UNIVERSITATEA “PETROL-GAZE” PLOIEŞTIFACULTATEA: TEHNOLOGIA PETROLULUI ŞI PETROCHIMIEI

SPECIALIZAREA: MANAGEMENTUL ŞI CONTROLUL CALITĂŢII PRODUSELOR ŞI A FACTORILOR DE MEDIU

GRUPA: B

ANTOCIANI

MASTERAND: GRIGORE CĂTĂLINA-ANDREEAPROFESOR: CONF. DR. ING. BOMBOS DORIN

2010

Capitolul I – Antocianii din fructe şi legume

I.1. Introducere

Consumul de fructe a fost asociat cu un risc scăzut de a dezvolta cancer. Cei mai abundenţi constituienţi flavonoizi ai fructelor sunt antocianii (antocianine, glicozide, antocianidine), care cauzează coloraţii intense. În această lucrare, vor fi descrise dovezile epidemiologice fără să se facă aluzie la activitatea de prevenire a cancerului provocat de conţinutul de antociani prezenţi în alimente şi rezultatele studiilor chemiopreventive făcute pe rozătoare cu antociani sau cu antociani conţinuţi în fructe/extracte vegetale, precum şi proprietăţile farmacologice ale antocianilor. Antocianidinele s-au dovedit a inhiba supravieţuirea celulei maligne şi a confunda multe evenimente oncogene de semnalizare, în intervalul concentraţiei de 10-6 - 10-4 M. Studiile farmacocinetice ale antocianilor, după consumul lor ca unic agent, sugerează că antocianii ating nivelul de 10-8 -10-7 în sângele uman. Literatura de specialitate disponibilă în prezent oferă indicii despre posibila utilitate a antocianilor sau a amestecurilor de antociani la intervenţiile chemiopreventive ale cancerului. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a favoriza dezvoltarea lor clinică.

Unele rapoarte media pe teme de sănătate implică faptul că o dietă bogată în fructe şi legume colorate este panaceul nutriţional într-o societate marcată de probleme, cum ar fi obezitatea, ateroscreloza şi cancerul. Nu există un interes în creşterea rolului de nutriţie şi constituienţilor dietetici specifici în cauzarea şi prevenirea cancerului. Proeminent în constituienţii dietetici alimentari sunt flavonoidele. Exemplele includ izoflavonii care apar în soia, ceapă şi legumele cu frunze. Antocianii apar în regnul vegetal şi conferă coloraţie luminoasă roşie sau albastră fructelor de pădure sau altor fructe şi legume.

Ce face antocianii deosebit de interesanţi faţă de alte flavonoide este faptul că aceştia apar în dietă la concentraţii relativ ridicate. Aportul zilnic de antociani în dieta din SUA a fosr sugerat a fi 180-215 mg/zi, în timp ce aportul zilnic de flavonoide dietetice (genisteina, quercetin şi apigenina) este estimat la doar 20-25 mg/zi. Antocianidinele găsite în plantele superioare sunt cianidin, delfinidin, malvidin, pelargonidin, peonidin şi petunidin (figura 1), cu o distribuţie în natură de 50%, 12%,12%, 12%, 7% şi 7%.

Figura 1 – Structura antocianidinelor

1

I.2. Dovezi epidemiologice

Care este dovada care să susţină ideea că fructele şi legumele colorate, adică alimentele care conţin niveluri ridicate de antociani, posedă proprietăţi de întârziere sau de prevenire a cancerului? Deşi datele epidemiologice nu sunt abundente, există rapoarte care fac aluzie la potenţialul lor de anti-carcinogenitate.

Într-un grup de persoane vârstnice, care au consumat cantităţi mari de căpşuni, aportul adăugat de a dezvolta cancer a fost de 0,3 comparativ cu subiecţii care s-au abţinut de la consumul mare fructe.

Consumul de fructe şi legume colorate a fost, de asemenea, asociat unui risc redus de cancer mamar uman şi reapariţia polipului colorectal. Antocianii conţinuţi de produsele alimentare au fost asociaţi cu un risc scăzut de boli cardiace coronariene. S-au dovedit a avea efecte benefice în mai multe părţi ale organismului, inclusiv sistemului nervos central şi ochi, şi au fost suspectate de a semăna cu „paradoxul francez”, adică scăderea riscului de boli cardiovasculare în ciuda unei diete bogate în grăsimi la persoanele care trăiesc în Franţa.

I.3. Proprietăţile chimice

Componentele antocianilor sunt glucoza, galactoza şi arabinoza care, de obicei, sunt conjugate cu molecula antocianidinei prin intermediul grupării hidroxil. Unele antocianine cuprind mai multe părţi de zahăr care implică funcţiunile hidroxil din molecula de aglicon.

Antocianii sunt extrem de solubili în apă şi apar în conformaţii diferite dependente de pH , cu variaţii de culori sau intensităţi de culoare (figura 2). La pH<3, inelul din mijloc conferă culoarea intensă a moleculei. Deşi stabilitatea cationului flavilium, aşa cum a fost judecat prin spectrofotometrie UV-VIS, este compromisă de creşterea pH-ului, manifestările conformaţiilor ale antocianilor pentru acţiunea farmaceutică sunt neclare.

Figura 2 – Dependenţa pH-ului

2

I.4. Proprietăţile chemopreventive ale cancerului la animale

Există opt rapoarte în care abilitatea/capacitatea antocianilor sau amestecurilor care conţin antociani interferă cu carcinogeneza la animale.. În cadrul unei anchete comparative pe şoareci, animalele au primit fiecare un amestec de antocianine la 800 mg/l, sau cianidină pură la 200 mg/l cu apă potabilă, tartă de cireşe sau vişine adăugat la dietă (200g/kg dietă). Aceste sume corespund la doze de aproximativ 2,4 şi 0,6 mg antociani/animal/zi sau 600 mg de tartă de cireşe/animal/zi, bazându-se pe aportul mediu zilnic de alimentaţie şi apă. Şoarecii care au primit aceste intervenţii, numărul adenomului cecal a fost redus comparativ cu animalele care au avut o dietă controlată sau cele care au primit droguri antiinflamatorii. Numărul de adenoame intestinale nu a fost influenţat semnificativ de antociani.

Un studiu recent efectuat în laborator sugerează o moderare, dar o reducere semnificativă în numărul mic de adenom intestinal ApcMin la şoarecii care au primit antocianină conţinută în extractul din afine sau cianidin-3-glucozidă pură la 0,1% în dieta lor. Această concentraţie se traduce într-o doză de aproximativ 3 mg antocianină/şoarece/zi. Animalele care au primit o dietă de antocianină conţinută în orezul roşu cleios au prezentat eficienţe anti-tumorale, în ceea ce priveşte timpul de supravieţuire a crescut în comparaţie cu animalele cu o dietă controlată sau cu o dietă normală de orez. La şobolanii femelă, tumorile mamare au fost induse de expunerea la 7,12-dimetil benzen antracen, prin consumarea de suc de struguri. Animalele care au consumat suc, incidenţa, multiplicitatea şi greutatea finală a tumorilor mamare au fost reduse.

Coloranţii derivaţi din cartofii dulci, varză roşie şi porumb, care sunt bogate în antociani, inhibă carcinogeneza indusă chimic la şobolani. Adenoamele de colon şi adenocarcinoamele au fost induse de tratamentul cu 1,2 dimetil hidrazină (DMH) şi incidenţa tumorii a fost majorată prin complexarea dietei cu cancerigen amine heterociclice 2-amino-1-metil-6-fenilimidazo piridina (PhIP).

S-a dovedit, de asemenea, că antocianii previn cancerul de piele la rozătoare. Aplicarea antocianinei conţinută în extractul de rodie determină o întârziere a debutului şi scăderea incidenţei şi a sarcinii de tumori cutanate.

I.5. Efecte farmacologice în vitro

3

Studiile în care efectele antocianilor asupra creşterii celulare sau pe evenimentele celulare care au legătură cu promovarea sau progresia tumorii au fost investigate şi sumarizate în tabelul 1 şi 2. În ceea ce priveşte inhibarea de supravieţuire a celulelor neoplazice, antocianidinele au demonstrat potenţă mai mare decât omologii lor glicozilici. Antocianidinele compromit durata de supravieţuire a celulelor atunci când se găsesc în concentraţii de 10-5 - 10-4 M. Antocianidinele s-au dovedit a inhiba creşterea fibroplastelor embrionare şi a celulelor canceroase maligne derivate din ţesuturile umane. Dintre antocianidine, delfinidina posedă cea mai mare creştere a activităţii inhibitoare. Antocianina conţinută în extractele din struguri, afine sau fructe de pădure, la 25-75 lg/ml inhibă dezvoltarea celulelor maligne de cancer la colon. Delfinidina, cianidina şi malvidina inhibă activitatea receptorilor factorului de creştere epidermică (EGFR) tirozin kinazeică obţinută din celulele A431 cu IC5.

Antocianinele s-au dovedit a fi antioxidanţi puternici şi pot interfera cu carcinogenitatea prin angajarea acestei proprietăţi. Utilizarea metodei feerice de reducere a capacităţii plasmei pentru a reflecta activitatea antioxidantă, 3-glucozidele de delfinidină, petunidină şi malvidină s-au dovedit a fi antioxidanţi de 2-2,5 ori mai puternici decât acidul ascorbic.

Structura activităţii antioxidantă emergentă din aceasta şi din alte studii, sugerează că activitatea antioxidantă puternică este asociată cu prezenţa grupelor hidroxil în inelul antocianinelor. Capacităţile antioxidante a cianidinei au fost similare cu cele ale tocoferolului în sistemele de testare care utilizează acid linoleic, lipozomi, membrane eritrocitare. Capacitatea antioxidantă a fost de asemenea demonstrată în vitamina E – deficitară la şobolani. Şobolanii care au avut o dietă suplimentară bogată în extracte cu conţinut mare de antocianină, capacitatea antioxidantă a plasmei a fost superioară şi nivelele hepatice ale 8-hidroxi-20-oxiguanosină au fost inferioare comparativ cu dieta şobolanilor care nu au primit extracte cu conţinut de antocianină.

I.6. Farmacologia clinică şi pre-clinică

O întrebare crucială în ceea ce priveşte proprietăţile farmacocinetice ale antocianinelor este dacă acestea sunt supuse metabolic de glucozilare în organismul mamiferelor. S-a sugerat că vilozităţile intestinale pot cataliza antocianinele hidrolizate pentru a genera agliconul, dar până la dovezi concludente pentru acestă ipoteză, rămâne incertă.

