Upload
vokien
View
232
Download
2
Embed Size (px)
Citation preview
REPLIKASI DAN REPLIKASI DAN POLYMERASE CHAIN REACTIONPOLYMERASE CHAIN REACTION
(PCR)(PCR)Debbie S. Retnoningrum
Sekolah Farmasi, ITB
Pustaka:1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, hal. 27-28; 110-1202. Groves MJ, 2006, hal. 40 – 443. Brown TA, 2006, hal 6-7; 181-193
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 22
DOGMA SENTRAL BIOLOGI MOLEKULERDOGMA SENTRAL BIOLOGI MOLEKULER
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 33
REPLIKASIREPLIKASI
• Replikasi adalah penggandaan DNA• Sintesis 2 molekul DNA dari 1 molekul DNA• Konsep pasangan basa• Arah 5’ ke 3’ pada untai yang disintesis• Dikatalisis oleh DNA polimerase
www.uic.edu/.../lecture4/replication4.jpg
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 44
KomponenKomponen –– komponenkomponen ReplikasiReplikasi DNADNA
Mulai pada origin of replication (ori)Protein pengikat DNA untai tunggalHelikase (pembukauntai)Primase (RNA polimerase)DNA polimerase
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 55
ReplikasiReplikasi DNADNA
• REPLIKASI DNA:– Pemanjangan untai baru
DNA– dNTP: dATP, dTTP, dGTP,
dCTP– Dikatalisis oleh DNA
polimerase
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 66
Gap filling & DNA repairPol-εReplikasi pada mitokondriaPol-γReplikasi leading strandPol-δGap filling & DNA repairPol-βReplikasi lagging strandPol-α
EukariotReplikasiPol IIIGap filling & DNA repairPol IIGap filling & DNA repairPol I
FungsiProkariot
DNA DNA PolimerasePolimerase
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 77
Polymerase Chain Reaction (PCR)Polymerase Chain Reaction (PCR)
Karry Mullis, penemu PCRPemenang hadiah Nobel
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 88
SIKLUS PCRSIKLUS PCR
94 oC
55 oC
72 oC
SIKLUS 1 SIKLUS 2 SIKLUS 3
T
WAKTU (DETIK)
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 99
SIKLUS PCR dan HASIL AMPLIFIKASISIKLUS PCR dan HASIL AMPLIFIKASI
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1010
Polymerase Chain Reaction (PCR)Polymerase Chain Reaction (PCR)
www.scq.ubc.ca/wp-content/uploads/2006/07/PCR.gif
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1111
KOMPONEN PCRKOMPONEN PCR
• cetakan DNA
• oligonukleotida pendek (primer)
• DNA polimerase termostabil :Taq Polymerase(Thermus aquaticus) & buffer
• dNTP (dATP, dTTP, dCTP dan dGTP)
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1212
Genom yang ditentukan urutannyaGenom yang ditentukan urutannyahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1313
Contoh informasi pada data genBankContoh informasi pada data genBank
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1414
Amplifikasi DNA target dalam genom organismeAmplifikasi DNA target dalam genom organisme
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1515
Amplifikasi DNA targetAmplifikasi DNA target dalam genom organismedalam genom organisme
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1616
DETEKSI PRODUK PCRDETEKSI PRODUK PCR
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1717
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1818
PCR PCR untukuntuk deteksideteksi PatogenPatogen
GEN TARGETP1
P2
PRODUK PCR: 490 pb
TARGET HARUS SPESIFIK PATOGEN
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1919
PCR UNTUK DETEKSI PATOGENPCR UNTUK DETEKSI PATOGEN
DETEKSI Mycobacterium tuberculosisDNA TARGET: FRAGMEN TARGET IS6110 BERSALINAN TINGGI Bahan dahak
DETEKSI Chlamydia trachomatisDNA TARGET: GEN MAJOR OUTER MEMBRANE PROTEIN = MOMPBahan usap vagina (4), darah (5), mata (6)
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2020
MODIFIKASI PCRMODIFIKASI PCR
• PCR-HIBRIDISASI (PRODUK PCR DIHIBRIDISASI DENGAN PELACAK)
• PCR multipleks• Nested-PCR• PCR-sekuensing• Real-time PCR
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2121
Denaturation
Addition of probe
Hybridization
PRINSIP HIBRIDISASIPRINSIP HIBRIDISASI
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2222
lisis
PCR
denaturasi
hibridisasisubstrat
deteksi kolorimetriΣ molekul target ⇒ Σ sinyal
PCR PCR HIBRIDISASI DENGAN DETEKSI HIBRIDISASI DENGAN DETEKSI KOLORIMETRIKOLORIMETRI
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2323
DETEKSI KOLORIMETRIDETEKSI KOLORIMETRI
Produk PCRBiotin
AvidinHorse radish peroxidase
H2O2
TMB
Pelacak
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2424
PCR MULTIPLEKSPCR MULTIPLEKS
• PASANGAN PRIMER UNTUK DNA TARGET > 1• CONTOH:
– Escherichia coli: GEN TARGET gen LT1, ST1, SLT1, SLT2, VT1, VT2, VTE
– 7 PASANGAN PRIMER– 7 PRODUK PCR
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2525
LT1
ST1
SLT1SLT2VT1VT2VTE
S A B C D
HASIL PCR MULTIPLEKSHASIL PCR MULTIPLEKS
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2626
Contoh Hasil PCR multipleksContoh Hasil PCR multipleks
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2727
NestedNested--PCRPCR
GEN FLAGELIN S. typhiST1
ST2
458 pb
343 pb
PCR pertama
PCR kedua
ST3
ST4
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2828
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2929
PCR SEKUENSINGPCR SEKUENSING
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 3030
PCR REALPCR REAL--TIMETIME
• PCR KONVENSIONAL: – TAHAP AMPLIFIKASI DAN DETEKSI TERJADI
SECARA KONSEKUTIF
• PCR REAL-TIME– TAHAP AMPLIFIKASI DAN DETEKSI TERJADI
SECARA SIMULTAN
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 3131
Deteksi pada PCR konvensionalDeteksi pada PCR konvensional
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 3232
Daerah deteksi realDaerah deteksi real--time PCRtime PCR
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 3333
PELACAK HIBRIDISASIPELACAK HIBRIDISASI
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 3434
PELACAK HIBRIDISASIPELACAK HIBRIDISASI
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 3535
Contoh hasil realtime PCRContoh hasil realtime PCR