SKRSKRÍÍNING GENETICKÝCH NING GENETICKÝCH PROGNOSTICKÝCH FAKTOROV U PROGNOSTICKÝCH FAKTOROV U

PACIENTOV SPACIENTOV S CHRONICKOU CHRONICKOU LYMFOCYTOVOU LEUKLYMFOCYTOVOU LEUKÉÉMIOUMIOU

M. Leitnerová, D.Ilenčíková

Oddelenie onkologickej genetiky, NOÚ Bratislava

ChronickChronickáá lymfocytovlymfocytováá leukleukéémiamia BB--typutypu

BB--CLLCLLheterogenita heterogenita

klinických prejavovklinických prejavovpriebehu priebehu progresieprogresie ochoreniaochorenia

heterogenita na genetickej heterogenita na genetickej úúrovni rovni šštrukttruktúúrnerne a numericka numerickéé chromozchromozóómovmovéé aberaberááciecie s rs rôznouôznouprognostickou relevanciouprognostickou relevanciou

FamiliFamiliáárny rny vsvs. sporadický typ CLL. sporadický typ CLLFamiliFamiliáárnyrny

2 a viac pacienti s CLL v 1.st. pr2 a viac pacienti s CLL v 1.st. prííbuzenstvebuzenstvevek v vek v ččase ase dgdg: 57,9 : 57,9 ±± 12,112,1sekundsekundáárne primrne primáárne TU:rne TU:

19% (mo19% (moččový mechový mechúúr a r a skvamocelulskvamoceluláárnyrny CaCa kokožže)e)25% do 4 r. po 25% do 4 r. po CLLCLL

transformtransformáácia do NHL cia do NHL –– bez rozdielubez rozdielu

SporadickýSporadickýojedinelý výskyt CLL v RAojedinelý výskyt CLL v RAvek v vek v ččase ase dgdg: 70,1 : 70,1 ±± 11,911,9SekundSekundáárne primrne primáárne TU:rne TU:

8,8%8,8%75% do 4 r. po CLL75% do 4 r. po CLL

transformtransformááciacia do NHL do NHL –– bez rozdielu bez rozdielu

IshibeIshibe NN et al. Leu & Lymfona 2001, 42(1-2), 99-108

FamiliFamiliáárny rny vsvs. sporadický typ CLL. sporadický typ CLL

LynnLynn R. R. GoldinGoldin, , Hematology 2007Hematology 2007

PrognostickPrognostickéé markerymarkery

KonvenKonvenččnnáá cytogenetikacytogenetika

cytogenetickcytogenetickéé metodiky metodiky –– in in vitrovitro stimulstimuláácia CLL cia CLL lymfocytovlymfocytovmitogmitogéénminmidôkaz prdôkaz príítomnosti tomnosti transloktranslokááciciíí

novnovéé prognostickprognostickéé markerymarkerynepriaznivnepriazniváá prognprognóózaza

MolekulMolekuláárne prognostickrne prognostickéé markerymarkeryDNA DNA úúroveroveňň –– mutmutáácie, cie, polymorfizmypolymorfizmy ((IgHIgH mutamutaččný status)ný status)RNA RNA úúroveroveňň –– ggéénovnováá expresiaexpresia (ZAP70, CLLU1, LPL)(ZAP70, CLLU1, LPL)

r. 1978 r. 1978 –– žžiadna iadna ššpecifickpecifickáá aberaberáácia u CLL (cia u CLL (MitelmanMitelman and and LevanLevan))r. 1990 r. 1990 –– pridanie pridanie BB--bunkovýchbunkových mitogmitogéénovnov, u 40, u 40--50% pacientov 50% pacientov detekovandetekovanéé

klonklonáálnelne chromozchromozóómovmovéé zmienyzmienyr. 200r. 20000 –– mitogmitogéénn PokeweedPokeweed,, antiCD40, TPA, antiCD40, TPA, cytochalasincytochalasin B,B, 80% aber80% aberááciciíí (D(Dohnerohner et al)et al)r. 2006 r. 2006 -- pridanie ILpridanie IL--4, 4, CpGCpG oligodeoxynukleotidyoligodeoxynukleotidy a ILa IL--22 ((HaserlachHaserlach et.al,2007)et.al,2007)

