L. M., Polanco, I., Vartdal, F., & Thorsby, E. HLA-DR and -DQ genotypes of celiac disease patients serologically typed to be non-DR3 or non-DR5/7. Hum Immunol 35, 188-192 (1992).

41. Louka, A. S. & Sollid, L. M. HLA in coeliac disease: unravelling the complex genetics of a complex disorder. Tissue Antigens 61, 105-117 (2003).

42. Zhong, F. et al. An autosomal screen for genes that predispose to celiac disease in the western counties of Ireland. Nat.Genet 14, 329-333 (1996).

43. Greco, L. et al. Genome search in celiac disease. Am J Hum Genet 62, 669-675 (1998).

44. King, A. L. et al. A genome-wide family-based linkage study of coeliac disease. Ann Hum Genet 64, 479-490 (2000).

45. Naluai, A. T. et al. Genome-wide linkage analysis of Scandinavian affected sib-pairs supports presence of susceptibility loci for celiac disease on chromosomes 5 and 11. Eur J Hum Genet 9, 938-944 (2001).

Bibliografia

89

46. Liu, J. et al. Genomewide linkage analysis of celiac disease in Finnish families. Am J Hum Genet 70, 51-59 (2002).

47. Woolley, N. et al. A new locus for coeliac disease mapped to chromosome 15 in a population isolate. Hum Genet 111, 40-45 (2002).

48. Popat, S. et al. Genome screening of coeliac disease. J Med Genet 39, 328-331 (2002).

49. Neuhausen, S. L. et al. Genome-wide linkage analysis for celiac disease in North American families. Am J Med Genet 111, 1-9 (2002).

50. van Belzen, M. J. et al. A major non-HLA locus in celiac disease maps to chromosome 19. Gastroenterology 125, 1032-1041 (2003).

51. van Belzen, M. J. et al. A genomewide screen in a four-generation Dutch family with celiac disease: evidence for linkage to chromosomes 6 and 9. Am J Gastroenterol 99, 466-471 (2004).

52. Rioux, J. D. et al. Genomewide search and association studies in a Finnish celiac disease population: Identification of a novel locus and replication of the HLA and CTLA4 loci. Am J Med Genet A 130A, 345-350 (2004).

53. Garner, C. P. et al. Genome-wide linkage analysis of 160 North American families with celiac disease. Genes Immun. 8, 108-114 (2007).

54. Ding, Y. C. et al. An autosomal genome-wide screen for celiac disease in Bedouin families. Genes Immun. 9, 81-86 (2008).

55. Greco, L. et al. Existence of a genetic risk factor on chromosome 5q in Italian coeliac disease families. Ann Hum Genet 65, 35-41 (2001).

56. Babron, M. C. et al. Meta and pooled analysis of European coeliac disease data. Eur J Hum Genet 11, 828-834 (2003).

57. Rioux, J. D. et al. Genetic variation in the 5q31 cytokine gene cluster confers susceptibility to Crohn disease. Nat.Genet 29, 223-228 (2001).

58. Morahan, G. et al. Linkage disequilibrium of a type 1 diabetes susceptibility locus with a regulatory IL12B allele. Nat.Genet 27, 218-221 (2001).

59. Louka, A. S. et al. The IL12B gene does not confer susceptibility to coeliac disease. Tissue Antigens 59, 70-72 (2002).

60. Wapenaar, M. C. et al. The SPINK gene family and celiac disease susceptibility. Immunogenetics 59, 349-357 (2007).

61. Koskinen, L. L. et al. Fine mapping of the CELIAC2 locus on chromosome 5q31-q33 in the Finnish and Hungarian populations. Tissue Antigens 74, 408-416 (2009).

Bibliografia

90

62. Martin-Pagola, A. et al. No association of CTLA4 gene with celiac disease in the Basque population. J Pediatr Gastroenterol Nutr 37, 142-145 (2003).

63. Djilali-Saiah, I. et al. CTLA-4 gene polymorphism is associated with predisposition to coeliac disease. Gut 43, 187-189 (1998).

