NOÄI QUI PHOØNG THÖÏC HAØNH NOÄI QUI PHOØNG THÖÏC HAØNH SINH HOÙASINH HOÙA

NOÄI QUI PHOØNG THÖÏC HAØNH NOÄI QUI PHOØNG THÖÏC HAØNH SINH HOÙASINH HOÙA

1. SV phaûi coù maët taïi phoøng thí nghieäm ñuùng giôø aán ñònh. Nhöõng SV ñeán treã 10 phuùt keå nhö vaéng maët (khoâng thöïc taäp buø). SV phaûi laøm ñaày ñuû caùc baøi thöïc taäp vaø ñaït yeâu caàu phaàn thöïc taäp môùi ñuû ñieàu kieän döï thi phaàn lyù thuyeát.

2. Trong moãi buoåi thöïc taäp, caùc SV trong nhoùm ñöôïc chia thaønh 4 tieåu nhoùm (khoaûng 4-5 SV) vaø moãi tieåu nhoùm thöïc hieän moät baøi thöïc taäp, nhöng moãi SV phaûi töï laøm heát taát caû caùc noäi dung cuûa baøi thöïc taäp ñoù. Tröôùc khi ñeán phoøng thöïc taäp, SV caàn nghieân cöùu kyõ noäi dung, yù nghóa cuûa baøi thöïc taäp saép laøm, khoâng neân tieán haønh caùc baøi thöïc taäp moät caùch maùy moùc, thuï ñoäng.

3. Moãi tieåu nhoùm ñöôïc söû duïng vaø chòu traùch nhieäm veà nhöõng duïng cuï, hoùa chaát cuûa baøi thöïc taäp ñang laøm. Cuoái moãi buoåi thöïc taäp, SV phaûi röûa duïng cuï, laøm veä sinh, xeáp ñaët choã thöïc taäp goïn gaøng, noäp baøi töôøng trình vaø baøn giao cho giaùo vieân phuï traùch xaùc nhaän tröùôc khi ra veà.

4. Trong khi laøm thöïc taäp, SV phaûi giöõ traät töï, saïch seõ vaø yeân laëng. Khi chöa ñöôïc söï höôùng daãn cuûa giaùo vieân, tuyeät ñoái khoâng toø moø söû duïng caùc duïng cuï ñieän, caùc maùy moùc ñieän töû cuûa phoøng thöïc taäp.

5. Sau moãi buoåi thöïc taäp, moãi sinh viên ñeàu phaûi laøm baøi töôøng trình (theo maãu) vaø noäp cho giaùo vieân phuï traùch vôùi caùc noäi dung: giaûi thích nhöõng noäi dung ñaõ laøm, nhöõng noäi dung chöa roõ hay neâu nhöõng thaéc maéc neáu coù…

6. Vaøo phoøng thöïc taäp phaûi maëc aùo blouse.

PHIẾU THỰC HÀNH SINH HÓAHọ và tên sinh viên : NGUYỄN THỊ NGUYỆT ÁNH Lớp TC05TY

Tổ : I Nhóm : 01

Ngày: 24 – 12 – 2007. Thực hành bài : Thực nghiệm về glucid

PHẦN TƯỜNG TRÌNH1. Phaûn öùng Molisch – Xác định sự có mặt của

glucid trong mẫu xét nghiệm. Ghi nhaän keát quaû:

fructose : + saccharose : + tinh bột : +

3. Phaûn öùng Benedict- xaùc ñònh tính khöû của đường

Ghi nhaän keát quaû: fructose : + saccharose : - tinh bột : -

MỤC LỤC

Trang

Bài 1 Thực nghiệm về glucid 01

Bài 2 Thực nghiệm về lipid và enzyme 07

Bài 3 Thực nghiệm về protein và amino acid

12

Bài 4 Thực nghiệm về vitamin và chất khoáng

20

BAØI 1. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ GLUCID

1. PHAÀN ÑÒNH TÍNH 1.1. P/ư Molisch : xaùc ñònh söï coù maët của

glucid trong maãu xeùt nghieäm1.2. P/ư Seliwanoff :xác ñònh söï coù maët cuûa

caùc đường đơn thuoäc nhoùm ketose 1.3.P/ư Benedict: xaùc ñònh tính khöû của

đường 1.4. Khảo sát tinh bột 1. P/ư maøu cuûa tinh boät vôùi iod 2. P/ư phaân giaûi tinh boät2. PHAÀN ÑÒNH LÖÔÏNG GLUCID• Ñònh haøm löôïng glucose trong maùu (theo

Somogyi-Nelson)

BAØI 1. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ GLUCIDBAØI 1. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ GLUCID

1. PHAÀN ÑÒNH TÍNH

1.1. Phaûn öùng Molisch

Laø phaûn öùng xaùc ñònh söï coù maët của các

aldoses và ketoses trong maãu xeùt nghieäm

. Nguyeân taéc

Döôùi taùc duïng cuûa H2SO4 ñaäm ñaëc,

polysaccharide ñöôïc phaân giaûi taïo thaønh caùc

phaân töû monosaccharide, saûn phaåm naøy seõ

taïo laäp caùc nhaân furfural hay hydroxymethyl

furfural. Nhaân furfural taïo phöùc chaát vôùi .

naphtol trong thuoác thöû Molisch döùôi daïng

voøng nhaãn maøu tím giöõa 2 lôùp dung dòch.

Pentose Hexose

H2SO4 H2SO4

Furfural Hydroxy methyl furfural

CHOO

HO CH2- -CHO

OCHO

O

-naphthol

Phức chất màu tím

.. Hoùa chaát Thuoác thöû Molisch Dung dòch glucid 1%:

glucose,

fructose,

saccharose,

tinh bột

H2SO4 ñaäm ñaëc

Caùch laømDuøng pipette huùt :

1 ml glucose 1% cho vaøo oáng nghieäm lôùn cỡ 10 ml 5 giọt thuoác thöû Molisch, laéc ñeàu. Ñaët nghieâng oáng nghieäm, laáy caån thaän 1 ml H2SO4 ñaäm ñaëc cho chaûy doïc thaønh oáng. Quan saùt voøng nhaãn maøu tím giöõa 2 lôùp dung dòch. Laëp laïi phaûn öùng vôùi caùc loaïi glucid 1% khaùc :

fructose saccharose tinh bột

Ghi nhaän keát quaû.

