Upload
duongkiet
View
238
Download
2
Embed Size (px)
Citation preview
VALIDASI PENETAPAN KADAR CAMPURAN PARASETAMOL,
PROPIFENAZON, DAN KAFEIN DENGAN METODE KROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Adrian Rendy Irmanto
NIM : 058114010
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2008
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
VALIDASI PENETAPAN KADAR CAMPURAN PARASETAMOL,
PROPIFENAZON, DAN KAFEIN DENGAN METODE KROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Adrian Rendy Irmanto
NIM : 058114010
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2008
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
Halaman Persembahan You still are blind if you see a winding road Because there is always a straight way to the point you see
Don’t try to looked so wise Don’t cry ‘cause you’re so right Don’t try with fakes or fears Because you will hate yourself in the end
(Akeboshi)
Kupersembahkan karyaku ini untuk :
Tuhan Yang Maha Kuasa
Papa dan Mamaku tercinta
Adik – adikku
Sahabat – sahabatku
Almamaterku
Serta mereka yang mengasihiku
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah menyertai dan
melimpahkan kasih karunia-Nya kepada penulis, sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi yang berjudul VALIDASI PENETAPAN KADAR
CAMPURAN PARASETAMOL, PROPIFENAZON, DAN KAFEIN
DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE
TERBALIK, sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi
(S.Farm) pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Keberhasilan penulis dalam menyusun skripsi ini tidak bisa lepas dari bantuan dan
dukungan dari banyak pihak, baik berupa material, moral, maupun spiritual.
Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Ibu Rita Suhadi,M.Si.,Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma.
2. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt, selaku dosen pembimbing dan dosen
penguji. Terima kasih atas segala bimbingan, masukan, waktu, kesabaran
dan perhatiannya yang besar selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.
3. Ibu Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. dan Bapak Jeffry Julianus, M.Si. selaku
dosen penguji atas segala masukan berupa kritik dan saran demi
kesempurnaan skripsi ini.
4. Papa, Mama, Vania, Nana, dan Juan atas doa dan dukungannya.
5. Mas Thomas Arian Adrianto, S.Farm. atas bantuan, masukan, dan
diskusinya yang sangat membantu.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
6. Mas Bimo, Mas Kunto, Mas Parlan, Mas Wagiran, serta Mas Ottok atas
bantuan dan dukungan selama pelaksanaan penelitian ini
7. My best partner Happy yang sekuat tenaga membantu penelitian ini dari
awal sampai selesai.
8. Sahabat – sahabatku yang terbaik, Dewi ”Sutok”, Mia, Aster, Tyas `Ndut,
dan Widdy terima kasih atas doa dan dukungannya.
9. Rio atas pinjaman scannernya yang sangat membantu penyusunan skripsi
ini.
10. Teman-teman angkatan 2005, terutama kelas FST; Yoyok, Fian, Feli, Lina
Chang, Ong, Totok, Made, Berto, dan Reni, terima kasih atas kebersamaan
selama ini serta doa dan dukungannya.
11. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah
banyak membantu.
Semoga Tuhan melimpahkan berkat dan rahmatNya atas segala kebaikan dan
ketulusan yang telah diberikan.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran demi penyempurnaan skripsi
ini. Akhirnya besar harapan penulis semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi
perkembangan ilmu pengetahuan dan bermanfaat bagi orang banyak.
Yogyakarta, Desember 2008
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan
dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah
Yogyakarta, Desember 2008
Adrian Rendy Irmanto
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama : Adrian Rendy Irmanto
Nomor Mahasiswa : 058114010
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
VALIDASI PENETAPAN KADAR CAMPURAN PARASETAMOL,
PROPIFENAZON, DAN KAFEIN DENGAN METODE KROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata
Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain,
mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan
mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis
tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya
selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal 16 Februari 2009
Yang menyatakan
(Adrian Rendy Irmanto)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
INTISARI
Salah satu kombinasi zat aktif yang umum digunakan dalam obat
analgesik – antipiretik adalah parasetamol, propifenazon, dan kafein yang
memiliki kelarutan dalam etanol yang hampir sama dan serapan maksimum pada
daerah UV yang berdekatan. Metode yang dapat digunakan untuk memisahkan
sekaligus menetapkan kadar ketiga komponen tersebut yaitu metode KCKT fase
terbalik dengan detektor UV.
Kondisi KCKT fase terbalik yang optimal untuk menetapkan kadar ketiga
komponen tersebut yaitu kolom DuPont Instruments Zorbax ODS 4,6mm x 25cm;
fase gerak metanol : aquabidest (40 : 60) pada flow rate 2 ml/menit serta detektor
UV pada panjang gelombang 272 nm. Parameter validitas yang diuji meliputi
akurasi, presisi, spesifisitas, linearitas, dan range.
Akurasi ditunjukkan oleh nilai rentang recovery sebesar 95,741 – 98,759%
untuk parasetamol; 97,760 – 101,220% untuk propifenazon; dan 105,556 –
109,397% untuk kafein. Presisi ditunjukkan oleh nilai CV sebesar 0,978% untuk
parasetamol; 1,132% untuk propifenazon; dan 1,128% untuk kafein. Spesifisitas
ditunjukkan oleh profil pemisahan ketiga analit dalam campuran. Linearitas
ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,9999 untuk parasetamol;
0,9991 untuk propifenazon; dan 0,9991 untuk kafein. Range untuk parasetamol
antara 239,3998 – 246,6509 ppm; untuk propifenazon antara 148,3515 – 151,6788
ppm; dan untuk kafein antara 50,0863 – 83,9953 ppm.
Kata kunci : parasetamol, propifenazon, kafein, KCKT, validitas
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
ABSTRACT
One of active ingredients combination commonly used in analgesic–
antipiretic drug is paracetamol, propyphenazone, and caffeine which are have
almost similar solubility in ethanol and maximum absorbance at nearly UV range.
The method which can be used to separate and quantify those three active
ingredients is Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography with
UV detector.
The optimum condition of RP-HPLC for quantifying those three active
ingredients were DuPont Instruments Zorbax ODS 4,6mm x 25cm column;
methanol : aquabidest (40 : 60) mobile phase at 2 ml/minute flow rate and UV
detector at the wavelength of 272 nm. Validity parameters which were tested
including accuracy, precision, specificity, linearity, and range.
Accuracy was proved by recovery range of 95.741 – 98.759% for
paracetamol, 97.760 – 101.220% for propyphenazone, and 105.556 – 109.397% for
caffeine. Precision was proved by CV of 0.978% for paracetamol; 1.132% for
propyphenazone; and 1.128% for caffeine. Specificity was showed by separation
profile of those three analytes in mixture. Linearity was proved by correlation
coefficient (r) of 0.9999 for paracetamol; 0.9991 for propyphenazone; and 0.9991
for caffeine. Range for paracetamol were between 239.3998 – 246.6509 ppm; for
propyphenazone were between 148.3515 – 151.6788 ppm; and for caffeine were
between 50.0863 – 83.9953 ppm.
Keywords : paracetamol, propyphenazone, caffeine, HPLC, validity.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL .............................................................................. . i
HALAMAN JUDUL .................................................................................. ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN .................................................................... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. v
PRAKATA .................................................................................................. vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................... viii
INTISARI ................................................................................................... ix
ABSTRACT ................................................................................................. x
DAFTAR ISI ............................................................................................... xi
DAFTAR TABEL ....................................................................................... xv
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xvii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xx
BAB I. PENGANTAR ............................................................................... 1
A. Latar Belakang ………………………………………………………... 1
1. Permasalahan.................................................................................... 2
2. Keaslian penelitian ........................................................................... 3
3. Manfaat penelitian ............................................................................ 4
B. Tujuan Penelitian ................................................................................... 4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ........................................................ 5
A. Parasetamol............................................................................................ 5
B. Propifenazon ........................................................................................... 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
C. Kafein ..................................................................................................... 6
D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.......................................................... 7
1. Peralatan KCKT............................................................................... 7
2. Pembagian Jenis Kromatografi........................................................ 12
3. Kromatografi Partisi Fase Balik....................................................... 14
4. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif................................................... 16
E. Spektrofotemetri Ultraviolet................................................................... 24
F. Kesahihan Metode Analisis Instrumental................................................ 25
1. Akurasi............................................................................................. 26
2. Presisi............................................................................................... 26
3. Limit of Detection............................................................................. 27
4. Limit of Quantitation........................................................................ 27
5. Linieritas........................................................................................... 28
6. Spesifisitas........................................................................................ 28
7. Range………………………………………………………………………. 28
G. Kesalahan Metode Analisis Instrumental……………….…………...... 30
1. Kesalahan Sistematik........................................................................ 30
2. Kesalahan Tidak Sistematik.............................................................. 31
H. Keterangan Empiris …............................................................................. 31
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .................................................. 33
A. Jenis Rancangan Penelitian .................................................................... 33
B. Variabel Penelitian ................................................................................. 33
1. Variabel Utama.................................................................................. 33
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
2. Variabel Pengacau Terkendali............................................................ 34
C. Definisi Operasional................................................................................ 34
D. Bahan Penelitian..................................................................................... 34
E. Alat Penelitian ....................................................................................... 35
F. Tata Cara Penelitian ............................................................................... 36
1. Pembuatan Larutan Baku Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein... 36
2. Pembuatan Fase Gerak..................................................................... 37
3. Pengamatan Panjang Gelombang Pengamatan antara Parasetamol,
Propifenazon, dan Kafein dengan Spektrofotometer UV..................... 38
4. Pengamatan Waktu Retensi Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein... 38
5. Optimasi Pemisahan Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein dengan
KCKT.................................................................................................... 39
6. Validasi Metode Analisis................................................................ 39
F. Analisis Hasil........................................................................................ 40
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 42
A. Penyiapan Fase Gerak............................................................................ 42
B. Pembuatan Larutan Baku....................................................................... 43
C. Optimasi Metode KCKT......................................................................... 44
1. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Dengan
Spektofotometri UV........................................................................ 44
2. Pengamatan Waktu Retensi Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein
dan Optimasi Pemisahan Parasetamol, Propifenazon, dan
Kafein.............................................................................................. 46
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
D. Penetapan Kadar Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein dalam Sampel
Simulasi..................................................................................................... 60
1. Pembuatan Kurva Baku.................................................................. 60
2. Penetapan Kadar Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein dalam
Campuran Sampel Simulasi dan Validasi Metode.......................... 63
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .................................................... 71
A. Kesimpulan ............................................................................................ 71
B. Saran ....................................................................................................... 72
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 73
LAMPIRAN ................................................................................................ 76
BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 109
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Nilai indeks polaritas pelarut.................................................. 11
Tabel II. Parameter analitik.......................…………………………… 29
Tabel III. Pengamatan waktu retensi parasetamol, propifenazon, dan
kafein pada berbagai perbandingan fase gerak dan flow rate
tertentu............................................................................ 47
Tabel IV. Data kurva baku parasetamol………………......................... 60
Tabel V. Data kurva baku propifenazon………………....................... 61
Tabel VI. Data kurva baku kafein………….......................................... 62
Tabel VII. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sampel simulasi
kadar rendah………………................................................... 64
Tabel VIII. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi
kadar rendah ……………….................................................. 64
Tabel IX. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel simulasi kadar
rendah........………………..................................................... 64
Tabel X. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sampel simulasi
kadar sedang........………………........................................... 66
Tabel XI. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi
kadar sedang........………………........................................... 66
Tabel XII. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel simulasi kadar
sedang........……………….................................................... 67
Tabel XIII. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sampel simulasi
kadar tinggi........………………........................................... 68
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
Tabel XIV. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi
kadar tinggi........………………........................................... 68
Tabel XV. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel simulasi kadar
tinggi........………………...................................................... 68
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Rumus struktur parasetamol................................................... 5
Gambar 2. Rumus struktur propifenazon................................................... 6
Gambar 3. Rumus struktur kafein............................................................ 6
Gambar 4. Skema peralatan KCKT......................................................... 7
Gambar 5. Skema pemilihan kolom......................................................... 10
Gambar 6. Pemilihan jenis KCKT............................................................ 13
Gambar 7. Reaksi antara gugus silanol dan gugus klorosilan.................. 15
Gambar 8. Reaksi pembuatan kolom oktadesilsilan................................. 15
Gambar 9. Resolusi antara dua peak yang berdekatan............................. 17
Gambar 10. Difusi Eddy............................................................................ 20
Gambar 11. Transfer massa fase diam dan fase gerak................................ 21
Gambar 12. Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam................... 22
Gambar 13. Pengukuran peak asymmetry factor dan peak tailing factor..... 23
Gambar14. Spektra panjang gelombang maksimum parasetamol,
propifenazon, dan kafein........................................................ 44
Gambar 15. Gugus non polar pada parasetamol, propifenazon, dan kafein 48
Gambar 16. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan
kafein dengan fase gerak metanol : aquabidest (70 : 30) flow
rate 0,5 ml/menit............................................................ 49
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
Gambar 17. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan
kafein dengan fase gerak metanol : aquabidest (60 : 40) flow
rate 0,5 ml/menit............................................................ 50
Gambar 18. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan
kafein dengan fase gerak metanol : aquabidest (50 : 50) flow
rate 0,5 ml/menit ……………………………………... 51
Gambar 19. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan
kafein dengan fase gerak metanol : aquabidest (50 : 50) flow
rate 1,0 ml/menit............................................................ 52
Gambar 20. Penggaraman kafein oleh asam asetat glasial ……………... 53
Gambar 21. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan
kafein dengan fase gerak metanol : aquabidest : asam asetat
glasial (70 : 28,5 : 1,5) flow rate 0,5 ml/menit ……………. 53
Gambar 22. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan
kafein dengan fase gerak metanol : aquabidest : asam asetat
glasial (60 : 37 : 3) flow rate 0,5 ml/menit ………………... 54
Gambar 23. Penggaraman propifenazon oleh asam asetat glasial ……… 55
Gambar 24. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan
kafein dengan fase gerak metanol : aquabidest : asam asetat
glasial (50 : 49 : 1) flow rate 0,5 ml/menit ………………... 56
Gambar 25. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan
kafein dengan fase gerak metanol : aquabidest (40 : 60) flow
rate 1,0 ml/menit ........................................................... 57
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xix
Gambar 26. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan
kafein dengan fase gerak metanol : aquabidest (40 : 60) flow
rate 1,5 ml/menit ……………………………………... 58
Gambar 27. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan
kafein dengan fase gerak metanol : aquabidest (40 : 60) flow
rate 2,0 ml/menit ……………………………………... 59
Gambar 28. Kurva baku parasetamol……………………………...……… 61
Gambar 29. Kurva baku propifenazon…………………………...………... 61
Gambar 30. Kurva baku kafein……..……………………………...……… 62
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xx
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Sertifikat analisis parasetamol............................................. 76
Lampiran 2. Sertifikat analisis propifenazon............................................ 77
Lampiran 3. Sertifikat analisis kafein....................................................... 79
Lampiran 4. Skema pembuatan larutan baku parasetamol dan contoh
perhitungan kadar larutan baku yang digunakan ............... 80
Lampiran 5. Skema pembuatan larutan baku propifenazon dan contoh
perhitungan kadar larutan baku yang digunakan ............... 81
Lampiran 6. Skema pembuatan larutan baku kafein dan contoh
perhitungan kadar larutan baku yang digunakan ............... 82
Lampiran 7. Kromatogram larutan kurva baku parasetamol…….......... 83
Lampiran 8. Kromatogram larutan kurva baku propifenazon................... 87
Lampiran 9. Kromatogram larutan kurva baku kafein............................ 91
lampiran 10. Skema pembuatan sampel simulasi dan contoh perhitungan
kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam sampel
simulasi.................................................................................. 95
Lampiran 11. Kromatogram sampel...............................................…….. 103
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Dewasa ini, obat seolah – olah sudah menjadi suatu kebutuhan penting
dalam hidup sehari – hari. Hal ini didukung oleh kecenderungan masyarakat untuk
melakukan self medication terutama untuk penyakit pada tingkat keparahan yang
tidak serius (Azizahwati, 2000). Salah satu penyakit yang sering menjadi objek
self medication oleh masyarakat adalah influenza, yang umumnya diobati dengan
obat analgesik – antipiretik.
Salah satu kombinasi zat aktif dalam obat analgesik – antipiretik yang
umum digunakan adalah kombinasi parasetamol, propifenazon, dan kafein.
Kombinasi ini berfungsi untuk mengoptimalkan efek terapi obat serta
meminimalisasi efek merugikan (adverse effect) yang mungkin terjadi bila zat
aktif tersebut dipejankan dalam bentuk tunggal dengan dosis besar untuk
mencapai intensitas efek terapi yang diinginkan (Raffa, 2006).