Două studii recente efectuate pe şobolani sprijină ideea că hidroliza s-ar putea produce şi în vivo. Într-un studiu, animalele au primit fiecare cianidin-3-glucozidă fie pe cale orală, fie intravenos. Doar şobolanii care au primit doza pa cale orală au arătat prezenţa cianidin-3-glucoronidei în plasmă. Prezenţa glucoronidei implică formarea intermediară a agliconului. Absenţa cianidin-3-glucoronidei din plasmă, după administrarea intravenoasă, sugerează că formarea agliconului este o consecinţă a metabolismului lor, fie de către microflora intestinală, fie a mucoasei intestinale. Într-un alt raport recent, cianidina a fost identificată în plasmă prin spectrometria de masă. Metabolic, conjugatele antocianinelor, altele decât 3-glucoronidele, au fost de asemenea raportate, inclusiv speciile o-metilate. Glocoronidele au fost de asemenea găsite la şobolanii care au primit delfinidin-3-glucozidă şi la porcii cu o dietă pe bază de boabe. Metabolismul antocianinelor, când se administrează sub formă de extracte de boabe, la om a primit o atenţie deosebită. Serul şi urina voluntarilor sănătoşi, care au ingerat extract de boabe înecăcioase conţinând 4-cianidin-3-glicozide, au fost analizate pentru sursele de fitochimicale şi conjugaţi metabolici. Concentraţia maximă totală de antocianine în ser a ajuns la 0,59 IM în termen de 2 ore de la consum. În urină, concentraţia de antocianine totale a atins pragul de 18 IM în termen de 5 ore şi un nivel persistent după 24 ore. Metaboliţii au fost identificaţi ca glucoronide conjugate, precum şi ca derivaţi metilaţi şi oxidaţi din cianidin-3-glucozidă.

Într-un studiu efectuat pe adulţii care au primit un amestec de 4-cianidin-3-glucozidă în suc concentrat de soc, majoritatea speciilor de antocianine au fost constatate din compuşii originali. Excreţia maximă de urină a fost observată după o oră. După 5 ore, 0,053% din doza administrată a fost eliminată, din care 6,2% au fost metaboliţii glucoronidelor. Rezultatele duc la concluzia că dozele mici de antocianine urmează metabolismul în mucoasa intestinală, în timp ce la doze mari metabolismul hepatic prezintă importanţă, o diferenţă care ar putea afecta profilul de eliminare a antocianinelor.

Alte studii umane ale biodisponibilităţii şi ale farmacocineticii antocianinelor au fost efectuate la femeile vârstnice. Într-un studiu, extractele de afine şi soc au fost comparate. Concentraţia antocianinelor în urină, după

4

consumul de afine, a fost mult mai mică decât cea după consumul de extract de soc, iar antocianinele nu au fost detectate în plasmă. La voluntarii de sex masculin, care au ingerat praf de afine sălbatice uscate, farmacocinetica antocianinei a fost corelată cu capacitatea serului antioxidant.

13 ng/ml de antocianine au fost detectate în ser după 4 ore. Rezultatele obţinute cu ajutorul testului ORAC, care reflectă proprietăţile antioxidante, sugerează o corelaţie pozitivă între conţinutul de antocianine serice de după prânz şi statutul antioxidant. Într-un alt studiu, voluntarii au primit diferite băuturi bogate în mavidin-3-glucozidă. Nivelele înalte ale plasmei de malvidin-3-glucozidă au fost atinse după 50 minute, 90 minute sau 120 minute de la consumarea de vin roşu, vin roşu dezalcolizat sau suc de struguri roşii. La femeile care au primit extract de soc, concentraţiile nivelului plasmei de cianidin-3-sanbubiozidă şi cianidin-3-glucozidă au fost 39nM, respectiv 43 nM.

Capitolul II – Determinarea pigmenţilor în legume

II.1. Introducere

Pigmenţii din plante sunt responsabili pentru culoarea strălucitoare din ţesuturile plantelor. Aceştia sunt, de asemenea, găsiţi în ţesuturile animalelor şi, eventual, în produsele alimentare transformate ca aditivi. Aceşti pigmenţi au un impact important asupra valorii comerciale a produselor, deoarece culorile stabilesc primul contact cu consumatorii. În plus, pigmenţii din plante pot avea o influenţă asupra sănătăţii consumatorilor. Pigmenţii pot fi uşor modificaţi şi chiar distruşi. Procesele analitice au fost dezvoltate pentru a determina compoziţia pigmentului. Scopul acestei lucrări este de a oferi o scurtă prezentare a acestor metode.

Un număr mare de legume poartă culori strălucitoare. Aceste culori sunt conferite de pigmenţii conţinuţi în celule. Pe baza structurilor lor chimice, pigmenţii pot fi clasificaţi în patru clase: tetrapiroli (clorofila), carotenoide (carotena), compuşi polifenolici (antocianina) şi alcaloizi (betalanii). Un exemplu de structură chimică a unui membru din fiecare clasă este prezentată în figura 3. Numărul de molecule care aparţin fiecărei clase este destul de mare şi, în consecinţă, ar fi necesare câteva volume pentru a descrie proprietăţile lor particulare.

Figura 3 – Structura chimică a unui membru din fiecare clasă

5

Deşi ţesuturile animale conţin pigmenţi din plante, cum ar fi carotenoidele, aceste ţesuturi, de obisei, nu pot fi sintetizate. Prin urmare, pigmenţii trebuie să fie obţinuţi din alimente. Odată asimilaţi, pigmenţii intră pe căile biochimice, de-a lungul cărora pot fi modificaţi în cele din urmă.

De exemplu, β-carotena este împărţită în două, una din acestea servind ca un precursor al vitaminei A (o moleculă importantă). O creştere a numărului de studii indică faptul că pigmenţii plantelor au roluri positive asupra sănătăţii umane. Deoarece consumul de alimente proaspete a scăzut, în timp ce alimentele procesate au crescut, culorile alimentelor au devenit aspecte importante în procesul de formare al alimentelor.

În scopul de a restabili nivelul natural al pigmenţilor în produsele proceste, pigmenţii extraşi sunt încorporaţi în produsele alimentare finale. În mod similar, prepararea produselor fortificate necesită adăugarea de pigmenţi în produse. Indiferent de tipul de produse finale, pigmenţii sunt încorporaţi în conformitate cu apariţia lor naturală sau în cadrul unui produs modificat chimic.

Ca o consecinţă a acestor nevoie de adăugare de pigmenţi, cererea în coloranţii naturali izolaţi a crescut în comparaţie cu coloranţii sintetici. Cu toate acestea, această necessitate nu poate fi întotdeauna îndeplinită datorită limitării în furnizarea de materii prime, deoarece producţia de pigmenţi utilizează metodele convenţionale de cultivare a plantelor, care sunt influenţate de condiţiile climatice, de cultivatorii de plante şi de soiuri. În consecinţă, o parte a cercetării pigmenţilor din plante este orientată în găsirea unor noi surse de pigmenţi. Această căutare nu este orientată doar în găsirea de alternative naturale pentru coloranţii sintetici, ci şi cu scopul de a descoperi noi specii şi noi proceduri pentru producerea de pigmenţi, de exemplu din celule şi/sau culturile ţesutului, sau ingineriei genetice.

6

Din toate aceste motive menţionate mai sus, analiza pigmentului constituie o adevărată provocare analitică, deoarece pigmenţii sunt adesea parte din structura complecşilor lor şi/sau amestecuri. Prin urmare, abordarea acestor probleme nu este niciodată simplă. Pentru a prelua această provocare, este necesar să se aibă la dispoziţie un număr diversificat de proceduri analitice, capabile să cuantifice rapid şi precis diferiţii pigmenţi şi, eventual, degradarea lor în produsele prezente în probă. Dezvoltarea puterii metodelor analitice este, de asemenea, o primă importanţă în controlul calităţii. Metodele de extracţie a pigmenţilor şi de separare sunt revizuite pe scurt, apoi sunt descrise modalităţile de identificare şi de cuantificare a pigmenţilor.

II.2. Extracţia pigmentului

Pregătirea probelor din ţesuturile biologice este deseori plictisitoare şi consumatoare de timp, deoarece exactitatea analizelor depinde de mai mulţi parametrii legaţi de pregătirea probei. În plus, extracţia completă a pigmenţilor necesită adesea mai multe etape şi poate utiliza un amestec de mai mulţi solvenţi. Acest lucru este valabil în cazul în care proba conţine pigmenţi de diferite polarităţi şi/sau sunt prezenţi într-o matrice complexă.

În cazurile rare, pigmenţii pot fi extraşi într-o singură treaptă. Scopul următoarei discuţii nu este de a face o listă completă a extracţiei şi a metodelor analitice descrise în literatura de specialitate, ci de a oferi exemple reprezentative selectate, care pot fi apoi utilizate ca referinţă.

II.2.1. Moleculele de clorofilă şi de carotenoideMoleculele de clorofilă şi de carotenoide sunt mai degrabă compuşi hidrofobi şi, prin urmare, acestea pot

fi extrase cu un singur solvent organic sau cu un amestec de solvenţi organici folosiţi ca omogenizator. De exemplu, Thompson a extras licopenul din roşii folosind un amestec de hexan, acetonă şi etanol (50:25:25). Extracţia a fost repetată până când nu a mai fost observată nici o culoare în ţesuturi. Toate fracţiile au fost colectate într-o pâlnie de separare şi tratate cu dietil eter. O soluţie de NaCl 10% poate fi adăugată pentru a asista transferul pigmenţilor în faza nepolară. Faza apoasă este aruncată şi stratul pigmentat este uscat cu Na2SO4 anhidru. Atunci când este necesar, pigmenţii pot fi spălaţi cu KOH şi agitaţi periodic. Pigmenţii sunt apoi transferaţi în dietil eter prin adăugare de apă distilată şi faza organică este spălată cu apă până când se ajunge la un mediu neutru. În final, faza apoasă este eliminată. Faza organică este filtrată pe Na2SO4 anhidru pentru a usca pigmenţii.

Câteva carotenoide, cum ar fi cele conţinute în şofran, sunt solubile în apă. Pentru a extrage carotenoidele din şofran, ţesuturile plantelor se agită timp de 30 minute în apă rece. Soluţia este încălzită la 60 oC timp de 30 minute şi apoi lăsată la întuneric timp de 24 de ore. Stratul limpede de la suprafaţă conţine pigmenţii.

Metodele cele mai uzuale de extracţie a carotenoidelor şi a clorofilelor utilizează solvenţi organici. Cei mai mulţi dintre aceşti solvenţi sunt toxici şi costisitori. Câteva metode, cum ar fi extracţia de lichid supercritic, au fost sugerate ca metode alternative pentru extracţia carotenoidelor, deoarece acestea sunt netoxice şi necostisitoare.

II.2.2. Antocianinele Antocianinele sunt pigmenţi solubili în apă, deoarece scheletul de bază este adesea acilat cu una sau mai

multe lanţuri laterale polare, cum ar fi glucozidele. În funcţie de pH, atomul de oxigen din heterociclu poate fi încărcat pozitiv (figura 1). Este recomandată extracţia cu apă, acetonă sau cloroform. Adăugarea unei mici cantităţi de acid clorhidric sau de acid formic este recomandată pentru a prevenii degradarea compuşilor neacilaţi. O comparaţie a eficacităţii extracţiei cu diferiţi solvenţi indică faptul că cel mai bun solvent este HCl 1% în metanol. Cu toate acestea, atenţia ar trebui orientată spre scăderea valorii pH-ului atunci când extractele sunt concentrate prin evaporare.

Raportul lui Revilla compară diferitele protocoale pentru extracţia antocianinei din strugurii roşii. Autorii au concluzionat că aceşti solvenţi care conţin până la 0,12 molL HCl poate provoca hidroliza parţială a antocianinelor acilate. După extracţie este recomandat să se prepurifice extractul prin extracţia în fază solidă pe Sephadex sau Amberlite XAD-7 sau metanol activat. Antocianinele sunt absorbite pe fază, în timp ce zaharurile, acizii sau alte molecule solubile în apă sunt spălaţi cu soluţie apoasă de HCl 0,01%.