1.2. Phaûn öùng Seliwanoff

Laø phaûn öùng xaùc ñònh söï coù maët cuûa caùc đường đơn thuoäc nhoùm ketose (nhö fructose,xylulose, ribulose).

. Nguyeân taéc

Trong moâi tröôøng HCl ñaäm ñaëc, fructose taïo thaønh saûn phaåm dihydroxymethyl furfural, saûn phaåm naøy seõ phaûn öùng vôùi resorcinol taïo thaønh phöùc chaát maøu ñoû.

. Hoùa chaát

- Thuoác thöû Seliwanoff (resorcinol trong HCl ñaäm ñaëc)

- Dung dòch glucid 1%:glucose, fructose, saccharose, tinh bột…

HOHC

CHOH HO-H

2 C-C CH-CH2OH O OH

HCl ññ -3H 2 O

CH2OH

CHHC

OHOH2C

OHHO

Resorcinol

Fructose Dihydroxymethyl fucfural

Phöùc chaát

maøu

ñoû

. Caùch laømDuøng pipette huùt :

1 ml dung dòch fructose 1% cho vaøo oáng nghieäm lôùn, 5 ml thuoác thöû Seliwanoff, laéc ñeàu. Ñun treân ñeøn coàn, vöøa ñun vöøa laéc nheï. Quan saùt maøu ñoû xuaát hieän ñaäm daàn leân. Laëp laïi phaûn öùng vôùi caùc dung dòch glucid coøn laïi:

- glucose - lactose- maltose- saccharose…

Ghi nhaän keát quaû.

1.3. Phaûn öùng Benedict

Laø phaûn öùng xaùc ñònh tính khöû của các

đường đơn và đường đôi.

. Nguyeân taéc

Aldehyde + th/thử Benedict → muối của carboxylic acid

+ Cu2O (đỏ gạch)

Tất cả các aldoses với nhóm chức CHO ở C1 đều là đường

khửCu 2+ + Glucose Cu2O + Muối của acid gluconic

Môi tr kiềm, to

. Hoùa chaát

Thuoác thöû Benedict (dung dòch CuSO4

trong moâi tröôøng kieàm sodium carbonate

vaø sodium citrate).

Dung dòch glucid 1%:

glucose,

fructose,

saccharose,

tinh boät…

. Caùch laøm

Duøng pipette huùt : 1 ml dung dòch glucose 1% cho vaøo oáng nghieäm lôùn, 5 ml thuoác thöû Benedict, laéc ñeàu. Ñun vaø laéc nheï treân ñeøn coàn.

Quan sát sự đổi màu của dung dịch và giải thích :

xanh dương → đục → vàng → đỏ gạch (tủa) → đen Laëp laïi phaûn öùng vôùi caùc dung dòch ñöôøng coøn laïi :

- fructose,

- saccharose,

- lactose,

- tinh bột...

Ghi nhaän keát quûa.

1.4. Phaûn öùng ñònh tính tinh boät (amidon)

1.4.1. Phaûn öùng maøu cuûa tinh boät vôùi iod

. Nguyeân taéc

Tinh boät (amidon) ñöôïc caáu taïo töø caùc caáu töû -D-glucose lieân keát laïi vôùi nhau baèng lieân keát glucosidic (1 4) taïo maïch thaúng amylose vaø (1 6) taïo maïch nhaùnh amylopectin. Maïch thaúng amylose trong dung dòch coù caáu truùc xoaén vôùi ñöôøng kính khoaûng 4-5Ao vaø taïo phaûn öùng maøu ñaëc tröng khi phaân töû iod loït vaøo trong voøng xoaén ôû nhieät ñoä phoøng.

. Hoùa chaát

- Dung dòch lugol (iod + KI)

- Dung dòch tinh boät 1%

- Dung dòch sodium thiosulfate (Na2S2O3) 1%

CAÁU TRUÙC HAÏT TINH BOÄT

CAÁU TRUÙC XOAÉN CUÛA MAÏCH AMYLOSE

ñöôøng kính khoaûng 4-5Ao

. Caùch laøm :

Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống :

5 ml dung dòch tinh boät 1%,

2 gioït dung dòch lugol, laéc ñeàu. Quan

saùt maøu xanh aùnh naâu (maøu xanh

chaøm)

Ống 1 : Ñun vaø laéc nheï treân ñeøn coàn

ñeán khi maøu xanh chaøm bieán maát.

Ñaët oáng nghieäm döôùi voøi nöùôc ñeå

laøm laïnh, quan saùt maøu xanh chaøm có

xuaát hieän trôû laïi không ? Tại sao?

Ống 2 :

cho vaøi gioït Na2S2O3 vào, laéc ñeàu,

quan saùt maøu xanh chaøm có bieán

maát không?.

Giải thích.

1.4.2. Phaûn öùng phaân giaûi tinh boät

. Nguyeân taéc

Trong moâi tröôøng acid ñaäm ñaëc vaø nhieät ñoä cao, caùc lieân keát glucosidic giöõa caùc caáu töû -D-glucose bò beû gaõy, giải phoùng caùc phaân töû -D-glucose. Tinh boät ñaõ thuûy phaân khoâng cho phaûn öùng maøu ñaëc hieäu vôùi iod.

. Hoaù chaát

- Dung dòch tinh boät 1%

- H2SO4 ñaäm ñaëc

- Dung dòch phenolphtalein 1%

- Dung dòch sodium hydroxyde (NaOH) 10%

. Caùch laøm

1) Thủy phân tinh bột

5 ml dung dòch tinh boät 1% + 5 gioït

H2SO4, laéc ñeàu.

Ñun treân ñeøn coàn, vừa đun vừa laéc nheï 2 phút.

Xác định dung dịch đã thủy phân hoàn toàn hay chưa thì nhoû 1 gioït iod leân gaïch men vaø laáy 1 gioït dung dòch ñang ñun nhỏ lên giọt iod, troän ñeàu, quan saùt maøu xanh chaøm coù xuaát hieän khoâng? Neáu còn maøu xanh chaøm, tieáp tuïc ñun theâm 1 phuùt vaø thöû laïi vôùi iod.