Kini, banyak obat analgesik – antipiretik yang berupa kombinasi
parasetamol, propifenazon, dan kafein diproduksi dalam berbagai merek dagang,
di antaranya Bodrex migra, Paramex, dan Saridon yang berbentuk tablet.
Banyaknya produksi obat – obat ini perlu diimbangi dengan peningkatan
pengawasan mutu, agar obat yang beredar tersebut dapat dijamin keamanan dan
khasiatnya. Belum adanya suatu metode yang sederhana, cepat, dan tepat yang
dapat dijadikan acuan untuk menetapkan kadar ketiga komponen tersebut secara
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
simultan, mendasari perlunya dilakukan suatu penelitian untuk mendapatkan
kondisi yang optimal untuk menetapkan kadar ketiga komponen tersebut secara
simultan.
Metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dipilih karena dengan
metode ini dapat dilakukan pemisahan zat aktif parasetamol, propifenazon, dan
kafein sekaligus penetapan kadar tiap zat aktif tersebut dalam campuran. Ketiga
komponen zat aktif tersebut memiliki sifat fisika – kimia yang mirip, antara lain
kelarutan dalam etanol yang hampir sama dan serapan maksimum pada daerah
UV yang berdekatan (Clarke, 1986).
Hasil yang diperoleh dari optimasi yang dilakukan merupakan suatu
metode analisa yang baru sehingga perlu dilakukan validasi agar metode ini
memiliki hasil yang dapat dipertanggungjawabkan. Dalam USP 28, parameter
yang diuji pada validasi metode meliputi akurasi, presisi, spesifisitas, linieritas,
dan range (Anonim, 2005). Melalui penelitian ini, diharapkan dapat diperoleh
informasi mengenai metode analisis multikomponen dari campuran parasetamol,
propifenazon, dan kafein menggunakan kondisi KCKT yang teruji validitasnya.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dapat disusun permasalahan
sebagai berikut :
a. Bagaimanakah kondisi yang optimal untuk memisahkan dan menetapkan kadar
parasetamol, propifenazon, dan kafein secara simultan dengan metode KCKT
fase terbalik menggunakan kolom C18?
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
b. Apakah metode KCKT fase terbalik yang digunakan untuk penetapan kadar
parasetamol, propifenazon, dan kafein secara simultan memiliki akurasi,
presisi, spesifisitas, linieritas, dan range yang baik?
2. Keaslian Penelitian
Analisis multikomponen dari campuran parasetamol, propifenazon, dan
kafein dalam tablet sediaan obat pernah dilakukan oleh Dimitrovska, Trajkovic-
Jolevska, Nancovska, dan Ilievska (1995) dengan metode KLT dan spektrofometri
UV. Penelitian lain yang pernah dilakukan adalah Program Komputer Analisis
Multikomponen Untuk Obat Flu dan Analgesik – Antiinflamasi (Yanuar, Hayun,
Suryadi, Henry, dan Wulandari, 2003) yang menggabungkan teknik
spektrofotometri UV dan matriks matematika, serta Optimasi Penetapan Kadar
Obat Analgesik Multikomponen dengan Metode KCKT Fase Balik (Ivanovic,
Medenica, Malenovic, Jancic, dan Misljenovic, 2003) yang menggunakan fase
gerak metanol : aquabidest pada berbagai rasio berkisar dari (30 : 70 v/v) hingga
(65 : 35 v/v) pada detektor UV 265 nm dan kolom Beckman Ultrasphere ODS
4,6 mm x 150 mm dengan ukuran partikel 5 µm. Namun tidak diketahui kondisi
yang optimal untuk penelitian tersebut karena tidak dipublikasikan secara bebas.
Metode KCKT banyak digunakan untuk menganalisis sediaan obat
multikomponen. Namun validasi penetapan kadar campuran parasetamol,
propifenazon, dan kafein dengan metode KCKT dengan fase gerak, flow rate, dan
kolom DuPont Instruments Zorbax ODS 4,6 mm x 25 cm P.N 880952-702 yang
digunakan pada penelitian ini belum pernah dilakukan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat metodologis
Manfaat metodologis dari penelitian ini adalah dapat memberikan sumbangan
ilmiah mengenai metode penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan
kafein secara simultan yang teruji validitasnya.
b. Manfaat praktis
Manfaat praktis dari penelitian ini adalah dapat digunakan sebagai metode
untuk analisis multikomponen dari campuran parasetamol, propifenazon, dan
kafein.
B. Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang ada, maka dapat
disusun tujuan penelitian ini, yaitu :
1. Mengetahui kondisi yang optimal untuk memisahkan dan menetapkan kadar
parasetamol, propifenazon, dan kafein secara simultan dengan metode KCKT
fase terbalik menggunakan kolom C18.
2. Mengetahui akurasi, presisi, spesifisitas, linieritas, dan range metode KCKT
fase terbalik yang digunakan untuk penetapan kadar parasetamol,
propifenazon, dan kafein secara simultan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Parasetamol
Parasetamol mempunyai sinonim asetaminofen dan p-asetamidifenol,
dengan rumus molekul C8H9NO2 dan berat molekul 151,6 (Anonim,1995).
O
NH
OH
Gambar 1. Rumus struktur parasetamol (Anonim,1995)
Menurut Clarke (1986) 1 gram parasetamol larut dalam 70 ml air, 20 ml
air mendidih, 7 ml etanol, dan 50 ml kloroform. Parasetamol larut dalam
dimetilforfamid, metanol, etilendiklorida, aseton, etil asetat, dan natrium
hidroksida 1 N. Parasetamol tidak larut dalam eter, petroleum eter, pentana, dan
benzen (Anonim, 1995). Parasetamol memberikan serapan maksimum dalam
etanol pada panjang gelombang 250 nm dengan nilai A%1
1cm sebesar 913.
Parasetamol memberikan serapan maksimum dalam metanol pada panjang
gelombang 250 nm dengan nilai A%1
1cm sebesar 900 (Autherhoff,1987).
B. Propifenazon
Propifenazon mempunyai sinonim 4-isopropilantipirin, isopropilfenazon,
Baukal, dan Causyth, dengan rumus molekul C14H18N2O dan berat molekul
230,30 (Anonim,1989).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
O
N
N
Gambar 2. Rumus struktur propifenazon (Anonim,1989)
Propifenazon berbentuk kristal dengan rasa agak pahit. Titik didih
propifenazon pada 1030C. Propifenazon mudah larut dalam alkohol dan eter.
Kelarutan propifenazon dalam air sebesar 0,24 g / 100 ml pada 16,50C (Anonim,
1989). Propifenazon memberikan serapan maksimum dalam etanol pada panjang
gelombang 248 nm dengan nilai A%1
1cm sebesar 483; dan pada panjang gelombang
277 nm dengan nilai A%1
1cm sebesar 493 (Clarke, 1986).
C. Kafein
Kafein mempunyai sinonim 1,3,7-trimetilxantin atau 1,3,7-trimetil-2,6-
dioksopurin, dengan rumus molekul C8H10N4O2. Pemeriannya berupa serbuk
putih atau bentuk jarum mengkilat, biasanya menggumpal, tidak berbau, dan
berasa pahit (Anonim,1995).
O N
N
N
N
O
Gambar 3. Rumus struktur kafein (Anonim,1995)
Menurut Clarke (1986) 1 gram kafein larut dalam 60 ml air, 75 ml etanol,
50 ml aseton, 900 ml eter, dan 8 ml kloroform. Kafein agak sukar larut dalam air
dan dalam etanol, mudah larut dalam kloroform dan sukar larut dalam eter
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
(Anonim, 1995). Kafein memberikan serapan maksimum dalam HCl 0,1 N pada
panjang gelombang 272 nm dengan nilai A%1
1cm sebesar 470. Kafein memberikan
serapan maksimum dalam etanol pada panjang gelombang 273 nm dengan nilai
A%1
1cm sebesar 519 (Clarke, 1986).
D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1. Peralatan KCKT
KCKT merupakan kondisi kromatografi yang fase geraknya dialirkan
menuju kolom secara cepat dengan bantuan tekanan dari pompa dan hasilnya
dapat dideteksi dengan detektor (Hendayana, 2006). Tujuan dari KCKT adalah
memperoleh hasil pemisahan yang baik dalam waktu relatif singkat (Mulja dan
Suharman, 1995). Peralatan KCKT biasanya terdiri dari beberapa komponen
seperti yang dapat dilihat pada gambar di bawah ini :
Gambar 4. Skema Peralatan KCKT (Kazakevich dan Nair, 1996)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
Menurut Gritter, Bobbit, dan Schwarting (1991), ada tiga variabel utama
pada kondisi KCKT yang harus diperhatikan, yaitu :
a. Detektor
Detektor diperlukan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan yang
terdapat dalam kolom dan untuk mengukur jumlah komponen yang ada dalam
cuplikan (Johnson dan Stevenson, 1978). Beberapa persyaratan detektor
menurut Mulja dan Suharman ialah sensitivitas yang sangat tinggi dengan
rentang sensitivitas 10-8
hingga 10-15
gram solut per detik, kestabilan dan
reprodusibilitas yang sangat baik, memberikan respon yang linier terhadap
konsentrasi solut, dapat bekerja dari temperatur kamar hingga 400 0C, tidak
dipengaruhi perubahan temperatur dan kecepatan pelarut pengembang, mudah
didapat dan mudah dipakai oleh operator, selektif terhadap macam – macam
linarut dalam pelarut pengembang dan tidak merusak sampel. Detektor untuk
KCKT dibagi dalam dua kategori, yaitu :
1) Bulk Property Detector
Detektor ini merupakan jenis detektor yang mengukur sifat solut dan fase
gerak. Contohnya adalah detektor indeks bias. Detektor indeks bias adalah
suatu jenis detektor universal yang menangkap sinyal pada setiap solut yang
memiliki indeks bias berbeda dengan indeks bias fase gerak. Kelemahannya
adalah indeks bias sangat dipengaruhi oleh suhu. Selain itu, detektor indeks
bias juga kurang sensitif dan tidak cocok untuk kondisi elusi landaian
(Munson, 1991).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
2) Solute Property Detector
Detektor ini merupakan detektor yang selektif mengukur sifat solut.
Detektor ini lebih sensitif dibanding bulk property detector. Contohnya :
detektor UV-Vis dan detektor fluoresensi. Detektor pada KCKT yang sering
digunakan dalam analisis farmasi ialah detektor UV-Vis. Hal ini disebabkan
kebanyakan senyawa obat memiliki struktur yang dapat menyerap sinar
UV-Vis. Detektor UV digunakan untuk mendeteksi senyawa – senyawa
yang memiliki gugus kromofor dengan atau tanpa adanya gugus auksokrom,
sedangkan detektor visibel digunakan untul mendeteksi senyawa berwarna
yaitu senyawa yang memiliki gugus kromofor yang sangat panjang maupun
merupakan senyawa kompleks (Settle, 1997).
b. Kolom
Kolom pada kondisi KCKT merupakan bagian yang sangat penting karena
pemisahan komponen – komponen sampel akan terjadi di dalam kolom.
Keberhasilan pemisahan komponen – komponen sampel akan sangat
bergantung pada keadaan kolom (Mulja dan Suharman, 1995). Pemilihan
kolom yang tepat sangat menentukan keberhasilan pemisahan. Berikut ini
merupakan ikhtisar dalam pemilihan kolom untuk kondisi KCKT :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Gambar 5. Skema Pemilihan Kolom (Johnson dan Stevenson, 1978)
c. Fase gerak
KCKT dapat dikembangkan dengan pelarut tunggal, campuran pelarut atau
lebih sering dengan campuran pelarut yang terus – menerus berubah
susunannya, biasanya terdiri dari dua atau tiga pelarut dan disebut elusi gradien
(Gritter dkk, 1991). Pada KCKT, fase gerak harus mempunyai sifat : murni dan
tanpa cemaran, tidak bereaksi dengan kemasan, sesuai dengan detektor, dapat
melarutkan sampel, viskositas rendah, memungkinkan memperoleh kembali
sampel dengan mudah (jika diperlukan), dan harganya wajar (Johnson dan
Stevenson, 1978). Pada pemilihan fase gerak yang terpenting adalah kepolaran
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
campuran pelarut yang digunakan yang bersifat linier dengan kepolaran pelarut
murninya. Nilai kepolaran antara dua campuran sembarang pelarut dapat
dihitung dengan persamaan di bawah ini :
P’ = Φa P’a + Φb P’b
dengan Φa dan Φb adalah fraksi volume pelarut a dan b dalam campuran,
sedangkan P’a dan P’b adalah angka P’ pelarut murni (Gritter dkk, 1991).
Berikut adalah beberapa nilai indeks polaritas dari beberapa pelarut yang sering
digunakan :
Tabel 1. Nilai indeks polaritas pelarut
Pelarut Indeks
polaritas
Nilai Eluotropik UV Cut-off (nm)
Alumina C18 Silika
Heksana 0,1 0,01 - 0,00 195
Sikloheksana 0,2 0,04 - - 200
Toluena 2,4 0,29 - 0,22 284
Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212
Etil asetat 4,4 0,58 - 0,48 256
Aseton 5,1 0,56 8,8 0,53 330
Metanol 5,1 0,95 1,0 0,7 205
Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190
Dimetilformamid 6,4 - 7,6 - 268
Dimetilsulfoksida 7,2 0,62 - - 268
Air 10,2 - - - 190
(Snyder, Kirkland, dan Glajch,1997)
Tabel di atas menunjukkan bahwa semakin besar eluotropic values dari pelarut
menunjukkan semakin mudah untuk mengelusi sampel. Semakin besar indeks
polaritas yang dimiliki oleh pelarut maka semakin bersifat polar pelarut yang
digunakan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
2. Pembagian jenis kromatografi
Menurut Harris (1999), KCKT dibagi menjadi 5 jenis, yaitu :
a. Kromatografi partisi
Pada kromatografi partisi, fase diam dapat polar atau non polar. Bila fase diam
polar dan fase gerak non polar disebut kromatografi partisi fase normal,
sedangkan bila fase diam non polar dan fase gerak polar dinamakan
kromatografi partisi fase terbalik. Solut berkeseimbangan di antara fase diam
dan fase gerak.
b. Kromatografi adsorpsi
Kromatografi ini menggunakan fase diam padat dan fase gerak cair atau gas.
Solut dapat diadsorpsi pada permukaan partikel padat.
c. Kromatografi pertukaran ion
Anion atau kation diikatkan secara kovalen pada fase diam padat, biasanya
disebut resin. Ion – ion solut muatan berlawanan menyerang fase diam dengan
kekuatan elektrostatik dan fase geraknya berupa zat cair.
d. Kromatografi eksklusi
Pada kromatografi ini tidak ada interaksi tarik – menarik antara fase diam dan
solut. Fase gerak cair atau gas melalui gel berpori. Ukuran pori cukup kecil
untuk mengeluarkan solut yang besar. Molekul solut yang kecil akan masuk ke
dalam pori gel, sedangkan molekul yang besar akan mengalir tanpa memasuki
pori gel.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
e. Kromatografi afinitas
Digunakan untuk interaksi yang spesifik antara suatu jenis molekul solut dan
sebuah molekul yang lain yang secara kovalen terikat pada fase diam. Misalnya
untuk pemisahan komponen protein.
Pemilihan jenis KCKT yang tepat dan sesuai dengan sampel yang
dipisahkan akan menghasilkan pemisahan yang baik. Gambar berikut merupakan
bagan pendekatan umum dalam memilih jenis KCKT :
Gambar 6. Pemilihan jenis KCKT (Johnson dan Stevenson, 1978)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
3. Kromatografi partisi fase balik
Istilah fase normal dan fase terbalik digunakan dalam kromatografi partisi
untuk menggambarkan polaritas efektif antara fase diam dan fase gerak (Settle,
1997). Kromatografi dengan fase diam polar dan fase gerak kurang polar atau non
polar disebut kromatografi fase normal. Sebaliknya, kromatografi yang
menggunakan fase diam relatif non polar seperti hidrokarbon dan fase gerak polar
seperti air atau metanol disebut kromatografi fase terbalik (Gritter dkk, 1991).
Menurut Gritter dkk. (1991), konsep pada pengembangan kromatografi
cair partisi yaitu perlakuan sampel dalam kondisi cair – cair tergantung pada
kelarutannya di dalam kedua cairan yang terlibat. Jika solut ditambahkan ke
dalam kondisi yang terdiri atas dua pelarut yang tidak bercampur dan keseluruhan
kondisi dibiarkan seimbang, solut akan tersebar antara kedua fase itu menurut
persamaan :
CmCsK
K adalah koefisien distribusi, Cs adalah konsentrasi solut dalam fase diam dan
Cm adalah konsentrasi solut dalam fase gerak (Skoog, West, dan Holler,1994).