7

Adaosul de acetat de etil eluează compuşii fenolici, alţii decât antocianinele, care sunt eluate utilizând metanol acidifiat (HCl 0,01%).

II.2.3. BetalaineleAceşti pigmenţi sunt, de asemenea, solubili în apă şi de obicei localizaţi într-un singur loc în celula

plantei: vacuolă. Până acum, sinteza betalainei a fost observată doar în plantele care aparţin grupului taxonomic centrospermeae (sfecla roşie). Deoarece betalainele şi antocianinele sunt relatate chimic (nu biochimic), metodele de extracţie şi de prepurificare utilizate pentru antocianine, pot fi de asemenea aplicate şi la prepararea betalainelor.

II.3. Separarea cromatografică a pigmenţilor din legume

Pigmenţii sunt capabili să absoarbă lumina vizibilă, deoarece cromoforul (parte din molecule, care este implicat în absorbţia de lumină) este compus din mai multe legături duble conjugate.

Această proprietate unică, cu toate acestea, are o latură negativă: pigmenţii sunt foarte sensibili la acid, bază, oxigen, căldură şi lumină. Prin urmare, o atenţie deosebită ar trebui să fie acordată în timpul şi după extracţia pigmentului.

II.3.1. Coloana deschisăDiferite faze precum pudra de zaharoză, DEAE-Sepharose, celuloză sau MgO/Hyflosupercel au fost

utilizate pentru a realiza separarea clorofilei şi a carotenoidei. Toate trans-β-carotenele pot fi separate din izomerii cis-9 şi cis-13-carotenele folosind o coloană deschisă umplută cu NaOH. Pentru ficobiline, o coloană hidroximinerală poate fi utilizată. Antocianinele sunt capabile să se auto-agregheze. Sub această formă, ele sunt mult mai stabile, fiind împiedicată izomerizarea luminii lor.

Pentru a separa aceste agregate s-a folosit filtrarea pe gel. În zilele noastre, deşi cromatografia pe coloană deschisă este cea mai folosită pentru a curăţa extractele sau în scopuri de preparare, aceasta mai poate fi încă folosită pentru metodele analitice. De exemplu, Somers şi Evans au raportat că formarea agregatelor de antocianine glucizidice este tipic pentru învechirea vinului şi se referă la stabilitatea culorii. Acest proces natural poate fi puternic accelerat prin adăugarea de acetaldehide. Prin urmare, la adăugarea acestui compus la un vin tânăr, îl face să pară vechi. Într-o încercare de a găsi o metodă analitică, capabilă să stabilească vârsta reală a vinului, Jhonson şi Morris au folosit o coloană cu silicagel, împreună cu un gradient de acid formic, pentru a separa diferitele agregate ale antocianinelor glucozidice din vinurile roşii.

Folosind această tehnică, antocianinele au fost eluate în patru fracţii. Primele două fracţii conţin antocianine libere, iar celelalte două conţin antocianine polimerizate şi condensate. Comparând valorile antocianinelor în fiecare fracţie din vinul tratat şi cel netratat apare o diferenţă clară, deoarece vinul tratat conţine mai multe agregate de antocianine monoglucozidice decât în cel netratat. Acest lucru poate fi explicat prin faptul că acetaldehidele accelerează preferenţial condensarea pigmenţilor monoglucozidici , pigmenţii diglicozidici fiind acceleraţi mai uşor.

II.3.2. Cromatografia în strat subţireCromatografia în strat subţire este adesea utilizată ca o metodă rapidă, efectivă şi relativ necostisitoare.

De exemplu, Hornero-Mendez şi Minguez-Mosquera au separat carotenoidele din Capsicum annuum pe plăci de silicagel GF60 într-o cameră presaturată. Amestecul de eluare a fost compus din eter de petrol, acetonă şi dietil amină. O atenţie deosebită ar trebuie să fie acordată în cazul în care separarea se face pe silicagel, deoarece uşoara aciditate poate declanşa degradarea pigmentului, cum ar fi rearanjarea expozid-furanoxidelor în carotenoide. Prin urmare, este necesar a neutraliza prima aciditate a silicagelului înainte de separarea pigmentului. Din păcate, separarea compuşilor cu structuri similare prin cromatografia în strat subţire este dificilă de obicei. Acest lucru este bine ilustrat prin compararea cromatogramelor obţinute din pigmenţii extraşi din uleiul din seminţe de dovleac şi separaţi prin cromatografia în strat subţire sau HPLC. Utilizând cromatografia în strat subţire, sunt identificate patru benzi: două benzi verzi corespund pigmenţilor

8

protoclorofilei şi protofeofitinei (moleculele protoclorofilei, care au pierdut un atom de Mg2+), iar celelalte două benzi galbene reflectă prezenţa carotenoidelor.

Atunci când a fost analizată aceeaşi probă prin HPLC, au fost obţinute 14 picuri. Ca o consecinţă a puterii relativ scăzută a rezoluţiei cromatografiei în strat subţire, aceste metodologii au fost completate treptat cu tehnici de separare mai eficiente. Cu toate acestea, metodele cromatografiei pe coloană deschisă şi cromatografia în strat subţire sunt încă folosite pentru curăţarea extractelor şi/sau pentru a prepara o cantitate mare de pigmenţi.

II.3.3. Cromatografia în contracurentCa fluid de extracţie supercritic, cromatografia în contracurent constituie o metodă alternativă pentru

extracţiile solvenţilor şi permite analiza probelor pe o scară largă. De fapt, cromatografia în contracurent este o versiune automată de extracţie lichid-lichid, comparabilă la împărţirea repetată a unui analit între doi solvenţi imiscibili prin amestecarea viguroasă într-o pâlnie separatoare.

Ca orice tehnică cromatografică lichidă, cromatografia în contracurent funcţionează în condiţii uşoare şi permite o izolare nedistructivă a compuşilor naturali labile, cum ar fi pigmenţii. Având în vedere absenţa unor faze staţionare solide, scăderea absenţei este minimizată şi, în consecinţă, recuperarea probei este aproape de 100%.

Cromatografia în contracurent a fost aplicată cu succes la izolarea carotenoidelor din Gardenia şi antocianinele din mai multe surse.

II.3.4. Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC)Pigmenţii fotosintetici, clorofilele şi carotenoidele au un caracter clar hidrofob şi sunt, de obicei,

analizaţi de coloanele în fază inversată-C18. Mai recent, a apărut o coloană în fază inversată-C30, care este particular eficientă pentru separarea carotenoidelor, deoarece interacţiunile pigmenţilor şi faza staţionară sunt maximizate de dimensiunea lor similară. Cu această fază, mulţi izomeri cis ai aceleiaşi carotenoidă sunt separaţi unii din alţii. Această coloană în fază inversată-C30 a fost aplicată cu succes la determinarea carotenoidelor saponificate în sucul de portocale.

Cu toate acestea, când un amestec este complex, coeluţia poate deveni rapid limitată. Când valoarea totală de izomeri cis şi trans ai carotenoidelor este necesară, fazele staţionare mai puţin selective, cum ar fi coloana în fază inversată-C18, sunt preferate. Faza mobilă utilizată la separarea moleculelor hidrofobe este, de obicei, alcătuită din solvenţi organici, cu excepţia cazului când moleculele polare, cum ar fi esterii glicozili ai carotenoidelor sau clorofilei, sunt prezente în amestec. În acest ultim caz, este recomandat un solvent organic polar amestecat cu o mică cantitate de apă.

Pentru a îmbunăţăţii separarea pigmentului, încălzirea coloanei este uneori propusă. Această procedură, totuşi, nu este recomandată în cazul clorofilelor şi carotenoidelor, deoarece încălzirea poate declanşa izomerizarea carotenoidei şi epimerizarea şi alomerizarea clorofilei. Aceste modificări nu sunt detectate prin metodele uzuale de HPLC. Există multe metode prin HPLC descrise în literatura de specialitate pentru analiza carotenoidei. În ciuda acestei abundenţe, când compoziţia carotenoidei este foarte complexă, ar putea fi necesar întâi să se separe diferite grupe de carotenoide, folosind o coloană deschisă ambalată cu alumină. Folosind această metodă, au fost obţinute trei fracţii:

- fracţia 1, care conţine caroteni şi epoxi-carotenoide, a fost eluată cu eter de petrol- fracţia 2, care a fost compusă din monohidroxi şi ceto-carotenoide, a fost eluată cu 70-90% dietil eter în

eter de petrol- fracţia 3, compusă din polihidroxi-carotenoide, a fost eluată cu 0-30% etanol în eter.

Pigmenţii conţinuţi în fracţii individuale ar putea fi separaţi cu ajutorul cromatografiei în strat subţire sau metodele HPLC. În orice caz, trebuie avut grijă să se realizeze bune condiţii cromatografice pentru a garanta faptul că pigmenţii sau degradarea produselor nu scapă de analiză. Pentru a ilustra această posibilitate, profilele de eluţie HPLC ai pigmenţilor din uleiul de seminţe de dovleac folosind două metode diferite de faze HPLC inversate, recomandate pentru analizele pigmenţilor din plante, sunt ilustrate în figura 4. HPLC a fost, de asemenea, folosită pentru a evalua puritatea coloranţilor alimentari disponibili pe piaţă, care decurge din pigmenţii plantelor naturale.

9

Figura 4 – Cromatograma racordată la 400 nm a pigmenţilor (A-HPLC pentru metanol, acetonitril, clorură de metilen, iar B-HPLC pentru metanol, metanol-hexan)

În timp ce majoritatea metodelor utilizate pentru prepararea pigmenţilor fotosintetici se folosesc doar solvenţi organici, amestecurile eluate necesare la separarea compuşilor mai hidrofolici, cum ar fi antocianinele şi betalainele, sunt de obicei un amestec de solvenţi organici şi apoşi. Înainte de analiza antocianinelor prin HPLC, este recomandat să se purifice extractul pe un cartuş C18-RP activate în prealabil cu methanol acidifiat.

Folosind un protocol similar, Takeoka a analizat conţinutul de antocianine din stratul de seminţe de fasole neagră prin HPLC. Au fost găsite trei antocianine: delfinidin-3-glucoză, petunidin-3-glucoză şi malvidin-3-glucozidă. Compararea spectrelor de absorbţie ale compuşilor acilaţi şi neacilaţi arată că acilarea schimbă culoarea antocianinei la lungimi de undă mai scurte. Programele de eluţie HPLC pentru antocianine sunt îmbunătăţite în mod constant şi astăzi este posibil să se separe până la 15 antocianine diferite în 30 minute. Cu toate acestea, determinarea şi cuantificarea antocianinelor prin HPLC suferă din cauza lipsei generale de disponibilitate a standardelor de antocianine pure.

II.3.5. Cromatografia pe fluid supercriticExtracţia pe fluid supercritic a fost utilizată cu succes pentru a izola β-carotenele din morcovi şi

capsantinele din ardei. Favati a izolat β-carotena şi luteina din concentratele frunzelor la 40oC, la presiuni cuprinse între 29 şi 70 MPa. Deşi unele echipamente de laborator pot funcţiona cu mai puţin de 2 g, o limitare majoră a utilizării extracţiei pe fluid supercritic este cantitatea mare de material necesară.