2) Hoàn thành mẫu tinh bột đã thủy phân

Laøm laïnh oáng nghieäm döôùi voøi nöôùc,

Theâm 5 ml nöôùc caát vaø 1 gioït

phenolphtalein 1%, laéc ñeàu.

Nhoû töøng gioït NaOH 10%, laéc ñeàu, ñeán

khi coù maøu hoàng thaät nhaït.

3) Thử phản ứng : dung dòch tinh boät ñaõ

thuûy phaân ñöôïc duøng laøm maãu thöû

nghieäm phaûn öùng Seliwanoff vaø Benedict.

Ghi nhaän keát qủa :

- Phaûn öùng Seliwanoff : (+) hay (-) ? Tại sao?

- Phaûn öùng Benedict : (+) hay (-) ? Tại sao?

.2. PHAÀN ÑÒNH LÖÔÏNG GLUCID

Ñònh haøm löôïng glucose trong maùu (theo Somogyi-Nelson)

. Nguyeân taéc

Protein trong maùu ñöôïc sa laéng baèng dung dòch sulfate keõm vaø barium hydoxyde.

Glucose maùu seõ khöû Cu2+ trong moâi tröôøng kieàm tính, thaønh laäp Cu2O.

Saûn phaåm Cu2O phaûn öùng vôùi hoãn hôïp arsenomolybdate (maøu vaøng chanh) taïo thaønh arsenomolybdous (maøu xanh).

Tuøy vaøo möùc ñoä maøu ñaäm nhaït ñöôïc xaùc ñònh töø quang phoå keá ta suy ra haøm löôïng glucose trong maùu theo ñöôøng chuaån.

. Hoaù chaát

- Maùu khaùng ñoâng

- Dung dòch sulfate keõm 5%

- Dung dòch barium hydroxyde 0.3N

- Dung dòch Somogyi (CuSO4 + muoái Rochelle + NaOH )

- Dung dòch Nelson (ammonium molybdate + H2SO4)

- Dung dòch glucose chuaån 0,05mg/ml

. Caùch laøm

1) Xử lý mẫu : loại protein, thu mẫu chỉ chứa glucose

Cho vaøo oáng nghieäm ly taâm 1,5ml nöôùc caát,

0,1ml maùu khaùng ñoâng : duøng micropipette để huùt, duøng goøn lau saïch maùu quanh ngoaøi oáng huùt, cho maùu vaøo oáng nghieäm treân (chuù yù khoâng ñöôïc thoåi phaàn maùu coøn soùt laïi trong micropipette), laéc ñeàu.

0.2 ml dung dòch barium hydroxyde 0.3N, laéc ñeàu,

0.2 ml dung dòch sulfate keõm 5%, laéc ñeàu.

Duøng moät oáng nghieäm khaùc coù löôïng nöôùc baèng vôùi oáng maùu, caû hai cho vaøo maùy ly taâm, ly taâm 3000 voøng/phuùt trong 5 phuùt. Chú ý : đặt 2 ống đối

xứng nhau trong máy

2) Làm phản ứng

Duøng 3 oáng nghieäm lôùn, ñaùnh daáu thöù töï vaø cho vaøo moãi oáng:

- oáng 1 : 1ml nöôùc caát

- oáng 2 : 1 ml dung dịch mẫu đã xử lý

- oáng 3 : 1 ml dung dòch glucose chuaån

cho vaøo moãi oáng treân 2ml dung dòch Somogyi, laéc ñeàu,

ñaët vaøo nöôùc noùng 70-1000C trong 20 phuùt, laøm laïnh caû 3 oáng,

theâm vaøo moãi oáng 2ml dung dòch Nelson, laéc ñeàu,

cho 10 ml nöôùc caát vaøo caùc oáng ñeå pha loaõng, ñeå yeân 5 phuùt.

3) Đọc kết qủa

So maøu baèng quang phoå keá vôùi böùc soùng = 520nm :

- Duøng oáng 1 ñeå caân baèng maùy

- Ño trò soá T (ñoä haáp thu quang phoå) cuûa oáng 2 vaø oáng 3

- Tính keát quaû theo coâng thöùc:

T2/T3 x 0.05 x 100/0.05 = mg glucose/100 ml maùu

T2 : ñoä haáp thu quang phoå cuûa oáng 2

T3 : ñoä haáp thu quang phoå cuûa oáng 3

0.05 : noàng ñoä cuûa glucose chuaån

100 : tính trong 100 ml maùu

0.05 : theå tích maùu söû duïng trong phaân tích

Baøi 2. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ LIPID Baøi 2. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ LIPID VAØ ENZYMEVAØ ENZYME

1. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ LIPID 1.1. Khaûo saùt tính hoøa tan vaø nhuõ hóa môõ 1.2. Khaûo saùt saéc toá maät

- Phaûn öùng Gmelin : mật + HNO3

- Phaûn öùng Smith : mật + dd I trong cồn 1.3. Khaûo saùt theå ketone

- Phaûn öùng Legal- Phaûn öùng Rothera

2. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ ENZYME 2.1. Khaûo saùt catalase trong maùu 2.2. Khaûo saùt hoaït löïc amylase trong huyeát thanh

1. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ LIPID

1.1. Khaûo saùt tính hoøa tan vaø nhuõ hoaù

môõ

. Nguyeân taéc

Lipid coù tính chaát khoâng tan trong nöôùc

do coù söùc caêng beà maët cao, chuùng chæ

tan trong dung moâi höõu cô nhö alcohol,

acetone, bezen… Ñeå laøm giaûm söùc caêng

beà maët lipid trong hoãn hôïp lipid-nöôùc,

chuùng ta coù theå duøng caùc chaát nhö

muoái kieàm, xaø phoøng, maät… vaø hoãn

hôïp seõ coù maøu traéng ñuïc nhö söõa (nhuõ

töông), lipid ôû döôùi daïng nhöõng haït nhoû li

ti (haït micell), hieän töôïng naøy ñöôïc goïi laø

hieän töôïng nhuõ hoùa.

