Pembahasan Prosedur

Percobaan kali ini berjudul Studi Absorbsi Obat secara In Vitro dengan tujuan

untuk mempelajari pengaruh pH terhadap absorbsi obat melalui saluran

pencernaan secara in vitro. In vitro berarti percobaan d i l akukan d i l ua r

t ubuh a t au pada kond i s i l ab o ra to r i um . P ro f i l pH vs ke l a ru t an

mem ber ikan gam ba ran da r i ke l a ru t an oba t pada be r baga i pH ,

yan g dapa t men un jukkan j i k a sua tu oba t  bersifat basa akan larut

pada media asam. Demikian juga sebaliknya obat yang bersifat asam

akan larut dalam media basa. Absorbsi secara biologi dapat didefinisikan

sebagai proses menyerap atau asimilasi zat ke dalam sel atau ke jaringan dan

organmelalui difusi atau osmosis, seperti dalam penyerapan nutrisi oleh sistem

pencernaan,atau penyerapan obat ke dalam aliran darah. Absorpsi sistemik suatu

obat dari saluran cerna tergantung pada rate limiting step (jika sediaan

obat berbentuk tablet), sifat fisiko-kimia, dan anatomi fisiologi tempat absorpsi.

Banyak h a l y a n g m e m p e n g a r u h i k e c e p a t a n a b s o r p s i , d a n

u m u m n y a a b s o r p s i o b a t s e c a r a p a s i f   dipengaruhi oleh derajad

ionisasi dimana jika berhadapan dengan membran sel, membran sel

akan lebih permeabel terhadap bentuk obat yang tidak terionkan

dibandingkan dengan bemtuk terionkan karena membran sel terdiri atas lipid

dan protein.

Perbedaan pH pada tempat absorpsi dapat mempengaruhi jumlah obat yang

diserap olehsaluran pencernaan. Pada percobaan ini untuk membuktikan

hal tersebut, maka asam salisilatakan ditempatkan pada dua tempat

absorpsi yaitu pada pH larutan buffer 1,2 dan 7,5 dimana  pada kondisi

pH 1,2 mengggambarkankondisi cairan lambung sedangkan pH larutan

buffer 7,5men ggam bar kan kond i s i c a i r an i n t e s t i na l . Ca i r an

l am bung bua t an i n i d ib ua t t anpa peps in , sedangkan cairan intestin

yang digunakan tanpa pankreatin. Asam HCl merupakan obat golongan

asam. Sehingga berdarkan teori like dissolves like, dalam buffer asam asam,

senyawa tersebut akan berada dalam bentuk bebas (bentuk

molekulnya). Sebaliknya, jika asam HCl berada dalam lingkungan basa

yaitu pada pH bu f f e r 7 ,5 maka a sam HCl akan be rada da l am

ben tuk t e r i onkan yang l eb ih banyak  daripada bentuk molekulnya.

Karena lapisan membran sel banyak tersusun oleh lipid, maka obat

yang berada dalam bentuk molekul akan lebih mudah melewati

membran. Sedangkan obat dalam bentuk terionkan karena bersifat polar

akan kesulitan melalui membran sel yang bersifat lipofilik.

Prosedur awal yang dilakukan adalah menentuan α maksimum, ka rena

pada pan j ang gelombang maksimum akan membeikan kepekaan (sensitivitas)

yang tinggi, disamping itu juga un tuk member ikan ke sa l ahan yang

kec i l . Dan pan j ang ge lombang yang digunakan dalam percobaan ini

adalah 277 nm dan membuat kurva baku, membuat kurva baku agar

diperoleh persamaan regresi linear yang diperlukan untuk pencarian kadar obat

yang terabsorpsi.

Selanjutnya menentuan absorpsi pada usus halus tikus. Hewan percobaan yang

digunakan dalam percobaan ini adalah tikus karena diperkirakan memiliki

saluran pencernaan yang hampir sama dengan manusia. Disamping itu

juga harganya yang relatif murah dam pemeliharaannya yang lebih

mudah dibandingkan hewan percobaan l a i nny a . Pada percobaan ini tikus

yang digunakan sejumlah 3 ekor, salah satunya sebagai replikasi. Da r i n i l a i

ab so rbans i yan g d ipe ro l eh d i t en t ukan kada r oba t mas ing -

mas ing s am pe l deng an menggunakan persamaa kurva baku yang telah ada.

Sebe lum d igunakan hewan pe rcoba an d ip uasakan t e r l eb ih

dahu lu s e l ama 24 j am , namun tetap diberi minum air masak. Tikus dibunuh

dengan eter, pengorbanan dlakukan secara kimia tidak secara fisik  karena

ditakutkan akan merusak organ tikus yang akan digunakan dalam

percobaan. Setelah tikus dikorbankan, perut dibedah menggunakan

gunting sepanjang linea mediana dan ususnya dikeluarkan. Usus sepanjang

15 cm dibawah pylorus dibuang karena t e rdapa t ke l en j a r    pankreas dan

muara ductus colectivus dan dikhawatirkan masih dipengaruhi oleh keasaman

lambung. Kemudian 20 cm dibawahnya dipotong untuk percobaan. B a g i a n

u s u s y a n g d i g u n a k a n u n t u k p e r c o b a a n t e r s e b u t

m e r u p a k a n d u o d e n u m . Dig unak an bag i an duodennu m dengan

pe r t im bangan bahwa d ib ag i an t e r s eb u t menun juk kan absorpsi

obat yang paling cepat karena adanya villi dan mikrovilli yang

menyebabkan luasnya permukaan tempat absorpsi.

Usus kemudian dibersihkan dari lipid yang menempel di dalam larutan NaCl

0,9% b/v. Usus juga harus dibersihkan dari sisa makanan yang menempel

agar proses absorpsi bisa berjalan dengan normal. Selama preparasi

usus harus selalu direndam dalam larutan NaCl 0,9% b/v. S e l a i n i t u

p r e p a r a s i u s u s j u g a t i d a k b o l e h t e r l a l u l a m a u n t u k

m e n g h i n d a r i k e m u n g k i n a n terjadinya kematian usus. Bagian anal

digunakan sebagai control. Ujung anal dari potongan usus tersebut diikat dengan

benang, kemudian dengan menggunakan batang gelas yang berdiameter 2 mm

usus tersebut dibalik, sehingga bagian mukosa terletak di luar. Kanula

dimasukkan ke ujung oral dari usus yang belum terikat.

Gambar 1. Bagan alat untuk percobaan absorpsi in vitro hasil modifikasi alat

Crane dan Wilson.

1 = tabung gelas. 2 = kanula yang dibuat dari gelas. 3 = pipa gelas untuk

oksigen. 4 = pipa gelas untuk keluarnya gas. 5 = tutup karet. 6 = usus halus tikus

yang dibalik. 7 = cairan mukosa. 8 = cairan serosal.

Keun tungan da r i metode ini adalah:

•Merupakan metode sedrehana dan reprodusibel

•Dapat membedakan proses absorpsi secara aktif dan pasif 

•Dapa t d i l akukan un tuk menge t ahu i dae r ah pada u sus ha lu s

dengan abso rps i optimal terutam dalam kasus transport aktif 

Selama jalannya percobaan bagian usus tersebut tidak boleh

bergesekan dengan benda lain seperti pinset atau dipengang dengan

tangan karena apabila usus tersentuh, akan merusak  villi usus yang berada

diluar terbut sehingga akan mempengaruhi proses absorpsi dan hasil yang didapat

akan tidak valid.

Usus diukur denga panjang efektif 7 cm yang sebelumnya diisi dengan cairan

serosal 1,4 ml yang terdiri dari larutan natrium klorida 0,9% b/v yang merupakan

larutan fisiologis. Fungsi dari penambahan larutan fisologis tersebut dimaksudkan

untuk mengkondisikan usus supaya sama dengan cairan fisiologis

tubuh. Kantong usus yang sudah diisi cairan serosal ini dimasukkan ke dalam

tabung yang sudah diisi cairan mucosal 75 ml (yang mengandung bahan obat)

pada suhu 37oC agar kondisinya sama dengan suhu tubuh. Suhu ini harus

dikendalikan dan variasi suhu harus dihindari sebab adanya variasi

suhu padakebanyakan obat dapat mempengaruhi laju kelarutan karena kenaikan

suhu dapat meningkatkan energi kinrtik molekul dan meningkatkan

kecepatan difusi. Kantong usus untuk kontrol dilakukan dengan cara yang

sama, tetapi dengan menggunakan cairan mucosal tanpa obat.

Selama percobaan berlangsung, seluruh bagian usus dijaga agar dapat

terendam dalam cairan mucosal dan selalu dialiri gas oksigen dengan kecepatan

kira-kira 100 gelembung per menit untuk menjaga aktifitas sel dan untuk menjaga

agar sel-sel usus tetap hidup..

Pada waktu tertentu kadar obat dalam cairan serosal ditentukan. Untuk

penentuan ini seluruh cairan serosal diambil melalui kanula dan segera dicuci

dengan larutan 0,9% b/v natrium klorida sebagai pembilas, kemudian diisi lagi

dengan 1,4 ml larutan 0,9 % b/v natrium klorida.

Cara Analisis:

Diambil 1 ml sampel kemudian ditambah dengan 2 ml larutan seng sulfat 5 %

dan 2 ml barium hidroksida 0,3 N maka akan terjadi endapan berwarna putih

yang merupakan protein. Adanya protein dalam sampel perlu

d i h i l a n g k a n k a r e n a p r o t e i n m e m i l i k i k r o m o f o r y a n g

d a p a t m e n y e r a p s i n a r U V s e h i n g g a dikhawatirkan akan

mempengaruhi nilai absorbansi yang diperoleh . Larutan dikocok dan

dipusingkan selama 5 menit untuk menyempurnakan pemisahan. Ambil bagian

yang jernih kemudian dibaca pada panjang gelombang maksimum.

Catatan : cairan mucosal terdiri dari : 0,01 M asetosal dalam cairan lambung

buatan tanpa pepsin (pH 1,2) dan dalam cairan usus buatan tanpa pankreatin (pH

7,5). Cairan serosal terdiri dari 1,4 ml larutan 0,9% b/v natrium klorida.

Evaluasi data :

a. Dibuat grafik hubungan antara jumlah dan kadar obat yang ditranspor

sebagai fungsi waktu

b. Dihitung Pm (permeabilitas) dan lag time

c. Dihitung Ka (tetapan kecepatan absorpsi)

d. Bandingkan parameter di atas pada pH 1,2 dan pH 7,5