Hal – hal yang harus diperhatikan dalam pemilihan metode kromatografi
partisi fase balik adalah :
a. Kolom
Kolom yang digunakan pada jenis kromatografi ini ialah kemasan fase terikat.
Penyanga pada kemasan fase terikat terbuat dari silika (Gritter dkk, 1991).
Kemasan fase terikat bersifat stabil karena fase diamnya terikat secara kimia
pada penyangga, sehingga tidak mudah terbawa oleh fase gerak. Kemasan fase
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
terikat mempunyai tipe ikatan siloksan (Si-O-Si-C), dibuat dari reaksi antara
gugus klorosilan dengan gugus silanol yang terdapat pada permukaan silika
gel, seperti pada gambar berikut :
Si OH ClSi(CH3)2R Si O Si(CH3)2R+ + HCl
Gambar 7. Reaksi antara gugus silanol dan gugus klorosilan
Tertambatnya sampel pada fase diam dipengaruhi oleh panjang pendeknya
rantai karbon. Kelebihan kolom dengan rantai karbon yang lebih panjang
adalah sifatnya yang lebih retensif, sehingga sampel yang mempunyai sifat
mirip dengan kolom akan tertambat lebih lama (Skoog dkk, 1994). Menurut
Willard, Merritt, Dean, dan Settle (1988), kolom oktadesilsilan digunakan pada
aplikasi yang membutuhkan retensi yang maksimal, sehingga pemisahan
komponen sampel dapat lebih optimal. Oktadesilsilan dapat dibuat dari reaksi
berikut :
Si OH (CH2)17CH3SiCl Si O Si (CH2)17CH3+ + HCl
Gambar 8. Reaksi pembuatan kolom oktadesilsilan (Gritter dkk, 1991)
Fase diam yang biasa digunakan pada kromatografi partisi fase balik adalah
oktadesilsilan (ODS). Selain ODS, dikenal pula silika dengan substitusi oktil
(C8) (Munson, 1991). Interaksi antara senyawa dengan sisa silanol dapat
mengganggu penggunaan kolom fase terbalik. Akibatnya waktu retensi dari
senyawa standar menjadi lebih sulit untuk ditafsirkan. Dalam beberapa kasus,
interaksi menyebabkan tailing terutama pada pertukaran ion. Lamanya suatu
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
senyawa ditahan akan tergantung pada lipofilisitas dalam kasus kolom fase
terbalik seperti ODS silika gel. Fase gerak yang lebih hidrofil akan lebih cepat
mengelusi suatu senyawa dari kolom fase terbalik (Watson, 1999). Ukuran
kinerja kolom dilihat dari kemampuan kolom untuk memisahkan komponen
senyawa yang akan dianalisis. Batasan yang banyak digunakan adalah sebagai
berikut yaitu jumlah lempeng teoritik (N), dan nilai H atau HETP (Height
Equivalent to a Theoritical Plate) yang merupakan penentu ukuran efisiensi
kolom, faktor resolusi, serta bentuk peak. Kolom yang efisien dapat mencegah
pelebaran peak yang sempit.
b. Fase gerak
Kemampuan KCKT dalam memisahkan banyak senyawa terutama bergantung
pada tambatan sampel dan pemisahan komponen dalam campuran. Pada fase
balik, kandungan utama fase geraknya adalah air. Pelarut yang dapat campur
dengan air seperti metanol, etanol, asetonitril, dan tetrahidrofuran ditambahkan
untuk mengatur kepolaran fase gerak. Menurut Munson (1991), pemodifikasi
fase gerak yang paling banyak digunakan ialah metanol, asetonitril, dan
tetrahidrofuran. Metanol sering digunakan karena merupakan pelarut yang
sangat murni, mudah didapat, dan berhasil baik pada banyak pemisahan
(Johnson dan Stevenson, 1978).
4. Analisis kualitatif dan analisis kuantitatif
Waktu retensi adalah selang waktu yang diperlukan oleh linarut (solut)
mulai saat injeksi hingga keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
dan dinyatakan sebagai tr ( Mulja dan Suharman, 1995). Waktu retensi ini bersifat
sangat khas untuk senyawa tertentu pada kondisi tertentu (kolom, suhu, laju
aliran, dan sebagainya). Beberapa senyawa mungkin mempunyai waktu retensi
berdekatan tetapi tiap senyawa hanya mempunyai satu waktu retensi saja. Waktu
retensi tidak terpengaruh oleh adanya komponen lain (Nair dan Bonelli, 1988).
Di dalam setiap pemisahan yang dipentingkan adalah kemampuan suatu
kondisi untuk memisahkan dua komponen dalam campuran. Kemampuan tersebut
dinamakan resolusi (Rs) yang didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak
dibagi dengan rata – rata lebar dasar puncak, seperti terlihat pada gambar berikut :
Gambar 9. Resolusi antara dua peak yang berdekatan
(Johnson dan Stevenson, 1991)
Berdasarkan definisi di atas, maka persamaan resolusi adalah sebagai
berikut :
) W(W (1/2)
)(t - )(t Rs
2 1
r1r2
……………………………(1)
Resolusi dikatakan baik apabila nilai Rs ≥ 1,5 yang berarti pemisahan
telah mencapai 99,7% (Sastrohamidjojo, 2002). Resolusi juga dipengaruhi oleh
beberapa faktor yang dapat terlihat pada persamaan berikut :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Rs = 4
1 N
1
1'
'
k
k………………………….(2)
a b c
Untuk memperbaiki daya pisah maka faktor – faktor tersebut perlu
dioptimasi. Optimasi efisiensi kolom (a) dilakukan dengan menambah jumlah
lempeng teoritis (N), yaitu dengan memperpanjang kolom (N=L/H) dengan L
adalah panjang kolom yang digunakan, dan N adalah jumlah pelat teoritis dari
suatu kolom sehingga diperoleh puncak yang kecil dan resolusi yang baik.
Optimasi faktor selektivitas (b) dilakukan dengan mengganti pelarut atau
mengubah komposisi pelarut sehingga efisiensi pelarut bertambah dan resolusi
juga meningkat. Optimasi faktor kapasitas (c) dilakukan dengan memvariasi
kekuatan pelarut sehingga fase gerak dapat memberikan harga k’ suatu komponen
sampel menjadi lebih besar atau lebih kecil. Dengan meningkatkan harga k’ maka
akan memperbaiki resolusi (Noegrohati, 1994).
Ada dua teori yang dapat menerangkan tentang efisiensi kolom yaitu :
a. Teori pelat
Teori ini menyatakan bahwa pelat (atau lebih baik disebut HETP) merupakan
tinggi atau panjang dari kolom yang cukup dapat mencapai kesetimbangan
antara solut dalam fase gerak dan fase diam. Semakin banyak pelat yang
dimiliki kolom maka akan memberikan puncak yang lebih sempit atau dapat
dikatakan efisiensi kolom menjadi lebih baik.
HETP = N
L…………………………………(3)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
HETP adalah ketinggian ekivalen terhadap jumlah pelat teoritis, L adalah
panjang kolom yang digunakan, dan N adalah jumlah pelat teoritis dari suatu
kolom (Sastrohamidjojo, 2002). Menurut Mulja dan Suharman (1995), dapat
dikatakan bahwa makin kecil harga L/N atau makin kecil harga HETP maka
makin baik efisiensi kolom yang digunakan. Konsekuensi dari penambahan
lempeng teoritis yaitu semakin lama sampel untuk terelusi yang berakibat
waktu retensi semakin lama (Skoog dkk, 1994). Daya pisah dapat diperbaiki
apabila efisiensi kolom rendah yang dapat diukur secara kuantitatif seperti pada
persamaan berikut :
N =
2Rt
=
2
16W
tR= 5,54
2
1/2 W
tR………………….. (4)
tr adalah waktu retensi zat analit dan W adalah lebar alas peak kromatogram,
sedangkan W1/2 adalah lebar peak pada setengah tinggi peak (Anonim, 1995).
b. Teori laju
Teori ini didasarkan pada parameter – parameter transfer massa antara fase
diam dan fase gerak, laju difusi solut di sepanjang kolom, laju alir fase gerak,
dan dinamika fase gerak. Ada 3 faktor yang sangat menentukan berdasarkan
teori laju ini yaitu :
1) Difusi Eddy
Difusi ini disebabkan karena banyaknya kemungkinan celah dalam partikel
terpacking yang dapat dilewati oleh molekul solut. Dengan demikian
molekul solut ada yang melewati bagian kolom yang dekat dengan dinding
yang merupakan daerah dengan kerapatan packing rendah sehingga molekul
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
tersebut dapat lebih cepat keluar dari kolom. Sedangkan untuk molekul yang
melalui bagian tengah kolom yang merupakan suatu daerah packing lebih
tinggi akan keluar kolom dengan kecepatan yang lebih rendah. Hal ini
menyebabkan elusi untuk tiap solut menjadi kurang efisien (Hendayana,
2006).
Gambar 10. Difusi Eddy
2) Difusi longitudinal
Difusi ini merupakan gerakan molekul solut yang cenderung untuk berdifusi
ke segala arah secara acak karena adanya perbedaan konsentrasi
(Noegrohati, 1994). Semakin lama solut berada dalam kolom maka semakin
besar pula kecenderungan untuk berdifusi yang dapat mengakibatkan
melebarnya peak kromatogram.
3) Transfer massa non ekuilibrium
Terjadi karena aliran fase gerak yang terlalu cepat sementara sebagian
molekul solut tidak dapat keluar dari fase diam secara cepat sehingga
sebagian solut akan terlambat meninggalkan kolom sehingga dapat terjadi
pelebaran peak sekaligus membuat pemisahan tidak efisien (Hendayana,
2006).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
A B
Gambar 11. Transfer massa fase diam (A) dan fase gerak (B)
Demikian pula yang terjadi pada cekungan kolom, solut dalam fase diam
bertemu dengan fase gerak yang masih baru, karena laju transfer solut tidak
terjadi dengan segera, masih ada solut yang tertinggal dalam fase diam. Efek
netto yang terjadi dari kedua keadaan ini adalah pelebaran peak solut pada
kedua ujungnya.
Hubungan antara difusi, kesetimbangan dan kecepatan dinyatakan dalam
persamaan Van Deemter yaitu :
HETP = A + B
+ C ...………………………. (5)
HETP adalah tinggi lempeng teoritis. Suku A adalah difusi Eddy. Untuk
mendapatkan harga A yang kecil maka diameter dalam packing kolom harus
dibuat kecil dan kerapatannya seragam. Suku B adalah difusi longitudinal.
Peran difusi ini tidak terlalu penting dalam kromatografi cair tetapi sangat
berperan terutama dalam kromatografi gas. Pelebaran peak dapat dikurangi
dengan meningkatkan flow rate fase gerak dan menjadi penting bila flow rate
fase gerak sangat lambat (Watson, 1999). Tanda berarti kecepatan rata-rata
dari fase gerak. Suku C adalah transfer massa yang merupakan hasil
penjumlahan dari nilai transfer massa fase gerak dan fase diam (Noegrohati,
1994). Laju migrasi solut tergantung pada keadaan ekuilibrium dan kecepatan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
fase gerak, di samping pelebaran peak yang tergantung pada keadaan aliran
dalam kolom, difusi longitudinal dan laju transfer massa.
Bentuk peak yang dihasilkan dari hasil pemisahan merupakan ukuran
efisiensi kolom. Kolom yang menghasilkan pemisahan dengan peak yang simetris
selalu lebih disukai. Peak yang kurang simetris dapat mengakibatkan
ketidakakuratan pengukuran resolusi, ketidaktelitian hasil pengukuran kuantitatif,
memperkecil resolusi, dan tidak dapat mendeteksi sinyal yang kecil, dan waktu
retensi tidak reprodusibel (Noegrohati, 1994). Bentuk peak yang tidak simetris
dengan front di belakang turun dengan landai disebut tailing. Sedangkan pada
keadaan sebaliknya di mana pada bagian depan naik dengan landai disebut
fronting atau leading (Kuwana, 1980). Distribusi analit dalam fase gerak dan fase
diam pada saat terjadi tailing dan leading dapat dilihat sebagai berikut :
Gambar 12. Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam
Terjadinya peak yang asimetri dapat disebabkan oleh jumlah solut yang
terlalu besar dalam kolom, dekomposisi solut, analit teradsorpsi kuat dalam sisi
aktif fase diam (Watson, 1999).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Salah satu cara untuk menilai bentuk peak adalah dengan peak asymmetry
factor (As). Nilai As diukur pada 10% dari tinggi peak. Kolom yang baik akan
menghasilkan nilai As sebesar 0,9 – 1,1 (Snyder dkk, 1997). Harga As > 1 berarti
kromatogram tersebut mengekor. Semakin besar harga As maka makin tidak
efisien kolom yang dipakai (Mulja dan Suharman, 1995). Cara lain untuk menilai
bentuk peak adalah dengan peak tailing factor (PTF). Pengukuran dengan
menggunakan peak tailing factor lebih disukai. Pengukuran dengan PTF diukur
pada 5% dari tinggi peak. Peak asymmetry factor dan peak tailing factor dapat
dihitung seperti disajikan pada gambar di bawah ini. Kedua hal tersebut dapat
disebabkan karena kolom yang buruk, sampel overload, pemilihan pelarut yang
tidak tepat, efek kimia, dan efek tambatan sekunder dari silanol (Snyder dkk,
1997).
Gambar 13. Pengukuran peak asymmetry factor dan peak tailing factor
Analisis kualitatif bertujuan untuk membuktikan ada tidaknya senyawa
tertentu dalam sampel dengan cara membandingkan waktu retensi senyawa murni
dan waktu retensi senyawa yang dimaksud dalam sampel.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Respon yang berupa tinggi peak maupun luas area peak dapat digunakan
untuk analisis kuantitatif. Analisis berdasarkan tinggi peak dapat memberikan
ketelitian yang tinggi jika keadaan kolom tidak menyebabkan pelebaran peak.
Pada kromatogram yang memiliki bentuk peak relatif lebar, analisis berdasarkan
luas area peak lebih disukai dibanding analisis berdasarkan tinggi peak
(Noegrohati,1994).
E. Spektrofotometri Ultraviolet
Spektrofotometri UV-Vis merupakan bagian dari teknik analisis
spektroskopik yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat
(190 – 380 nm) dan sinar tampak (380 – 780 nm) dengan menggunakan instrumen
spektrofotometer. Spektrum UV-Vis merupakan korelasi serapan (sebagai ordinat)
dan panjang gelombang (sebagai absis) berupa pita spektrum. Terbentuknya pita
tersebut disebabkan transisi energi yang tidak sejenis dan terjadi eksitasi
elektronik lebih dari satu macam pada gugus molekul yang kompleks.
Analisis dengan spektrofotometri UV-Vis selalu melibatkan pembacaan
serapan radiasi elektromagnetik oleh molekul atau radiasi elektromagnetik yang
diteruskan. Keduanya dikenal sebagai serapan (A) tanpa satuan dan transmitan
dengan satuan persen (%T).
Bouguer Lambert dan Beer membuat rumus hubungan antara transmitan
atau serapan terhadap intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang dianalisis dan
tebal larutan yang mengabsorbsi sebagai :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
T = II
o
t = 10 –ε.b.c
A = log T
1 = ε.b.c
A = a.b.c
Dengan T adalah persen transmitan, I0 dan It adalah intensitas radiasi yang datang
dan yang diteruskan. A adalah serapan, ε adalah koefisien ekstingsi molar atau
daya serap molar (L mol-1
cm-1
), yaitu serapan suatu larutan dibagi dengan tebal
larutan b dalam cm dan konsentrasi molar c dalam mol. L-1
. a adalah daya serap
dengan satuan L g-1
cm-1
, yang merupakan hasil bagi serapan (A) dibagi dengan
hasil perkalian kadar c yang dinyatakan dalam gram per liter zat dan panjang sel
dalam cm (b). Nilai daya serap molar dapat dihitung dengan persamaan sebagai
berikut :
ε = A cm
%1
1.BM. 10
-1
A cm
%1
1 adalah serapan jenis yaitu serapan dari larutan 1% zat terlarut dalam sel
dengan ketebalan 1 cm. BM adalah massa molekul relatif zat (Mulja dan
Suharman, 1995).