. Hoùa chaát

- Daàu thöïc vaät hoaëc môõ ñoäng vaät

- Dung dòch xaø phoøng, maät pha loaõng

- Dung moâi höõu cô: alcohol, acetone

. Caùch laøm

Quan sát sự hòa tan – Cho vào 2 ống nghiệm :

Ống 1 : 2 ml alcohol

Ống 2 : 2 ml acetone

Cho vào mỗ ống 1 giọt dầu hoặc mỡ, lắc nhẹ.

Quan sát sự hòa tan của lipid trong hai loại dung môi

Quan sát sự nhũ hóa

Cho vaøo 4 oáng nghieäm :

oáng 1 : 1ml nöôùc caát

oáng 2 : 1 ml xaø phoøng

oáng 3 : 1 ml sodium benzoate

oáng 4 : 1ml maät pha loaõng

Cho vaøo moãi oáng 1 gioït daàu hoaëc môõ, laéc ñeàu.

Quan saùt hieän töôïng nhuõ hoùa ôû caùc oáng 2, 3 và 4.

1.2. Khaûo saùt saéc toá maät

. Nguyeân taéc

Bilirubin vaø biliverdin laø caùc saéc toá

maät, taïo ra maøu vaøng xanh cuûa maät.

Döôùi taùc duïng cuûa HNO3 ñaäm ñaëc hoaëc

iod, saéc toá maät bò oxy hoùa taïo saûn phaåm

coù maøu ñaëc tröng.

. Hoùa chaát

- Maät pha loaõng

- HNO3 ñaäm ñaëc

- Dung dòch iod 0.5% trong alcohol

. Caùch laømPhaûn öùng Gmelin: Huùt 2 ml maät pha loaõng cho vaøo oáng nghieäm lôùn, Đaët nghieâng oáng nghieäm, laáy caån thaän 1ml HNO3 cho chaûy töø töø doïc theo thaønh oáng. Quan saùt söï thay ñoåi maøu ôû phaàn döôùi oáng nghieäm. Ghi nhaän keát quaû.Phaûn öùng Smith: Huùt 2 ml maät pha loaõng cho vaøo oáng nghieäm lôùn, Đaët nghieâng oáng nghieäm, cho dung dòch iod chaûy töø töø doïc theo thaønh oáng. Quan saùt söï thay ñoåi maøu treân beà maët dung dòch. Ghi nhaän keát quaû.

1.3. Khaûo saùt theå ketone

. Nguyeân taéc

Theå ketone trong maùu ñoäng vaät goàm acetone, acetoacetic acid, -hydroxy butyric acid. Haøm löôïng theå ketone trong maùu gia taêng khi coù söï roái loaïn bieán döôõng. Theå ketone taïo phöùc chaát maøu ñaëc tröng vôùi sodium nitroprusside trong moâi tröôøng kieàm tính.

. Hoùa chaát

- Dung dòch ketone - Boät ammonium sulfate

- Dung dòch sodium nitroprusside 2% - Ammoniac ñaäm ñaëc

- NaOH 10%

. Caùch laøm

Phaûn öùng Legal:

Cho 2ml dung dòch ketone vaøo oáng nghieäm lôùn,

1 ml dung dòch sodium nitroprusside, laéc ñeàu,

Kiềm hóa bằng vaøi gioït NaOH 10%, laéc ñeàu.

Quan saùt maøu ñoû cam.

Ghi chuù: Phaûn öùng Legal cho kết qủa döông tính vôùi caùc dung dòch ketone và cả với creatine vaø creatinine.

Phaûn öùng Rothera:

Cho 2ml dung dòch ketone vaøo oáng nghieäm lôùn,

Cho dần boät ammonium sulfate, khuaáy ñeàu ñeán khi baõo hoøa,

Theâm 2 ml dung dòch sodium nitroprusside, 1 ml ammoniac,

laéc ñeàu,

Quan sát :

- phaûn öùng maøu tím vôùi acetone,

- maøu ñoû cam vôùi acetoacetic acid ,

- khoâng maøu vôùi creatinine.

2. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ ENZYME

2.1. Khaûo saùt catalase trong maùu

. Nguyeân taéc

Catalase laø enzyme thuoäc lôùp oxidoreductase, hieän dieän trong nhieàu moâ baøo ñoäng vaät nhö gan, hoàng caàu… coù taùc duïng ngaên chaän söï tích luõy hydrogen peroxide trong maùu vaø trong moâ baøo theo phaûn öùng:

H2O2 H2O + ½ O2

. Hoùa chaát

- Maùu khaùng ñoâng pha loaõng

- Dung dòch hydrogen peroxid (H2O2) 1%

- Dung dòch sodium cyanide (NaCN) 5%

Catalase

. Caùch laøm

Laáy 3 oáng nghieäm lôùn ghi soá thöù

töï :

OÁng 1 OÁng 2

OÁng 3*

- Maùu khaùng ñoâng 1 ml 1 ml

1ml*

- NaCN 5% 5 gioït - -

- H2O2 1% 1 ml 1 ml 1 ml

(OÁng soá 3* : maùu khaùng ñoâng pha loaõng,

phaûi ñun caùch thuûy hoaëc ñun treân ñeøn

coàn 2 phuùt).

Quan saùt hieän töôïng suûi boït (taïo thaønh

khí O2 töï do) ôû caùc oáng nghieäm. Ghi nhaän

keát quaû.

2.2. Khaûo saùt hoaït löïc amylase trong huyeát thanh

. Nguyeân taéc

Döôùi taùc duïng cuûa amylase, tinh boät bò thuûy phaân thaønh nhöõng caáu töû nhoû hôn laø dextrin hay thuûy phaân ñeán saûn phaåm cuoái cuøng laø maltose vaø glucose. Phaûn öùng maøu ñaëc tröng giöõa iod vôùi tinh boät vaø dextrin cuõng khaùc nhau. Döïa vaøo nguyeân taéc naøy ñeå xaùc ñònh hoaït löïc cuûa amylase.