64. Holopainen, P. et al. Candidate gene region 2q33 in European families with coeliac disease. Tissue Antigens 63, 212-222 (2004).

65. Popat, S. et al. Analysis of the CTLA4 gene in Swedish coeliac disease patients. Scand J Gastroenterol 37, 28-31 (2002).

66. Hunt, K. A. et al. A common CTLA4 haplotype associated with coeliac disease. Eur J Hum Genet 13, 440-444 (2005).

67. Brophy, K. et al. Haplotypes in the CTLA4 region are associated with coeliac disease in the Irish population. Genes Immun. 7, 19-26 (2006).

68. van Belzen, M. J. et al. A major non-HLA locus in celiac disease maps to chromosome 19. Gastroenterology 125, 1032-1041 (2003).

69. O'Connell, C. B. & Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nat.Cell Biol 5, 171-172 (2003).

70. Matter, K. & Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods 30, 228-234 (2003).

71. Monsuur, A. J. & Wijmenga, C. Understanding the molecular basis of celiac disease: what genetic studies reveal. Ann Med 38, 578-591 (2006).

72. Amundsen, S. S. et al. Association analysis of MYO9B gene polymorphisms with celiac disease in a Swedish/Norwegian cohort. Hum Immunol 67, 341-345 (2006).

73. Giordano, M. et al. A family-based study does not confirm the association of MYO9B with celiac disease in the Italian population. Genes Immun. 7, 606-608 (2006).

74. Nunez, C. et al. No evidence of association of the MYO9B polymorphisms with celiac disease in the Spanish population. Tissue Antigens 68, 489-492 (2006).

75. Forabosco, P. et al. Meta-analysis of genome-wide linkage studies in celiac disease. Hum Hered. 68, 223-230 (2009).

76. Lopez-Vazquez, A. et al. MHC class I chain related gene A (MICA) modulates the development of coeliac disease in patients with the high risk heterodimer DQA1*0501/DQB1*0201. Gut 50, 336-340 (2002).

77. Rueda, B. et al. A functional variant of IFNgamma gene is associated with coeliac disease. Genes Immun. 5, 517-519 (2004).

Bibliografia

91

78. Curley, C. R., Monsuur, A. J., Wapenaar, M. C., Rioux, J. D., & Wijmenga, C. A functional candidate screen for coeliac disease genes. Eur J Hum Genet 14, 1215-1222 (2006).

79. Abel, M. et al. Adulthood-onset celiac disease is associated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) gene polymorphism. Hum Immunol 67, 612-617 (2006).

80. Santin, I. et al. Association of KIR2DL5B gene with celiac disease supports the susceptibility locus on 19q13.4. Genes Immun. 8, 171-176 (2007).

81. Nunez, C. et al. Involvement of macrophage migration inhibitory factor gene in celiac disease susceptibility. Genes Immun. 8, 168-170 (2007).

82. Wapenaar, M. C. et al. Associations with tight junction genes PARD3 and MAGI2 in Dutch patients point to a common barrier defect for coeliac disease and ulcerative colitis. Gut 57, 463-467 (2008).

83. Alizadeh, B. Z. et al. Association analysis of functional variants of the FcgRIIa and FcgRIIIa genes with type 1 diabetes, celiac disease and rheumatoid arthritis. Hum Mol Genet 16, 2552-2559 (2007).

84. Santin, I. et al. The functional R620W variant of the PTPN22 gene is associated with celiac disease. Tissue Antigens 71, 247-249 (2008).

85. Nunez, C. et al. IL23R: a susceptibility locus for celiac disease and multiple sclerosis? Genes Immun. 9, 289-293 (2008).

86. Dema, B. et al. Lack of association of NKX2-3, IRGM, and ATG16L1 inflammatory bowel disease susceptibility variants with celiac disease. Hum Immunol 70, 946-949 (2009).

87. Hirschhorn, J. N. & Daly, M. J. Genome-wide association studies for common diseases and complex traits. Nat.Rev Genet 6, 95-108 (2005).

88. van Heel, D. A. et al. A genome-wide association study for celiac disease identifies risk variants in the region harboring IL2 and IL21. Nat.Genet 39, 827-829 (2007).