Din punct de vedere analitic, extracţia supercritică este compatibilă cu cromatografia pe fluid supercritic, deoarece aceste două tehnici pot arăta faza mobilă şi unele dispozitive, favorizând dezvoltarea metodologiilor de extracţie şi separare. Deoarece puterea eluţiei a CO2 pur cu privire la carotenoide este destul de slabă, este necesar să se adauge co-solvenţi, pentru a creşte solubilitatea carotenoidelor în CO2.

10

Teoria solubilităţii parametrului prezice că solubilitatea maximă a unui compus este atinsă atunci când solubilitatea parametrului solventului este echivalentă cu cea a solutului. De exemplu, β-carotena poate fi extrasă la 43oC şi aproximativ 70 MPa. Din păcate, unele echipamente nu permit eluţia la o presiune aşa mare. Prin urmare, noile condiţii ale presiunii şi temperaturii ar trebui să fie găsite utilizând o diagramă, care să conecteze variaţiile de presiune la densitatea gazelor pentru diferite temperaturi. La temperaturi mai scăzute, densităţile similare a celor ajunse la temperaturi mai mari, pot fi obţinute pentru presiuni mai scăzute.

Aceste condiţii sunt numite condiţii supercritice. Ibanez a separat cu succes β-carotena în mai puţin de 10 minute în aceste condiţii. Cea mai bună separare a fost obţinută la 10oC şi la o presiune de aproximativ 35 MPa, cu o coloană capilară care conţine grupări de silonal dezactivat cu un reactiv octametil-ciclotetrasiloxan. Această coloană nu poate fi utilizată la temperaturi înalte, deoarece structura fazei poate fi distrusă la temperaturi înalte, formând legături O-Si-CH3 cu fază de silicagel. În multe cazuri, experimentele au fost axate pe determinarea presiunii optime, temperaturii şi paşii de separare pentru a realize extracţia carotenoidei.

Contrar, profilul concentraţiei de carotenoide în etapa supercritică a primit o atenţie mai mică. Ambrogi a raportat variaţia concentraţiei carotenoidei de-a lungul procesului. În condiţiile presiunii (30 MPa), temperaturii (60oC) şi fluxului de CO2 (8-9 kg/h), 75% din totalul carotenoidei au fost recuperate implicând doar 15% din totalul de CO2 necesar pentru extracţia pigmenţilor.

II.3.6. Electroforeza capilară Pigmenţii cu structuri foarte asemănătoare pot fi greu de separat utilizând coloane clasice RP-C18

HPLC. Acesta este cazul zeaxantinei şi luteinei. Pentru a depăşi această dificultate, un program particular HPLC cu solvent ar trebui să fie aplicat. Ca alternativă, pot fi folosite alte metode de separare, cum ar ficoloana capilară.

Electroforeza capilară permite separări rapide ale compuşilor şi un cost relativ scăzut, deoarece deşeurile sunt puternic reduse. Este utilizată cu succes în separarea zeaxantinei şi luteinei. Buna separare şi eluţia rapidă a pigmenţilor sugerează faptul că electroforeza capilară este potrivită pentru analizele de rutină ale probelor mici.

Electroforeza capilară a fost angajată la separarea pigmenţilor antocianinei din căpşuni, soc, coacăze negre. Cromatografia electrocinetică micelară a fost utilizată la analiza conţinutului de antocianină al câtorva probe de produse alimentare.

II.4. Detecţia pigmenţilor

Odată separaţi, pigmenţii eluaţi vor fi identificaţi şi cuantificaţi. În timp ce identificarea pigmentului este adesea bazată pe proprietăţile spectrale şi pe comportarea cromatografică a moleculelor eluate individual, cuantificările sunt mai mult bazate pe măsurătorile absorbanţei.

Detaliile structurilor moleculare ale moleculelor eluate pot fi obţinute utilizând metode analitice sofisticate, cum ar fi spectrometri de masă şi spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară multidimensională. În continuare, sunt prezentate câteva metode de identificare şi de cuantificare a pigmenţilor din legume.

II.4.1. Spectroscopia UV-VISSpectrele de absorbţie ale pigmenţilor pot fi considerate ca o amprentă a lor. Prin urmare, spectroscopia

prin absorbţie constituie cea mai simplă modalitate de a identifica şi cuantifica majoritatea pigmenţilor prezenţi în amestec. Mai multe posibilităţi, variind de la măsurătorile manuale utilizând un colorimetru până la detectoarele cu diode, pot fi utilizate. Aici, aş dori să subliniez importanţa condiţiilor necesre pentru o determinare exactă a pigmenţilor.

Deoarece mediul pigmentului poate fi puternic influenţat de poziţia maximă a absorbanţei şi de forma spectrului, o măsurare exactă a concentraţiei pigmentului cere ca pigmentul să fie dizolvat într-un solvent ai

11

cărui coeficienţi de absorbţie specifici au fost determinaţi. Cu aceste date, este întotdeauna posibil să se stabilească un nou set de ecuaţii, adaptate situaţiilor particulare, cum ar fi un amestec complex de eluare utilizat în HPLC. Precizia măsurătorilor depinde de tipul de dispozitiv utilizat, de determinarea exactă a poziţiei maxime a absorbanţei şi, de asemenea, de precizia coeficientului de absorbţie utilizat în calcule. Prin urmare, este recomandat să se verifice în mod regulat literatura de specialitate pentru noile valori. Limitarea majoră, în identificarea pigmenţilor pe baza spectrului de absorbţie, este suprapunerea benzilor de absorbţie a pigmenţilor prezenţi în amestec. Atunci când co-eluează doi pigmenţi, de obicei, este posibil să se stabilească un set de ecuaţii, care permite calcularea concentraţiilor ambilor pigmenţi. Cu toate acestea, această metodă este mai puţin eficientă când numărul pigmenţilor este prea mare.

Pentru completare, este necesar să se precizeze că izomerii cis ai carotenei pot fi recunoscuţi, deoarece spectrul de absorbţie prezintă o bandă suplimentară în regiunea UV. Spectroscopia de fluorescenţă poate fi mai de ajutor datorită extracţiei selective a pigmenţilor, cum ar fi clorofilele, dar inutilă în cazul carotenoidelor, deoarece fluorescenţa lor este foarte slabă.

II.4.2. Spectroscopia în infraroşu (IR)Alte metode spectroscopice pot fi folosite la identificarea pigmenţilor pe baza unei trăsături structurale

particulare. De exemplu, spectroscopia IR a fost utilizată pentru a detecta prezenţa unei grupări alilice în fucoxantina carotenoidei, aloxantina şi bastaxantina.

Spectroscopia IR a fost, de asemenea, folosită pentru a stabili detaliile luminii indusă de dependenţa oxigenului a colorantului clorofilă în alimente.

În concluzie, metodele spectroscopice permit o identificare brută a pigmenţilor prezenţi într-un extract, dar, în cele mai multe cazuri, compoziţia specifică poate rămâne obscură. Prin urmare, obţinerea informaţiilor detaliate despre compoziţia unui amestec de pigmenţi necesită analize suplimentare. Aceste analize implică adesea separarea amestecului în componentele sale folosind metode cum ar fi cromatografia.

Nici una dintre metodele descrise mai sus nu corespunde pe deplin la identificarea structurilor pigmenţilor. Deşi amprenta spectrală conţine suficiente informaţii care permit identificarea cromoforului, aceasta nu conţine întotdeauna suficiente informaţii care permit determinarea structurii complete a pigmentului. În multe cazuri, în special în cele cu antocianine, structura pigmentului este mult diferită faţă de cea a cromoforului. Deşi informaţiile lipsă pot fi parţial deduse din comportarea cromatografică şi din comportarea datelor obţinute, alte metode, cum ar fi spectroscopia de masă, trebuie să fie folosite la caracterizarea completă a structurii moleculei.

II.4.3. Spectroscopia de masă (MS)Clorofilele şi carotenoidele au prezentat speciale provocări analitice spectroscopiei de masă, din cauza

maselor lor mari, volatilităţii scăzute şi instabilităţii termice. Cele mai recente progrese în analizele spectroscopiei de masă ale tetrapirolilor au fost obţinute cu

ajutorul dezvoltării metodelor de ionizare atmosferică, adică izomerizarea chimică la presiunea atmosferică (APCI) şi ionizarea de tip electrospray (ESI). Tehnica APCI, împreună cu RP-HPLC, se dovedeşte a fi eficientă pentru detectarea clorofilei. Procedura este aproape de 1000 de ori mai sensibilă decât izomerizarea de tip termospray. Pentru a demonstra potenţialul spectroscopiei de masă de tip electrospray în cercetarea clorofilei, interfaţa ESI a fost conectată cu un spectru de masă cu ioni capcană ca analizator de masă.

Folosind metoda spectroscopiei de masă, alomerii clorofilei şi derivaţii ei, produse în timpul prelucrării fructelor şi legumelor, au fost izolate şi structurile lor determinate. Folosind această metodă, Giusti a obţinut informaţii structurale pe o componentă minoră de antocianină din sucul de struguri şi varză roşie. O metodă similară a fost folosită la analiza antocianinelor prezente în extractele de vin roşu, precum şi în cele de coacăze negre.

O limitare a spectroscopiei de masă în analizele antocianinelor şi alcaloidelor apare din incapacitatea acestora de a se diferenţia dintre diferitele forme diastereoizomerice ale zahărului. Prin urmare, această metodă nu poate oferi informaţii cu privire la substituienţii exacţi glicozidici, altele decât numărul atomilor de carbon şi prezenţa grupărilor metilice legate de fracţiile de zahăr. Pentru a obţine mai multe informaţii asupra structurii

12

acestor substituienţi este necesar să se folosească tehnologia spectroscopiei de masă. ESI-MS a fost de asemenea folosită cu succes în determinarea structurii moleculare a altor pigmenţi insolubili în apă, cum ar fi moleculelepolifenolice galbene, conţinute în curcuma estrasă din rizomul Curcuma longa.

II.4.4. Spectroscopia RMNInformaţii suplimentare cu privire la structura moleculelor de pigment pot fi, de asemenea, obţinute prin

spectroscopia RMN. De exemplu, Choung a utilizat spectroscopia RMN pentru a identifica antocianinele separate prin HPLC din straturile seminţelor de fasole cultivate în Coreea. Studiul a dezlănţuit faptul că straturile roşii şi maro ale seminţelor de fasole conţin mai multe antocianine: cianidin-3,5-glucozidă, delfinin-3-glucozidă, cianidin-3-glucozidă şi pelargonin-3-glucozidă, dar nu şi petunidin-3-glucozidă. Petunidin-3-glucozidă este prezent doar în straturile negre ale seminţelor de fasole. Straturile albe ale seminţelor de fasole nu conţin antocianine.

Spectroscopia RMN a fost recent utilizată la stabilirea structurii antocianinelor, cum ar fi gentiodelfina şi 5-carboxi-piranopelargonina, betacianinele.

Spectroscopia RMN este un instrument foarte puternic pentru deterninarea structurilor pigmenţilor. Cu toate acestea, ea are două limitări majore intrinseci:

- necesită o cantitate relativ mare de probe (în intervalul mg)- achiziţia de date poate fi lungă, în special în cazul 2D-RMN.