Phaûn öùng:

Tinh boät Dextrin Maltose Glucose

+I2 + I2 + I2

+ I2

Maøu xanh chaøm Maøu naâu Khoâng maøu Khoâng maøu

Amylase

Maltase

. Hoùa chaát

- Huyeát thanh

- Dung dòch NaCl 0.9%

- Dung dòch iod 0.5% trong alcohol

- Dung dòch tinh boät 1%

. Caùch laøm

Duøng 9 oáng nghieäm lôùn ghi soá thöù töï töø 1 ñeán 9, cho moãi oáng 1 ml NaCl 0.9%. Pha loaõng noàng ñoä huyeát thanh (amylase) baèng caùch duøng pipette huùt chính xaùc 1ml huyeát thanh cho vaøo oáng 1, laéc ñeàu (oáng 1 coù huyeát thanh pha loaõng noàng ñoä ½). Huùt chính xaùc 1 ml hoãn hôïp ôû oáng 1 cho vaøo oáng 2, laéc ñeàu (huyeát thanh pha loaõng noàng ñoä ¼). Huùt chính xaùc 1 ml hoãn hôïp ôû oáng 2 cho vaøo oáng 3… tieáp tuïc pha loaõng ñeán oáng 9. Huùt chính xaùc 1 ml hoãn hôïp ôû oáng 9 boû ñi.

Hóa chất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NaCl 0.9% 1 1 1 1 1 1 1 1 1 H.thanh 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Tinh bột 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Số thứ tự các ống nghiệm

Ñaët taát caû 9 oáng vaøo nöôùc aám 370C trong 60 phuùt

Nhoû 1 gioït dung dòch iod vaøo moãi oáng, laéc ñeàu

Quan sát söï thay ñoåi maøu (chuù yù: soá thöù töï cuûa caùc oáng phaûi ñuùng).

Hoạt lực amylase

Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Đơn vị/ml 4 8 16 32 64 128 256 512 1024

Ñoïc keát quaû baèng caùch choïn soá thöù

töï cuûa oáng coù maøu naâu caïnh oáng coù

maøu xanh, tra baûng ñeå suy ra hoaït löïc

amylase trong huyeát thanh xeùt nghieäm

BAØI 3. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ PROTEIN BAØI 3. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ PROTEIN VAØ AMINO ACIDVAØ AMINO ACID

1. PHAÀN ÑÒNH TÍNH

1.1. Pư ninhydrin :xaùc ñònh nhoùm -amine (p/ư định tính amino acids) – f/c màu tím

1.2. Pư biurette : x/đ l/ keát peptide – muối Cu2+ màu tím

1.3. P/ư xanthoproteic:x/đ caùc AA voøng nhö Tyr, Trp

1.4. P/ư Hopkins Cole : x/đ söï hieän dieän cuûa Trp

1.5. Khaûo saùt sự sa laéng vaø bieán tính cuûa protein

2. PHAÀN ÑÒNH LÖÔÏNG

2.1. Ñònh hàm löôïng protein toång soá trong

huyeát thanh baèng khuùc xaï keá.

2.2. Ñònh haøm löôïng albumin vaø globulin

trong huyeát thanh baèng phöông phaùp

Reinhold (so màu)

2.3. Ñònh haøm löôïng nitrogen amine baèng

phöông phaùp Sorenxen (chuẩn độ)

1. PHAÀN ÑÒNH TÍNH

1.1. Phaûn öùng ninhydrin

. Nguyeân taéc

Phaûn öùng ninhydrin laø phaûn öùng xaùc ñònh nhoùm -amine trong phaân töû amino acid, protein, caùc saûn phaåm chuyeån hoaù töø protein vaø caùc chaát coù nhoùm amine khoâng phaûi laø protein (NPN). Ninhydrin taùc duïng vôùi nhoùm amine taïo phöùc chaát maøu tím. Đây là p/ư thường sử dụng để định tính các amino acids

. Hoùa chaát

- Thuoác thöû ninhydrin

- Dung dòch amino acid 1%: glycine, alanine, serine.

- Dung dòch protein 1%: loøng traéng tröùng, gelatin.

. Caùch laøm Lấy 2ml dung dòch loøng traéng tröùng 1% cho vaøo oáng nghieäm 1ml thuoác thöû ninhydrin, laéc ñeàu, ñun vaø laéc nheï treân ñeøn coàn. Quan saùt maøu tím. Laëp laïi phaûn öùng vôùi caùc dung dòch gelatin, glycine, alanine vaø serine vaø ghi nhaän keát quaû .

1.2. Phaûn öùng biurette

. Nguyeân taéc

Phaûn öùng biurette xaùc ñònh sự có mặt của lieân keát peptide (CO-NH) trong mẫu xét nghiệm (định tính protein, polypeptide). Trong moâi tröôøng kieàm, CuSO4 seõ phaûn öùng với

lieân keát peptide thaønh laäp phöùc hôïp muoái ñoàng nhò maøu tím.

Phöùc hôïp muoái ñoàng nhò maøu tím

. Hoùa chaát

- Thuoác thöû biurette

- Dung dòch protein 1%: loøng traéng tröùng,

gelatin.

- Dung dòch amino acid 1%: glycine, alanine,

serine.

. Caùch laøm

Lấy 2ml dung dòch loøng traéng tröùng 1% cho

vaøo oáng nghieäm

2ml thuoác thöû biurette, laéc ñeàu,

ñun vaø laéc nheï treân ñeøn coàn. Quan saùt

maøu tím.

Laëp laïi phaûn öùng vôùi caùc dung dòch

gelatin, glycine, alanine vaø serine . Ghi nhaän

keát qủa?

1.3. Phaûn öùng xanthoproteic

. Nguyeân taéc

Phaûn öùng xathoproteic xaùc ñònh sự có mặt của caùc amino acid voøng nhö Tyr, Trp trong mẫu xét nghiệm. HNO3 ñaäm ñaëc seõ nitrate hoùa voøng phenolic vaø indol taïo ra saûn phaåm nitrotyrosine vaø nitrotryptophane coù maøu vaøng, sau ñoù trong moâi tröôøng kieàm maïnh nhö NH4OH hay NaOH seõ taïo phöùc hôïp maøu cam.