IdentifikIdentifikáácia prestavby cia prestavby IgHIgH FISHFISH

transloktranslokááciacia IgHIgH ggéénu nu –– nepriaznivý prognostický faktornepriaznivý prognostický faktoridentifikidentifikáácia cia ffúúznehozneho partnera partnera napr. t(14;18) napr. t(14;18) –– Bcl2Bcl2--IgH, t(8;14) IgH, t(8;14) –– MYCMYC--IgH, ..... IgH, ..... identifikidentifikááciacia deldelééciecie varibilnejvaribilnej oblasti oblasti IgHIgH ggéénunu

Ilenčíková,Plank, Lek Obz 57,2009

DelDelééciecie IgHIgH konkonšštantnej oblastitantnej oblasti

del(14)(q24.1q32.33)del(14)(q24.1q32.33)ččastejastejšíší výskyt u atypických CLL (kratvýskyt u atypických CLL (kratšíším prem prežžíívanvaníím pacientov) m pacientov) s s triztrizóómioumiou 12, 12, deldel p53, p53, deldel ATM a rôznymi genetickými aberATM a rôznymi genetickými aberááciamiciamiččastejastejššie s nemutovaným ie s nemutovaným IgHIgH(V)(V)deldelééciecie IgHIgH(C) predpoklad (C) predpoklad intersticiintersticiáálnychlnych deldelééciciíí –– v v klonovýchklonových populpopulááciciáách ch CLL veCLL veľľkostne kostne heterogheterogéénnenne

výskyt izolovanej del(14)(q24.1q32.33) bol výskyt izolovanej del(14)(q24.1q32.33) bol asociaovanýasociaovaný s dobrým s dobrým preprežžíívanvaníím (nezm (nezáávisle od veku, klinickvisle od veku, klinickéého ho ššttáádia a dia a IgHIgH(V) statusu)(V) statusu)participparticipáácia na rozvoji cia na rozvoji ochorenia ochorenia

Dôkaz prestavby Dôkaz prestavby IgHIgH--klonalityklonality

identifikidentifikáácia cia klonklonáálnejlnej B bunkovej populB bunkovej populáácie cie výsledok je potrebnvýsledok je potrebnéé interpretovainterpretovaťť v kontexte klinických, histologických a v kontexte klinických, histologických a imunofenotypovýchimunofenotypových ddáátt

Biomed 2 Concerted Action BMH4 – CT98-3936, Leukemia 2003, 17, 2257-2317, Arthritis Res 2000; 2:303-14

MutaMutaččný status ný status IgHIgHVV

neznezáávislý prognostický faktorvislý prognostický faktoru 40u 40--50% pacientov 50% pacientov -- expresiaexpresia IgHIgHVV ggéénovnovéého regiho regióónu odlinu odliššnnéého od ho od sekvencie zsekvencie záárodorodoččnej lnej líínie (2%)nie (2%)homolhomolóógia gia 98% 98% –– nepriaznivnepriazniváá prognprognóózazaprpríítomnostomnosťť somatických mutsomatických mutááciciíí priaznivpriazniváá prognprognóóza za ((s výnimkou regis výnimkou regióónu nu VH3VH3--21)21)

Catovski et.al,2006

BB--CLL: chromozCLL: chromozóómovmovéé aberaberááciecie

frekventované – významné prognostické faktory predikujúce progresiuochorenia a prežívanie pacienta

nepriaznivá prognóza priaznivá prognóza

sporadické – prognosticky význam neznámy

del13q14del13q14+12+12deldel 6q216q21del11q22 del11q22 (ATM)(ATM)

del17p13 del17p13 (TP53)(TP53)

