pembahasan pemantauan kolom dengan metode KLTpembahasan Pada
praktikum kali ini dilakukan percobaan pemantauan kolom dengan
metode KLT tujuan dilakukan pemantauan yaitu untuk menentukan
jumlah komponen dalam campuran, menentukan identitas anatara dua
campuran dan memonitor perkembangan reaksi. Dasar pemisahan pada
KLT adalah perbedaan kecepatan migrasi diantara fase diam yang
berupa padatan dan fase gerak berupa campuran solvetn atau pelarut
(eluen) yang jua dikenal dengan pistilah pelarut pengembang campur.
Adapun fase diam yang digunakan pada praktikum ini adalah
menggunakan campuran butanol, asam asetat dan air dengan
perbandingan 4 : 2 : 1 selain menggunakan campuran tersebut
dilakukan pula elusi dengan eluen yang berbeda menggunakan
n-butanol dan etanol dengan perbandingan 3 : 1 larutan n-butanol
digunakan untuk menarik senyawa yang semi polar sedangkan etanol
untuk menarik senyawa yang polar.Tahap yang digunakan yaitu 1.
Persiapan plat2. Pembuatan eluen3. Persiapan chamber4. Penotolan
dan pengembangan Plat yang digunakan adalah silika gel Gf 254 lapis
tipis atau penyangga terdiri dari plat (kaca, aluminium, plastik)
dan adsorben (silika gel, alumina, selulosa, dll). Silika gel dapat
membentuk ikatan hidrogen di permukaanya karena pada permukaannya
terikat gugus gidroksil. Oleh karena itu silika gel sifatnya sangat
polar. Sebelum digunakan proses KLT, plat harus di keringkan dulu
di dalam oven agar plat bebas dari molekul-molekul air yang
terikat. Jumlah air yang terikat tersebut sangat berpengaruh pada
pemisahan karena air terikat sangat kuat pada adsorben sehigga
menghambat terjadinya kesetimbangan dengan molekul-molekul analit.
Selain itu plat juga tidak boleh rusak agar warna pada sampel dapat
terpisah dengan baik. Setelah plat diaktivasi di dalam oven plat di
ambil dengan menggunakan pinset dan meletakkannya di atas kaca yang
sebelumnya telah di bersihkan dengan alkohol. Alasan menggunakan
pinset karena lebih efektif dari pada menggunakan tangan langsung
karena, dikhawatirkan tangan berkeringat sehingga dapat menambahkan
jumlah air pada plat. Selanjutnya plat diberi tanda garis dan titik
untuk proses penotolan dan elusi.Pada pemilihan eluen tergantung
dari jenis analit yang akan dipisahkan. Eluen yang menyebabakan
seluruh noda yang ditotolkan pada plat naik sampai batas atas plat
(solvent Fron) tanpa mengalami pemisahan berarti eluen terlalu
polar. Sebaliknya jika noda yang ditotolkan pada palt sama sekali
tidak bergerak berarti eluen kurang polar. Semakin dekat kepolaran
antara sampel dan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase
gerak tersebut. Sebelum dilakukan pengembangan chamber dijenuhkan
terlebih dahulu karena ketika fase gerak mulai naik ke fase diam
sedapat mungkin tidak ada penghalang atau gangguan. Jika chamber
tidak jenuh maka di dalam chamber masih terdapat udara dengan uap
eluen, maka aliran eluen akan tertahan sehingga menyebabkan
pemisahan tidak berjalan dengan baik. parameter migrasi pada KLT
adalah nilai Rf . Rf adalah waktu tambah atau waktu yang diperlukan
untuk mengelusi maksimum suatu sampel dihitung dari titik awal
penotolan. Oleh karena itu nilai Rf selalu lebih kecil dari 1.
Berdasarkan percobaan didapatkan nilai Rf 0,3 cm pada perbandingan
7:3 , 0,9 cm pada perbandingan 8:2, 7:3, dan 6:4, serta 0,06 cm
pada perbandingan 5:5. Jadi spot yang paling baik pada perbandingan
7:3 dengan eluen n-butanol dan etanol dengan nilai Rf 0,3 cm. Hal
ini disebabkan karena nilai Rf tersebut paling maksimal daya
elusinya dalam pemisahan. Daya elusi sendiri terletak antara 0,2
sampai 0,8. Dari proses elusi tersebut tidak terlihat adanya spot
secara kasat mata sehingga perlu di deteksi di lampu UV 254 nm dan
UV 366 nm. Maka diperoleh nada yang terlihat. Pada lampu UV 254 nm
noda terlihat karena adanya daya interkasi anatara sinar uv dengan
indikator flourosensi seperti timah kadminum sulfida yang terdapat
pada lempeng dimana lempeng berflourosensi sedangkan sampel tampak
gelap. Pada lampu uv 366 nm noda berflourosensi sedangkan lempeng
berwarna gelap. Penampakan noda terjadi karena adanya daya
interkasi antara sinar uv dengan gugus kromofor yang terikat oleh
ausokrom yang ada pada noda tersebut.PEMBAHASAN KROMATOGRAFI KOLOM
(KK)Pembahasan Pada praktikum ini dilakukan percobaan mengenai
kromatgrafi kolom fase diam yang digunakan adalah silika gel
sedangkan fase geraknya memakai n-butanol : etanol dengan beberapa
perbandingan. Fraksi yang di gunakan adalah fraksi air dari
simplisia rosella. Kromatografi kolom adalah kromatografi yang
menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen
dalam campuran KK merupakan kelanjutan dari KLT. Prinsipnya sama
dengan KLT, KK digunakan untuk memurnikan senyawa atau memisahkan
campuran. Fase diam yang digunakan bisa berupa padat atau cair.