F. Kesahihan Metode Analisis Instrumental
Persoalan analisis terkait dengan kecilnya kadar senyawa yang dianalisis
dan kompleksnya kandungan sampel yang dianalisis. Untuk mengatasi hal
tersebut, metode analisis instrumental yang dipilih harus dapat menyelesaikan
masalah yang ada. Analisis dengan menggunakan instrumen perlu memperhatikan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
kecermatan dan ketelitian alat. Untuk itu, diperlukan suatu pedoman mengenai
kesahihan metode analisis. Parameter – parameter yang digunakan sebagai
pedoman kesahihan metode analisis antara lain :
1. Akurasi
Akurasi adalah ukuran kedekatan nilai hasil percobaan dengan nilai yang
sesungguhnya, dinyatakan dengan persen recovery (Anonim, 2005). Akurasi
untuk bahan obat dengan kadar kecil disepakati 90 – 110%, akurasi untuk kadar
obat yang lebih besar disepakati 95 – 105%, sedangkan akurasi untuk bahan baku
disepakati 98 – 102%. Sedangkan untuk bioanalisis rentang akurasi 80 – 120%
masih bisa diterima (Mulja dan Hanwar, 2003).
2. Presisi
Presisi adalah suatu ukuran kedekatan nilai data satu dengan data lainnya
dalam suatu pengukuran pada kondisi analisis yang sama. Menurut United State
Pharmacopeia (USP) 28, presisi didefinisikan sebagai tingkat kesesuaian di antara
masing – masing hasil analisis yang dihasilkan dengan menggunakan metode
analitik secara berulang – ulang untuk pengambilan sampel homogen yang
berulang kali. Presisi seringkali diukur sebagai persen Relative Standard
Deviation (RSD) atau Coefficient of Variation (CV) untuk sejumlah sampel yang
berbeda bermakna secara statistik. Kriteria presisi diberikan jika metode
memberikan nilai CV 2% atau kurang. Akan tetapi nilai ini fleksibel tergantung
pada kadar analit dalam sampel yang dianalisis. Pada kadar 1% atau lebih, standar
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
deviasi relatif antara laboratorium ialah sekitar 2,5%. Pada kadar satu per sejuta,
RSD-nya adalah 16% (Harmita ,2004)
3. Limit of Detection (LOD)
LOD adalah konsentrasi terrendah dari analit yang dapat diukur pada
kondisi percobaan tertentu tetapi tidak perlu secara kuantitatif. LOD merupakan
parameter uji batas pengukuran dan menentukan apakah analit berada di atas atau
di bawah suatu nilai tertentu. Menurut USP 28, untuk metode instrumental, signal
to noise ratio ditentukan dengan membandingkan hasil uji dari sampel yang telah
diketahui konsentrasinya dengan hasil uji blanko dan menetapkan konsentrasi
analit terrendah yang dapat dideteksi. Konsentrasi analit yang mampu
memberikan respon 2-3 kali respon blanko inilah yang kemudian ditetapkan
sebagai LOD.
4. Limit of Quantification (LOQ)
LOQ adalah konsentrasi terrendah dari analit dalam sampel yang dapat
ditentukan dengan presisi dan akurasi yang baik pada kondisi percobaan tertentu
dari suatu metode. LOQ ditentukan dengan membandingkan sinyal terukur dari
sampel dengan konsentrasi analit yang rendah dengan sinyal dari blankonya.
Perbandingan signal to noise yang dapat diterima adalah 10 : 1 (Anonim, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
5. Linieritas
Linieritas suatu metode analitik adalah kemampuannya untuk memperoleh
hasil uji yang proporsional dengan konsentrasi analit pada sampel yang
dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Linieritas yang baik ialah nilai r yang
lebih besar dari nilai r tabel (Snyder dkk,1997). Persyaratan data linieritas yang
bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0.999 (Harmita, 2004).
6. Spesifitas
Spesifitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan
akurat respon analit di antara seluruh komponen sampel yang mungkin ada dalam
matriks sampel (Mulja dan Hanwar,2003).
7. Range
Range adalah interval antara kadar terrendah sampai kadar tertinggi dari
suatu analit yang masih dapat diukur secara kuantitatif menggunakan metode
tertentu yang masih dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang mencukupi.
Biasanya range memiliki satuan yang sama dengan satuan yang digunakan pada
metode analisis, misalnya persen atau ppm (Anonim, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
USP 28 mencantumkan beberapa kategori uji umum yang harus memenuhi
validitas data, yaitu :
a. Kategori I
Meliputi metode analitik yang digunakan untuk mengukur secara kuantitatif
sejumlah besar komponen dari serbuk obat atau senyawa aktif (termasuk
preservatif) dalam sediaan obat jadi.
b. Kategori II
Meliputi metode analitik yang digunakan untuk penentuan kemurnian dalam
serbuk obat atau penentuan senyawa degradasi dalam sediaan obat jadi.
c. Kategori III
Meliputi metode analitik yang digunakan untuk penentuan sifat – sifat khusus
seperti kecepatan disolusi dan pelepasan obat.
d. Kategori IV
Meliputi metode analitik yang digunakan untuk mengidentifikasi sediaan
farmasi.
Tabel II.Parameter Analitik
Karakteristik
Kinerja
Analitik
Kategori
1
Kategori II Kategori
III
Kategori
IV Kualitatif Kuantitatif
Akurasi Ya * Ya * Tidak
Presisi Ya Tidak Ya Ya Tidak
Spesifisitas Ya Ya Ya * Ya
LOD Tidak Ya Tidak * Tidak
LOQ Tidak Tidak Ya * Tidak
Linieritas Ya Tidak Ya * Tidak
Range Ya * Ya * Tidak
*Mungkin diperlukan, tergantung sifat uji spesifik yang dilakukan
(Anonim, 2005)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
G. Kesalahan Metode Analisis Instrumental
Kesalahan atau galat pada metode pada umumnya dapat disebabkan oleh
beberapa faktor yaitu metode dan prosedur analisis zat yang ditentukan, instrumen
yang dipakai, dan faktor individu yang mengerjakan. Kesalahan pada analisis
kimia dibagi menjadi dua macam, yaitu :
1. Kesalahan sistematik
Kesalahan ini disebut juga kesalahan prosedur yakni kesalahan yang
menyimpang secara tetap dari harga kadar yang sebenarnya karena proses
pelaksanaan prosedur analisis. Kesalahan sistematik ini dibagi lagi menjadi dua
macam berdasarkan sumber kesalahan, yaitu :
a. Kesalahan pada metode analisis
Kesalahan ini agak sulit dideteksi karena kesalahan pada metode analisis ini
antara lain disebabkan sifat fisika dan kimia dari reagen yang dipakai tidak
memadai secara ideal. Demikian juga dapat disebabkan oleh reaksi yang tidak
sempurna.
b. Kesalahan individual
Kesalahan ini timbul karena kesalahan individu dalam mengamati dan
membaca instrumen yang sedang dikerjakan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
Untuk menghindari kemungkinan terjadinya kesalahan sistematik ini ada
beberapa hal yang harus diperhatkan, yaitu :
1) Kalibrasi instrumen secara berkala
2) Pemilihan metode dan prosedur standar dari badan resmi
3) Pemakaian bahan kimia yang memiliki derajat pro analysis
4) Peningkatan pengetahuan dan kemampuan dari individu yang bekerja di
laboratorium analisis.
2. Kesalahan tidak sistematik
Kesalahan ini disebut juga kesalahan acak yaitu penyimpangan yang tidak
tetap dari hasil penentuan kadar dengan instrumen yang disebabkan oleh fluktuasi
dari instrumen yang digunakan. Kesalahan acak yang disebabkan oleh derau
instrumen tidak dapat diketahui penyebabnya dan juga tidak dikontrol. Pemakaian
instrumen dengan kualitas baik akan dapat menekan harga galat tidak sistematik
ini. Demikian juga pemakaian ilmu statistik untuk perhitungan hasil analisis
diharapkan dapat memperkecil perbedaan dalam menentukan kadar dengan harga
yang sebenarnya (Mulja dan Suharman, 1995).
H. Keterangan Empiris
Salah satu kombinasi obat yang banyak beredar adalah campuran dari
parasetamol, propifenazon, dan kafein yang memiliki kelarutan dalam etanol yang
mirip dan serapan maksimum pada panjang gelombang yang berdekatan sehingga
sulit dipisahkan dengan alat sederhana. KCKT dapat digunakan untuk
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
memisahkan sekaligus menetapkan kadar dari tiap komponen yang sudah
dipisahkan. Campuran ketiganya tersebut akan ditetapkan dengan menggunakan
kondisi KCKT yang optimal. Parameter validitas metode yang diuji meliputi
akurasi (ditinjau dari nilai recovery), presisi (ditinjau dari nilai CV), spesifisitas
(ditinjau dari profil pemisahan pada kromatogram yang menunjukkan pemisahan
hingga baseline untuk ketiga analit), linieritas (ditunjukkan oleh nilai koefisien
korelasi (r) yang diperoleh dari penentuan persamaan kurva baku dengan analisis
regresi linear), dan range (ditunjukkan dari rentang kadar analit terukur yang
memenuhi parameter akurasi dan presisi)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis rancangan penelitian eksperimental
deskriptif dengan dua variabel bebas dalam perlakuan pada subyek uji.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel utama
a. Variabel bebas
1) Jenis dan perbandingan fase gerak yaitu metanol : aquabidest dan
metanol : aquabidest : asam asetat glasial.
2) Flow rate fase gerak yang digunakan.
b. Variabel tergantung
1) Pemisahan peak dari parasetamol, propifenazon, dan kafein yang dapat
dilihat dari waktu retensi masing – masing.
2) Validitas metode yang ditinjau dari akurasi, presisi, spesifisitas, linieritas,
dan range penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam
sampel simulasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
2. Variabel pengacau terkendali
Variabel pengacau terkendali pada percobaan ialah kemurnian pelarut dan
kemurnian senyawa baku yang digunakan. Untuk mengatasinya digunakan pelarut
pro analysi dan bahan kualitas working standard.
C. Definisi Operasional
1. Larutan induk sampel simulasi adalah campuran 50 mg parasetamol, 30 mg
propifenazon, dan 10 mg kafein yang dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml.
2. Sampel simulasi kadar rendah adalah campuran parasetamol, propifenazon, dan
kafein yang dibuat dari larutan induk sampel simulasi yang dipipet sebanyak
125 µl dan diencerkan dengan metanol hingga 10 ml.
3. Sampel simulasi kadar sedang adalah campuran parasetamol, propifenazon,
dan kafein yang dibuat dari larutan induk sampel simulasi yang dipipet
sebanyak 500 µl dan diencerkan dengan metanol hingga 10 ml.
4. Sampel simulasi kadar tinggi adalah campuran parasetamol, propifenazon, dan
kafein yang dibuat dari larutan induk sampel simulasi yang dipipet sebanyak
750 µl dan diencerkan dengan metanol hingga 10 ml.
5. Parameter validitas metode analisis yang digunakan yaitu akurasi, presisi,
spesifisitas, linieritas, dan range.
D. Bahan – bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah parasetamol kualitas
working standard (Wenzhou Pharmaceutical Factory), propifenazon kualitas
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
working standard (Vani Chemicals & Intermediates Limited), kafein kualitas
working standard (Brataco Chemika), metanol p.a. (E. Merck), asam asetat glasial
p.a (E.Merck), dan aquabidest (Laboratorium Kimia Organik Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma).
E. Alat – Alat Penelitian
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah :
1. Spektrofotometer UV/Vis merek Perkin Elmer Lambda 20
2. Kuvet.
3. Seperangkat sistem KCKT yang terdiri dari :
a. Pompa merek Shimadzu LC-10 AD No. C20293309457 J2.
b. Detektor UV/Vis merek Shimadzu SPD-10 AV No. C20343503697 KG.
c. CBM 101 merek Shimadzu No. C50363502311.
d. Seperangkat komputer merek ACER.
e. Printer merek Hewlett Packard Deskjet 670 C.
f. Injektor jenis katup suntik model 77251.
g. Kolom ODS merek DuPont Instruments Zorbax berdimensi 4,6 mm x 25
cm P.N 880952-702.
4. Syringe merek Hamilton Part. No. 2933087.
5. Alat degasing ultrasonik merek Retsch T640 No. 935922012 EY.
6. Penyaring Whatmann anorganik dan organik.
7. Membrane filter holder merek Whatmann kapasitas 300 ml.
8. Neraca analitik merek Scaltec SBC 22.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
9. Vakum merek Gast DOA-P104-BN.
10. Penyaring Milipore.
11. Mikropipet 100 – 1000 µl merek Biohit.
12. Seperangkat alat gelas.
F. Tatacara Penelitian
1. Pembuatan larutan baku parasetamol, propifenazon, dan kafein
a. Larutan baku parasetamol
1) Pembuatan larutan baku induk parasetamol
Lebih kurang 50 mg baku parasetamol yang ditimbang seksama
dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml.
2) Pembuatan seri larutan baku parasetamol
Larutan baku induk parasetamol dari langkah di atas dipipet 125 µl;
250 µl; 375 µl; 500 µl; 625 µl; dan 750 µl lalu dimasukkan dalam labu
ukur 10 ml dan diencerkan dengan metanol hingga tanda sehingga
didapatkan kadar 62,5 ppm; 125,0 ppm; 187,5 ppm; 250,0 ppm; 312,5
ppm; dan 375,0 ppm.
b. Larutan baku propifenazon
1) Pembuatan larutan baku induk propifenazon
Lebih kurang 30 mg baku propifenazon yang ditimbang seksama
dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
2) Pembuatan seri larutan baku propifenazon
Larutan baku induk propifenazon dari langkah di atas dipipet 125 µl;
250 µl; 375 µl; 500 µl; 625 µl; dan 750 µl lalu dimasukkan dalam labu
ukur 10 ml dan diencerkan dengan metanol hingga tanda sehingga
didapatkan kadar 37,5 ppm; 75,0 ppm; 112,5 ppm; 150,0 ppm; 187,5
ppm; dan 225,0 ppm.
c. Larutan baku kafein
1) Pembuatan larutan baku induk kafein
Lebih kurang 10 mg baku kafein yang ditimbang seksama dilarutkan
dalam metanol hingga 10 ml.
2) Pembuatan seri larutan baku kafein
Larutan baku induk kafein dari langkah di atas dipipet 125 µl; 250 µl;
375 µl; 500 µl; 625 µl; dan 750 µl lalu dimasukkan dalam labu ukur 10
ml dan diencerkan dengan metanol hingga tanda sehingga didapatkan
kadar 12,5 ppm; 25,0 ppm; 37,5 ppm; 50,0 ppm; 62,5 ppm; dan 75,0
ppm.
2. Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ialah campuran :
a. Metanol : aquabidest dengan perbandingan 40 : 60; 50 : 50; 60 : 40; dan
70 : 30.
b. Metanol : aquabidest : asam asetat glasial dengan perbandingan 50 : 49 : 1;
60 : 37 : 3; dan 70 : 28,5 : 1,5.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
Masing – masing perbandingan fase gerak dibuat sesuai dengan volume yang
dibutuhkan kemudian digojog dan disaring dengan penyaring Whatman anorganik
dengan bantuan pompa vakum. Fase gerak kemudian dihilangkan gelembungnya
dengan degassing selama 15 menit.
3. Penentuan panjang gelombang pengamatan antara parasetamol,
propifenazon, dan kafein dengan spektrofotometer UV
Lebih kurang 10 mg baku parasetamol, propifenazon, dan kafein yang
ditimbang seksama dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml. Larutan tersebut
diencerkan hingga kadar 10 ppm untuk tiap zat dan dibaca absorbansinya pada
panjang gelombang 200 – 300 nm dengan spektrofotometer UV. Berdasarkan
kurva panjang gelombang vs absorbansi parasetamol, propifenazon, dan kafein
yang diperoleh, diamati dan ditentukan panjang gelombang overlapping.
4. Pengamatan waktu retensi parasetamol. propifenazon, dan kafein
Larutan baku induk parasetamol, propifenazon, dan kafein masing –
masing dipipet 500 µl lalu diencerkan dengan metanol hingga 10 ml. Larutan
hasil pengenceran tiap zat tersebut disaring dengan millipore dan dihilangkan
gelembungnya dengan degassing selama 15 menit. Kemudian sebanyak 40 μl
larutan tersebut disuntikkan ke dalam KCKT dengan kolom ODS
(4,6 mm x 25 cm); fase gerak yang telah dibuat pada langkah no.2 dan flow rate
tertentu pada panjang gelombang pengamatan yaitu 272 nm. Waktu retensi tiap
analit diamati dari kromatogram yang didapat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
5. Optimasi pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein
Lebih kurang 50 mg parasetamol, 30 mg propifenazon, dan 10 mg kafein
ditimbang seksama, lalu dicampur dan dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml.
Larutan tersebut dipipet 500 μl dan diencerkan dengan metanol hingga 10 ml,
sehingga didapatkan larutan campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein
dengan perbandingan kadar masing – masing ialah 250 ppm : 150 ppm : 50 ppm.