........+3q+3q+18q21 +18q21 (BCL2)(BCL2)

+19+19del10q23 del10q23 (PTEN)(PTEN)

+8q24 +8q24 (MYC)(MYC)

+2p24 +2p24 (MYCN)(MYCN)

del9p21 del9p21 (CDKN2A/B)(CDKN2A/B)

p15,p16p15,p16

delp53delp53 –– TP53TP53 ((tumor protein p53 )tumor protein p53 )p53; LFS1; TRP53; FLJ92943; TP53 p53; LFS1; TRP53; FLJ92943; TP53

proteproteíínn p53 p53 -- tumorsupresorovýtumorsupresorový proteproteíínnodpoveodpoveďď bunky na bunky na rôznorodýrôznorodý stres stres regulregulááciouciou ciecieľľovýchových ggéénov nov ((indukciaindukcia zastavenia zastavenia bunkovbunkovééhoho cyklu, cyklu, apoptapoptóózaza, , senescenciasenescencia,DNA ,DNA opravy, metabolickopravy, metabolickéé zmenyzmeny))vysokvysokáá expresiaexpresia prpríítomntomnáá v transformovaných bunkových lv transformovaných bunkových lííniniáách ch mutmutáácie p53 nastcie p53 nastáávajvajúú v mnov množžstve stve rôznych typoch rakoviny (aj u CLL)rôznych typoch rakoviny (aj u CLL)

Prognosticky významnPrognosticky významnéé chromozchromozóómovmovéé aberaberááciecie

delp53

Prognosticky významnPrognosticky významnéé chromozchromozóómovmovéé aberaberááciecie

del11q22del11q22 –– ATMATM ((ataxiaataxia telangiectasiatelangiectasia mutatedmutated))AT1; ATA; ATC; ATD; ATE; ATDC; TEL1; TELO1; MGC74674; DKFZp781A0AT1; ATA; ATC; ATD; ATE; ATDC; TEL1; TELO1; MGC74674; DKFZp781A0353; ATM 353; ATM

proteproteíínn -- ččlen rodiny PI3/PI4 len rodiny PI3/PI4 kinkináázzregulreguláátor mnotor množžstva stva „„ downstreamdownstream““ proteproteíínovnov(p53,BRCA1, CHK2, RAD17,RAD9, BS1) (p53,BRCA1, CHK2, RAD17,RAD9, BS1) ATM ATM proteproteíínn//ATRkinATRkináázyzy –– „„kontrolkontrolóóryry““ hlavnýchhlavných bodovbodov bunkovbunkovééhohocyklu cyklu potrebnýchpotrebných pre pre bunkovbunkovúú odpoveodpoveďď na DNA na DNA popošškodeniekodenie a pre a pre gengenóómovmovúú stabilitustabilitu

asociovaný s ochorenasociovaný s ochoreníím m ataxiaataxia teleangiectasiateleangiectasia a a s s niektorýminiektorými autozomautozomáálnelne recesrecesíívnymivnymi ochoreniamiochoreniami del11q22

www.rndsystems.com

triztrizóómiamia chromozchromozóómu 12mu 121515--20% (cytogeneticky) alebo 1620% (cytogeneticky) alebo 16--25 % (FISH) 25 % (FISH) obsahuje viac ako 1400 obsahuje viac ako 1400 proteproteíínn--kkóódujdujúúcichcich ggéénovnov487 487 lokusovlokusov momožžno spojino spojiťť s ochorens ochoreníím u m u ľľududíí

Steven E. Scherer et al., Nature 2006

Prognosticky významnPrognosticky významnéé chromozchromozóómovmovéé aberaberááciecie

trizómia 12

del13q14del13q14ččastoasto prpríítomný primtomný primáárny genetický rny genetický markermarkerpriaznivpriazniváá prognprognóóza (pokiaza (pokiaľľ jedinjedináá abnormalita)abnormalita)zahzahŕňŕňa netranskribovaný ga netranskribovaný géén a 2 n a 2 microRNAmicroRNA ggéény ny markermarker indukuje preruindukuje preruššenie enie retinoblastretinoblastóómovejmovejsignsignáálnej drlnej drááhyhy