Prin urmare, analistul ar trebui să fie sigur că pigmentul studiat ar rămâne stabil pe parcursul întregii perioade de analiză. De exemplu, betalainele sunt labile în condiţii extreme de aciditate. În aceste condiţii, degradarea pigmentului se produce foarte repede ca rezultat în spectrul complex RMN şi, de asemenea, duce la pierderea probei.

Pentru a depăşi aceste dificultăţi, Stintzing a testat mai multe combinaţii de solvenţi. El a găsit că cel mai potrivit solvent este oxidul de deuteri (D2O) la 25oC şi la valori ale pH-ului cuprinse între 5 şi 7, deoarece permite obţinerea stabilităţii pe termen lung a pigmenţilor şi este compatibil cu cerinţele 13C-RMN. În aceste condiţii, solubilitatea betalainelor este suficientă, iar cumulul sistemului şi semnalele probei au loc. Conformaţia 3D a pigmenţilor antocianinei poate fi investigată folosind tehnica spectroscopiei nucleare.

II.5. Identificarea şi cuantificarea pigmentului

În secţiunile precedente au fost prezentate diferite metode analitice care pot fi utilizate la identificarea pigmenţilor. Un punct crucial este calibrarea semnalului detector. Această problemă necesită standarde, în mod ideal, identice pentru fiecare pigment considerat. Aceste standarde nu sunt întotdeauna disponibile în comerţ şi ar trebui înainte să fie preparate. Gândindu-se la această problemă, Schiedt şi Liaaen-Jensen au definit criteriul minim pentru identificarea carotenoidelor:

- spectrul de absorbţie în regiunea UV-VIS, obţinut din cel puţin doi solvenţi diferiţi, ar trebui să fie în concordanţă cu cromoforul sugerat

- proprietăţile cromatografice ale pigmentului purtativ şi ale standardului trebuie să fie identice în cromatografia în strat subţire (Rf) şi HPLC: ambi compuşi trebuie co-eluaţi

- un spectru de masă ar trebui obţinut, care permite în cele din urmă confirmarea masei moleculare.Alte reguli nu sunt specificate pentru identificarea altor pigmenţi naturali, fiind sugerat un criteriu

similar. Chiar şi atunci când identificarea şi calibrarea detectorului au fost îmbunătăţite în conformitate cu aceste reguli, cuantificarea pigmentului poate să nu fie aşa de puternică. Suma pigmenţilor într-o probă încălzită poate fi mai mare decât înainte. Ca un paradox, care a fost frecvent raportat în fructele sau legumele fierte, a fost atribuită unei extractibilităţi mari ale pigmenţilor după preparare, deoarece după încălzire ar declanşa ruperea peretelui celulei, apoi se facilitează eliberarea pigmenţilor din celule.

13

Capitolul III – Studiile chimice ale antocianinelor

III.1. Introducere

Antocianinele sunt coloranţi naturali, care au prezentat interes crescut datorită gamei extinse de culori, efectelor inofensive şi benefice pentru sănătate. Din cauza potenţialului mare de aplicare pe care antocianinele îl reprezintă pentru industria alimentară, farmaceutică şi cosmetică, utilizarea lor a fost limitată din cauza instabilităţii lor relative şi procentului mic de extracţie.

În prezent, cele mai multe investigaţii ale antocianinelor sunt axate pe rezolvarea acestor probleme, precum şi pe purificarea şi identificarea lor. În acest document, cele mai recente progrese în investigarea chimică a antocianinelor sunt prezentate pe scurt, subliniind efectele pH-ului, co-pigmentării ionului complex şi activităţii antioxidantă asupra stabilităţii lor.

Studiul coloranţilor naturali este un domeniu extins şi activ al investigaţiei datorită interesului crescut de substituire a coloranţilor sintetici cu efecte toxice la oameni. Carotenoidele şi antocianinele sunt printre cei mai utilizaţi coloranţi vegetali în industria alimentară. Carotenoidele sunt liposolubile, instabile şi capabile să coloreze produsele alimentare de la galben la roşu; aceştia sunt obţinuţi în general din morcovi, roşii şi ardei. Pe

14

de altă parte, antocianinele sunt solubile în apă şi mai puţin stabile decât carotenoidele; ei sunt extraşi din struguri, fructe de pădure, varză roşie, mere, ridichii, trandafiri, lalele şi orhidee.

Antocianinele (din greacă „anthos”=floare şi „kianos”=albastru) sunt pigmenţii cei mai importanţi ai plantelor vasculare; ei sunt inofensivi şi uşor de încorporat în mediul apos, ceea ce îi fac interesanţi pentru utilizarea lor precum coloranţi naturali solubili în apă. Aceşti pigmenţi sunt responsabili pentru culorile portocalii, roşii, rozului, violete, albastre strălucitoare ale florilor şi fructelor unor anumite plante. O altă proprietate importantă a antocianinelor este activitatea lor antioxidantă, care joacă un rol vital în prevenirea bolilor neuronale şi cardiovasculare, cancer şi diabet. Există mai multe rapoarte axate pe efectul antocianinelor în tratarea cancerului, pe nutriţia umană şi pe activitatea lor biologică.

Prin urmare, datorită potenţialului enorm al antocianinelor naturale ca pigmenţi sănătoşi, există un număr foarte mare de rapoarte găsite în literatura de specialitate pe diverse domenii, cum ar fi: dezvoltarea unor tehnici analitice de purificare şi separare, aplicarea în produsele alimentare, identificarea şi distribuţia în plante, urmărirea culorii şi schimbării pigmenţilor, biosinteza, analizele cantitative folosind tehnici cromatografice şi electroforetice şi în presarea plantelor.

Investigaţiile cele mai recente pun accent pe informaţiile importante ale metodelor de stabilitate, extracţie, purificare şi identificare.

III.2. Chimia antocianinelor

Antocianidele sunt structurile de bază ale antocianinelor (tabelul 1). Antocianidele (sau agliconii) sunt constituite dintr-un nucleu aromatic legat de un lanţ heterociclic care conţine O2, şi care este, de asemenea, legat de o legătură C-C de al treilea C al nucleului aromatic. Când antocianidele se regăsesc în formă glicozidică sunt cunoscute sub numele de antociani.

Culoarea acestor molecule a fost explicată prima dată de Pauling în 1939, care a propus că structura de rezonanţă a ionului de flavilium este cauza intensităţii culorii lor.

Există o mare varietate de antocianine răspândite în natură (numele şi prescurtările celor mai comune sunt redate în tabelul 1). Principalele diferenţe între ele sunt numărul grupărilor hidroxilate, natura şi numărul de zaharuri legate de structura lor, grupările carboxilice alifatice sau aromatice legate de zahărul din moleculă şi poziţia acestor legături. Până în prezent, există rapoarte cu mai mult de 500 de antocianine diferite şi 23 antocianidine din care doar 6 sunt cele mai întâlnite în plantele vasculare: Pg, Pn, Cy, Mv, Pt şi Dp. Derivaţii glicozidici ai celor 3 antocianidine non-metilate (Cy, Dp, Pg) sunt cei mai frecvent întâlniţi în natură, fiind găsiţi în proporţie de 80% în frunzele pigmentate, 69% în fructe şi 50% în flori.

Procentele de distribuţie a celor 6 antocianidine cele mai întâlnite în fructe şi legume sunt: 50% Cy, 12% Dp, 12% Pg, 12% Pn, 7% Pt, şi 7% Mv. Derivaţii glicozidici cei mai răspândiţi sunt: 3-monoside, 3-bioside, 3,5- şi 3,7-diglucozide. Prezenţa derivaţilor 3-glucozide este de 2,5 de ori mai frecvenţi decât 3,5- diglucozidele şi decât cel mai comun antocianin – Cy-3-glucozida.

Varietatea mare de antocianine găsite în natură le face a fi un grup complex şi interesant de studiat.

Tabelul 1 – Identifiacrea structurii antocianidinelor

15

III.3. Stabilitatea antocianinelor

Antocianinele izolate sunt foarte instabile şi foarte sensibile la degradare. Stabilitatea lor este afectată de mai mulţi factori, cum ar fi: pH-ul, temperatura de depozitare, structura chimică, concentraţia, lumina, oxigenul, solvenţii, prezenţa enzimelor, flavonoidele, proteinele şi ionii metalici.

Stabilitatea chimică a antocianinelor este principalul obiectiv al studiilor recente, datorită aplicaţiilor lor abundente şi potenţiale, efectelor lor benefice şi utilizării lor ca alternativă la coloranţii artificiali.

III.3.1. Solventul şi efectele concentraţiei antocianineiInvestigaţiile recente cu sărurile sintetice ale flaviliumului în soluţii de natură diferită (acetonitril : apă,

etanol, propileuglicol, dioxan şi 2-butadonă) au arătat că schimbările de culoare depind de solvent şi de concentraţia sărurilor sintetice ale flaviliumului (VFs). În solvenţi protici, sărurile sintetice ale flaviliumului se colorează în roşu, în timp ce în solvenţii aprotici soluţiile sunt galbene. Acest lucru a fost explicat presupunând că speciile roşii şi galbene corespund unui monomer, respectiv unui dimer; de aceea, atunci când creşte concentraţia sărurilor sintetice ale flaviliumului, culoarea roşie este favorizată.

De asemenea, s-a observat că, atunci când creşte cantitatea de apă în acetonitril, monomerul este transformat într-un dimer de culoare verde. Astfel, apa joacă un rol fundamental în dimerizarea sărurilor de

16

flavinilium, datorită faptului că aceste molecule necesită neutralizarea propriilor lor repulsii electrostatice cu moleculele de apă, astfel încât dimerizarea să poată avea loc.

III.3.2. Influenţa pH-uluiAntocianinele pot fi găsite în diferite forme chimice care depind de pH-ul soluţiei (figura 5). La pH =1,

cationul de flavilium (de culoare roşie) este specia predominantă şi contribuie la colorarea soluţiilor în roşu şi violet (figura 5A). La valorile pH-ului cuprinse între 2 şi 4, speciile quinoidale sunt predominante cele albastre (figura 5B-D). La valori ale pH-ului cuprinse între 5 şi 6, doar 2 specii incolore pot fi observate (pseudobaza carbinolului şi calconul - figura 5E-F). La pH>7, antocianinele sunt degradate în funcţie de grupele lor de substituenţi (figura 5 – reacţii de degregare). La valori pH cuprins între 4 şi 6, coexistă patru forme structurale ale antocianinelor: cationul de flavilium, baza quinoidală anhidridă, baza incoloră a carbinolului şi calconul galben pal. Echilibrul dintre bazele quinoidale şi carbinol are loc prin intermediul cationului de flavilium aşa cum este arătat în figura 1 (structurile D, A şi E). Când pH-ul este crescut, de asemenea, suma bazelor anhidre creşte şi, în condiţii mai acide, specia predominantă este ionul roşu de flavilium.

Stabilitatea antocianidinelor este influenţată de substituenţi şi de prezenţa grupelor adiţionale de hidroxil sau de metoxil, care scad stabilitatea agliconului în mediul neutru; de aceea, Pg este antocianidina cea mai stabilă. Opus agliconilor, monoglicozidelor şi diglicozidelor, derivaţii sunt cei mai stabili în condiţii de pH neutru. Investigaţiile cu privire la stabilitatea antocianinelor şi la variaţia culorii cu pH duc la concluzia că schimbările de culoare ale acestor compuşi sunt cele mai importante în regiunea alcalină, datorită instabilităţii lor.