Kemudian larutan tersebut disaring dengan millipore dan dihilangkan
gelembungnya dengan degassing selama 15 menit. Sebanyak 40 μl larutan
campuran disuntikkan ke dalam KCKT dengan kolom ODS (4,6 mm x 25 cm);
fase gerak yang telah dibuat pada langkah no.2 dan flow rate tertentu pada
panjang gelombang pengamatan yaitu 272 nm. Dari hasil kromatogram diamati
waktu retensi masing – masing senyawa pada berbagai perbandingan fase gerak
serta flow rate yang digunakan.
6. Validasi metode analisis
a. Pembuatan kurva baku
Seri kadar larutan baku parasetamol, propifenazon, dan kafein dari langkah
no. 1 yang telah disaring dengan penyaring milipore dan dihilangkan
gelembungnya dengan degassing selama 15 menit diinjeksikan pada sistem
KCKT dengan fase gerak metanol : aquabidest dengan rasio 40 : 60 dan
flow rate 2 ml/menit. AUC (Area Under Curve) untuk tiap peak yang
muncul diamati dari kromatogram yang didapat. Lalu, ditentukan persamaan
regresi linear antara kadar tiap analit terhadap AUC.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
b. Pembuatan larutan induk campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein
Lebih kurang 50 mg parasetamol, 30 mg propifenazon, dan 10 mg kafein
ditimbang seksama, dicampur, dan dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml.
c. Penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam campuran
Larutan campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein dari langkah
no.6b. dipipet 125 μl; 500 μl; dan 750 μl dan diencerkan dengan metanol
hingga 10 ml. Larutan tersebut disaring dengan milipore dan dihilangkan
gelembungnya dengan degassing selama 15 menit, lalu diinjeksikan pada
sistem KCKT dengan fase gerak metanol : aquabidest dengan rasio 40 : 60
dan flow rate 2 ml/menit. AUC (Area Under Curve) tiap peak yang muncul
diamati dari kromatogram yang didapat. Kemudian kadar analit dihitung
dengan memasukkan nilai AUC yang diperoleh dari tiap analit ke dalam
persamaan kurva baku yang telah diperoleh dari analisis regresi linear.
G. Analisis Hasil
Kondisi KCKT yang optimal untuk mendapatkan pemisahan yang baik
dari parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam campuran dapat dilihat dari
profil pemisahan dari kromatogram yang diperoleh dan perhitungan resolusi
(jarak antara dua puncak dibagi dengan rata – rata lebar dasar puncak) dengan
rumus sebagai berikut :
) W(W (1/2)
)(t - )(t Rs
2 1
r1r2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
Hasil optimasi ini lalu digunakan untuk menentukan kesahihan metode,
yang dinyatakan dengan parameter berikut :
1. Akurasi ditentukan dengan nilai recovery
Recovery = 100%x diketahuikadar
kurkadar teru
2. Presisi diukur dengan Coefficient of variance (CV)
CV = 100%x rata - rata
bakusimpangan
recovery
3. Spesifisitas ditentukan dari profil pemisahan pada kromatogram yang
menunjukkan pemisahan hingga baseline untuk ketiga analit.
4. Linieritas ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari
penentuan persamaan kurva baku dengan analisis regresi linear.
5. Range ditunjukkan oleh rentang kadar analit terukur yang memenuhi kriteria
akurasi dan presisi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Penyiapan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ialah campuran dari metanol :
aquabidest dan metanol : aquabidest : asam asetat glasial yang bersifat polar.
Pemilihan fase gerak tersebut didasarkan pada kondisi kromatografi yang dipilih
yaitu kromatografi partisi fase terbalik, karena ketiga senyawa analit bersifat polar
sehingga untuk mengelusinya dengan cepat digunakan fase gerak yang polar
sesuai dengan kepolaran ketiga senyawa analit, serta menggunakan kolom C-18
yang bersifat non polar agar ketiga analit dapat terpisah akibat perbedaaan
interaksi tiap analit dengan fase diam. Pemilihan fase gerak ini sangat penting
karena dapat mempengaruhi waktu retensi dan pemisahan dari komponen –
komponen yang akan dianalisis. Kedua jenis fase gerak yang digunakan pada
penelitian ini mengandung metanol yang termasuk golongan alkohol karena
ketiga analit mudah larut dalam etanol yang juga termasuk golongan alkohol.
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring untuk menghilangkan
partikel yang dapat menyebabkan kerusakan pada pompa serta menyumbat kolom.
Selanjutnya, fase gerak didegas untuk menghilangkan gelembung – gelembung
gas yang terlarut dalam fase gerak, agar tidak terjadi sinyal palsu pada detektor.
Fase gerak yang digunakan ini mengacu pada studi pustaka terhadap jurnal
penelitian Optimization of the RP-HPLC Method for Multicomponent Analgetic
Drug Determination yang ditulis oleh Ivanovic, dkk pada 2003 tentang pemisahan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan menggunakan fase gerak metanol :
aquabidest pada berbagai rasio berkisar dari (30 : 70 v/v) hingga (65 : 35 v/v).
pada detektor UV 265 nm dan kolom Beckman Ultrasphere ODS 4,6 x 150 mm,
ukuran partikel 5 µm. Fase gerak tersebut juga dimodifikasi dengan asam asetat
glasial untuk menggaramkan kafein sehingga diharapkan dapat terjadi pemisahan
ketiga analit yang lebih optimal.
B. Pembuatan Larutan Baku
Larutan baku induk dari masing – masing komponen uji dibuat dengan
kadar tertentu, yaitu 5000 ppm untuk parasetamol, 3000 ppm untuk propifenazon,
dan 1000 ppm untuk kafein. Pelarut yang digunakan ialah metanol p.a karena
senyawa memiliki kelarutan yang baik dalam metanol. Selain itu syarat pelarut
yang dapat digunakan dalam KCKT ialah kemurniannya tinggi dan dapat mudah
campur dengan fase gerak dan mudah terelusi.
Larutan untuk seri kurva baku dari masing – masing senyawa dibuat dalam
6 seri kadar yaitu untuk baku parasetamol dibuat dengan kadar 62,5 ppm;
125,0 ppm; 187,5 ppm; 250,0 ppm; 312,5 ppm; dan 375,0 ppm. Untuk baku
propifenazon dibuat dengan kadar 37,5 ppm; 75,0 ppm; 112,5 ppm; 150,0 ppm;
187,5 ppm; dan 225,0 ppm. Sedangkan untuk kafein digunakan kadar 12,5 ppm;
25,0 ppm; 37,5 ppm; 50,0 ppm; 62,5 ppm; dan 75,0 ppm. Masing – masing kadar
tersebut dibuat dari pengenceran larutan baku induk tiap senyawa. Pemilihan seri
kadar kurva baku tersebut dimaksudkan agar kadar masing – masing senyawa
yang terdapat pada sampel simulasi dengan perbandingan 5 : 3 : 1 antara
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
parasetamol, propifenazon, dan kafein dapat tercakup dalam rentang kurva baku
yang digunakan sehingga dapat ditetapkan kadarnya dengan persamaan kurva
baku yang didapatkan.
C. Optimasi Metode KCKT
1. Penentuan panjang gelombang pengamatan dengan spektrofotometri
ultraviolet
Penentuan panjang gelombang pengamatan ini dimaksudkan untuk
menentukan pada panjang gelombang berapa ketiga senyawa yaitu parasetamol,
propifenazon, dan kafein memberikan absorbansi yang cukup besar. Penentuan
panjang gelombang pengamatan ini dilakukan dengan mengukur absorbansi dari
ketiga senyawa masing – masing pada panjang gelombang 200 – 300 nm yang
termasuk dalam panjang gelombang ultraviolet. Kurva serapan dari parasetamol,
propifenazon dan kafein dapat terlihat seperti pada gambar di bawah ini :
Gambar 14. Spektra panjang gelombang maksimum parasetamol (a), propifenazon (b), dan
kafein (c)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Kurva serapan di atas menunjukkan panjang gelombang pada saat serapan
dari parasetamol maksimal adalah pada 248 nm sedangkan menurut Autherhoff
(1987) serapan maksimal dari parasetamol dalam metanol adalah pada 250 nm.
Untuk propifenazon berdasarkan pengamatan panjang gelombang saat serapannya
maksimal adalah pada 247 nm dan 274 nm, sedangkan menurut Clarke (1986)
serapan maksimal dari propifenazon dalam etanol ialah pada 248 nm dan 277 nm.
Untuk kafein berdasarkan pengamatan panjang gelombang saat serapannya
maksimal adalah pada 272 nm dan menurut Clarke (1986) serapan maksimal dari
kafein dalam etanol adalah pada 273 nm. Hasil pengukuran ini menunjukkan
pergeseran panjang gelombang sebesar 1 hingga 3 nm yang mungkin disebabkan
kondisi pengujian pada saat penelitian berbeda dengan kondisi pengujian pada
literatur yang dapat mempengaruhi absorbansi dari senyawa. Selain itu pelarut
yang digunakan pada penelitian adalah metanol, padahal yang digunakan secara
teoritis untuk propifenazon dan kafein adalah etanol. Menurut Rohman (2007),
penggunaan pelarut yang lebih polar akan menggeser panjang gelombang serapan
maksimum suatu senyawa ke panjang gelombang yang lebih pendek (pergeseran
hipsokromik).
Dari beberapa panjang gelombang pengamatan yang ada, dipilih panjang
gelombang 272 nm dengan alasan pada panjang gelombang tersebut, kafein yang
kadarnya paling kecil dalam campuran dapat terdeteksi dengan baik. Pada panjang
gelombang tersebut nilai serapan dari kafein optimal, sedangkan serapan dari
kedua senyawa yang lain yaitu parasetamol dan propifenazon kurang optimal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
tetapi tetap dapat terdeteksi dengan baik karena kadarnya dalam campuran yang
cukup tinggi.
2. Pengamatan waktu retensi parasetamol, propifenazon, dan kafein dan
optimasi pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein
Pengamatan waktu retensi (tr) dari parasetamol, propifenazon dan kafein
dilakukan pada tiap perbandingan fase gerak metanol : aquabidest yaitu (70 : 30),
(60 : 40), (50 : 50), dan (40 : 60) serta metanol : aquabidest : asam asetat glasial
(70 : 28,5 : 1,5), (60 : 37 : 3), dan (50 : 49 : 1) dengan flow rate 0,5 ml/menit;
1 ml/menit; 1,5 ml/menit; dan 2 ml/menit. Pola pemisahan dari tiap perbandingan
fase gerak yang digunakan berbeda – beda. Hal tersebut dapat dilihat dari hasil
pengamatan waktu retensi dari parasetamol, kafein, dan propifenazon yang
ditampilkan dalam tabel berikut :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Tabel III. Pengamatan waktu retensi parasetamol, propifenazon, dan kafein
pada berbagai perbandingan fase gerak dan flow rate tertentu Komposisi Fase
Gerak
Flow rate
(ml/menit)
tR
parasetamol
(menit)
tR
kafein
(menit)
tR
propifenazon
(menit)
Keterangan
Metanol :
aquabidest
70 : 30 0,5 6,341 7,972 7,995 tidak
terpisah
sempurna
60 : 40 0,5 6,376 8,229 9,675 tidak
terpisah
sempurna
50 : 50 0,5 6,420 & 6,729 8,783 13,583 peak ganda
parasetamol 1,0 3,352 & 3,457 4,511 6,870 peak ganda
parasetamol 40 : 60 1,0 3,637 5,245 12,933 Rs
parasetamol
– kafein =
2,477
1,5 2,469 3,540 8,409 Rs
parasetamol
– kafein =
1,617
2,0 1,816 2,534 5,850 Rs
parasetamol
– kafein =
1,306
Metanol :
aquabidest
: asam
asetat
glasial
70 :
28,5 :
1,5
0,5 6,067 & 6,343 7,938 7,962 tidak
terpisah
sempurna
60 :
37 :
3
0,5 6,360 8,078 8,989 tidak
terpisah
sempurna
50 :
49 :
1
0,5 6,487 & 6,752 8,709 13,108 peak ganda
parasetamol
Pemisahan yang terjadi pada kolom KCKT dipengaruhi oleh koefisien
partisi dari senyawa yang dianalisis terhadap fase gerak dan fase diam. Hal
tersebut secara langsung dipengaruhi oleh interaksi yang terjadi antara senyawa
analit dengan fase diam dan fase gerak yang digunakan. Interaksi antara
parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam campuran dengan fase diam
merupakan ikatan van der Waals antara gugus non polar yang ada pada ketiga
senyawa tersebut dengan fase diamnya yaitu C-18. Namun, interaksi yang terjadi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
sangat rumit dan susah digambarkan sehingga hanya dapat ditunjukkan gugus non
polar yang ada pada ketiga senyawa tersebut ialah sebagai berikut :
N
NN
N
O
O
N
O
H
OH
c
O
N
N
ba
Gambar 15. Gugus non polar pada parasetamol (a); kafein (b); dan propifenazon (c) yang
berinteraksi dengan kolom ODS
Semakin banyak gugus non polar yang ada dalam suatu senyawa maka
dapat diperkirakan bahwa senyawa tersebut terikat lebih kuat dengan fase
diamnya yang bersifat non polar sehingga waktu retensinya lebih panjang. Dalam
penelitian ini, propifenazon memiliki gugus non polar paling banyak sehingga
interaksi dengan fase diamnya paling kuat dan akan terelusi paling lama.
Parasetamol memiliki gugus non polar yang paling sedikit sehingga waktu
elusinya paling cepat di antara ketiga senyawa analit. Hal tersebut sesuai dengan
teori tentang koefisien partisi (Skoog dkk., 1994) di mana senyawa dengan
koefisien partisi kecil akan lebih cepat keluar dari kolom karena kadar linarut
dalam fase geraknya lebih banyak sehingga dapat lebih cepat terelusi. Untuk
memisahkan ketiganya dapat dilakukan dengan mengganti jenis kolom maupun
fase gerak yang digunakan. Namun, pada penelitian hanya dilakukan perubahan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
komposisi fase gerak yang digunakan karena keterbatasan jenis kolom yang ada di
laboratorium.
Hasil pengamatan waktu retensi parasetamol, propifenazon, dan kafein
pada fase gerak metanol : aquabidest (70 : 30) pada flow rate 0,5 ml/menit
menunjukkan bahwa parasetamol terelusi lebih dulu, setelah itu kafein dan
propifenazon. Kafein dan propifenazon belum dapat memisah. Hal ini dapat
dilihat dari kromatogram di bawah ini :
Gambar 16. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan fase
gerak metanol : aquabidest (70 : 30) flow rate 0,5 ml/menit
Kromatogram tersebut hanya dapat menggambarkan dua puncak dari tiga
senyawa yang ada. Pada tr = 6,337 merupakan peak parasetamol dan pada tr =
7,991 merupakan peak gabungan dari propifenazon dan kafein. Peningkatan laju
alir tidak dilakukan karena hanya akan memperpendek waktu retensi yang
diperoleh akan tetapi tidak akan memberikan perbedaan yang lebih besar sehingga
pemisahan yang diperoleh masih kurang baik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
Kemudian, dilakukan running dengan fase gerak metanol : aquabidest
(60 : 40) pada flow rate 0,5 ml/menit. Penggunaan fase gerak metanol : aquabidest
dengan rasio 60 : 40 dimaksudkan untuk mengurangi komposisi metanol dalam
fase gerak sehingga dapat mengurangi afinitas propifenazon terhadap fase gerak.
Propifenazon mudah larut dalam metanol tapi sukar larut dalam air, sedangkan
kafein memiliki kelarutan dalam air yang lebih baik daripada propifenazon.
Sehingga diharapkan dengan menurunkan komposisi metanol dalam fase gerak
dapat terjadi pemisahan peak kafein dari peak propifenazon. Hasil yang didapat
adalah sebagai berikut :
Gambar 17. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan fase
gerak metanol : aquabidest (60 : 40) flow rate 0,5 ml/menit
Pada tr = 6,376 merupakan peak parasetamol; pada tr = 8,229 merupakan
peak kafein; dan pada tr = 9,675 merupakan peak propifenazon. Dari hasil
kromatogram yang didapat terlihat masih terjadi sedikit tumpang tindih antara
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
peak kafein dan propifenazon yang.disebabkan masih terlalu tingginya komposisi
metanol dalam fase gerak ini.