89. Romanos, J. et al. Six new coeliac disease loci replicated in an Italian population confirm association with coeliac disease. J Med Genet 46, 60-63 (2009).

90. Amundsen, S. S. et al. Four novel coeliac disease regions replicated in an association study of a Swedish-Norwegian family cohort. Genes Immun. 11, 79-86 (2010).

91. Todd, J. A. et al. Robust associations of four new chromosome regions from genome-wide analyses of type 1 diabetes. Nat.Genet 39, 857-864 (2007).

Bibliografia

92

92. Zhernakova, A. et al. Novel association in chromosome 4q27 region with rheumatoid arthritis and confirmation of type 1 diabetes point to a general risk locus for autoimmune diseases. Am J Hum Genet 81, 1284-1288 (2007).

93. Hunt, K. A. et al. Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response. Nat.Genet 40, 395-402 (2008).

94. Dema, B. et al. Association of IL18RAP and CCR3 with coeliac disease in the Spanish population. J Med Genet 46, 617-619 (2009).

95. Plaza-Izurieta L. Replication of the celiac disease GWAs results in Spanish population.Manuscript on preparation.

96. Trynka, G. et al. Coeliac disease-associated risk variants in TNFAIP3 and REL implicate altered NF-kappaB signalling. Gut 58, 1078-1083 (2009).

97. Maiuri, M. C. et al. Nuclear factor kappa B is activated in small intestinal mucosa of celiac patients. J Mol Med 81, 373-379 (2003).

98. Dubois, P. C. et al. Multiple common variants for celiac disease influencing immune gene expression. Nat.Genet 42, 295-302 (2010).

99. Invernizzi, P. Future directions in genetic for autoimmune diseases. J Autoimmun. 33, 1-2 (2009).

100. Maiuri, L. et al. Association between innate response to gliadin and activation of pathogenic T cells in coeliac disease. Lancet 362, 30-37 (2003).

101. Hue, S. et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity 21, 367-377 (2004).

102. Jabri, B. & Sollid, L. M. Tissue-mediated control of immunopathology in coeliac disease. Nat.Rev Immunol 9, 858-870 (2009).

103. Maiuri, L. et al. Definition of the initial immunologic modifications upon in vitro gliadin challenge in the small intestine of celiac patients. Gastroenterology 110, 1368-1378 (1996).

104. Martin-Pagola, A. et al. MICA response to gliadin in intestinal mucosa from celiac patients. Immunogenetics 56, 549-554 (2004).

105. Folk, J. E. & Chung, S. I. Transglutaminases. Methods Enzymol. 113, 358-375 (1985).

106. Folk, J. E. & Cole, P. W. Transglutaminase: mechanistic features of the active site as determined by kinetic and inhibitor studies. Biochim Biophys Acta 122, 244-264 (1966).

107. Heap, G. A. & van Heel, D. A. Genetics and pathogenesis of coeliac disease. Semin Immunol 21, 346-354 (2009).

Bibliografia

93

108. Caputo, I., Barone, M. V., Martucciello, S., Lepretti, M., & Esposito, C. Tissue transglutaminase in celiac disease: role of autoantibodies. Amino.Acids 36, 693-699 (2009).

109. Lindfors, K., Kaukinen, K., & Maki, M. A role for anti-transglutaminase 2 autoantibodies in the pathogenesis of coeliac disease? Amino.Acids 36, 685-691 (2009).

110. Mazzarella, G. et al. An immunodominant DQ8 restricted gliadin peptide activates small intestinal immune response in in vitro cultured mucosa from HLA-DQ8 positive but not HLA-DQ8 negative coeliac patients. Gut 52, 57-62 (2003).

111. Lundin, K. E. et al. T lymphocyte recognition of a celiac disease-associated cis- or trans-encoded HLA-DQ alpha/beta-heterodimer. J Immunol 145, 136-139 (1990).

112. Nilsen, E. M. et al. Gluten specific, HLA-DQ restricted T cells from coeliac mucosa produce cytokines with Th1 or Th0 profile dominated by interferon gamma. Gut 37, 766-776 (1995).