Prognosticky významnPrognosticky významnéé chromozchromozóómovmovéé aberaberááciecie

bialelická del13q14

del13q14

del17p13(TP53)detekcia nezávisle od

výsledku MLPA

StratStratéégiagia genetickgenetickéého vyho vyššetrenia pacientov s etrenia pacientov s BB--CLL v NOCLL v NOÚÚ

MLPACLL1 a CLL2

Pacienti s CLL – neliečení a relaps

72h. kultivácia PK s PKW, separácia MACS (CD19)MACS (CD19)

I-FISH„panel CLL“

Pozitívne nálezy

Primárna detekciachromozómových aberácií

Verifikácia a kvantifikáciapozitívnych nálezov z MLPA

PK - heparínPK - EDTA

CLL1 a CLL2 FISH panel CLL1 a CLL2 FISH panel

CLL1 paneldel ATM, del p53

CLL2 paneldel13q14/13q34/+12

MLPA MLPA multiplex ligationmultiplex ligation--dependent probe amplificationdependent probe amplification

detekcia gendetekcia genóómových altermových alterááciciíí

identifikidentifikáácia delcia delééciciíí a duplika duplikááciciíí

analýza 40 odlianalýza 40 odliššných (50bp dlhých) ných (50bp dlhých) DNA sekvenciDNA sekvenciíí (FISH (FISH –– 2020--50kb)50kb)

multiplexnmultiplexnáá semikvantitatsemikvantitatíívna PCRvna PCR

Analýza metAnalýza metóódou MLPAdou MLPA

55+19+19

332p24 (MYCN)2p24 (MYCN)

338q24 (MYC)8q24 (MYC)

229p21 (CDKN2A/B)9p21 (CDKN2A/B)

1118q21 (MADH4, BCL2)18q21 (MADH4, BCL2)

2210q23 (PTEN)10q23 (PTEN)

336q256q25--2626

8817p13 17p13 (TP53)(TP53)

1010+12+12

7711q23 11q23 (ATM)(ATM)

121213q14 13q14 (RB1, DLEU, (RB1, DLEU, MIR15,MIR15,--16, KCNRG)16, KCNRG)

NumberNumber ofof probesprobesLocusLocus

Analýza metódou MLPA

- štandardný postup odporúčaný výrobcom

- vyšetrovaný materiál – priama izolácia DNA alebo izolácia DNA zo separovaných leukocytov

(150 ng do reakcie)

- fragmentačná analýza – ABI 3130 a GeneMapper software (Applied Biosystems)

Frekventované aberácie

Sporadické aberácie

=

del 13q14 – MLPA vs. FISHnegatívna kontrola

pacient

Pacienti s CLL Pacienti s CLL –– MLPA a FISH analýzaMLPA a FISH analýza8/2007 8/2007 –– 4/20104/2010

19,8% 19,8% (n = 55)(n = 55)del17p13 (TP53)del17p13 (TP53)

7,5% 7,5% (n = 21)(n = 21)25,9% 25,9% (n = 72)(n = 72)60,5% 60,5% (n = 168)(n = 168)62% 62% (n = 278)(n = 278)

21,5% 21,5% (n = 17)(n = 17)sporadiksporadikéé aberaberááciecie

15,1% 15,1% (n = 42)(n = 42) (single 10,1%)(single 10,1%)+12+12

22,3% 22,3% (n = 62)(n = 62)del11q23 (ATM)del11q23 (ATM)

63,5% 63,5% (n = 47)(n = 47) (single 34,2%)(single 34,2%)del13q14del13q14

3 a viac 3 a viac aberaberááciciíí2 2 aberaberááciecie1 1 aberaberááciaciaPozitPozit..