. Hoùa chaát

- HNO3 ñaäm ñaëc

- NH4OH ñaäm ñaëc

- Dung dòch protein 1%: loøng traéng tröùng, gelatin

CH2 CH COOH- -NH2

OH

HNO3

CH2 CH COOH-

NH2

OH

- NO

O

CH2 CH COOH-NH2

OH

- NO

O

-

-

NH4

NH4

NH4OH

Tyrosine Nitrotyrosine Muoái cuûa acid nitronic

--

(maøu vaøng) (maøu cam)

. Caùch laøm

Lấy 2ml dung dòch loøng traéng tröùng 1% cho vaøo oáng nghieäm

Laáy caån thaän 1ml HNO3 ñaäm ñaëc cho

chaûy doïc theo thaønh oáng nghieäm, laéc ñeàu,

Đun vaø laéc nheï treân ñeøn coàn, quan saùt maøu vaøng xuaát hieän.

Laøm laïnh, theâm vaøi gioït NH4OH, maøu

vaøng chuyeån ñoåi daàn sang maøu cam.

Laëp laïi thí nghieäm vôùi dung dòch gelatin.

Ghi nhận keát quaû?

1.4. Phaûn öùng Hopkins Cole

. Nguyeân taéc

Laø phaûn öùng xaùc ñònh söï hieän dieän

cuûa tryptophan. Voøng indol phaûn öùng

vôùi thuoác thöû Hopkins Cole (Mg2+ + oxalic

acid) hay chaát para dimethyl

aminobenzaldehyde taïo thaønh phöùc chaát

coù maøu tím trong moâi tröôøng acid ñaäm

ñaëc. Hóa chất

Các dung dịch protein và amino acid như thí nghiệm 1

H2SO4 đâm đặc

Thuốc thử para dimethylaminobenzadehyde : hòa tan 2

gam thuốc thử trong 100 ml alcohol 950.

. Caùch laøm

Lấy 2ml loøng traéng tröùng 1% cho vaøo oáng nghieäm,

1 ml thuốc thử para dimethylaminobenzadehyde, lắc đều.

Laáy caån thaän 2 ml H2SO4 đđ cho chaûy từ

từ doïc theo thaønh oáng nghieäm xuống đáy.

Quan sát vòng tím indol giữa 2 lớp dung dịch. Nếu lắc

mạnh vòng tím sẽ biến mất.

Laëp laïi thí nghieäm vôùi dung dòch gelatin vaø các amino acid

Ghi nhận keát qủa?

1.5. Khaûo saùt tính chaát sa laéng vaø bieán tính cuûa protein

. Nguyeân taéc

Protein hoøa tan trong nöôùc taïo thaønh dung dòch keo beàn vöõng nhờ söùc ñaåy tónh ñieän giöõa caùc haït keo protein mang ñieän tích cuøng daáu vaø lôùp voû thuûy hoùa. Neáu maát moät trong hai loaïi yeáu toá hoaëc caû hai thì caùc haït keo seõ keát dính laïi taïo ra hieän töôïng sa laéng vaø protein bò bieán tính. Coù nhieàu caùch laøm sa laéng protein nhö sa laéng bôûi muoái kieàm, dung moâi höõu cô, kim loaïi naëng, acid maïnh...

. Hoùa chaát

- Loøng traéng tröùng 1%

- Dung dòch SA baõo hoøa - Acetone

- Acetate chì 5% - Trichloroacetic acid 10%

. Caùch laøm

Duøng 4 oáng nghieäm lôùn ghi soá thöù töï :

Quan saùt vaø so saùnh söï sa laéng vaø bieán tính cuûa loøng traéng tröùng ôû caùc oáng qua hieän töôïng keát tuûa.

Ghi nhaän keát qủa ?

Hóa chất Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Lòng trắng trứng 3ml 3ml 3ml 3ml Ammonium sulfate 3ml - - - Acetone - 3ml - - Acetate chì - - 1ml - Trichloroacetic.A - - - 1ml

2. PHAÀN ÑÒNH LÖÔÏNG

2.1. Ñònh haøm löôïng protein toång soá trong huyeát thanh baèng khuùc xaï keá (Refractometer A/O-USA)

. Nguyeân taéc

Döïa vào söï khaùc bieät veà ñoä chieát xuaát n giöõa caùc dung dòch huyeát thanh, aùnh saùng ñi qua dung dòch seõ bò khuùc xaï vaø tia loù qua laêng kính ñöôïc ñònh laïi qua thò tröôøng laøm ranh giôùi hai vuøng saùng toái, chæ löôïng protein toång soá treân thöôùc chuaån.

. Hoùa chaát

- Huyeát thanh

- Acetone

- Nöôùc caát

. Caùch laøm

Duøng goøn taåm acetone lau maët kính, sau ñoù röûa laïi nhieàu laàn baèng nöôùc caát vaø lau laïi baèng goøn khoâ.

Ñaäy naép nhöïa treân maët laêng kính vaø nhoû moät gioït huyeát thanh vaøo raõnh ñaäy.

Nhìn qua thò kính seõ coù ñöôïc thò tröôøng vôùi 2 vuøng: vuøng toái ôû treân vaø vuøng saùng ôû döôùi. Ranh giôùi hai vuøng caét ngang thöôùc chuaån seõõ xaùc ñònh haøm löôïng protein toång soá trong maãu huyeát thanh xeùt nghieäm, ñôn vò ño laø g/dl (soá gram protein trong 100 ml huyeát thanh).

2.2. Ñònh haøm löôïng albumin vaø globulin

trong huyeát theo baèng phöông phaùp

Reinhold

. Nguyeân taéc

Tieåu phaàn globulin trong huyeát thanh

ñöôïc loaïi boû baèng dung dòch muoái

ammonium sulfate qua söï sa laéng vaø ly taâm

taùch laáy phaàn nöôùc trong (chæ coøn tieåu

phaàn albumin).

Sau ñoù duøng dung dòch sulfate ñoàng trong

thuoác thöû biurette seõ laøm hieän maøu do

caùc lieân keát peptide cuûa albumin. Ñoä ñaäm

nhaït tuøy thuoäc vaøo soá lieân keát peptide

trong dung dịch. Haøm löôïng albumin ñöôïc

xaùc ñònh baèng ñoä maät ñoä quang hoïc (%T)

ôû böôùc soùng = 550 nm.