113. Troncone, R. et al. Majority of gliadin-specific T-cell clones from celiac small intestinal mucosa produce interferon-gamma and interleukin-4. Dig.Dis Sci 43, 156-161 (1998).

114. Monteleone, G. et al. Role of interferon alpha in promoting T helper cell type 1 responses in the small intestine in coeliac disease. Gut 48, 425-429 (2001).

115. Leon, A. J. et al. Interleukin 18 maintains a long-standing inflammation in coeliac disease patients. Clin Exp Immunol 146, 479-485 (2006).

116. Steinman, L. A brief history of T(H)17, the first major revision in the T(H)1/T(H)2 hypothesis of T cell-mediated tissue damage. Nat.Med 13, 139-145 (2007).

117. Castellanos-Rubio, A. et al. TH17 (and TH1) signatures of intestinal biopsies of CD patients in response to gliadin. Autoimmunity 42, 69-73 (2009).

118. Harris, K. M., Fasano, A., & Mann, D. L. Monocytes differentiated with IL-15 support Th17 and Th1 responses to wheat gliadin: Implications for celiac disease. Clin Immunol 135, 430-439 (2010).

119. Monteleone, I. et al. Characterization of IL-17A-producing cells in celiac disease mucosa. J Immunol 184, 2211-2218 (2010).

120. Sjostrom, H. et al. Identification of a gliadin T-cell epitope in coeliac disease: general importance of gliadin deamidation for intestinal T-cell recognition. Scand J Immunol 48, 111-115 (1998).

Bibliografia

94

121. Sturgess, R. et al. Wheat peptide challenge in coeliac disease. Lancet 343, 758-761 (1994).

122. Maiuri, L. et al. In vitro activities of A-gliadin-related synthetic peptides: damaging effect on the atrophic coeliac mucosa and activation of mucosal immune response in the treated coeliac mucosa. Scand J Gastroenterol 31, 247-253 (1996).

123. Picarelli, A. et al. 31-43 amino acid sequence of the alpha-gliadin induces anti-endomysial antibody production during in vitro challenge. Scand J Gastroenterol 34, 1099-1102 (1999).

124. Arentz-Hansen, H. et al. The intestinal T cell response to alpha-gliadin in adult celiac disease is focused on a single deamidated glutamine targeted by tissue transglutaminase. J Exp Med 191, 603-612 (2000).

125. Anderson, R. P., Degano, P., Godkin, A. J., Jewell, D. P., & Hill, A. V. In vivo antigen challenge in celiac disease identifies a single transglutaminase-modified peptide as the dominant A-gliadin T-cell epitope. Nat.Med 6, 337-342 (2000).

126. Fina, D. et al. Interleukin 21 contributes to the mucosal T helper cell type 1 response in coeliac disease. Gut 57, 887-892 (2008).

127. Lammers, K. M. et al. Gliadin induces an increase in intestinal permeability and zonulin release by binding to the chemokine receptor CXCR3. Gastroenterology 135, 194-204 (2008).

128. Schulzke, J. D., Bentzel, C. J., Schulzke, I., Riecken, E. O., & Fromm, M. Epithelial tight junction structure in the jejunum of children with acute and treated celiac sprue. Pediatr Res 43, 435-441 (1998).

129. Ciccocioppo, R. et al. Altered expression, localization, and phosphorylation of epithelial junctional proteins in celiac disease. Am J Clin Pathol 125, 502-511 (2006).

130. Sander, G. R., Cummins, A. G., Henshall, T., & Powell, B. C. Rapid disruption of intestinal barrier function by gliadin involves altered expression of apical junctional proteins. FEBS Lett 579, 4851-4855 (2005).

131. Yamada, A., Irie, K., Fukuhara, A., Ooshio, T., & Takai, Y. Requirement of the actin cytoskeleton for the association of nectins with other cell adhesion molecules at adherens and tight junctions in MDCK cells. Genes Cells 9, 843-855 (2004).