Figura 5 – Formele chimice ale antocianinelor dependente de pH

17

III.3.3. Efectul de co-pigmentareCo-pigmentarea este un fenomen în care, pigmenţii şi alţi compuşi organici incolori, sau ionii metalici,

sub formă moleculară sau ascoiaţii complexe, generează o creştere sau o schimbare a intensităţii culorii. În stiinţa alimentară, acest fenomen este considerat o interacţiune foarte importantă deoarece culoarea este unul din factorii cruciali de calitate în acceptarea produselor. Unele investigaţii sugerează că, co-pigmentarea antocianinelor cu alţi compuşi (co-pigmenţi) este principalul mecanism de stabilizare a culorii în plante. Co-pigmenţii sunt sisteme bogate în electroni p, care au capacitatea să se asocieze cu ionii flaviliumului, care sunt destul de săraci în electroni. Această asociere oferă protecţie atacului nucleofil al apei în poziţia 2 a ionului de flavilium şi altor specii, cum ar fi peroxizii şi sulfur-dioxinele în poziţia 4.

Co-pigmenţii sunt, în general, incolori, dar când sunt amestecaţi cu o soluţie antocianică, interacţiunea producând un efect hipercronic şi o schimbare batocromă în spectru de absorbţie (regiunea UV-VIS). Co-

18

pigmenţii pot fi flavonoide, alcaloizi, aminoacizi, acizi organici, nucleotide, polizaharide, metale sau alte antocianine.

Interacţiunea antocianine – co-pigmenţi poate fi realizată în 5 moduri diferite, în funcţie de speciile care intreacţionează (figura 6). Dacă co-pigmentul este altă antocianină, este formată o asociere sigură sau o copigmentare intramoleculară; când interacţiunea se face cu un metal, se efectuează o complexare; în cazul în care are loc intre co-pigmenţi şi perechea de electroni liberi, are loc o co-pigmentare intermoleculară, iar în cele din urmă, cazul cel mai complex, co-pigmentarea poate avea loc prin interacţiunea unui aglicon, zahăr, co-pigment cu protonii, toate în acelaşi timp.

Figura 6 – Interacţiunea antocianinelor (A) self-association, (B) intramolecular copigmentation, (C) metal complexation, (D) intermolecular

copigmentation

Când co-pigmentul este un alt compus fenolic, interacţiunea este trecătoare din cauza lipsei legăturilor chimice. Acest component este rezultatul unui femomen chimic cunoscut sub denumirea de formare a unui

19

complex prei schimbarea transferului sau interacţii p-p; acest fenomen apare atunci când compuşii cu srcini opuse interacţionează. Rezultatul total de co-pigmentare se bazează pe două etape:

- formarea complexului p-p, care determină schimbările proprietăţilor spectrale ale moleculelor în ionul de flaviliu, creşte intensitatea absorbţiei (efectul hipercromic) şi a lungimii sale de undă (efect batocrom)

- stabilirea formei flaviliumului de un complex p deplasează echilibrul în partea în care creşte intensitatea culorii roşii (figura 7).Prin urmare, amploarea efectului de co-pigmentare este dependentă de pH, deoarece la valori mici ale

pH-ului, toate moleculeleantocianinei sunt în formă flaviliumă, iar la valori ridicate ale pH-ului, antocianina este în forma ei pseudobază de carbinol, care este incoloră.

Efectul de co-pigmentare este evident la pH=4-6, unde antocianinele există în forme incolore. Recent a fost propus că formarea de complex p-p induce reacţiile dintre antocianine şi acizii tanici din vinuri, producând legături covalente care generează acizii tanici pigmentaţi. Cuplarea chimică dintre antocianine şi acizii tanici nu este bine cunoscută; cu toate acestea, unii cercetători au sugerat că mecanismul implică acetaldehidele, acizii tanici şi antocianinele. Reacţii similare au fost, de asemenea, observate între acizii tanici şi flavan-3-etanolii.

Figura 7 – Exemple ale stabilităţii antocianinelor

20

III.3.4. Interacţia ionilor metaliciVarietatea de culori în flori, iniţial, a fost explicată prin formarea chelaţilor dintre metale şi sărurile

flaviliumului. În ciuda interesului scăzut în industria alimentară despre complexarea antocianină-metal, această interacţiune constituie o alternativă viabilă pentru stabilizarea culorii, în special, în cazul în care metalele conţinute nu implică un risc pentru sănătate sau în cazul în care ele chiar fac parte din mineralele esenţiale dietei. Una dintre principalele caracteristici ale antocianinelor şi antocianidinelor cu grupări orto-di-hidroxil (Cy, Dp, Pt), este capacitatea lor de a forma complcşi metal-antocianină (tabelul 1). Unele studii privind stabilitatea culorii în plante sugerează că aceste culori albastre sunt datorate unui complex format între antocianine şi unele metale, cum ar fi: Al, Fe, Cu, Sn, Mg şi Mo.

În interacţiunea antocianinei cu Al(III), complexarea a fost formată cu Cy şi alţi derivaţi flavonoizi, constatând faptul că acest proces stabilizează baza albastră de quinoidal, prin evitarea oxidării sale. Alţi autori au studiat variaţia culorii a unui ţesut de varză Hindu adăugând soluţii de Mo (IV şi VI), unde, în ambele cazuri culoarea albastră a fost stabilizată. Acest fapt sugerează posibilitatea de complexare dintre antocianină şi Mo. Mai multe studii recente au arătat că,complexarea dintre o-di-hidroxilantocianină şi Fe (III) sau ionii de Mg (II) la pH=5, este esenţială pentru formarea culorii albastre în plante, mai ales în cazul în care raportul stoichiometric antocianină:Fe(III) este 1:6 sau mai mare pentru Mg (II).

III.3.5. Activitatea antioxidantă Compuşii care sunt mai uşor de oxidat sunt adesea cei mai buni antioxidanţi (moleculele care pot dona

un electron liber sau un atom de H pentru a reacţiona cu radicalii liberi). Câteva studii au sugerat că, conţinutul de antocianină şi activitatea ei antioxidantă corespunzătoare, contribuie la efectul protector al fructelor şi legumelor împotriva bolilor cornice şi degenerative. Unele plante şi extracte din fructe cu conţinut ridicat de compuşi fenolici, au fost raportate pentru a acţiona ca inhibitori mutagenici şi carcinogenici. Substanţele fitochimice, care prezintă o activitate antioxidantă, include, pe lângă compuşii fenolici (flavonoide), compuşi azotaţi, tocoferoli, carotenoide şi acid ascorbic.

În catecoli, oxidarea se realizează prin intermediul radicalilor liberi, până când formează semiquinone foarte stabile. Compuşii cu grupe de catecol sau 1,4-hidroquinonă sunt deosebit de uşor de oxidat, deoarece radicalul fenoxil poate fi stabilizat cu oxigen.

Dacă ar fi făcută o anlogie între grupările de catecol şi cele mai frecvente antocianidine, ar fi de aşteptat că acelea care au o substituţie cu o-dihidroxil (Cy, Dp, Pt) sunt cele mai sensibile la oxidare. În cazul Pg, Pn şi Mv oxidarea nu se poate realize uşor, deoarece ele nu sunt substituite o-dihidroxil. Din cele 6 cele mai comune antocianidine, Pg este cea mai stabilă în condiţii de pH neutru.

Având în vedere stabilitatea radicalului semiquinonă în catecol, în figura 8 este propus un mechanism radicalic liber pentru stabilitatea semiquinonei formată prin oxidarea Cy. Presupunând de asemenea această supoziţie pentru o-dihidroxil antocianidină cu metale, este probabil că acest complex reduce capacitatea antioxidantă a antocianinei sau a antocianidinei, pentru că atomii de oxigen sunt limitaţi de ionul metallic, ca şi în complxul antocianină-Al(III) şi ele nu ar mai fi disponibile pentru reacţiile de oxidare.

Antocianidinele şi antocianinele au arătat o activitate antioxidantă mai mare decât vitamina C şi E. Aceşti compuşi sunt capabili de a capta radicalii liberi prin donare de atomi de hidrogen fenolici; acesta este motivul pentru activitatea lor anticarcinogenică. A fost de asemenea raportată o corelare lineară între valorile capacităţii antioxidante şi conţinutul de antocianine în mure, zmeură şi căpşuni; în plus, a fost descries faptul că extractele de boabe posedă o activitate de curăţare ridicată faţă de speciile reactive ale oxigenului generate chimic. Acţiunea antioxidantă a fructelor de pădure este direct proporţională cu conţinutul de antocianine.

21

Figura 8 – Mecanismul propus pentru stabilitatea radicalului Cy semiquinonă

III.3.6. PyranoantocianinelePrimul raport al pyranoancianinelor datează din 1996, când o nouă clasă de pigmenţi a fost detectată în

vinurile roşii filtrate. Aceste molecule au avut o atenţie deosebită pe parcursul ultimilor 10 ani, deoarece ele au o stabilitate mai mare decât antocianinele, la variaţiile valorilor de pH. Ele sunt formate în urma reacţiei antocianinelor cu moleculele care au greutate moleculară mică, precum 4-vinilfenol, acidul piruvic şi flavonolii. De asemenea, unele pyranoantocianine au fost detectate în soluţiile de vin studiate. Aceste atribute diferite ale pyroantocianinelor au ridicat unele semne de întrebare cu privire la contribuţia lor posibilă pentru culoarea vinurilor roşii vechi.

Structurile bine cunoscute ale principalelor pyranoantocianine sunt arătate în figura 9. Studiile efectuate au arătat dependenţa concentraţiei soluţiilor faţă de câţiva factori: acidul piruvic, acetaldehidă, nivelurile antocianinei, pH şi temperatură.

Mecanismul sugerează o reacţie a antocianinelor din vin cu acizii hidroxicinamici simpli (acidul coumaric, cafeic, ferulic şi sinapic). Reacţia este destul de rapidă, dar depinde de condiţiile de depozitare. Pentru analiza compuşilor puri au fost utilizate metodele UV-VIS, 1H-RMN, 13C-RMN, MS-ESI şi LC-ESI-MS. Unele pyranoancianine au fost identificate în sucul negru de morcovi şi în sucurile de portocale.

22

Figura 9 – Structurile chimice ale pyranoantocianinelor

III.4. Metode de extracţie şi purificare

III.4.1. Metodele de extracţieExtracţia solventului a fost cea mai uzuală metodă de extracţie a diferiţilor compuşi prezenţi în fructe,

inclusiv flavonoidele. Compuşii fenolici au fost extraşi prin mărunţire, uscare sau doar prin înmuierea fructelor proaspete într-un solvent de extracţie. Antocianinele sunt molecule polare, astfel cei mai frecvenţi solvenţi utilizaţi în extracţii sunt amestecurile apoase de etanol, metanol sau acetonă. Aceste metodologii implică co-extracţia substanţelor nefenolice (zaharuri, acizi organici şi proteine), care necesită procese de purificare ulterioare (de exemplu, extracţia în fază solidă SPE).

23

Printre metodele cele mai uzuale sunt cele care utilizează metanolul acidulat sau etanolul ca agenţi de extracţie. Dintre aceste metode, extracţia cu metanol este cea mai eficientă, de fapt, s-a constatat că, în extracţiile antocianinei din pulpa de struguri, extracţia cu metanol este cu 20% mai eficientă decât extracţia cu etanol, şi cu 73% mai eficientă decât extracţia cu apă.