. Hoaù chaát

- Huyeát thanh

- Thuoác thöû biurette

- Sodium chloride 0.9%

- Dung dòch ammonium sulfate 23% (hoaëc sodium sulfate 23%)

. Caùch laøm

Loaïi boû globulin:

Huùt 0.5 ml huyeát thanh cho vaøo oáng nghieäm lôùn,

theâm 7.5 ml Na2 SO4 23%, laéc ñeàu, ñeå yeân

5 phuùt,

ly taâm 3000 voøng/phuùt trong 5 phuùt, loaïi boû caën baèng caùch loïc qua giaáy loïc. Ñaây laø nöôùc loïc 1 (chæ coøn albumin).

Tìm protein toång soá: Huùt 0.5 ml huyeát thanh cho vaøo oáng nghieäm lôùn, 7.5 ml NaCl 0.9%. Laéc ñeàu, ly taâm boû caën (neáu coù). Ñaây laø nöôùc loïc 2. Duøng 3 oáng nghieäm lôùn ghi soá thöù töï:

Ñeå yeân 30 phuùt. Ñoïc trò soá haáp thu %T treân quang phoå keá vôùi = 550 nm.

Dung dịch Ống 1 Ống 2 Ống 3

Nước lọc 1 (albumin) 5ml - -

Nước lọc 2 (protein TS = albumin + globulin )

- 5ml -

Na2SO4 23% (để cân bằng máy)

- - 5ml

Thuốc thử biurette 5ml 5ml 5ml

- OÁng 3 : Ñeå chænh maùy vôùi ñoä haáp thu = 0

- OÁng 1 : Ñoä haáp thu cuûa albumin.- OÁng 2 : Ñoä haáp thu cuûa protein

toång soá.* Caùch tính : Ví duï :

- Ñoä haáp thu cuûa albumin (Abs) = 11 - Ñoä haáp thu protein toång soâ’(Abs)

= 25- Protein toång soá =

7 g%. Vaäy : Haøm löôïng albumin huyeát

thanh laø := 3,08 g%

7 x 11 25 Suy ra haøm löôïng globulin huyeát

thanh laø : 7,0 - 3,08 = 3,92 g%.

2.3. Ñònh haøm löôïng nitrogen amine baèng phöông phaùp Sorenxen

. Nguyeân taéc

Nitrogen amine cuûa nhoùm amine töï do trong caùc dung dòch amino acid, peptide vaø protein thöôøng lieân keát noäi phaân töû vôùi nhoùm carboxyl töï do seõ ñöôïc phong beá baèng nhoùm formaldehyde ñeå giaûi phoùng nhoùm carboxyl. Nhoùm carboxyl ñöôïc chuaån ñoä ñònh löôïng baèng dung dòch sodium hydroxyde, töø ñoù giaùn tieáp suy ra löôïng nitrogen amine.

. Hoùa chaát

-Dung dòch glycine NaOH 0.2N

-Formaldehyde trung tính

- Nöôùc caát ñun soâi ñeå nguoäi

- Phenophtalein 0.05% trong alcohol 700

. Caùch laøm

Laáy 2 bình tam giaùc ghi thöù töï

Laéc ñeàu, ñem ñònh chuaån vôùi NaOH 0.2N töø burette ñeán khi coù maøu ñoû tía. Ghi soá ml NaOH 0.2N ñaõ duøng ñònh chuaån cho moãi bình.

Dung dịch Bình 1 Bình 2

Glycine 10 ml -

Nước cất - 10 ml

Formaldehyde 5 ml 5 ml

Phenolphtalein 2 giọt 2 giọt

Tính haøm löôïng nitrogen amine theo coâng thöùc :

X (mg/ 10 ml) = (A-B) x 2.,8

X : Số mg nitrogen amine chứa trong 10 ml dung dịch glycine

A : Số ml NaOH định chuẩn bình 1 (glycine)

B : Số ml NaOH định chuẩn bình 2 (nước cất)

2,8 : Số mg nitrogen tương ứng với 1 ml NaOH định chuẩn

BAØI 4. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ VITAMIN - KHOAÙNG CHAÁT

1. Ñònh löôïng vitamin C trong huyeát thanh baèng phöông phaùp chuaån ñoä 2,6 dichlorophenol indophenol

2. Ñònh löôïng calcium huyeát thanh theo phöông phaùp Clark vaø Colip (chuaån độ)

3. Ñònh löôïng phospho voâ cô huyeát thanh theo phöông phaùp Urbach va Raabe (so màu)

1. Ñònh löôïng vitamin C trong huyeát thanh baèng phöông phaùp chuaån ñoä 2,6 dichlorophenol indophenol

. Nguyeân taéc

Vitamin C khoâng beàn, deã bò oxy hoùa bôûi oxygen cuûa khoâng khí. Trong moâi tröôøng acid vaø yeám khí vitamin C bền vững. Chaát 2,6 dichlorophenol indophenol coù maøu xanh döông (daïng oxy hoùa), khi nhaän caëp hydrogen töø ascorbic acid seõ trôû thaønh khoâng maøu (daïng khöû) vaø trong moâi tröôøng acid yeáu thì saûn phaåm daïng khöû khoâng maøu seõ coù maøu hoàng nhaït khoâng beàn.

. Hoùa chaát

- Huyeát thanh

- Metaphosphoric acid 5%

- Thuoác thöû 2,6 dichlorophenol indophenol 0.001N

C C C C C CH OH

2

-OH

H- HO-

-OH O

-H

O C C C C C CH OH

2

-OH

H- HO-

-OH O

-H

O C C C C C CH OH

2

-OH

H- HO-

-OH O

O

+ O= = N - -OH

Cl

Cl

-OH

Cl

Cl

- N - H

HO - C C C C C CH OH

O

= =

O O

-H H-

HO-

O

A.Ascorbic 2,6 dichlorophenol indophenol

A.Dehydroascorbic

2,6 dichlorophenol indophenol daïng hoaøn nguyeân (khoâng maøu)

2

+

. Caùch laøm

Duøng 2 oáng nghieäm ly taâm, ghi soá thöù töï

Laéc ñeàu, ly taâm caû 2 oáng vôùi 3000 voøng/phuùt.