132. Szakal, D. N. et al. Mucosal expression of claudins 2, 3 and 4 in proximal and distal part of duodenum in children with coeliac disease. Virchows Arch 456, 245-250 (2010).

133. Visser, J., Rozing, J., Sapone, A., Lammers, K., & Fasano, A. Tight junctions, intestinal permeability, and autoimmunity: celiac disease and type 1 diabetes paradigms. Ann N Y Acad Sci 1165, 195-205 (2009).

Bibliografia

95

134. Benahmed, M. et al. Inhibition of TGF-beta signaling by IL-15: a new role for IL-15 in the loss of immune homeostasis in celiac disease. Gastroenterology 132, 994-1008 (2007).

135. Prud'homme, G. J. & Piccirillo, C. A. The inhibitory effects of transforming growth factor-beta-1 (TGF-beta1) in autoimmune diseases. J Autoimmun. 14, 23-42 (2000).

136. Mazzarella, G. et al. Constitutive activation of the signal transducer and activator of transcription pathway in celiac disease lesions. Am J Pathol 162, 1845-1855 (2003).

137. De Stefano, D. et al. The role of NF-kappaB, IRF-1, and STAT-1alpha transcription factors in the iNOS gene induction by gliadin and IFN-gamma in RAW 264.7 macrophages. J Mol Med 84, 65-74 (2006).

138. Ulloa, L., Doody, J., & Massague, J. Inhibition of transforming growth factor-beta/SMAD signalling by the interferon-gamma/STAT pathway. Nature 397, 710-713 (1999).

139. Barone, M. V. et al. Humoral immune response to tissue transglutaminase is related to epithelial cell proliferation in celiac disease. Gastroenterology 132, 1245-1253 (2007).

140. Ehrmann, J. et al. Immunohistochemical study of the apoptotic mechanisms in the intestinal mucosa during children´s coeliac disease. Virchows Arch 442, 453-461 (2007).

141. Giovannini, C. et al. Wheat gliadin induces apoptosis of intestinal cells via an autocrine mechanism involving Fas-Fas ligand pathway. FEBS Lett 540, 117-124 (2003).

142. Watson, A. J., Appleton, D. R., & Wright, N. A. Adaptive cell-proliferative changes in the small-intestinal mucosa in coeliac disease. Scand J Gastroenterol.Suppl 74, 115-127 (1982).

143. Mazzarella, G. et al. Gliadin activates HLA class I-restricted CD8+ T cells in celiac disease intestinal mucosa and induces the enterocyte apoptosis. Gastroenterology 134, 1017-1027 (2008).

144. Korhonen, M., Ormio, M., Burgeson, R. E., Virtanen, I., & Savilahti, E. Unaltered distribution of laminins, fibronectin, and tenascin in celiac intestinal mucosa. J Histochem.Cytochem. 48, 1011-1020 (2000).

145. Verbeke, S. et al. Basement membrane and connective tissue proteins in intestinal mucosa of patients with coeliac disease. J Clin Pathol 55, 440-445 (2002).

146. Daum, S. et al. Increased expression of mRNA for matrix metalloproteinases-1 and -3 and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in intestinal biopsy specimens from patients with coeliac disease. Gut 44, 17-25 (1999).

Bibliografia

96

147. Mora, B. et al. Association of the matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) promoter polymorphism with celiac disease in male subjects. Hum Immunol 66, 716-720 (2005).

148. Louka, A. S. et al. Coeliac disease candidate genes: no association with functional polymorphisms in matrix metalloproteinase 1 and 3 gene promoters. Scand J Gastroenterol 37, 931-935 (2002).

149. Ciccocioppo, R. et al. Matrix metalloproteinase pattern in celiac duodenal mucosa. Lab Invest 85, 397-407 (2005).

150. Reinstein, E. [The ubiquitin system for intracellular protein degradation--involvement in human pathologies and therapeutic implications]. Harefuah 143, 605-8, 621, 620 (2004).

151. Elliott, P. J., Zollner, T. M., & Boehncke, W. H. Proteasome inhibition: a new anti-inflammatory strategy. J Mol Med 81, 235-245 (2003).