442442

PoPoččet pacientovet pacientov

55 %55 %del13qdel13q

7 %7 %del17pdel17p

16 %16 %+12+12

18 %18 %del11qdel11q

DDööhnerhner etet alal. (2000) . (2000)

Döhner et al. (2000): Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N. Engl. J. Med. 343, 1910-1916.

SporadickSporadickéé aberaberááciecie –– MLPA a FISH analýzaMLPA a FISH analýza8/2007 8/2007 –– 4/20104/2010

n = n = 77(2,5%)(2,5%)

n = 4 n = 4 (1,4%)(1,4%)

n = 5 n = 5 (1,7%)(1,7%)

n = 13 n = 13 (4,6%)(4,6%)

n = 6 n = 6 (2,1%)(2,1%)

n = 10 n = 10 (3,6%)(3,6%)

+19+19del10q23 del10q23 (PTEN)(PTEN)

3 x 8q243 x 8q24(MYC)(MYC)

3 x 2p243 x 2p24(MYCN)(MYCN)

del9p21del9p21(CDKN2A/B)(CDKN2A/B)

del6q25del6q25--2626

n = 42 n = 42 (15,1%)(15,1%)

PozitPozit..

del9p21 (CDKN2A/B) del6q25-26

BB--CLL: MLPA vs. FISHCLL: MLPA vs. FISH

InterfInterfáázovzováá FISH (IFISH (I--FISH):FISH):-- šštandardntandardnáá metmetóódada detekcie chromozdetekcie chromozóómových abermových aberááciciííasociovaných s CLLasociovaných s CLL

MLPA MLPA ((MultiplexMultiplex ligationligation--dependentdependent probeprobe amplificationamplification) ) -- novnováá metmetóóda detekcie da detekcie deldelééciciíí a a aplifikaplifikááciciíí ggéénov a nov a chrchr. . lokusovlokusov

MetodickMetodickéé limity MLPA:limity MLPA:-- neschopnosneschopnosťť odlodlíšíšenia enia monomono--alelickejalelickej od od bibi--alelickejalelickej deldelééciecie-- nemonemožžnosnosťť presnej kvantifikpresnej kvantifikáácie pozitcie pozitíívneho nvneho náálezu lezu -- potrebnpotrebnáá kombinkombináácia s metcia s metóódou FISHdou FISH

Výhody MLPA oproti FISH:Výhody MLPA oproti FISH:-- menmenššia ia ččasovasováá a manua manuáálna nlna náároroččnosnosťť-- multiplexnmultiplexnáá reakcia reakcia –– finanfinanččne efektne efektíívnevne-- skrskrííning ning šširirššieho spektra genetických ieho spektra genetických markerovmarkerov u CLL pacientov u CLL pacientov

ZZááverver

MetMetóóda MLPA je da MLPA je menejmenej ččasovoasovo a a manumanuáálnelne nnáároroččnou nou metmetóódoudou a poskytuje a poskytuje detekciu detekciu šširirššiehoieho spektra spektra patognomickýchpatognomických oblastoblastíí asociovaných s Basociovaných s B--CLL v CLL v porovnanporovnaníí s s rutinnerutinne vyvyššetrovanýmetrovaným „„CLL CLL –– panelompanelom““ metmetóódoudou FISH.FISH.

BudBudúúcece ššttúúdiedie oo CLL CLL poupoužžijijúúcc technikytechniky molekulmolekuláárnejrnej biolbiolóógiegie budbudúúpokrapokraččovaovaťť vv zlepzlepššovanovaníí nnášášhoho chcháápaniapania biologickejbiologickej podstatypodstaty aa klinickej klinickej manifestmanifestááciecie ochorenia aochorenia a budbudúú identifikovaidentifikovaťť novnovéé lielieččebnebnéé cieleciele..

MZSR.2005/16-NOU-01

ĎĎAKUJEM ZA POZORNOSAKUJEM ZA POZORNOSŤŤ