Plant Science, 2009 C ó lon-Carmona Lab - University of Massachusetts Boston, USA

An oxidative stress response to polycyclic aromatic hydrocarbon

exposure is rapid and complex in A. thaliana

Plant Science, 2009 Cólon-Carmona Lab - University of Massachusetts Boston, USA

Resumo

HPA foram uma classe de compostos orgânicos carcinogênicos cancerígenos e são candidatos atrativos para a fitorremediaçãoPlântulas de Arabidopsis foram tratadas com fenantreno para entender em detalhes os mecanismos de stress oxidativoA atividade de das enzimas antioxidantes SOD, POD, CAT e APX, assim como H2O2, GSH e o produto da oxidação lipídica malondialdehyde (MDA) foram medidos no tecido foliar após 30 dias de tratamento com fenantreno de 0.25-1.25 mMSOD teve sua atividade aumentadaCAT permaneceu praticamente inalteradaPOD e APX exibiram pico em 0.25 mM e declinaram em concentrações mais altasH2O2, GSH e MDA aumentaram com fenantreno e o DAB mostrou-se dose-dependente da acumulação de H2O2

Resumo

Os níveis de RNAm de APX1 e CAT2 foram medidos em 6 pontos durante 72h de fenantreno a 1mM : APX1 - 48h e CAT2- 12hOs níveis de clorofila a e b caem com o aumento da concentração de fenantrenoA microscopia eletrônica de transmissão revelou que cloroplastos e mitocôndrias ficam deformados e estruturam celulares colapsaramIsto mostra que estresse oxidativo é um componente importante da resposta aos HPA em plantas

Materiais e Métodos

1.PlantasFenantreno em metanol 100 mM em MS 1/2 (2% de

sacarose, 0,8% de fitoagar, pH 6) em concentrações finais de 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1 e 1.25 mM

Esterilização: etanol 75% e 10% de hipoclorito de sódio

Ecotipo Columbia - sementes 3d a 4oC e transferidas para 23oC, fotoperíodo16/8h

As sementes germinadas foram contadas e o crescimento das plântulas monitorado

Os parâmetros fisiológicos foram medidos 30 dias após os experimentos terminados

As folhas das plantas foram coletadas no meio do dia, congeladas em N2liq e estocadas a -80oC até o ensaio


Para os ensaios de RNAm as plântulas foram crescidas por 11 dias e transferidas para o meio com 1mM de fenantreno ( uso de controle)

Os tecidos foliares foram coletados após 4, 6, 8, 12 e 72h de plantas controle e em fenantreno

Também coletadas ao meio-dia, congeladas em N2 e estocadas -80oC ?

2. Parâmetros fisiológicosTecidos foliares (0.2-1g) foram homogenizados mm PBS

gelado (50mM pH7) contendo 1% PVPCentrifugados a 10,000 rpm 4oC por 10 minO Sobrenadante foi usado imediatamente para determinar

as atividades de SOD, POD, CAT, MDA e proteínas.


A atividade de SOD foi determinada por NBT em 560 nmPOD: metódo guaiacol (mistura de 3 mL contendo guaiacol 20mM, 100mM PBS, 20uL de H2O2 30% (m/v) e 80uL de extrato enzimático) a 470 nmCAT: perseguindo a diminuição da absorbância a 240 nm ( método UV)MDA: thiobarbituric acid colorimetry (? Hodges 48)Proteína: Comassie blueAPX: perseguindo a diminuição da absorbância a 290 nm ( método UV). Folhas (0.5g) foram homogeneizadas em 5 mL de extrato enzimático (pH 7.8) contento 50mM PBS, 15mM EDTA, 12mM ascorbato

centrifugação a 8000 rpm a 4oC por 15 min -> o sobrenandante foi utilizado para determinar a atividade de APX Mistura para o ensaio (1mL): 50mM PBS (pH7), 0.1 mM EDTA, 0.5 mM Ascorbato, extrato enzimático e 0.8 mM de H2O2


Conteúdo de GSH 0.5g de folha por DTNB (Guo35)Abs a 412nm

Conteúdo de clorofila0.2g de folha (Guo35)Abs a 663, 646 e 470 nm

Conteúdo de H2O2 0.5g de folha (Guo35)Absorbância foi medida a 410nm

DAB: folhas de 14 dias de estresse foram imersas em solução de DAB (pH7) overnight e descoloridas em etanol 100% por 3h

TODOS OS EXPERIMENTOS FORAM REALIZADOS EM QUADRUPLICATA

Materiais e Métodos3. METFolhas de 16 dias : fixação em gluta, desidratação em série

de etanol e lavado em acetona e polimerizados em eponCortes de 70-80nm e marcados por acetado de uranila e citrato

de chumboJeol 1200

4. qRT-PCRExtração em trizolcDNA por kit InvitrogenKit Sybr premixGene de referência ACT7Genes CAT2 (?) e APX1

5.Análises estatísticas: 3-25 replicatas (ANOVA- SPSS software)

Resultados

1.Efeito nas plântulasTaxa de germinação e tamanho da raiz diminuíram com o

tratamento com fenantreno 1mM por mais de 11 dias (Fig1)

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Resultados

Raízes ficaram deformadas e com auxiliares após 30 dias de exposição a fenantreno 0.5mM (dados não mostrados)

Os efeitos fisiológicos aumentam com o aumento da concentração de fenantreno (Fig2)

Com fenantreno a 1mM algumas plântulas morreram a partir do dia 19



Resultados

2. Mudanças no conteúdo de clorofila e na ultraestrutura celular

Os níveis de clorofila a e b caíram com o aumento das concentrações de clorofila após 30 dias (Fig3)



Resultados

Após 16 dias de tratamento com 1mM de fenantreno os cloroplastos perdem a forma e as lamelas se toram menos distintas. Além disso as mitocôndrias e outras organelas não são distinguíveis, consistente com danos membranares

Algumas células colapsaram e tanto cloroplastos quanto mitocôndrias não são distinguíveis (Fig4)



Resultados

3. EnzimasFigura 5: Plantas com 30d Diferenças significativas da atividade de SOD são

detectadas ente 0.75, 1.0 e 1.25mM de fenantrenoA atividade de CAT foi essensialmente inalterada, mas

sugerindo decaimentoTodos os níveis de fenantreno induzem as atividades de

POD e APX, com atividade máxima a 0.25mM

Resultados



Resultados

4.qRT-PCRCAT2 e APX1 (folhas) foram medidos em 5 pontos entre 0 e 72h com 1mM de fenantreno (Fig6)CAT2 desapareceu com 12h e continuou reprimidoAPX1 aumenta com 12-24h e atinge seu ponto máximo em 48h



Resultados

5.GSHOs níveis de GSH aumentam com a concentração de fenantreno Fig 7



Resultados6. H2O2

Plantas de 30 dias (fig8)

DAB: tecidos foliares de 14 dias





Resultados

7. MDAFig8b



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