152. Hipp, M. S., Kalveram, B., Raasi, S., Groettrup, M., & Schmidtke, G. FAT10, a ubiquitin-independent signal for proteasomal degradation. Mol Cell Biol 25, 3483-3491 (2005).

153. Puel, A., Picard, C., Ku, C. L., Smahi, A., & Casanova, J. L. Inherited disorders of NF-kappaB-mediated immunity in man. Curr Opin Immunol 16, 34-41 (2004).

154. Orange, J. S., Levy, O., & Geha, R. S. Human disease resulting from gene mutations that interfere with appropriate nuclear factor-kappaB activation. Immunol Rev 203, 21-37 (2005).

155. Guo, D. et al. A functional variant of SUMO4, a new I kappa B alpha modifier, is associated with type 1 diabetes. Nat.Genet 36, 837-841 (2004).

156. Qiao, S. W., Sollid, L. M., & Blumberg, R. S. Antigen presentation in celiac disease. Curr Opin Immunol 21, 111-117 (2009).

157. Strehl, B. et al. Interferon-gamma, the functional plasticity of the ubiquitin-proteasome system, and MHC class I antigen processing. Immunol Rev 207, 19-30 (2005).

158. van Hall, T. et al. Differential influence on cytotoxic T lymphocyte epitope presentation by controlled expression of either proteasome immunosubunits or PA28. J Exp Med 192, 483-494 (2000).

159. Martin-Pagola, A. et al. MICA response to gliadin in intestinal mucosa from celiac patients. Immunogenetics 56, 549-554 (2007).

160. Provenzano, M., Rosi, C. R., & Mocellin, S. The Usefulness of Quantitative Real-Time PCR in Immunogenetics. Archives of Patology and Laboratory Medicine (2007).

Bibliografia

97

161. Yuan, H. Y. et al. FASTSNP: an always up-to-date and extendable service for SNP function analysis and prioritization. Nucleic Acids Res 34, W635-W641 (2006).

162. Conde, L. et al. PupaSNP Finder: a web tool for finding SNPs with putative effect at transcriptional level. Nucleic Acid Research 32, 242-248 (2007).

163. Wang, L., Liu, S., Niu, T., & Xu, X. SNPHunter: a bioinformatic software for single nucleotide polymorphism data acquistion and management. BCM Bioinformatics 6, 60-66 (2007).

164. Hemminger, B. M., Saelim, B., & Sullivan, P. F. TAMAL: an integrated approach to choosing SNPs for genetic studies of human complex traits. Bioinformatics 22, 626-627 (2007).

165. Argraves, G. L., Jani, S., Barth, J. L., & Argraves, W. S. ArrayQuest: a web resource for the analysis of DNA microarray data. BCM Bioinformatics 6, 287-292 (2007).

166. Al Shahrour, F. et al. Babelomics: advanced functional profiling of transcriptomics, proteomics and genomics experiments. Nucleic Acids Res 36, W341-W346 (2008).

167. Tomfohr, J., Lu, J., & Kepler, T. B. Pathway level analysis of gene expression using singular value decomposition. BMC Bioinformatics 6, 225 (2005).

168. Purcell, S. et al. PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am J Hum Genet 81, 559-575 (2007).

169. Juuti-Uusitalo, K. et al. cDNA microarray analysis of gene expression in coeliac disease jejunal biopsy samples. Journal of Autoimmunity 22, 249-265 (2007).

170. Diosdado, B. et al. A microarray screen for novel candidate genes in coeliac disease pathogenesis. Gut 53, 944-951 (2007).

171. Bracken, S., Byrne, G., Kelly, J., Jackson, J., & Feighery, C. Altered gene expression in highly purified enterocytes from patients with active coeliac disease. BMC Genomics 9, 377 (2008).

172. Buchholz, M. et al. SERPINE2 (protease nexin I) promotes extracellular matrix production and local invasion of pancreatic tumors in vivo. Cancer Res 63, 4945-4951 (2003).

173. Villanacci, V. et al. Expression of cell adhesion molecules in jejunum biopsies of children with coeliac disease. Ital.J Gastroenterol. 25, 109-116 (1993).