Laáy 3ml nöôùc trong ôû moãi oáng cho vaøo oáng nghieäm nhoû, ñem chuaån ñoä baèng thuoác thöû 2,6 dichlorophenol indophenol treân microburette ñeán khi coù maøu hoàng nhaït beàn trong 1 phuùt.

Ghi soá ml thuoác thöû ñaõ duøng cuûa moãi oáng .

Dung dịch Ống 1 Ống 2

Huyết thanh 1 ml -

Nước cất 3 ml 4 ml

Metaphosphric acid 5% 1 ml 1 ml

Tính keát quûa :

X =

(A - B ) x 0.088 x 5 x 100 mg%

3

Vôùi : X = Soá mg vitamin C tính trong 100 ml huyeát thanh.

A = Soá ml thuoác thöû ñònh chuaån oáng huyeát thanh.

B = Soá ml thuoác thöû ñònh chuaån oáng nöôùc caát.

0,088 = Số mg vitamin C ứng với 1 ml thuốc thử

4.2. Ñònh löôïng calcium huyeát thanh theo phöông phaùp Clark vaø Colip

. Nguyeân taéc

Calcium trong huyeát thanh ñöôïc taùch bôûi ammonium oxalate taïo thaønh calcium oxalate. Sau ñoù döôùi taùc duïng cuûa sulfuric acid, calcium oxalate seõ taïo ra 2 saûn phaåm calcium sulfate vaø oxalic acid. Oxalic acid ñöôïc chuaån ñoä baèng potassium permanganate.

. Hoùa chaát

- Huyeát thanh - Dung dòch ammonium oxalate 4%

- Dung dòch ammonium hydroxyde 2% - H2SO4 N

- Dung dòch potassium permanganate 0.01 N

COO - NH4 COO

Ca2+ + Ca + 2 NH+4

COO-NH4 COO

COO COOH

Ca + 2H2SO4 + CaSO4

COO COOH COOH

+ 2KMnO4 + 2H2SO4 10 CO2 + 2MnSO4 + K2 SO4 COOH + 8 H2O

. Caùch laøm

Duøng 2 oáng nghieäm ly taâm, ghi soá thöù töï

- Laéc ñeàu, ñeå yeân 3 phuùt, ly taâm 3000 voøng/phuùt/5 phuùt. OÁng 1 ñoå heát nöôùc.

- OÁng 2 coù caën calcium oxalate maøu traéng ôû ñaùy oáng nghieäm, duøng pipette Pasteur huùt caån thaän phaàn nöôùc trong boû ñi (giöõ laáy caën)..

-Rửa căn oxalate Ca : cho vaøo moãi oáng 2 ml ammonium hydroxyde, ly taâm, loaïi boû phaàn nöôùc trong nhö treân, lặp laïi 2 laàn.

-Hòa tan cặn oxalate ca : cho vaøo moãi oáng 2 ml H2SO4 N, laéc ñeàu, ñaët vaøo nöôùc noùng 70-80oC trong 1 phuùt.

Dung dịch Ống 1 Ống 2

Nước cất 2 ml -

Huyết thanh - 2 ml

Ammonium oxalate 4% 1 ml 1 ml

Ñònh chuaån baèng dung dòch KMnO4 0.001 N treân

microburette (vừa định chuẩn vừa nhúng ống nghiệm vào nước

nóng) ñeán khi coù maøu hoàng nhaït beàn trong 1

phuùt. Ghi soá ml KMnO4 ñaõ duøng cho moãi oáng.

Tính keát quaû: X = (A-B) x 0.2 x 50 mg%

X = Soá mg Ca coù trong 100 ml huyeát thanh.

• A = Soá ml KMnO4 ñònh chuaån oáng huyeát

thanh.

• B = Soá ml KMnO4 ñònh chuaán oáng nöôùc caát.

• 0.2 = 1 ml KMnO4 0.01N töông öùng 0.2 mg Ca.

• 50 = 100/2 - tính trong 100 ml huyeát thanh.

3. Ñònh löôïng phospho voâ cô huyeát thanh theo phöông phaùp Urbach va Raabe

. Nguyeân taéc

Phospho voâ cô trong huyeát thanh seõ phaûn öùng vôùi molybdic acid taïo thaønh saûn phaåm phosphomolybdic acid vaø döôùi taùc duïng cuûa hydroquinon seõ laøm hoaøn nguyeân vaø taïo ra molybden maøu xanh. Protein trong huyeát thanh seõ hoøa tan bôûi taùc ñoäng cuûa hoãn hôïp carbonate-sulfite ñeå khoâng caûn trôû quùa trình hình thaønh molybden blue. Ñoä ñaäm nhaït cuûa dd tyû leä thuaän vôùi haøm löôïng phospho voâ cô trong huyeát thanh vaø xaùc ñònh baèng quang phoå keá vôùi = 720 nm.

. Hoùa chaát

- Dung dòch 1 : Sodium sulfite - Dung dòch 3 : Hydroquinon

- Dung dòch 2 : Ammonium molybdate

- Dung dòch 4 : Sodium carbonate + Sodium sulfite- Dung dòch phospho chuaån 5mg%- Huyeát thanh. Caùch laømDuøng 2 oáng nghieäm lôùn, ghi soá thöù töï

Dung dịch Ống 1 Ống 2

Phospho chuẩn 0.2 ml Huyết thanh - 0.2 ml Dung dịch 1 1 ml 1 ml Dung dịch 2 0.5 ml 0.5 ml

Để yên 5 phút

Dung dịch 3 0.5 ml 0.5 ml Để yên 5 phút

Dung dịch 4 5 ml 5 ml

Để yên 5 phút

Ghi chuù: duøng micropipette ñeå huùt huyeát thanh vaø phospho chuaån

Đo ñoä haáp thu quang phoå vôùi = 720 nm cuûa moãi oáng.

* Tính keát quûa :

Ví duï : - Ñoä haáp thu oáng phospho chuaån = 45%

- Ñoä haáp thu oáng huyeát thanh = 35%

Ta coù :

Ñoä haáp thu = 45% öùng vôùi 5mg% phospho voâ cô.

Ñoä haáp thu = 35% öùng vôùi haøn löôïng phospho voâ cô trong huyeát thanh.

Huyeát thanh seõ coù haøm löôïng phospho voâ cô laø :

X =

45355 xmg%