Cu toate acestea, în industria alimentară este preferată extracţia cu etanol datorită toxicităţii metanolului. În extracţiile cu solvent acidulat, o atenţie deosebită ar trebui să aibă loc pentru a evita mediul puternic acid, deoarece antocianinele acidulate s-ar putea degrada (reacţie de hidroliză), iar în cazul antocianinelor 3-monoside legăturile glicozide ar putea fi distruse. În afară de extracţiile cu metanol şi metanol acidulat există rapoarte cu derivaţi ai etanolului sulfuraţi folosiţi ca agenţi de extracţie, utilizând o soluţie apoasă de SO 2 (HSO3

-), care poate reacţiona cu antocianinele provocând un atac nucleofil în moleculă şi cauzând această formă a antocianinei incolore. Înmuierea a fost, de asemenea, folosită pe scară largă pentru extracţia antocianinelor; în industria vinului este cea mai curentă metodă, care constă în măcinarea fructelor proaspete şi punerea în contact a sucului de struguri cu coaja pentru a extrage pigmenţii.

În extracţiile antocianinelor din coacăze, o soluţie apoasă de 80% etanol saturată cu SO 2 a fost utilizată ca agent de extracţie. Antocianinele din sorgul negru au fost extrase cu HCl 0,1% în metanol şi 70% soluţie apoasă de acetonă. Extracţia cu metanol acidulat a fost de două ori mai eficientă decât extracţia cu soluţie apoasă de acetonă.

Antocianinele în urma extracţiei cu soluţii apoase de acetonă nu au fost identificate; aparent moleculele de antocianine işi modifică semnificativ structura în soluţii apoase de acetonă, un fenomen care nu are loc în extracţia cu metanol acidulat. Această observaţie este în concordanţă cu alte investigaţii, care au reuşit să confirme formarea pyranoantocianinelor prin adăugarea acetonei.

În conformitate cu metodele de extracţie raportate în literatura de specialitate, se poate observa că, în scopul extracţiei antocianinelor acilate şi 3,5-diglicerinei, este necesar să se utilizeze un mediu acid pentru a evita hidroliza (acidul formic sau acidul acetic); în cazul extracţiei cu HCl 0,1% în metanol, au fost de asemenea obţinuţi aglicoli, dar în aceste condiţii nu se ştie dacă agliconii au fost simpli sau dacă ei au hidrolizat în timpul extracţiei. Se poate concluziona că atunci când se utilizează mediu acid este posibil să se extragă mai multe şi diferite antocianine.

III.4.2. Metodele de purificare Metodele de extracţie propuse până acum nu sunt selective pentru antocianine, deoarece ele sunt în

măsură să co-extragă un număr mare de alţi compuşi, cum ar fi zaharuri sau acizi organici. În consecinţă, este necesar să se implementeze noi tehnici de purificare, în scopul de a izola antocianinele care interesează. În acest sens, s-a propus o varietate mare de tehnici, de la extracţiile în fază solidă (SPE) şi în fază lichid-lichid (LLE) până la utilizarea tehnicilor cromatografice sofisticate precum cromatografia în contracurent (CCC), cromatografia lichidă la presiune medie (MPLC) şi cromatografia lichidă de înaltă presiune (HPLC).

Extracţia în fază solidă se utilizează frecvent în analiza C18 sau cartuşului Sephadex, în care antocianinele sunt puternic legate de grupările hidroxil şi separate ulterior de alţi compuşi prin creşterea polarităţii cu diferiţi solvenţi. Cromatografia în contracurent şi cromatografia lichidă la presiune medie sunt utilizate ca metode de purificare cu analize ulterioare prin HPLC pentru elucidare structurală, cu avantajul de a minimiza timpul de separare şi solvenţii fazei mobile.

Cea mai frecventă metodă utilizată pentru separarea antocianinelor este HPLC cu detectorul UV-VIS sau matricea de fotodiodă (PDA).

III.4.3. Platforma de prelucrare pilotDeşi importanţa pigmenţilor naturali este cunoscută, există puţine rapoarte în utilizarea plantelor şi

fructelor pentru extracţia antocianinelor. Acest lucru ar putea fi cauzat de trei factori limitativi, adesea trecuţi cu vederea în studiile ştiinţifice:

- eficienţa recuperării şi extracţiei- comercializarea extractelor rezultate- adecvarea practică pentru produsele alimentare şi farmaceutice.

24

Un alt factor important este stabilitatea şi intensitatea coloraţiei dată de antocianine, care depinde de structurile lor moleculare şi de asociaţiile inter şi intramoleculare. Antocianinele sunt, de asemenea, cunoscute pentru sensibilitatea lor la căldură. În efortul de a păstra proprietăţile acestor compuşi au fost explorate câteva strategii pilot.

Le, Durst şi Wrolstand (2002) au efectuat câtevaexperimente pentru extragerea antocianinelor din afinele congelate. Ei au folosit extracţia cu acetonă alimentară cu adăugare de SO2 ca agent de extracţie.Apoi, o etapă de purificare a fost făcută prin reextragerea cu chloroform:soluţie de acetonă (2:1) şi concentrarea acestora printr-un tratament termic. Extractul final conţinând 465 mgxkg-1 din totalul antocianinelor corespunde la o rată de recuperare de la 13% la 23%.

Într-un alt studio, Kammerer, Kljusuric, Carle şi Schieber (2005) au evaluat o răşină schimbătoare de ioni pentru recuperarea şi concentrarea antocianinelor din extractele de tescovină de struguri. Extractul apos a fost preparat prin adăugarea de apă peste coaja strugurilor proaspeţi. Produsul rezultata a fost trecut prin răşină şi eluat cu metanol. Temperaturile de absorbţie şi desorbţie au fost de 25oC, respective 50oC. Ratele de recuperare raportate au variat de la 96% la 100%. Valorile retie de recuperare în platforma de prelucrare pilot au fost comparate cu cele obţinute experimental în laborator, rezultatele relevate nu au prezentat diferenţe semnificative între recuperările prevăzute de ambele metode.

În scopul de a reduce la minimum nedorita descompunere naturală microbiană a antocianinelor în timpul etapei de extracţie, Meng, Lozano, Bombarda, Gaydon şi Li (2006) au propus o metodologie de curgere transversală de microfiltrare cu o membrană ceramică şi osmoză inversă. Acest process a fost aplicat în frustescens Perrila cu 0,01 molxl-1 de acid azotic ca agent de extracţie. Extractul acid final a fost concentrat de 9,4 ori conţinând 422 mgxl-1 din totalul de antocianine şi reprezentând 77% din extrasul total.

III.5. Metodele de identificare

Identificarea antocianinelor are un rol critic în studiile taxonomice şi de alterare, în afară de evaluarea calităţii produselor alimentare brute şi prelucrate. Datorită caracteristicilor spectrale ale antocianinelor care oferă informaţii utile calitative şi cantitative, de fapt spectroscopia este tehnica cea mai folosită datorită simplităţii ei şi costului redus. Giusti şi Wrolstad (2001) au publicat comentariile excelente despre metodele utilizate cel mai frecvent în caracterizarea şi cuantificarea antocianinelor (UV-VIS, HPLC, PDA).

Prin urmare, spectrometria de masă (MS) şi spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară protonică (1H-RMN) şi 13C-RMN au devenit tehnicile preferate pentru identificarea antocianinelor.

III.5.1. Spectrometria de masă (MS)Analizele antocianinelor prin spectrometria de masă au fost efectuate pentru diferite scopuri: elucidarea

structurală, studiul transformărilor în timpul învechirii vinului roşu, polimerizările şi reacţiile cu alte flavonoide. În tabelul 2 sunt prezentate referinţele principale ale utilizării spectrometriei de masă în studiile antocianinelor.

Recent, tehnicile cum ar HPLC cuplată cu MS, APCI-MS, FAB-MS şi ESI-MS au devenit instrumente foarte puternice pentru identificarea antocianinelor. În ultimele două decenii, numeroase metode de ionizare au fost dezvoltate pentru probele nevolatile sau pentru probele instabile termodinamic precum antocianinele. Aceste tehnici evită ulterioara volatilizare şi ionizare şi măreşte energia probelor solide sau lichide în diferite moduri, astfel încât se produce formarea directă a ionilor gazoşi. Ca o consecinţă, este posibil să se obţină spectre foarte simplificate. Printre aceste surse de desorbţie s-au contactat FAB, ESI şi MALDI, care sunt considerate surse regulate de ionizare, deoarece ele provoacă fragmentare slabă şi permit determinări exacte ale maselor moleculare (tabelul 2).

Wang, Kalt şi Sporns (2000) au raportat utilizarea MALDI-ToFMS pentru identificarea extractului de affine. Principalul avantaj al acestei tehnici, conform autorilor, a fost acela că analizele au fost effectuate în aproximativ 4 minute/probă.

25

Tabelul 2 – Analizele antocianinelor prin spectrometria de masă

III.5.2. Rezonanţa magnetică nucleară (RMN)Tehnica RMN a fost utilizată pentru elucidarea structurală a antocianinelor. Prin efectuarea

experimentelor de corelare COSY, a fost posibilă identificarea antocianinelor acilate în trandafiri, observând că principalele antocianine au fost Cy-3-cum-glc-5-glc, Pn-3-cum-glc-5-glc şi Cy-3-sop. În ceea ce priveşte identificarea antocianinelor în căpşuni, au fost efectuate de Froytlog, Slimestad şi Andersen (1998) aceleaşi experimente de corelare cum ar fi HMBC, HSQC, DQF-COSY. În acest studiu, un nou aglicon a fost găsit: 5-carboxipyranpelargonidina.

Experimentele de corelare au fost folosite de câţiva cercetători, în special pentru a determina poziţia glicozidei în antocianine. În mod similar, câteva experimente RMN de corelare au fost făcute pentru adiţia antocianinei (cu acid piruvic) găsită în vinul roşu. În acest studiu, este propus un mecanism pentru formarea a doi pigmenţi obţinuţi din acelaşi produs (acid Mv-3-glc-piruvic şi acid Mv-3-cum-glc-piruvic), aceste studii fiind efectuate cu ajutorul metodelor 1H-RMN şi 2D-RMN (COSY).

Spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară a fost foarte utilă pentru identificarea produşilor de reacţie a antocianinelor cu alţi compuşi, cum ar fi derivaţii acidului cinamic, radicalii peroxil, catechinele şi flavonolii.

26

III.5.3. Electroforeza capilară (CE) Utilizarea electroforezei capilare în separarea antocianinelor este destul de recentă, limitată şi

promiţătoare datorită solubilităţii ridicate în apă a acestor compuşi. Electroforeza capilară este tehnica potrivită pentru separarea, identificarea şi cuantificarea antocianinelor.

Primele analize ale antocianinei prin electroforeza capilară au fost raportate în 1996. În acest studiu s-a folosit un tub capilar siliconic, o soluţie tampon de borat (pH=8) şi detector PDA. Datorită instabilităţii antocianinelor la pH bazic, rezoluţia şi sensibilitatea metodei au fost foarte mici, iar autorii au fost în măsură să obţină rezultate doar la concentraţii ridicate ale antocianinei. Mai târziu, aceiaşi cercetători au propus alte metodologii prin utilizarea soluţiei tampon de fosfat la pH=2,1 şi CTAB ca surfactant cationic. CTAB a fost folosită pentru a acoperi suprafaţa capilară în scopul de a evita interacţiunile pereţilor antocianinei şi a schimba direcţia EOF, care afectează rezultatele separării şi cuantificării.