174. Kristiansen, O. P., Larsen, Z. M., & Pociot, F. CTLA-4 in autoimmune diseases--a general susceptibility gene to autoimmunity? Genes Immun. 1, 170-184 (2000).

Bibliografia

98

175. Penkov, D. et al. Involvement of Prep1 in the alphabeta T-cell receptor T-lymphocytic potential of hematopoietic precursors. Mol Cell Biol 25, 10768-10781 (2005).

176. Bastians, H. & Ponstingl, H. The novel human protein serine/threonine phosphatase 6 is a functional homologue of budding yeast Sit4p and fission yeast ppe1, which are involved in cell cycle regulation. J Cell Sci 109 ( Pt 12), 2865-2874 (1996).

177. Przemioslo, R., Wright, N. A., Elia, G., & Ciclitira, P. J. Analysis of crypt cell proliferation in coeliac disease using MI-B1 antibody shows an increase in growth fraction. Gut 36, 22-27 (1995).

178. Ryan, A. W. et al. Haplotype variation at the IBD5/SLC22A4 locus (5q31) in coeliac disease in the Irish population. Tissue Antigens 64, 195-198 (2004).

179. Michl, P. et al. CUTL1 is a target of TGF(beta) signaling that enhances cancer cell motility and invasiveness. Cancer Cell 7, 521-532 (2005).

180. Kim, S. Y. New target against inflammatory diseases: transglutaminase 2. Arch Immunol Ther Exp (Warsz.) 52, 332-337 (2004).

181. Hunt, K. A., Franke, L., Deloukas, P., Wijmenga, C., & van Heel, D. A. No evidence in a large UK collection for celiac disease risk variants reported by a Spanish study. Gastroenterology 134, 1629-1630 (2008).

182. Dema, B. et al. Lack of replication of celiac disease risk variants reported in a Spanish population using an independent Spanish sample. Genes Immun. 10, 659-661 (2009).

183. Latiano, A. et al. Analysis of candidate genes on chromosomes 5q and 19p in celiac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 45, 180-186 (2007).

184. Mandel, M., Gurevich, M., Pauzner, R., Kaminski, N., & Achiron, A. Autoimmunity gene expression portrait: specific signature that intersects or differentiates between multiple sclerosis and systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol 138, 164-170 (2007).

185. Aoki, C. A. et al. Transforming growth factor beta (TGF-beta) and autoimmunity. Autoimmun.Rev 4, 450-459 (2005).

186. Woolley, N., Mustalahti, K., Maki, M., & Partanen, J. Cytokine gene polymorphisms and genetic association with coeliac disease in the Finnish population. Scand J Immunol 61, 51-56 (2005).

187. Diosdado, B., Monsuur, A. J., Mearin, M. L., Mulder, C., & Wijmenga, C. The downstream modulator of interferon-gamma, STAT1 is not genetically associated to the Dutch coeliac disease population. Eur J Hum Genet 14, 1120-1124 (2006).

Bibliografia

99

188. Rueda, B., Zhernakova, A., Lopez-Nevot, M. A., Martin, J., & Koeleman, B. P. Association study of functional genetic variants of innate immunity related genes in celiac disease. BMC Med Genet 6, 29 (2005).

189. van Hall, T. et al. Differential influence on cytotoxic T lymphocyte epitope presentation by controlled expression of either proteasome immunosubunits or PA28. J Exp Med 192, 483-494 (2000).

190. Strehl, B. et al. Interferon-gamma, the functional plasticity of the ubiquitin-proteasome system, and MHC class I antigen processing. Immunol Rev 207, 19-30 (2005).

191. Raasi, S., Schmidtke, G., & Groettrup, M. The ubiquitin-like protein FAT10 forms covalent conjugates and induces apoptosis. J Biol Chem 276, 35334-35343 (2001).

Documents

Partehartzaile funtzionalak eritasun zeliakoan ...€¦ · Gaixotasun autoimmune konplexu honen genetika ulertzeko xedez, nire tesi proiektuaren helburua genoma osoaren adierazpen