Sedangkan fase gerak berupa cair atau gas. Mekanisme pemisahan 1.
Kromatografi Adsorbsi.Komponen yang dipisahkan secara selektif
teradsorpsi pada permukaan adsorben.2. Kromatografi PartisiAnalit
mengalami partisi antara lapisan cairan fase diam (stasioner) dan
eluen sebagai fase gerak (mobile).3. Kromatografi Siza Eksklusi
Solut dilewatkan kedalam adsorben berpori Solut dengan ukuran kecil
akan masuk ke dalam pori-pori adsorben. Solut dengan ukuran lebih
besar dari pori-pori adsorben akan terelusi lebih dulu.4.
Kromatografin Pertukaran Ion Fase diam memiliki muatan tertentu,
analit yang berbeda muatannya akan tertahan dalam adsorben dan
secara selektif akan terelusi oleh fase gerak berupa dapar. 5.
Kromatografi Afinitas Banyak digunakan untuk memisahkan
enzim-enzim. Fase diam memiliki gugus khas (ligan) dengan afinitas
tinggi terhadap solut. Solut yang bentuknya cocok dengan ligan akan
tertahan di adsorben (membentuk kompleks) dolut yang lain akan
terelusi. Kompleks yang terbentuk antara solut dengan ligan dielusi
ulang sehingga diperoleh solut yang diinginkan.Kedalam KK
ditmbahkan glass woll, pasir, silika gel, fraksi air yang dicampur
silika gel, dan eluen. Glass woll digunakan untuk menahan pasir dan
silika gel, pasir digunakan unutuk menjerap kotoran. Silika gel
sebagai fase diam untuk menjerap analit sedangkan eluen untuk
membawa analit menuju vial yang terletak dibawah kolom sebagai
penampungan fraksi.Di dalam kolom, aliran fase gerak akan membawa
komponen-komponen analit ke arah sepanjang kolom. Pada saat fase
gerak mengalir sepanjang kolom terjadi kesetimbangan dinamis antara
komponen yang terdapat dalam fase gerak dengan komponen yang
terdapat dalam fase diam sehingga mempengaruhi jumlah plat teori
(N). Maka makin banyak palt maka pemisahan makin baik sehingga
kolom makin efisien.Berbagai ukuran kolom dapat digunakan dimana
hal utama yang dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai untuk
menerima sampel-sampel tanpa melampaui fase diamnya. Panjang kolom
harus sekurang-kurangnya sepuluh kalu ukuran diamterernya. Adapun
diameter dan panjang kolom yang digunakan pada praktikum ini adalah
2 cm dan 24,5 cm.Bahan pengemasnya adalah suatu adsorben yaitu
silika gel yang kemudian dimasukkan dalam bentuk suspensi kedalam
porsi fase gerak dan dibiarkan diam didalam hamparan basah dengan
sedikit cairan dibiarkan turun sampai mencapai puncak permukaan
hamparan.Pemilihan ukuran kolom tergantung dariA. Jumlah sampel
yang akan dipisahkan, perbandingan adsorben cuplikan 10:1B.
Perbandingan panjang dengan diameter kolom 12:1C. Untuk sampel yang
multikomponen yang memepunyai afinitas yang sama terhadap adsorben
maka dipilih kolom yang panjang, sedangkan untuk komponen dengan
afinitas yang berbeda terhadap adsorben maka dipilih kolom yang
pendek.Adapun cara penyiapan kolom yang digunakan pada praktikum
ini adalah cara basah agar meminimalkan reaksi terjadinya
keretakkan fase diam akibat kekeringan atau kurang ratanya fase
gerak bila dibandingkan cara kering maupun bubur atau lumpuran.
Pada saat menuangkan fase diam ke corong maka serbuk tersebut tidak
boleh menempel pada dinding kolom dan tidak terbentuk rongga agar
pemisahan berjalan sempurna. Dari praktikum diperoleh 10 fraksi
dengan warna yang semakin encer (tidak pekat).Parameter kinetika
pemisahan ada 4 :1. Slektivitas () 2. Kapasitas kolom (K1) 3.
Resolusi (Rs)4. Jumlah plat teori (N)Slektivitas yaitu kemampuan
untuk mengenali senyawa-senyawa didalam campuran untuk mendapatkan
slektivitas meksimum harus dicari mekanisme pemisahan yang paling
sesuai (partisi, adsorpsi size exclusion, atau ion exchange).
Kp = koefisien partisi, perbaningan konsentrasi analit dalam
fase diam dan fase gerak ( Cs/Cm).Pembilang adalah Kp yang lebih
besar Nilai 1Nilai makin besar maka pemisahan makin baik.Kapasitas
kolom adalah ukuran interaksi suatu analit dengan fase diam. Hal
ini menunjukkan kemampuan kolom menampung analit maka semakin lama
analit berbeda dalam kolom akan semakin besar nilai kapasitasnya.k1
= Resolusi adalah ukuran kuantitatif yang menyatakan kemampuan
kolom dalam memisahkan komponen-komponen. Resolusi oleh 3 faktor
yaitu efisiensi (N), selektivitas () dan retensi (K1).Rs = Rs =
Berarti pemisahan tidak semprna Rs 1,5 berarti pemisahan baik.