Alte variante ale electroforezei capilare au fost utilizate pentru determinarea cantitativă a antocianinelor în vin ca o alternativă a HPLC; studiul a fost realizat cu ajutorul unei capilare siliconice şi a soluţiei tampon Na2B4O7 la pH=8,4 cu 15% metanol ca modificator. Electroferogramele au fost obţinute la 599 nm şi, în scopuri de cuantificare, curbele de calibrare au fost realizate folosind Mv-3-glc ca standard. În acest raport, rezultatele au fost mai bune decât cele publicate în 1996, deoarece a fost făcută o preconcentrare a soluţiei, în afară de adăugarea modificatorilor organici pentru a spori selectivitatea metodei şi stabilitatea antocianinelor.

O metodă similară a fost propusă pentru antocianinele acilate sau non-acilate şi derivaţii 3-glucozidei. Calvo, Saenz-Lopez, Fernandez-Zurbano şi Tena (2004) au efectuat unele experimente de electroforeză capilară pentru pigmenţii care au fost separaţi de LC, cu scopul de a identifica compuşii şi pentru a determina timpul de migrare, explicaţiile lor fiind bazate pe raportul de schimbare a masei şi pe posibilitatea formării unui complex cu moleculele soluţiei tampon de tetraborat.

Un alt mod de utilizare a electroforezei capilare, care a fost folosit în analizele antocianinelor, este electrocromatografia micelară (MEKC). Prin utilizarea acesteia, s-a descoperit o metodă de a separa simultan 6 antocianine (Mv-3,5-diglc, Mv-3-glc, Mv-3-gal, Pg-3-glc, Cy-3,5-diglc şi Cy-3-gal). Condiţiile de analiză au fost: soluţie tampon de fosfat 30 mM + 400 mM borat-TRIS + 50 mM SDS, pH=7. Concentraţia mare de borat a fost foarte importantă la separarea perechilor de diasteromeri, cum ar fi Mv-3-glc şi Mv-3-gal. În ceea ce priveşte SDS, este cunoscut faptul că formarea de miceli încărcaţi negativ oferă stabilitate chimică antocianinelor în soluţii apoase. Rezultatele acestor investigaţii indică faptul că numărul de sarcini negative şi o distribuţie organizată a acestor sarcini pe suprafaţa micelei sunt factori determinanţi pentru a permite stabilitatea şi păstrarea culorii a antocianinelor.

Electroforeza capilară a fost de asemenea folosită pentru a crea corelaţii între conţinutul antocianinelor şi învechirea vinului roşu. Electroforeza capilară cuplată cu ESI-MS a fost utilizată pentru monitorizarea antocianinelor şi flavonoidelor în vin. Condiţiile experimentale au fost: soluţie tampon de cloroacetat de amoniu (pH=2) şi soluţie tampon de borat de amoniu (pH=9, cu o selectivitate mare a derivatelor cu grupări hidroxil). Metoda spectrometriei de masă a fost optimizată şi fragmentările antocianinelor au fost studiate în detaliu.

III.5.4. Calcule teoreticeCâţiva cercetători au efectuat calcule teoretice în scopul de a prezice comportamentul chimic al

antocianinelor în diferite soluţii. Rapoartele calculelor teoretice pentru antocianine sunt limitate, dar unul dintre studiile care au fost bazate pe calculele orbitalilor moleculari (MO) a fost făcut în scopul de a determina interacţiunea unor acizi organici cu antocianinele şi modul în care aceasta le afectează colorarea (efectul de co-pigmentare).

În plus, unele studii au fost efectuate pentru caracteristicile structurale şi electronice pentru patru antocianidine: Pg, Cy, Dp şi An. Pentru aceste molecule, structurile plane şi cele în afara planului au fost determinate la un nivel de teorie B3LYP/D95. Rezultatele au indicat faptul că structurile plane sunt mai stabile decât cele în afara planului, iar autorii au arătat că hidroxilarea grupării fenil produce o schimbare în energia excitată fără a ţine cont de efectele solventului; acest fapt este de acord cu experimentele precedente spectrale şi cu experimentele de calcul ale orbitalilor moleculari.

27

III.6. Concluzii

Antocianii, mai ales antocianidenele, posedă o varietate de proprietăţi farmacologice, făcându-i interesanţi ca potenţial agenţi chemopreventivi de cancer. Ei apar în fructe şi legume în cantităţi relativ mari. Studiile farmacocinetice sugereaza că antocianinele sunt uşor de ingerat din sursele lor naturale, care pot furniza nivelurilor sanguine la oameni un domeniu de 10-8-10-7 M. Problemele care rămân nerezolvate sunt atât dacă aceste nivele sunt suficiente pentru exercitarea efectelor robuste anticarcinogenice, cât şi dacă antocianinele exercită eficacitate chemopreventivă ei însişi sau în cazul în care au nevoie să fie supuşi hidrolizei cu omologii lor agliconici.

Antocianidinele s-au dovedit a inhiba supravieţuirea celulei maligne şi semnalizarea oncogenică cu potenţă rezonabilă. Deşi studiul literaturii disponibile în prezent prevede sugestiile la utilitatea potenţială a antocianilor ca intervenţii chemopreventive de cancer, sunt necesare studii suplimentare. Două tipuri de investigaţii par a fi deosebit de importante. În primul rând, diferenţele potenţialelor farmacologice dintre derivaţii antocianilor trebuie să fie definite în continuare, pentru a permite stabilirea proprietăţilor care urmează să fie făcute cu privire la antocianine şi/sau antocianidine. În al doilea rând, studiile ar trebui să se concentreze pe tipurile de ţesuturi care ar putea fi susceptibile la prevenirea cancerului cu antociani. Rezultatele din astfel de studii, împreună cu cele prezentate mai sus, vor oferi baza ştiinţifică solidă pentru a sprijini ideea că ingestia de 5 porţii de fructe colorate/zi este foarte bună, deoarece poate preveni cancerul.

Accentul investigaţiilor recente ne permite să constatăm o creştere semnificativă în utilizarea antocianinelor ca şi coloranţi naturali în diverse produse în timpul următorilor ani. Având în vedere efectul benefic pentru sănătate al acestor molecule, încorporarea lor în industria alimentară şi în industria băuturilor va reprezenta o valoare importantă. Punerea în aplicare a unei bune metodologii de extracţie, purificare şi identificare într-un laborator şi apoi într-o platformă de prelucrare pilot, va avea loc un impact asupra costului acestor coloranţi şi asupra standardelor lor în viitorul apropiat, precum şi asupra creşterii unor noi instrumente de autentificare ale acestor produse alimentare.

Cercetarea pigmenţilor din plante este fascinantă. Ea implică mai multe metode şi cunoştinţe profunde în mai multe domenii. Studiile pigmentului din plante ar trebui să continue, deoarece ele pot procura câteva impresii interesante imediate la fel de bine ca şi avantajele comerciale şi ale sănătăţii. Pentru aceste avantaje, este important să se aibă la dispoziţie cele mai bune metodologii pentru analizarea compoziţiei pigmentului din probe. Aceste metode pot conţine tehnici, cum ar fi spectrometria în infraroşu, spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară etc., care, în trecut, au fost mai restrânse din punct de vedere al utilizării lor în cercetările de bază.

28

Bibliografie

1. Darren Cooke, William P. Steward, Andreas J. Gescher, Tim Marczylo – “Anthocyans from fruits and vegetables – Does bright colour signal cancer chemopreventive activity?”European Journal of Cancer 41 (2005): 931-1940

2. Araceli Castaneda-Ovando, Ma. De Lourdes Pacheco-Hernandez, Ma. Elena Paez-Hernandez, Jose A. Rodriguez, Carlos Andres Galan-Vidal – “Chemical studies of anthocyanins: A review”Food Chemistry 113 (2009): 859-871

3. Benoit Schoefs – “Determination of pigments in vegetables”Journal of Chromatography A, 1054 (2004): 217-226

29

CUPRINSCapitolul I – Antocianii din fructe şi legume.................................................................................1

I.1. Introducere.....................................................................................................................................................1I.2. Dovezi epidemiologice..................................................................................................................................2I.3. Proprietăţile chimice......................................................................................................................................2I.4. Proprietăţile chemopreventive ale cancerului la animale..............................................................................3I.5. Efecte farmacologice în vitro.........................................................................................................................3I.6. Farmacologia clinică şi pre-clinică................................................................................................................4

Capitolul II – Determinarea pigmenţilor în legume.......................................................................5II.1. Introducere....................................................................................................................................................5II.2. Extracţia pigmentului...................................................................................................................................6

II.2.1. Moleculele de clorofilă şi de carotenoide..............................................................................................6II.2.2. Antocianinele.........................................................................................................................................7II.2.3. Betalainele.............................................................................................................................................7

II.3. Separarea cromatografică a pigmenţilor din legume....................................................................................7II.3.1. Coloana deschisă...................................................................................................................................7II.3.2. Cromatografia în strat subţire................................................................................................................8II.3.3. Cromatografia în contracurent...............................................................................................................8II.3.4. Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC)...........................................................................8II.3.5. Cromatografia pe fluid supercritic.......................................................................................................10II.3.6. Electroforeza capilară..........................................................................................................................10

II.4. Detecţia pigmenţilor...................................................................................................................................11II.4.1. Spectroscopia UV-VIS........................................................................................................................11II.4.2. Spectroscopia în infraroşu (IR)...........................................................................................................11II.4.3. Spectroscopia de masă (MS)...............................................................................................................12II.4.4. Spectroscopia RMN.............................................................................................................................12

II.5. Identificarea şi cuantificarea pigmentului..................................................................................................13Capitolul III – Studiile chimice ale antocianinelor.......................................................................14

III.1. Introducere................................................................................................................................................14III.2. Chimia antocianinelor...............................................................................................................................14III.3. Stabilitatea antocianinelor.........................................................................................................................15

III.3.1. Solventul şi efectele concentraţiei antocianinei.................................................................................16III.3.2. Influenţa pH-ului................................................................................................................................16III.3.3. Efectul de co-pigmentare...................................................................................................................17III.3.4. Interacţia ionilor metalici...................................................................................................................20III.3.5. Activitatea antioxidantă.....................................................................................................................20III.3.6. Pyranoantocianinele...........................................................................................................................21

III.4. Metode de extracţie şi purificare...............................................................................................................22III.4.1. Metodele de extracţie.........................................................................................................................22III.4.2. Metodele de purificare.......................................................................................................................23III.4.3. Platforma de prelucrare pilot..............................................................................................................23

III.5. Metodele de identificare............................................................................................................................24III.5.1. Spectrometria de masă (MS)..............................................................................................................24III.5.2. Rezonanţa magnetică nucleară (RMN)..............................................................................................25III.5.3. Electroforeza capilară (CE)................................................................................................................26III.5.4. Calcule teoretice.................................................................................................................................26

III.6. Concluzii...................................................................................................................................................27Bibliografie...................................................................................................................................28

30