Berdasarkan hal tersebut, maka dilakukan pengamatan pemisahan ketiga
analit pada fase gerak metanol : aquabidest dengan rasio 50 : 50 pada flow rate
0,5 ml/menit dengan harapan peak kafein dan propifenazon dapat terpisah karena
perbedaan afinitas kedua zat tersebut terhadap fase gerak yang digunakan. Berikut
ini adalah kromatogram yang diperoleh :
Gambar 18. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan fase
gerak metanol : aquabidest (50 : 50) flow rate 0,5 ml/menit
Pada tr = 6,400 dan 6,722 merupakan peak parasetamol; pada tr = 8,776
merupakan peak kafein; dan pada tr = 13,323 merupakan peak propifenazon
Berdasarkan kromatogram yang didapat, diketahui peak kafein dan propifenazon
telah terpisah sempurna, namun terjadi peak ganda pada peak parasetamol.
Terjadinya peak ganda pada peak parasetamol mungkin disebabkan kurang
sesuainya fase gerak yang digunakan atau kurang tingginya flow rate. Sehingga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
berdasarkan dugaan tersebut, dilakukan peningkatan flow rate menjadi 1
ml/menit. Diharapkan dengan adanya peningkatan flow rate dapat mempercepat
tercapainya keseimbangan interaksi antara fase gerak, fase diam, dan analit yang
terjadi dalam kolom, sehingga dapat mencegah terbentuknya peak ganda pada
peak parasetamol. Berikut ini adalah kromatogram yang diperoleh :
Gambar 19. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan fase
gerak metanol : aquabidest (50 : 50) flow rate 1,0 ml/menit
Pada tr = 3,352 dan 3,471 merupakan peak parasetamol; pada tr = 4,532
merupakan peak kafein; dan pada tr = 6,957 merupakan peak propifenazon Dari
kromatogram yang didapat, diketahui peak parasetamol tetap menunjukkan peak
ganda. Sehingga disimpulkan rasio fase gerak yang digunakan memang masih
belum sesuai.
Berdasarkan hasil running yang sudah dilakukan menggunakan fase gerak
metanol : aquabidest yang belum dapat menghasilkan pemisahan yang baik, maka
dilakukan modifikasi fase gerak dengan menggunakan asam asetat glasial hingga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
pH fase gerak berkisar antara 3 hingga 4 untuk menggaramkan kafein yang
bersifat basa dengan reaksi sebagai berikut :
COH
O
CH3
N
NN
N
O
O
H3C
CH3
CH3
H+
CH3CO
O-
N
NNH
N
O
O
H3C
CH3
CH3 CO
O
CH3
H+
+
+
Gambar 20. Penggaraman kafein oleh asam asetat glasial
Hasil penggaraman kafein tersebut diperkirakan dapat meningkatkan
kelarutan kafein dalam fase gerak yang mengandung aquabidest sehingga dapat
lebih cepat terelusi dan terpisah dari propifenazon. Berikut adalah hasil running
dengan fase gerak metanol : aquabidest : asam asetat glasial (70 : 28,5 : 1,5) pada
flow rate 0,5 ml/menit :
Gambar 21. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan fase
gerak metanol : aquabidest : asam asetat glasial (70 : 28,5 : 1,5) flow rate 0,5
ml/menit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
Kromatogram tersebut hanya dapat menggambarkan dua puncak dari tiga
senyawa yang ada. Pada tr = 6,067 dan 6,343 merupakan peak parasetamol dan
pada tr = 7,962 merupakan peak gabungan dari propifenazon dan kafein. Peak
ganda pada peak parasetamol dapat disebabkan oleh fase gerak yang tidak sesuai.
Sedangkan tumpang tindih yang terjadi pada peak propifenazon dan kafein
dikarenakan komposisi metanol dalam fase gerak masih terlalu tinggi sehingga
kafein masih belum dapat terpisah dari propifenazon yang mudah larut dalam
metanol. Maka, dilakukan running menggunakan fase gerak dengan komposisi
metanol yang lebih rendah yaitu metanol : aquabidest : asam asetat glasial dengan
rasio 60 : 37 : 3 pada flow rate 0,5 ml/menit dengan harapan adanya kenaikan
jumlah air akan memudahkan larutnya garam kafein yang terbentuk dari reaksi
basa kafein dengan asam asetat glasial sehingga kafein lebih cepat terelusi dan
dapat terpisah sempurna dari propifenazon. Namun, didapatkan hasil sebagai
berikut :
Gambar 22. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan fase
gerak metanol : aquabidest : asam asetat glasial (60 : 37 : 3) flow rate 0,5
ml/menit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
Pada tr = 6,360 merupakan peak parasetamol; pada tr = 8,078 merupakan
peak kafein; dan pada tr = 8,989 merupakan peak propifenazon. Peak kafein
mengalami pengurangan waktu retensi dibandingkan waktu retensinya pada saat
running dengan fase gerak metanol : aquabidest (60 : 40) namun propifenazon
juga mengalami hal yang sama, bahkan pengurangan waktu retensinya lebih
signifikan. Hal ini mungkin disebabkan terjadinya penggaraman propifenazon
oleh asam asetat glasial dengan reaksi sebagai berikut :
Gambar 23. Penggaraman propifenazon oleh asam asetat glasial
Propifenazon yang telah tergaramkan tersebut akan meningkat
polaritasnya dan jadi lebih mudah larut dalam air yang ada dalam fase gerak
sehingga dapat keluar dari kolom ODS dengan lebih cepat.
Kemudian dilakukan running dengan fase gerak metanol : aquabidest :
asam asetat glasial (50 : 49 : 1) dan dialirkan pada flow rate 0,5 ml/menit untuk
melihat apakah penambahan asam asetat glasial dapat menghilangkan peak ganda
parasetamol yang terjadi pada saat running dengan fase gerak metanol :
aquabidest (50 : 50). Hasilnya adalah sebagai berikut :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Gambar 24. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan fase
gerak metanol : aquabidest : asam asetat glasial (50 : 49 : 1) flow rate 0,5
ml/menit
Pada tr = 6,407 dan 6,752 merupakan peak parasetamol; pada tr = 8,709
merupakan peak kafein; dan pada tr = 13,108 merupakan peak propifenazon. Peak
parasetamol masih menunjukkan peak ganda yang mungkin disebabkan rasio fase
gerak yang belum sesuai atau kondisi kolom yang diduga mengalami penurunan
kinerja.
Pengggunaan asam asetat glasial untuk modifikasi fase gerak ternyata
tidak memberikan hasil seperti yang diharapkan. Berdasarkan hal tersebut, maka
kembali dilakukan pengamatan pemisahan pada fase gerak metanol : aquabidest
dengan rasio 40 : 60 dan flow rate 1,0 ml/menit. Flow rate yang digunakan tidak
lagi dimulai dari 0,5 ml/menit melainkan 1,0 ml/menit dengan tujuan
mempercepat keluarnya analit dari kolom demi meningkatkan efisiensi waktu,
serta memperuncing bentuk peak dari ketiga analit. Berikut ini adalah
kromatogram yang diperoleh :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
Gambar 25. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan fase
gerak metanol : aquabidest (40 : 60) flow rate 1,0 ml/menit
Pada tr = 3,664 merupakan peak parasetamol; pada tr = 5,274 merupakan
peak kafein; dan pada tr = 13,162 merupakan peak propifenazon. Dari
kromatogram di atas, dapat terlihat peak parasetamol, kafein, dan propifenazon
telah terpisah sempurna dengan resolusi peak parasetamol – kafein (yang
merupakan peak yang paling dekat jaraknya dibanding peak kafein –
propifenazon) sebesar 2,477; namun waktu yang dibutuhkan oleh sampel untuk
sepenuhnya keluar dari kolom mencapai lebih dari 15 menit. Pemisahan dengan
menggunakan KCKT dapat dikatakan efisien apabila terjadi dalam waktu kurang
dari 15 menit, sehingga pemisahan yang tergambar pada kromatogram di atas
dapat disimpulkan sebagai pemisahan yang kurang efisien. Selain itu, bentuk peak
propifenazon yang tidak runcing pada kromatogram di atas dapat disebabkan oleh
kurang cepatnya keseimbangan interaksi yang tercapai antara fase gerak, fase
diam, dan analit yang terjadi dalam kolom akibat kurang tingginya flow rate yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
digunakan. Maka, berdasarkan pertimbangan di atas, dilakukan peningkatan flow
rate menjadi 1,5 ml/menit yang diperkirakan dapat memperbaiki bentuk peak
propifenazon yang tidak runcing serta mempercepat keluarnya seluruh sampel
dari kolom untuk meningkatkan efisiensi waktu pemisahan. Hasilnya dapat dilihat
pada kromatogram berikut :
Gambar 26. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan fase
gerak metanol : aquabidest (40 : 60) flow rate 1,5 ml/menit
Pada tr = 2,481 merupakan peak parasetamol; pada tr = 3,574 merupakan
peak kafein; dan pada tr = 8,590 merupakan peak propifenazon. Pada
kromatogram di atas, terlihat bentuk peak parasetemol dan kafein sudah cukup
runcing, sedangkan peak propifenazon masih kurang runcing meskipun waktu
yang dibutuhkan oleh sampel untuk sepenuhnya keluar dari kolom sudah kurang
dari 15 menit, serta resolusi peak parasetamol – kafein sebesar 1,617. Sehingga
dilakukan running pada flow rate yang lebih tinggi lagi, yaitu pada 2,0 ml/menit
untuk memperuncing bentuk peak propifenazon. Hasilnya dapat dilihat pada
kromatogram berikut :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
Gambar 27. Kromatogram pemisahan parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan fase
gerak metanol : aquabidest (40 : 60) flow rate 2,0 ml/menit
Pada tr = 1,816 merupakan peak parasetamol; pada tr = 2,534 merupakan
peak kafein; dan pada tr = 5,850 merupakan peak propifenazon. Dari kromatogram
tersebut dapat disimpulkan bahwa waktu retensi yang diperoleh lebih singkat,
pemisahannya cukup baik dengan nilai resolusi peak parasetamol – kafein sebesar
1,306 serta bentuk ketiga peak yang cukup runcing. Berdasarkan hasil optimasi
yang dilakukan, diperoleh kondisi yang optimal ialah sebagai berikut :
Instrumen : Shimadzu LC-10 AD
Kolom : ODS merek DuPont Instruments Zorbax berdimensi
4,6 mm x 25 cm P.N 880952-702
Fase gerak : metanol : aquabidest (40 : 60)
Flow rate : 2,0 ml/menit
AUFs/Attenuation : 0,01/8
Detektor : UV pada 272 nm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
D. Penetapan Kadar Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein
dalam Sampel Simulasi
1. Pembuatan Kurva Baku
Kurva baku parasetamol dibuat dengan kadar 62,5 ppm; 125,0 ppm; 187,5
ppm; 250,0 ppm; 312,5 ppm; dan 375,0 ppm, untuk propifenazon dibuat dengan
kadar 37,5 ppm; 75,0 ppm; 112,5 ppm; 150,0 ppm; 187,5 ppm; dan 225,0 ppm.
Sedangkan untuk kafein dibuat dengan kadar 12,5 ppm; 25,0 ppm; 37,5 ppm; 50,0
ppm; 62,5 ppm; dan 75,0 ppm. Tiap seri kadar baku tersebut kemudian
diinjeksikan pada KCKT dengan sistem seperti di atas. Untuk menentukan kurva
baku yang akan digunakan dari masing – masing senyawa, maka dilakukan
replikasi sebanyak 3 kali. Adapun persamaan untuk masing – masing kurva baku
dari parasetamol, propifenazon dan kafein dapat dilihat pada tabel IV, V dan VI
berikut ini :
Tabel IV. Data Kurva Baku Parasetamol
Baku parasetamol
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
C (ppm) AUC C (ppm) AUC C (ppm) AUC
63,0500 433277 62,2375 375404 62,7375 363578
126,1000 782447 124,4750 736919 125,4750 744345
189,1500 1158864 186,7125 1148448 188,2125 1138321
252,2000 1645115 248,9500 1555291 250,9500 1521173
315,2500 2030640 311,1875 1979372 313,6875 1905797
378,3000 2514297 373,4250 2323369 376,4250 2260491
B = 6632,3462 B = 6369,1628 B = 6080,5615
A = -36153,0000 A = -34268,8667 A = -12893,1333
r = 0,9986 r= 0,9996 r = 0,9999
SE = 47038,9469 SE = 23093,1561 SE = 11593,8110
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
Gambar 28. Kurva baku parasetamol (replikasi 3)
Tabel V. Data Kurva Baku Propifenazon
Baku propifenazon
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
C (ppm) AUC C (ppm) AUC C (ppm) AUC
37,5500 534864 37,1625 584806 36,9500 426220
75,1000 908171 74,3250 880325 73,9000 815260
112,6500 1297158 111,4875 1349126 110,8500 1250126
150,2000 1760441 148,6500 1852736 147,8000 1710807
187,7500 2230475 185,8125 2159391 184,7500 2264568
225,3000 2653911 222,9750 2706848 221,7000 2829904
B = 11432,7031 B = 11494,7041 B = 13011,4247
A = 61627,0000 A = 93770,2000 A = -133221,6667
r = 0,9991 r = 0,9969 r = 0,9973
SE = 38495,1921 SE = 69505,9370 SE = 74641,2891
Gambar 29. Kurva baku propifenazon (replikasi 1)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
Tabel VI. Data Kurva Baku Kafein
Baku kafein
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
C (ppm) AUC C (ppm) AUC C (ppm) AUC
12,1250 197727 12,5375 162383 11,2000 181499
24,2500 347263 25,0750 340703 22,4000 308807
36,3750 545312 37,6125 512751 33,6000 465661
48,5000 731223 50,1500 802826 44,8000 647505
60,6250 1001288 62,6875 950287 56,0000 803060
72,7500 1105900 75,2250 1120367 67,2000 961379
B = 15761,6518 B = 15744,1891 B = 14193,8852
A = -14099,6000 A = -42655,2000 A = 4918,2000
r = 0,9956 r = 0,9962 r = 0,9991
SE = 37797,8862 SE = 35909,8330 SE = 14419,9999
Gambar 30. Kurva baku kafein (replikasi 3)
Persamaan kurva baku dari parasetamol, propifenazon, dan kafein yang
diperoleh dari hasil 3 kali replikasi semuanya memiliki koefisien korelasi (r) yang
lebih besar dari nilai r tabel dengan derajat bebas (df) 4 dan taraf kepercayaan
99% yaitu 0,917 sehingga dapat dikatakan semua persamaan kurva baku yang
diperoleh tersebut dapat digunakan untuk menetapkan kadar sampel. Koefisien
korelasi (r) merupakan parameter linieritas dari suatu persamaan regresi linier di
mana nilainya semakin mendekati satu menunjukkan semakin baik linieritas
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
persamaan yang diperoleh sehingga semakin baik hubungan antara peningkatan
kadar dan peningkatan respon yang didapat. Respon yang dimaksudkan di sini
ialah nilai AUC (Area Under Curve). Namun hanya persamaan kurva baku yang
memiliki nilai r yang paling mendekati satu dan memiliki nilai SE yang paling
kecil yang digunakan untuk menetapkan kadar tiap komponen dalam simulasi
sampel. Nilai SE yang kecil dipilih karena menunjukkan penyimpangan yang
kecil pula. Persamaan kurva baku yang dipilih untuk menetapkan kadar campuran
parasetamol, propifenazon, dan kafein adalah y = 6080,5615 x – 12893,1333
untuk parasetamol; y = 11432,7031 x + 61627,0000 untuk propifenazon; dan
y = 14193,8852 x + 4918,2000 untuk kafein.
2. Penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam
campuran sampel simulasi dan validasi metode
Pada penelitian ini dilakukan penetapan kadar parasetamol, propifenazon,
dan kafein dalam campuran yang sesuai dengan perbandingan dalam komposisi
dalam tablet yang beredar di pasaran yaitu dengan perbandingan 5 : 3 : 1. Larutan
induk sampel simulasi yang digunakan pada penelitian ini dibuat dari baku
parasetamol sebanyak 50 mg, baku propifenazon 30 mg, dan baku kafein 10 mg
yang dicampur dan dilarutkan dalam metanol hingga 10 ml. Dengan demikian,
diharapkan hasil yang diperoleh dapat menggambarkan hal yang sama dengan
hasil yang diperoleh dari penetapan kadar ketiga komponen tersebut dalam sampel
yang sesungguhnya dan data yang diperoleh dapat menggambarkan validitas dari
metode yang diperoleh. Penetapan kadar dilakukan pada tingkat kadar rendah,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
sedang, dan tinggi; masing – masing sebanyak 3 kali replikasi untuk menentukan
akurasi dan presisi dari tiap hasil yang diperoleh. Nilai kadar dari tiap komponen
pada masing – masing sampel simulasi diperoleh dengan cara memasukkan nilai
AUC dari masing – masing senyawa pada tiap replikasi ke dalam persamaan
kurva baku masing – masing senyawa sehingga diperoleh hasil sebagai berikut :
Tabel VII. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sampel simulasi kadar
rendah Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
94,856 – 111,787%
SE = 5,099
= 101,868%
CV = 5,006%
1 347666 59,2970 4743,761 5001 94,856
2 361834 61,6271 4930,165 4982 98,960
3 413976 70,2023 5616,18 5024 111,787
Tabel VIII. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi
kadar rendah
Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
85,792 – 98,084%
SE= 3,807
= 90,558%
CV = 4,204%
1 441931 33,2646 2661,166 3031 87,798
2 436798 32,8156 2625,248 3060 85,792
3 485223 37,0513 2964,100 3022 98,084
Tabel IX. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel simulasi kadar rendah
Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
100,591 – 118,654%
SE = 5,991
= 106,671%
CV = 5,616%
1 173958 12,2470 979,7571 974 100,591
2 175876 12,3821 990,5674 983 100,770
3 216961 15,2766 1222,1320 1030 118,654
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
Validasi yang dilakukan pada penelitian ini termasuk dalam kategori I
menurut USP 28 karena penelitian yang dilakukan merupakan metode analisis
kuantitatif untuk menetapkan kadar zat aktif dalam sediaan farmasi. Validitas
metode yang digunakan pada penelitian ini ditentukan berdasarkan parameter
akurasi, presisi, spesifisitas, linieritas, dan range. Namun, parameter yang
difokuskan pada validasi yang dilakukan pada penelitian ini adalah akurasi dan
presisi yang diperoleh, karena parameter spesifisitas dapat dilihat langsung dari
hasil pemisahan yang terjadi, linieritas dapat dilihat dari nilai r (koefisien korelasi)
kurva baku, dan untuk parameter range ditentukan dari rentang kadar analit
terukur yang telah memenuhi kriteria parameter akurasi dan presisi. Parameter
akurasi dinyatakan dengan nilai recovery atau perolehan kembali, sedangkan
parameter untuk presisi dinyatakan dengan nilai CV (coefficient of variation).
Pada penetapan kadar yang telah dilakukan, rentang recovery yang
diperoleh adalah 94,856 – 111,787% untuk parasetamol dan 85,792 – 98,084%
untuk propifenazon. Nilai rentang recovery ini tidak memenuhi kesepakatan untuk
sampel dengan rasio besar yaitu 95 – 105% (Mulja dan Hanwar, 2003). Untuk
kafein memiliki rentang recovery yaitu 100,591 – 118,654% dan menurut Mulja
dan Hanwar (2003) untuk senyawa dengan rasio kecil rentang recovery yang
dianjurkan adalah 90 – 110% sehingga rentang dari hasil penelitian untuk kafein
juga dapat dikatakan tidak memenuhi persyaratan. Hasil ini menunjukkan bahwa
metode yang digunakan memiliki akurasi yang kurang baik pada penetapan kadar
ketiga analit dalam sampel simulasi kadar rendah.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
Pada penetapan kadar ini, diperoleh nilai CV sebesar 5,006% untuk
parasetamol; 4,204% untuk propifenazon; dan 5,616% untuk kafein. Nilai ini
tidak memenuhi syarat presisi yang baik yaitu harga CV < 2% untuk zat aktif
yang merupakan kadar analit yang besar dalam campuran (Harmita, 2004),
sehingga metode ini juga memiliki presisi yang kurang baik pada penetapan kadar
ketiga analit dalam sampel simulasi kadar rendah.
Selanjutnya, dilakukan penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan
kafein pada sampel simulasi kadar sedang dengan hasil seperti pada tabel berikut :
Tabel X. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sampel simulasi kadar
sedang Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery
= 95,741 – 98,759%
SE= 0,947
= 96,877%
CV = 0,978%
1 1442792 239,3998 4787,996 5001 95,741
2 1486883 246,6509 4933,019 4995 98,759
3 1448156 240,2819 4805,639 4999 96,132
Tabel XI. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi kadar
sedang
Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
97,760 – 101,220%
SE= 1,121
= 98,983%
CV = 1,132%
1 1759032 148,4693 2969,385 3031 97,967
2 1795726 151,6788 3033,577 2997 101,220
3 1757686 148,3515 2967,031 3035 97,760
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
Tabel XII. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel simulasi kadar
sedang Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
105,556 – 109,397%
SE= 1,218
= 107,980%
CV = 1,128%
1 715838 50,0863 1001,727 949 105,556
2 788289 55,1907 1103,814 1009 109,397
3 779949 54,6031 1092,063 1002 108,988
Berdasarkan tabel tersebut dapat dilihat bahwa rentang recovery yang
diperoleh adalah 95,741 – 98,759% untuk parasetamol dan 97,760 – 101,220%
untuk propifenazon. Nilai rentang recovery ini memenuhi kesepakatan untuk
sampel dengan rasio besar yaitu 95 – 105% (Mulja dan Hanwar, 2003). Untuk
kafein memiliki rentang recovery yaitu 105,556 – 109,397 % dan menurut Mulja
dan Hanwar (2003) untuk senyawa dengan rasio kecil rentang recovery yang
dianjurkan adalah 90 – 110% sehingga rentang dari hasil penelitian untuk kafein
dapat dikatakan memenuhi persyaratan. Hasil ini menunjukkan bahwa metode
yang digunakan memiliki akurasi yang baik untuk pengukuran kadar ketiga analit
dalam sampel simulasi kadar sedang.
Sedangkan, nilai CV yang diperoleh adalah 0,978% untuk parasetamol;
1,132% untuk propifenazon; dan 1,128% untuk kafein. Nilai CV ketiga analit
tersebut memenuhi syarat presisi yang baik yaitu harga CV < 2% untuk zat aktif
yang merupakan kadar analit yang besar dalam campuran (Harmita, 2004). Hasil
ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan memiliki presisi yang baik untuk
pengukuran kadar ketiga analit dalam sampel simulasi pada kadar sedang.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Kemudian, dilakukan penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan
kafein pada sampel simulasi kadar tinggi untuk menentukan akurasi dan
presisinya dengan hasil seperti pada tabel berikut :
Tabel XIII. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sampel simulasi
kadar tinggi Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
92,517 – 97,608%
SE= 1,498
= 94,775%
CV = 1,580%
1 2213225 366,1040 4881,387 5001 97,608
2 2134216 353,1103 4708,138 4998 94,200
3 2097955 347,1469 4628,625 5003 92,517
Tabel XIV. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi
kadar tinggi
Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
96,109 – 102,425%
SE= 2,025
= 98,386%
CV = 2,058%
1 2723590 232,8376 3104,501 3031 102,425
2 2588580 221,0285 2947,046 3050 96,624
3 2531417 216,0285 2880,380 2997 96,109
Tabel XV. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel simulasi kadar tinggi
Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
104,250 – 107,377%
SE= 0,969
= 106,166%
CV = 0,913%
1 1113029 78,0696 1040,928 974 106,871
2 1197138 83,9953 1119,937 1043 107,377
3 1108044 77,7184 1036,245 994 104,250
Berdasarkan tabel tersebut dapat dilihat rentang recovery yang diperoleh
adalah 92,517 – 97,608% untuk parasetamol dan 96,109 – 102,425 % untuk
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
propifenazon. Nilai rentang recovery parasetamol tidak memenuhi kesepakatan
untuk sampel dengan rasio besar yaitu 95–105% (Mulja dan Hanwar, 2003).
Sedangkan, nilai rentang recovery propifenazon memenuhi kesepakatan untuk
sampel dengan rasio besar yaitu 95–105% (Mulja dan Hanwar, 2003). Untuk
kafein memiliki rentang recovery yaitu 104,250 – 107,377% dan menurut Mulja
dan Hanwar (2003) untuk senyawa dengan rasio kecil rentang recovery yang
dianjurkan adalah 90–110% sehingga rentang dari hasil penelitian untuk kafein
dapat dikatakan memenuhi persyaratan. Hasil ini menunjukkan bahwa metode
yang digunakan memiliki akurasi yang kurang baik pada penetapan kadar
parasetamol dalam sampel simulasi kadar tinggi, namun memiliki akurasi yang
cukup baik pada penetapan kadar propifenazon dan kafein dalam sampel simulasi
kadar tinggi.
Sedangkan, nilai CV yang diperoleh adalah 1,580% untuk parasetamol;
2,058% untuk propifenazon; dan 0,913% untuk kafein. Nilai CV propifenazon
tidak memenuhi syarat presisi yang baik yaitu harga CV < 2% untuk zat aktif
yang merupakan kadar analit yang besar dalam campuran (Harmita, 2004),
sedangkan nilai CV parasetamol dan kafein memenuhi syarat CV < 2%. Hasil ini
menunjukkan bahwa metode yang digunakan memiliki presisi yang kurang baik
pada penetapan kadar propifenazon dalam sampel simulasi kadar tinggi, namun
memiliki presisi yang cukup baik pada penetapan kadar parasetamol dan kafein
dalam sampel simulasi kadar tinggi. Dari hasil analisis tersebut menunjukkan
bahwa metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan kondisi seperti yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
digunakan untuk menetapkan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam
sampel simulasi pada kadar tinggi memiliki akurasi dan presisi yang kurang baik.
Parameter linieritas metode ini telah dipenuhi berdasarkan nilai koefisien
korelasi kurva baku ketiga analit yang didapat yaitu lebih besar dari 0,999
(Harmita, 2004). Nilai koefisien korelasi baku parasetamol sebesar 0,9999; nilai
koefisien korelasi baku propifenazon sebesar 0,9991; dan nilai koefisien korelasi
baku kafein sebesar 0,9991.
Sedangkan parameter range merupakan rentang kadar analit terukur yang
telah memenuhi kriteria parameter akurasi dan presisi. Range untuk parasetamol
berkisar antara 239,3998 – 246,6509 ppm; range untuk propifenazon berkisar
antara 148,3515 – 151,6788 ppm; dan range untuk kafein berkisar antara
50,0863 – 83,9953 ppm
.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa :
1. Kondisi yang optimal untuk memisahkan komponen parasetamol,
propifenazon, dan kafein dalam campuran ialah sebagai berikut :
Instrumen : Shimadzu LC-10 AD
Kolom : ODS merek DuPont Instruments Zorbax berdimensi
4,6 mm x 25 cm P.N 880952-702
Fase gerak : metanol : aquabidest (40 : 60)
Flow rate : 2,0 ml/menit
AUFs/Attenuation : 0,01/8
Detektor : UV pada 272 nm
2. Metode penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein pada sampel
simulasi kadar sedang dengan KCKT dengan kondisi di atas memiliki akurasi
yang baik dilihat dari nilai recovery untuk parasetamol dan propifenazon
95–105% dan untuk kafein 90–110%; presisi yang baik untuk penetapan kadar
parasetamol, propifenazon, dan kafein dilihat dari nilai CV < 2%; spesifisitas
yang baik ditunjukkan oleh profil pemisahan ketiga analit; linieritas yang baik
ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasi (r) kurva baku ketiga analit yang
bernilai > 0,999; dan range untuk parasetamol berkisar antara
239,3998 – 246,6509 ppm; range untuk propifenazon berkisar antara
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
148,3515 – 151,6788 ppm; dan range untuk kafein berkisar antara
50,0863 – 83,9953 ppm
B. Saran
Perlu dilakukan analisis multikomponen terhadap sampel yang beredar di
pasaran yang mengandung tiga komponen di atas dengan menggunakan metode
pada penelitian ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1989, The Merck Index an Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and
Biologicals, 11th
ed., 7784, Merck & Co. Inc., Rahway N. J., USA.
Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 254, 649, 753, Departemen
Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Anonim, 2005, The United States Pharmacopeia 28th edition, 2748-2751, United
States Pharmacopeial Convention,Inc., Rockville.
Auterhoff, K., 1987, Identifikasi Obat, 165, 176, ITB Press, Bandung.
Azizahwati, 2000, Swamedikasi secara Aman dan Bijaksana, terutama dalam
Penanganan Batuk dan Pilek., Seminar Swamedikasi Khusus Dalam
Penanganan Batuk dan Pilek, Depok 23 September 2000, Universitas
Indonesia, Depok.
Clarke, E.G.C., 1986, Isolation and Identification of Drugs, 2nd edition, 234, 465,
538, The Pharmaceutical Press, London.
Dimitrovska, A., Trajkovic-Jolevska, S., Nancovska, A., dan Ilievska, M., 1995,
Determination of Propyphenazone, Paracetamol, Caffeine and
Codeine Phosphate with Thin Layer Chromatography, Bulletin of the
Chemists and Technologists of Macedonia, 14, 1, 39-41.
Gritter, R.J, Bobbit, J.M., Schwarting, A.E., 1991, Pengantar Kromatografi
diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, edisi II, 186, 199, 200,
206, ITB, Bandung.
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara
Perhitungannya, 5-25, Departemen Farmasi FMIPA UI, Depok.
Harris, D.C., 1999, Quantitative Chemical Analysis, 2nd
ed., 648, W.H.Freeman
and Company, New York.
Hendayana, S., 2006, Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis
Modern, 21-25, PT Remaja Rosdakarya, Bandung.
Ivanovic, D., Medenica, M., Malenovic, A., Jancic, B., Misljenovic, Dj., 2003,
Optimization of the RP-HPLC Method for Multicomponent
Analgetic Drug Determination., Boll Chim Farm., 142(9), 386-9.
Johnson, E.L., dan Stevenson, R., 1978, Basic Liquid Chromatography,
diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 6, 9, 22, ITB, Bandung.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
Kuwana, 1980, Physical Methods in Modern Chemical Analysis, 13, Academic
Press, New York.
Mulja, M. dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-Prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik
(Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Indonesia Airlangga,
Vol.III,No.2,71-76, Universitas Airlangga Press, Surabaya.
Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 6-11, 26, 31, 34
Universitas Airlangga, Surabaya.
Munson, J.W., 1991, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan
oleh Harjana, Parwa.B,15, 33-34, Universitas Airlangga Press,
Surabaya.
Nair, H.M. and Bonelli, E.J., 1988, Basic Gas Chromatography,diterjemahkan
oleh Kosasih Padmawinata,4,19, ITB,Bandung.
Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, 6, 18-21, 28, 31-32, UGM,
Yogyakarta.
Raffa, R.B., 2006, Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 21st
edition, 1542, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia.
Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, 229 – 250, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta
Sastrohamidjojo, 2002, Kromatografi, edisi kedua, 71, Liberty Yogyakarta,
Yogyakarta.
Settle, F.A., 1997, Handbook of Instrumental Techniques for Analytical
Chemistry, 150-151, Prentice Hall PTR, Upper Saddle River, New
Jersey.
Skoog, D.A., West, D.M, Holler, F.J., 1994, Analytical Chemistry : An
Introduction, 6th
edition, 490, Harcourt Brace College Publishers ,
Orlando, Florida.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L, 1997, Practical HPLC Method
Development, 2nd ed., 208-209, 252, 695-697, John Willey & Sons
Inc., New York.
Watson, 1999, Pharmaceutical Analysis, 98, 238, Churchill Livingstone, London.
Willard, H.H., Merritt, Jr., Dean, J.A, and Settle Jr, F.A, 1988, Instrumental
Methods of Analysis, 7th edition, 614-615, Wadsworth Publishing
Company, California.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
Yanuar, A., Hayun, Suryadi, M.T., Henry, A., dan Wulandari, R., 2003, Program
Komputer Analisis Multikomponen untuk Obat Flu dan Analgesik-
Antiinflamasi, Laporan Penelitian, FMIPA Universitas Indonesia,
Depok.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
Lampiran 1
Sertifikat Analisis Parasetamol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
Lampiran 2
Sertifikat Analisis Propifenazon
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
Lampiran 3.
Sertifikat Analisis Kafein
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
80
Lampiran 4. Skema pembuatan larutan baku parasetamol dan contoh perhitungan
kadar larutan baku yang digunakan
a. Skema pembuatan
Timbang seksama ± 50 mg parasetamol
↓
Larutkan dalam metanol ad 10 ml (Larutan induk PCT)
↓
Pipet larutan induk PCT sebanyak 125 µl; 250 µl; 375 µl; 500 µl; 625 µl; dan
750 µl
↓
Encerkan dengan metanol ad 10,0 ml
b. Perhitungan seri baku parasetamol (replikasi 3)
• Bobot parasetamol hasil penimbangan = 0,05019 g = 50,19 mg
• Kadar parasetamol dalam larutan induk PCT = 50,19 mg/10ml = 5019 ppm
• Seri larutan baku parasetamol :
Volume pemipetan Perhitungan
(Kadar dalam larutan induk PCT x pengenceran )
125 µl 5019 ppm x
10
125,0= 62,7375 ppm
250 µl 5019 ppm x
10
250,0= 125,4750 ppm
375 µl 5019 ppm x
10
375,0= 188,2125 ppm
500 µl 5019 ppm x
10
500,0= 250,9500 ppm
625 µl 5019 ppm x
10
625,0= 313,6875 ppm
750 µl 5019 ppm x
10
750,0= 376,4250 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
Lampiran 5. Skema pembuatan larutan baku propifenazon dan contoh
perhitungan kadar larutan baku yang digunakan
a. Skema pembuatan
Timbang seksama ± 30 mg propifenazon
↓
Larutkan dalam metanol ad 10 ml (Larutan induk PPZ)
↓
Pipet larutan induk PPZ sebanyak 125 µl; 250 µl; 375 µl; 500 µl; 625 µl; dan
750 µl
↓
Encerkan dengan metanol ad 10,0 ml
b. Perhitungan seri baku propifenazon (replikasi 1)
• Bobot propifenazon hasil penimbangan = 0,03004 g = 30,04 mg
• Kadar propifenazon dalam larutan induk PPZ = 30,04 mg/10ml = 3004 ppm
• Seri larutan baku propifenazon :
Volume pemipetan Perhitungan
(Kadar dalam larutan induk PPZ x pengenceran )
125 µl 3004 ppm x
10
125,0= 37,5500 ppm
250 µl 3004 ppm x
10
250,0= 75,1000 ppm
375 µl 3004 ppm x
10
375,0= 112,6500 ppm
500 µl 3004 ppm x
10
500,0= 150,2000 ppm
625 µl 3004 ppm x
10
625,0= 187,7500 ppm
750 µl 3004 ppm x
10
750,0= 225,3000 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
82
Lampiran 6. Skema pembuatan larutan baku kafein dan contoh perhitungan
kadar larutan baku yang digunakan
a. Skema pembuatan
Timbang seksama ± 10 mg kafein
↓
Larutkan dalam metanol ad 10 ml (Larutan induk KFN)
↓
Pipet larutan induk KFN sebanyak 125 µl; 250 µl; 375 µl; 500 µl; 625 µl; dan
750 µl
↓
Encerkan dengan metanol ad 10,0 ml
b. Perhitungan seri baku kafein (replikasi 3)
• Bobot kafein hasil penimbangan = 0,00896 g = 8,96 mg
• Kadar kafein dalam larutan induk KFN = 8,96 mg/10ml = 896 ppm
• Seri larutan baku kafein :
Volume pemipetan Perhitungan
(Kadar dalam larutan induk KFN x pengenceran )
125 µl 896 ppm x
10
125,0= 11,2000 ppm
250 µl 896 ppm x
10
250,0= 22,4000 ppm
375 µl 896 ppm x
10
375,0= 33,6000 ppm
500 µl 896 ppm x
10
500,0= 44,8000 ppm
625 µl 896 ppm x
10
625,0= 56,0000 ppm
750 µl 896 ppm x
10
750,0= 67,2000 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
83
Lampiran 7. Kromatogram Larutan Kurva Baku Parasetamol
Instrumen : Shimadzu LC-10 AD
Kolom : DuPont Instruments Zorbax ODS 4,6 mm x 25 cm
P.N. 880952-752.
Fase gerak : metanol : aquabidest (40 : 60)
Flow rate : 2,0 ml/menit
AUFs/Attenuation : 0,01/8
Detektor : UV pada 272 nm
Larutan Baku Parasetamol 62,7375 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
84
Larutan Baku Parasetamol 125,4750 ppm
Larutan Baku Parasetamol 188,2125 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
85
Larutan Baku Parasetamol 250,9500 ppm
Larutan Baku Parasetamol 313,6875 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
86
Larutan Baku Parasetamol 376,4250 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
87
Lampiran 8. Kromatogram Larutan Kurva Baku Propifenazon
Instrumen : Shimadzu LC-10 AD
Kolom : DuPont Instruments Zorbax ODS 4,6 mm x 25 cm
P.N. 880952-752.
Fase gerak : metanol : aquabidest (40 : 60)
Flow rate : 2,0 ml/menit
AUFs/Attenuation : 0,01/8
Detektor : UV pada 272 nm
Larutan Baku Propifenazon 37,5500 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
88
Larutan Baku Propifenazon 75,1000 ppm
Larutan Baku Propifenazon 112,6500 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
89
Larutan Baku Propifenazon 150,2000 ppm
Larutan Baku Propifenazon 187,7500 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
90
Larutan Baku Propifenazon 225,3000 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
91
Lampiran 9. Kromatogram Larutan Kurva Baku Kafein
Instrumen : Shimadzu LC-10 AD
Kolom : DuPont Instruments Zorbax ODS 4,6 mm x 25 cm
P.N. 880952-752.
Fase gerak : metanol : aquabidest (40 : 60)
Flow rate : 2,0 ml/menit
AUFs/Attenuation : 0,01/8
Detektor : UV pada 272 nm
Larutan Baku Kafein 11,2000 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
92
Larutan Baku Kafein 22,4000 ppm
Larutan Baku Kafein 33,6000 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
93
Larutan Baku Kafein 44,8000 ppm
Larutan Baku Kafein 56,0000 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
94
Larutan Baku Kafein 67,2000 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
95
Lampiran 10. Skema pembuatan sampel simulasi dan contoh perhitungan
kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam sampel simulasi
a. Skema pembuatan
Timbang seksama ± 50 mg baku parasetamol; 30 mg baku propifenazon dan
10 mg baku kafein
↓
Campur dan larutkan dalam metanol ad 10 ml (larutan induk sampel simulasi)
↓
Pipet larutan induk sampel simulasi sebanyak :
125 µl (sampel simulasi kadar rendah);
500 µl (sampel simulasi kadar sedang);
750 µl (sampel simulasi kadar tinggi)
↓
Encerkan dengan metanol ad 10 ml
↓
Saring dengan Millipore dan degassing selama 15 menit
↓
Injeksikan pada KCKT
b. Contoh perhitungan kadar parasetamol dalam sampel simulasi
1) Kadar teoritis parasetamol dalam sampel simulasi (contoh sampel simulasi
kadar rendah 1)
Berat penimbangan = 50,01 mg dilarutkan dalam 10 ml metanol (yang di
dalam larutan induk sampel simulasi terlarut propifenazon dan kafein juga
dengan perbandingan parasetamol : propifenazon : kafein = 5 : 3 : 1) dan
diencerkan dengan cara mengambil 125 µl larutan tersebut dan dilarutkan
dalam metanol ad 10 ml.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
96
Kadar parasetamol dalam larutan induk sampel simulasi
= ppmml
mg,5001
10
0150
Kadar terhitung parasetamol dalam larutan sampel simulasi kadar rendah
= ppm,ml
lx
ml
mg,512562
10
125
10
0150
2) Kadar terukur parasetamol hasil penelitian pada sampel simulasi (contoh
sampel simulasi kadar rendah 1)
Nilai AUC dari peak parasetamol dimasukkan ke dalam persamaan kurva
baku yang diperoleh yaitu untuk parasetamol y = 6080,5615x – 12893,1333
untuk mendapatkan kadar terukur parasetamol dalam larutan uji kemudian
dikalikan faktor pengenceran 10000/125 (sampel simulasi kadar rendah) untuk
mendapatkan kadar terukur parasetamol dalam larutan induk sampel simulasi.
Contoh :
Nilai AUC pada sampel simulasi kadar rendah no.1 = 347666
Persamaan kurva baku parasetamol (AUC vs konsentrasi (ppm)) :
y = 6080,5615x – 12893,1333
Perhitungan :
Kadar parasetamol dalam larutan uji :
347666 = 6080,5615x – 12893,1333
x = 59,2970 ppm
kadar parasetamol dalam larutan induk sampel simulasi =
59,2970 ppm x l
l
125
10000= 4743,7610 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
97
Recovery sampel =
simulasi sampellarutanpadalparasetamoteoritiskadar
simulasi sampelinduklarutandalamlparasetamoterukurkadarX100%
%,%xppm
ppm,856094100
5001
76104743
Kadar parasetamol dalam sampel simulasi kadar rendah Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
94,856 – 111,787%
SE = 5,099
= 101,868%
CV = 5,006%
1 347666 59,2970 4743,761 5001 94,856
2 361834 61,6271 4930,165 4982 98,960
3 413976 70,2023 5616,18 5024 111,787
Kadar parasetamol dalam sampel simulasi kadar sedang
Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery
= 95,741 – 98,759%
SE= 0,947
= 96,877%
CV = 0,978%
1 1442792 239,3998 4787,996 5001 95,741
2 1486883 246,6509 4933,019 4995 98,759
3 1448156 240,2819 4805,639 4999 96,132
Kadar parasetamol dalam sampel simulasi kadar tinggi
Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
92,517 – 97,608%
SE= 1,498
= 94,775%
CV = 1,580%
1 2213225 366,1040 4881,387 5001 97,608
2 2134216 353,1103 4708,138 4998 94,200
3 2097955 347,1469 4628,625 5003 92,517
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
98
c. Contoh perhitungan kadar propifenazon dalam sampel simulasi
1) Kadar teoritis propifenazon dalam sampel simulasi (contoh sampel simulasi
kadar rendah 1)
Berat penimbangan = 30,31 mg dilarutkan dalam 10 ml metanol (yang di
dalam larutan induk sampel simulasi terlarut parasetamol dan kafein juga
dengan perbandingan parasetamol : propifenazon : kafein = 5 : 3 : 1) dan
diencerkan dengan cara mengambil 125 µl larutan tersebut dan dilarutkan
dalam metanol ad 10 ml.
Kadar propifenazon dalam larutan induk sampel simulasi
= ppmml
mg,3031
10
3130
Kadar terhitung propifenazon dalam larutan sampel simulasi kadar rendah
= ppm,ml
lx
ml
mg,887537
10
125
10
3130
2) Kadar terukur propifenazon hasil penelitian pada sampel simulasi (contoh
sampel simulasi kadar rendah 1)
Nilai AUC dari peak propifenazon dimasukkan ke dalam persamaan kurva
baku yang diperoleh yaitu untuk propifenazon y = 11432,7031x + 61627,0000
untuk mendapatkan kadar terukur propifenazon dalam larutan uji kemudian
dikalikan faktor pengenceran 10000/125 (sampel simulasi kadar rendah) untuk
mendapatkan kadar terukur propifenazon dalam larutan induk sampel
simulasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
99
Contoh :
Nilai AUC pada sampel simulasi kadar rendah no.1 = 441931
Persamaan kurva baku propifenazon (AUC vs konsentrasi (ppm)) :
y = 11432,7031x + 61627,0000
Perhitungan :
Kadar propifenazon dalam larutan uji :
441931 = 11432,7031x + 61627,0000
x = 33,2646 ppm
kadar propifenazon dalam larutan induk sampel simulasi =
36,2646 ppm x l
l
125
10000= 2661,1660 ppm
Recovery sampel =
simulasi sampellarutanpadaonpropifenazteoritiskadar
simulasi sampelinduklarutandalamonpropifenazterukurkadarX100%
%,%xppm
ppm,798087100
3031
16602661
Kadar propifenazon dalam sampel simulasi kadar rendah Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
85,792 – 98,084%
SE= 3,807
= 90,558%
CV = 4,204%
1 441931 33,2646 2661,166 3031 87,798
2 436798 32,8156 2625,248 3060 85,792
3 485223 37,0513 2964,100 3022 98,084
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
100
Kadar propifenazon dalam sampel simulasi kadar sedang Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
97,760 – 101,220%
SE= 1,121
= 98,983%
CV = 1,132%
1 1759032 148,4693 2969,385 3031 97,967
2 1795726 151,6788 3033,577 2997 101,220
3 1757686 148,3515 2967,031 3035 97,760
Kadar propifenazon dalam sampel simulasi kadar tinggi
Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
96,109 – 102,425%
SE= 2,025
= 98,386%
CV = 2,058%
1 2723590 232,8376 3104,501 3031 102,425
2 2588580 221,0285 2947,046 3050 96,624
3 2531417 216,0285 2880,380 2997 96,109
d. Contoh perhitungan kadar kafein dalam sampel simulasi
1) Kadar teoritis kafein dalam sampel simulasi (contoh sampel simulasi kadar
rendah 1)
Berat penimbangan = 9,74 mg dilarutkan dalam 10 ml metanol (yang di dalam
larutan induk sampel simulasi terlarut parasetamol dan kafein juga dengan
perbandingan parasetamol : propifenazon : kafein = 5 : 3 : 1) dan diencerkan
dengan cara mengambil 125 µl larutan tersebut dan dilarutkan dalam metanol
ad 10 ml.
Kadar kafein dalam larutan induk sampel simulasi
= ppmml
mg,974
10
749
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
101
Kadar terhitung kafein dalam larutan sampel simulasi kadar rendah
= ppm,ml
lx
ml
mg,175012
10
125
10
749
2) Kadar terukur kafein hasil penelitian pada sampel simulasi (contoh sampel
simulasi kadar rendah 1)
Nilai AUC dari peak kafein dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku yang
diperoleh yaitu untuk kafein y = 14193,8852x + 4918,2000 untuk
mendapatkan kadar terukur kafein dalam larutan uji kemudian dikalikan faktor
pengenceran 10000/125 (sampel simulasi kadar rendah) untuk mendapatkan
kadar terukur kafein dalam larutan induk sampel simulasi.
Contoh :
Nilai AUC pada sampel simulasi kadar rendah no.1 = 173958
Persamaan kurva baku kafein (AUC vs konsentrasi (ppm)) :
y = 14193,8852x + 4918,2000
Perhitungan :
Kadar kafein dalam larutan uji :
173958 = 14193,8852x + 4918,2000
x = 12,2470 ppm
kadar kafein dalam larutan induk sampel simulasi
= 12,2470 ppm x l
l
125
10000= 979,7571 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
102
Recovery sampel
= simulasi sampellarutanpadaonpropifenazteoritiskadar
simulasi sampelinduklarutandalamonpropifenazterukurkadarX100%
= %,%xppm
ppm,5910100100
974
7571979
Kadar kafein dalam sampel simulasi kadar rendah Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
100,591 – 118,654%
SE = 5,991
= 106,671%
CV = 5,616%
1 173958 12,2470 979,7571 974 100,591
2 175876 12,3821 990,5674 983 100,770
3 216961 15,2766 1222,1320 1030 118,654
Kadar kafein dalam sampel simulasi kadar sedang
Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
105,556 – 109,397%
SE= 1,218
= 107,980%
CV = 1,128%
1 715838 50,0863 1001,727 949 105,556
2 788289 55,1907 1103,814 1009 109,397
3 779949 54,6031 1092,063 1002 108,988
Kadar kafein dalam sampel simulasi kadar tinggi
Sampel
AUC Kadar
terukur
(ppm)
Kadar
terukur
dalam
larutan
induk
(ppm)
Kadar
teoritis
larutan
induk
(ppm)
Recovery
(%)
Rentang recovery =
104,250 – 107,377%
SE= 0,969
= 106,166%
CV = 0,913%
1 1113029 78,0696 1040,928 974 106,871
2 1197138 83,9953 1119,937 1043 107,377
3 1108044 77,7184 1036,245 994 104,250
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
103
Lampiran 11. Kromatogram Sampel
Sampel simulasi kadar rendah
Sampel 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
104
Sampel 2
Sampel 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
105
Sampel simulasi kadar sedang
Sampel 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
106
Sampel 2
Sampel 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
107
Sampel simulasi kadar tinggi
Sampel 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
108
Sampel 2
Sampel 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
109
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi berjudul “Validasi Penetapan Kadar
Campuran Parasetamol, Propifenazon, dan Kafein
dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase
Terbalik” ini memiliki nama lengkap Adrian Rendy
Irmanto. Penulis dilahirkan di Sleman pada tanggal 8
Juni 1987 sebagai anak sulung dari empat bersaudara
dari pasangan Sugeng Irmanto dan Yenny. Pendidikan
formal yang pernah ditempuh yaitu TK Pangudi Luhur
Yogyakarta (1991-1993), SD Pangudi Luhur
Yogyakarta (1993-1999), SLTP Stella Duce 1 Yogyakarta (1999-2002), SMUN 3
Yogyakarta (2002-2005), dan pada tahun 2005 melanjutkan pendidikan di
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama masa kuliah,
penulis pernah menjadi asisten dosen pada Praktikum Analisis Makanan dan
Praktikum Kromatografi. Selain kegiatan akademik, penulis juga pernah
mengikuti beberapa kegiatan non – akademik, antara lain ikut dalam kepanitiaan
Insadha 2006 dan sumpahan apoteker angkatan XIII.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI