St. Ursula Gymnasium Aachen

Stufe 11

Facharbeit im Leistungskurs Biologie

zum Thema:

CRISPR/Cas9:

Eine gentechnische Innovation mit Zukunftsperspektiven?

Anwendungsbeispiele aus Lebensmittelproduktion und Krebsforschung

von

Juliane Ebner

Fachlehrerin:

Frau Ochel

Abgabetermin:

15. April 2016

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ........................................................................................................................... 1

2. Was ist CRISPR/Cas9? ...................................................................................................... 1

2.1 Entdeckung von CRISPR/Cas9 ................................................................................... 1

2.2 Der natürliche CRISPR/Cas9-Mechanismus ............................................................... 2

3. CRISPR/Cas9 als Revolution in der Gentechnik ............................................................... 3

3.1 Einführung von CRISPR/Cas9 in die Gentechnik ....................................................... 3

3.2 Verwendungsbeispiele von Restriktionsenzymen vor Cas9 ........................................ 4

3.3 Vorteile von Cas9 gegenüber anderen Restriktionsenzymen ....................................... 4

4. Anwendungsmöglichkeiten von CRISPR/Cas9 ................................................................. 5

4.1 CRISPR/Cas9 eröffnet viele Chancen ......................................................................... 5

4.2 CRISPR/Cas9 in der Lebensmittelproduktion ............................................................. 6

4.3 CRISPR/Cas9 in der Krebsforschung .......................................................................... 6

5. Probleme und Risiken von CRISPR/Cas9 in unterschiedlichen Anwendungsbereichen .. 7

5.1 Technische Probleme ................................................................................................... 7

5.1.1 Transport der CRISPR/Cas9-Komponenten ......................................................... 7

5.1.2 Off-target cuts von Cas9 ....................................................................................... 9

5.2 Ethische Probleme ..................................................................................................... 10

5.2.1 Kennzeichnung von Gentechnik in Lebensmitteln ............................................. 10

5.2.2 Sind Eingriffe in die menschliche Keimbahn verantwortbar? ............................ 11

6. Fazit ................................................................................................................................. 13

7. Anhänge ........................................................................................................................... 15

7.1 Alina Huth Experteninterview ................................................................................... 15

7.2 Abbildungen ............................................................................................................... 22

8. Literaturverzeichnis ......................................................................................................... 24

9. Selbstständigkeitserklärung ............................................................................................. 28

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1. Einleitung

Für meine Facharbeit wollte ich mich am liebsten mit einem Thema beschäftigen, das

mit Genetik zu tun hat. Das kommt daher, dass ich das Thema Genetik im Unterricht

sehr interessant fand. Ich habe also nach neuen Entwicklungen und Innovationen in

der Forschung gesucht und bin auf CRISPR/Cas9 gestoßen.

In dieser Facharbeit im Leistungskursfach Biologie erläutere ich zunächst den

CRISPR/Cas9-Mechanismus. Die Leitfrage, ob CRISPR/Cas9 eine gentechnische In-

novation mit Zukunftsperspektiven ist, soll durch diese Facharbeit erarbeitet werden.

Es sollen verschiedene Sichtweisen auf die Nutzungsmöglichkeiten und die potentiel-

len Gefahren und Probleme, die CRISPR/Cas9 mit sich bringt, beleuchtet werden.

Dazu dienen unter anderem konkrete Anwendungsbeispiele aus der Lebensmittelpro-

duktion und der Krebsforschung.

Die Forschung mit CRISPR/Cas9 hat außerdem eine hohe Aktualität und ist ein sehr

kontroverses Thema, da es viele Chancen, aber auch Gefahren mit sich bringt. Dem-

entsprechend gibt es viele verschiedene Meinungen.

2. Was ist CRISPR/Cas9?

2.1 Entdeckung von CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 ist eine moderne Methode in der Gentechnik, die auf einem natürlichen

Mechanismus beruht. Zuerst wurde sie in E.coli Bakterien gefunden. Man vermutete,

dass er als bakterielle Immunabwehr fungiert (Redaktion Pflanzenforschung.de b).

Die Abkürzung „CRISPR“ steht für clustered regularly interspaced short palindromic

repeats und ist die Bezeichnung für sich wiederholende DNA-Sequenzen, die im Ge-

nom der Bakterien zu finden sind. Vereinfacht gesagt, basiert CRISPR auf einem Rest-

riktionsenzym namens Cas9 (CRISPR-associated protein), welches DNA zielorientiert

zerschneiden kann und somit einen Virusbefall abwehrt (Ledford 2015, Kreiner u.

Schumann 2016, S. 51-52).

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Erste Ansätze wurden bereits im Jahre 1987 gemacht. Damals fanden Forscher in ei-

nem E. coli Bakterium die CRISPR-DNA, konnten ihr aber noch nicht die richtige

Bedeutung zuschreiben (Ishino Y u.a., 1987). Erst 2005 wurde die Hypothese aufge-

stellt, dass CRISPR ein bakterielles Verteidigungssystem gegen Virenbefall sei. Diese

Hypothese wurde bis hin zu den Jahren 2012/2013 so genau ausdifferenziert und prä-

zisiert, dass CRISPR/Cas9 erstmals in der Gentechnik verwendet werden konnte

(Abb.1). Allerdings ist das Immunabwehrsystem der Bakterien bis heute immer noch

nicht vollkommen entschlüsselt (Kreiner u. Schumann 2016, S.51).

2.2 Der natürliche CRISPR/Cas9-Mechanismus

Der CRISPR/Cas9 Abwehrmechanismus ist so aufgebaut, dass es in der CRISPR-

DNA, auch CRISPR-Locus genannt (Kreiner u. Schumann 2016, S.51), abwechselnd

Spacers und Repeats gibt (Abb.1). Repeats sind die Wiederholungen einer identischen

DNA-Sequenz innerhalb des CRISPR-Locus. Spacers tragen für den Abwehrmecha-

nismus der Bakterien eine ähnliche Aufgabe wie die Gedächtniszellen im menschli-

chen Immunsystem. Sie bestehen aus DNA-Fragmenten von Viren, die das Bakterium

in früheren Zeiten bereits befallen hatten. So ist das Bakterium fähig, bereits bekannte

Phagen-DNA schneller zu zerschneiden, sodass das Virus abgewehrt wird und das

Bakterium immun gegen dieses Virus ist (Doudna u. Charpentier 2012, Abb.1).

Um neue und somit unbekannte Phagen-DNA zu zerstören, durchläuft das Bakterium

drei Phasen. Die erste Phase, auch Adaptionsphase oder Akquisitionsphase genannt,

findet nach Befall durch ein neues Virus statt. Hier suchen Cas9-Proteine die Fremd-

DNA nach der PAM-Sequenz (Protospacer Adjacent Motif) ab, um den Protospacer

des Virus aus der Phagen-DNA herauszuschneiden. Diese Sequenz wird anschließend

als neuer Spacer in die CRISPR-DNA eingefügt (Abb.1; Kreiner u. Schumann 2016,

S.52; Sachdeva 2015, S.511; Al-Attar u.a. 2011, S.282-284).

Während der zweiten Phase, der Transkriptions- oder auch Bearbeitungsphase, wird

die vollständige CRISPR-DNA zusammen mit dem neuen Spacer transkribiert, sodass

die pre-crRNA (precursor crRNA) entsteht, welche durch Prozessierung zu crRNA

wird (Abb.1; Kreiner u. Schumann 2016, S.52; Sachdeva 2015, S.511; Al-Attar u.a.

2011, S.284f.).

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Im Verlauf der sogenannten Interferenzphase wird in Verbindung mit Cas9-Enzymen

die Phagen-DNA nach Sequenzen, die komplementär zu einem Spacer sind, abgesucht.

Bei einem Fund wird durch Cas9 ein Doppelstrangbruch durchgeführt. Somit wird das

Virus letztendlich unschädlich gemacht und das Bakterium verfügt bei einem neuen

Befall über eine Immunabwehr (Abb.1; Kreiner u. Schumann 2016, S.52; Sachdeva

2015, S.511; Al-Attar u.a. 2011, S.285f.).

3. CRISPR/Cas9 als Revolution in der Gentechnik

3.1 Einführung von CRISPR/Cas9 in die Gentechnik

„We propose an alternative methodology based on RNA-programmed Cas9 that

could offer considerable potential for gene-targeting and genome-editing

applications. “ (Doudna u. Charpentier 2012, S.820). Dies war der Schlusssatz der

Publikation von Emmanuelle Charpentier und Jennifer A. Doudna aus dem Jahr 2012.

Die beiden Forscherinnen und ihr Team, das auch an dieser Publikation beteiligt war,

lieferten die ausschlaggebenden Fakten, die für eine Etablierung von CRISPR/Cas9 in

der Gentechnik sorgten. Mithilfe von zahlreichen Experimenten versuchten sie,

CRISPR/Cas9 noch detaillierter nachvollziehen zu können und somit die Effizienz zu

optimieren (Doudna u. Charpentier 2012).

Ein in vitro-Experiment, bei dem das Cas9 aus Streptococcus pyogenes verwendet

wurde, sollte zunächst klären, ob sich das Restriktionsenzym Cas9 unter alleinigem

Einfluss der crRNA an die targetDNA bindet, oder ob noch eine weitere kurze und

nicht codierende RNA-Sequenz, die sogenannte tracrRNA (trans-activating crRNA),

dazu notwendig ist. Die Ergebnisse belegten, dass die tracrRNA essentiell ist, da sie

vermutlich die crRNA an den komplementären Strang der targetDNA leitet und Cas9

aktiviert (Doudna u. Charpentier 2012, S.818; Chylinsky, Le Rhun u. Carpentier, 2013;

Kreiner u. Schumann 2016, S.53f.).

Weitere Experimente zeigten, dass nur crRNA, tracrRNA und Cas9 notwendige Ele-

mente für das Genome-Editing mit CRISPR sind und dass man crRNA und tracrRNA

zu einem Molekül zusammenführen kann, welches man auch sgRNA (single-gui-

deRNA) nennt (Doudna u. Carpentier, 2012; Kreiner u. Schumann, 2016).

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CRISPR/Cas9 als Gene-Editing-Tool macht es also möglich, mit dem Restriktions-

enzym Cas9 gezielt Sequenzen aus tierischer und pflanzlicher DNA zu entfernen und

mithilfe von Rekombinationssystemen gegebenenfalls neue Sequenzen einzufügen.

Durch die individuell veränderbare guideRNA kann CRISPR/Cas9 passend an neue

Gensequenzen adaptiert werden (Kreiner u. Schumann, 2016).

3.2 Verwendungsbeispiele von Restriktionsenzymen vor Cas9

Schon vor CRISPR/Cas9 hat man Restriktionsenzyme in der Gentechnik verwendet.

Sie spielten ebenfalls in der Biotechnologie und der Medizin bereits eine wichtige

Rolle, weil sie die Bildung von rekombinanten Plasmiden ermöglichen.

Mit ihnen kann man unter anderem Pflanzengenome so kreuzen, dass die Pflanze be-

stimmte gewünschte Erbmerkmale aufweist. Ein Beispiel, bei dem Pflanzen genetisch

verändert wurden, ist der sogenannte Golden Rice. In dem gentechnisch modifizierten

Reis soll eine erhöhte Anreicherung von Provitamin A den häufigen Vitamin-A Mangel

von Menschen in Entwicklungsländern verringern (Kreiner u. Schumann 2016, S.53).

Ein weiterer Verwendungszweck der rekombinanten Plasmide ist die Herstellung von

therapeutischen Mitteln. Hier soll die angepasste Vektor-DNA für die gewünschten

Genprodukte (therapeutischen Proteine) codiert werden, sodass diese vom Bakterium

synthetisiert werden können. Ein Beispiel dafür ist das gentechnisch produzierte Insu-

lin, welches seit 1979 mithilfe von E. coli hergestellt wird (Kreiner u. Schumann, 2016,

S.52-53).

3.3 Vorteile von Cas9 gegenüber anderen Restriktionsenzymen

CRISPR/Cas9 bietet eine vorteilhafte Alternative zu anderen Restriktionsenzymen. Es

werden beispielsweise auch sogenannte Zinkfingernukleasen und TALEN-Nukleasen

als Restriktionsenzyme in der Gentechnik verwendet. Sie sind in der Herstellung ver-

glichen mit CRISPR/Cas9 deutlich komplizierter und zeitaufwändiger, weil sie kom-

plexe Herstellungsmethoden erfordern. Um die individuelle guideRNA

(crRNA/tracrRNA/sgRNA) von CRISPR herzustellen, benötigt man jedoch nur Stan-

dardreagenzien (Ledford 2015).

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Wegen der einfachen Herstellungsmethoden hat CRISPR/Cas9 auch ein vorteilhafte-

res Preis-Leistungs-Verhältnis als die anderen Nukleasen. Zinkfingernukleasen bei-

spielsweise kosten in der Herstellung etwa 5000$, während CRISPR/Cas9 bei einem

Kostenaufwand von circa 30$ liegt (Ledford 2015).

CRISPR ist also insgesamt einfacher und kostengünstiger in der Produktion und Nut-

zung als andere Gene-Editing-Tools, wie zum Beispiel Zinkfingernukleasen oder TA-

LEN-Nukleasen. Deshalb ist CRISPR/Cas9 aktuell die beliebteste Methode für die

Gentechnik und ist ein häufiges Forschungsthema geworden (Ledford 2015).

4. Anwendungsmöglichkeiten von CRISPR/Cas9

4.1 CRISPR/Cas9 eröffnet viele Chancen

Die Forschung mit CRISPR/Cas9 ist bereits in vielfältigen Bereichen aufzufinden.

Sie deckt Grundlagenforschung, Biotechnologie, Pflanzenforschung (s. 4.2), Beein-

flussung von Ökosystemen, Medizin (s. 4.3) und sogar Eingriffe in die menschliche

Keimbahn (s. 5.2.2) ab (DFG 2015, S.7-11).

Zum einen brachten es Wissenschaftler in ihren Laborexperimenten fertig, problema-

tischen multiresistenten Bakterien mittels CRISPR/Cas9 die Resistenz zu nehmen, in-

dem die CRISPR-Komponenten so konstruiert wurden, dass sie Doppelstrangbrüche

bei den Resistenz-Plasmiden der Bakterien auslösten. Des Weiteren konnte man hu-

manpathogene Viren, nämlich die zu Gebärmutterhalskrebs führenden Viren HPV-16

und HPV-18, den Hepatitis B Virus und den HI-Virus, durch verschiedene Vorgehens-

weisen unwirksam machen (Kreiner u. Schumann 2016, S.54-55).

Es wurden jedoch auch schon Experimente mit letalen, menschlichen Zygoten, die

künstlich befruchtet wurden, durchgeführt (s. 5.1.2). Das Ziel war es, eine mutierte

Gen-Sequenz gegen die voll funktionsfähige Sequenz auszutauschen, um somit Erb-

krankheiten zu bekämpfen. Allerdings kam es nicht ganz zu dem erhofften Erfolg, da

CRISPR/Cas9 die unerwünschte Sequenz nicht immer austauschen konnte (Kreiner u.

Schumann 2016, S.55; Zhou u. Huang 2015).

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4.2 CRISPR/Cas9 in der Lebensmittelproduktion

Bereits vor der Einführung von CRISPR/Cas9 in die Gentechnik hat man sich gen-

technische Verfahren für die Optimierung der Lebensmittelproduktion zunutze ge-

macht. Mittels älterer gentechnischer Methoden wurde zum Beispiel für höhere Er-

träge und Widerstandsfähigkeit bei Pflanzen gesorgt (s. 3.2).

Ein großer Vorteil von CRISPR/Cas9 ist, dass das Verfahren deutlich schneller ist als

die Kreuzung. Bei Pflanzen, die mit CRISPR gentechnisch manipuliert wurden, ist im

Endergebnis allerdings kein Unterschied zu denen zu erkennen, die durch Kreuzung

entstanden sind, weil keine nachweisbare Fremd-DNA eingeschleust wurde. (Huth

2016; DFG 2015, S. 7-8).

CRISPR/Cas9 wird in der Nahrungsmittelindustrie auch bei der Erzeugung von Milch-

produkten eingesetzt. Bei dieser Produktion können enorme Schäden durch einen Vi-

rusbefall der häufig genutzten Bakterien S. thermophilus aufkommen, da häufig ganze

Produktionslinien durch den Befall zerstört werden. Mithilfe von CRISPR kann gegen

einen solchen Befall vorgesorgt werden, indem man das Genom der Bakterien so ver-

ändert, dass sie immun gegen diese Viren sind. Sie können die Viren somit eigenstän-

dig abwehren (DFG 2014, S.31-32; Al-Attar u.a. 2011, S.286).

4.3 CRISPR/Cas9 in der Krebsforschung

Neben älteren Behandlungsarten gegen Krebs, wie zu Beispiel der Operation oder der

Chemotherapie, bietet CRISPR/Cas9 ganz neue Therapiemöglichkeiten. Zum einen

können durch Tierversuche mit CRISPR/Cas9 Krebsmedikamente gefunden werden.

Dazu werden mittels Cas9 und der passenden sgRNA Leserastermutationen in ver-

schiedenen Genen, die bekannterweise vermehrt in Krebszellen exprimiert werden,

ausgelöst. Auf diese Weise kann bei einer Genexpression kein funktionierendes Pro-

tein ausgebildet werden, sodass das Gen praktisch ausgeschaltet wurde. Anschließend

untersucht man, was das Fehlen dieses Gens bewirkt. Im idealen Fall sollten dadurch

ausschließlich die Krebszellen abgetötet werden und die anderen Zellen unverändert

bleiben. Wenn dies der Fall wäre, könnte man dann eine Substanz gegen das Protein

des ursprünglichen Gens entwickeln und somit ein mögliches Krebsheilmittel herstel-

len (Huth 2016; Sachdeva 2015, S.515).

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Des Weiteren werden durch CRISPR/Cas9 Verbesserungsmöglichkeiten der Immun-

abwehr des Krebspatienten erzielt. Mithilfe von CRISPR/Cas9 kann man nämlich die

Immunevasion der Krebszellen, also das gezielte Umgehen des körpereigenen Immun-

systems, abschwächen. Dazu entnimmt man dem Patienten oder einem Spender Blut,

um anschließend die T-Zellen so zu verändert, dass sie über einen Rezeptor verfügen.

Dieser Rezeptor erkennt die tumorspezifischen Antigene der Krebszellen und bindet

sich an sie, wodurch die Krebszellen absterben. Außerdem kann die Lebensdauer und

die Toxizität der Immunzellen erhöht werden, sodass die Krebszellen noch effizienter

bekämpft werden können (Huth 2016; Kreiner u. Schumann 2016, S.55).

Diese Therapie wurde in London bereits bei einem einjährigen Mädchen, das an Leu-

kämie erkrankt war, erfolgreich durchgeführt. Vor dem Einsatz der gentechnisch ver-

änderten T-Zellen hatte bei ihr keine Behandlung angeschlagen. Damals wurden zwar

noch TALEN-Nukleasen verwendet (GOSH-ICH Press Office 2015), jedoch könnte

diese Behandlungsform mit CRISPR noch kostengünstiger und präziser gemacht wer-

den (s.3.3).

5. Probleme und Risiken von CRISPR/Cas9 in unterschiedlichen An-

wendungsbereichen

5.1 Technische Probleme

5.1.1 Transport der CRISPR/Cas9-Komponenten

Neben den bereits genannten Möglichkeiten und Vorteilen, weist CRISPR/Cas9 aller-

dings auch noch einige technischen Probleme auf, welche die Arbeit damit einschrän-

ken.

Ein komplizierter Schritt ist zunächst der Transport von CRISPR/Cas9 in das Zielor-

gan im Körper, was ein Versuch von Daniel Anderson zeigt. Er versuchte, mithilfe von

CRISPR/Cas9 Tyrosinämie bei Mäusen zu heilen. Dazu wollte er das Gen mit der

Punktmutation, die die Krankheit ausgelöst hatte, durch ein intaktes Gen auswechseln.

Um Cas9 und sgRNA in das Zielorgan der Maus zu bringen, nutzte Anderson die so-

genannte hydrodynamische Injektion. Hierbei muss viel Flüssigkeit, welche die

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CRISPR-Komponenten transportieren soll, in den Blutkreislauf der Maus injiziert wer-

den. Der große Nachteil bei diesem Verfahren ist, dass sich das Blutvolumen durch die

Flüssigkeit verdoppelt. Das kann bei der Maus zu Leberschäden führen und ist beim

Menschen gar nicht durchführbar (Huth 2016; Ledford 2015; Sachdeva 2015, S.514).

Eine mögliche Option, die Komponenten in das Zielorgan zu befördern, ist die Nut-

zung von sogenannten Lipid-Nanopartikeln. Die Cas9 mRNA wird dazu in Lipid-

vesikel eingebettet, welche in den Nanopartikeln anschließend zu den entsprechenden

Zellen gebracht werden, wo die beladenen Lipidvesikel durch Endozytose in die Zel-

len übernommen werden können (Huth 2016).

Des Weiteren werden für den Transport der der sgRNA häufig Adeno-assoziierte Vi-

ren oder Lentiviren verwendet. Diese Viren werden dafür gentechnisch so manipuliert,

dass sie sich weder durch Befall eines Bakteriums vermehren, noch Krankheiten aus-

lösen können (Huth 2016, Livingstone 2015).

Man kann das Genom der Viren als Speicherort für die Cas9 RNA, die sgRNA und

falls nötig eine weitere DNA-Sequenz nutzen. So dienen die unschädlich gemachten

Viren als Transporthülle für die CRISPR-Komponenten (Huth 2016).

Die Schwierigkeit bei diesem Verfahren ist die limitierte Transportkapazität der Viren.

Adeno-assoziierte Viren verfügen über eine Maximalkapazität von 4,7 Kilobasen und

Lentiviren können 10 Kilobasen transportieren. Hinzu kommt, dass das Cas9-Gen al-

lein bereits 4 Kilobasen beansprucht und somit ein relativ komplexes und großes Pro-

tein ist. Häufig werden auch sogenannte Reportergene mittransportiert, um herausfin-

den zu können, ob das Einbringen von Cas9 gelungen ist. Für alle Komponenten zu-

sammen könnte möglicherweise zu wenig Platz vorhanden sein (Huth 2016).

Außerdem konnte Alina Huth im Zusammenhang mit ihrer Masterarbeit ein weiteres

Problem dieser Viren beobachten. Nach der ersten Infektion durch Lentiviren fanden

nur bei etwa 2% der infizierten Zellen eine Genexpression der CRISPR-Gene statt.

Zur Lösung dieses Problems sucht man momentan nach weiteren Transportmitteln und

nach Möglichkeiten, wie man das Cas9-Enzym kleiner gestalten kann (Huth 2016).

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5.1.2 Off-target cuts von Cas9

Wie schon in 4.1 kurz erwähnt wurde, gab es bereits Experimente von chinesischen

Forschern, bei denen menschliche Zygoten mittels CRISPR/Cas9 verändert werden

sollten. Das Forschungsziel war es, die Genauigkeit von CRISPR/Cas9 als Gene-Edi-

ting-Tool zu analysieren. Bei dem Experiment stand das Gen, das für das β-Globin-

Protein codiert, im Mittelpunkt. Bei einer Mutation dieses Gens löst es die Blutkrank-

heit β-Thalassämie aus, welche tödlich enden kann. Alle Zygoten in diesem Experi-

ment hatten die mutierte Gensequenz in ihrem Genom. Um sie zu heilen, wollten die

chinesischen Forscher die mutierte Gensequenz, auf der sich das krankheitsauslösende

Gen befindet, durch die passende nicht mutierte Gensequenz austauschen (Cyranoski

u. Reardon 2015; Zhou u. Huang 2015, S.363-366).

Durch dieses Experiment versuchte man also zu zeigen, dass genetisch bedingte

Krankheiten möglicherweise schon vor der Geburt heilbar sind. Dies schien ein großes

Potential zu bieten, jedoch waren die Ergebnisse des Experiments nicht erfolgverspre-

chend. Nach 48 Stunden Versuchslaufzeit waren von den insgesamt 86 verwendeten

Zygoten nur noch 71 am Leben. Es wurde das Genom von 54 Zygoten geprüft und

man fand heraus, dass CRISPR/Cas9 nur bei 28 Zellen die Veränderung im Genom

vollbracht hatte (Cyranoski u. Reardon 2015; Zhou u. Huang 2015, S.366-370).

Die geringe Effizienz von Cas9 ist zum Teil mit dem sogenannten off-target Effekt zu

begründen. Das bedeutet, dass Cas9 trotz einer minimal falschen Basenpaarung der

sgRNA an die DNA einen Doppelstrangbruch durchführen kann. Diese fehlerhaften

Doppelstrangbrüche in der DNA nennt man off-target cuts (Huth 2016, Zhou u. Huang

2015, S.366-370).

Hinzukommende erschwerende Faktoren bei dem Experiment waren einerseits Kom-

plikationen beim Transport und andererseits, dass man das Gen auf beiden homologen

Chromosomen ausschalten müsste, um es gänzlich zu entfernen (Huth 2016, Zhou u.

Huang 2015, S.366-370).

Mittlerweile gibt es allerdings Fortschritte zur Effizienzverbesserung von Cas9. Zum

einen werden sogenannte Cas9 Nickasen anstatt des ursprünglichen Cas9-Enzyms ge-

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nutzt. Sie verursachen keine Doppelstrang- sondern Einzelstrangbrüche. Demnach be-

nötigt man zwei Cas9 Nickasen, die sich unabhängig voneinander an derselben Stelle

im Genom anlagern müssen, um gemeinsam einen Doppelstrangbruch zu bewirken

(Huth 2016).

Des Weiteren werden sogenannte deadCas9 (dCas9) an Stelle von Cas9 verwendet.

Diese Cas9-Enzyme wurden inaktiviert, das heißt sie können die DNA zwar nicht

selbstständig zerschneiden, aber das richtige Gen lokalisieren. Um die DNA nach dem

Fund zu zertrennen, haben die dCas9-Enzyme eine zusätzliche Endonuklease gebun-

den. Diese schneidet die DNA allerdings nur, wenn sich noch eine weitere Endonuk-

lease direkt in ihrer Nähe befindet (Huth 2016; Sachdeva 2015, S.513).

Außerdem ist es möglich die noch zu hohe Toleranz von Fehlpaarungen der sgRNA zu

senken, indem man die Nukleotidanzahl der sgRNA von 20 auf 17-18 Nukleotide ver-

ringert. So soll die Präzision erneut verbessert werden (Huth 2016).

Durch jede Veränderung von Cas9 wird jedoch auch seine Effizienz beeinträchtigt.

Daher ist die Forschung mit Cas9 noch nicht beendet und man sucht nach weiteren

Optimierungsmöglichkeiten (Huth 2016).

5.2 Ethische Probleme

5.2.1 Kennzeichnung von Gentechnik in Lebensmitteln

Es gibt einige Bereiche, wie zum Beispiel die Heilung von Krebs (s. 4.3) oder HIV, in

denen die Anwendung von CRISPR/Cas9 in der Forschung ausschließlich befürwortet

wird. Allerdings bewerten Kritiker vor allem die Verwendung von CRISPR in der Nah-

rungsmittelindustrie und die Beeinflussung der menschlichen Keimbahn negativ

(Deutschlandfunk 2016).

In der Lebensmittelindustrie gilt CRISPR nach Definition des Gentechnikgesetzes

nicht als gentechnischer Eingriff, da er nicht von herkömmlichen Züchtungsmethoden

unterscheidbar ist. Dort wird der Begriff des gentechnisch veränderten Organismus

als „Organismus, mit Ausnahme des Menschen, dessen genetisches Material in einer

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Weise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen o-

der natürliche Rekombination nicht vorkommt [...]“ (BMJV a, §3) definiert. Ein wei-

teres Kriterium ist, dass „[...] das genetische Material des Organismus Eigenschaften

aufweist, die auf gentechnische Arbeiten zurückzuführen sind“ (BMJV a, §3). Es wird

keine nachweisbare Fremd-DNA eingefügt, wodurch beide Kriterien nicht zutreffen.

Somit sind die Konzerne gesetzlich nicht verpflichtet, die mit CRISPR bearbeiteten

Produkte als gentechnisch veränderte Organismen zu kennzeichnen (BMVJ a, §3 Be-

griffsbestimmungen).

Gentechnische Veränderungen an Nutzpflanzen werden auch als Grüne Gentechnik

bezeichnet und sind, allgemein betrachtet, europaweit ziemlich unbeliebt, besonders

in Deutschland. Es gibt jedoch auch Befürworter. Alina Huth beispielsweise denkt, es

sei eine bessere Aufklärung über verschiedene Arten von Gentechnik notwendig, da

sie ein unberechtigt schlechtes Image habe. CRISPR zum Beispiel beschleunige den

Kreuzungsvorgang nur und sei je nach Art der Genmanipulation gesundheitlich unbe-

denklich. Dies müsse allerdings für jede gentechnisch manipulierte Pflanze bewiesen

werden (Huth 2016).

Des Weiteren kann die übermäßige Nutzung von Pflanzenschutzmitteln in der Land-

wirtschaft durch die gentechnische Optimierung von Pflanzen eingedämmt werden,

was für den Verbraucher, aber auch für die Bauern vorteilhaft sei (Deutschlandfunk

2016, 21:30-21:54).

5.2.2 Sind Eingriffe in die menschliche Keimbahn verantwortbar?

Die Möglichkeit, mit CRISPR in die menschliche Keimbahn einzugreifen, wird von

Kritikern noch deutlich skeptischer als die Grüne Gentechnik aufgefasst. Ein Ziel die-

ser Eingriffe ist es, Erbkrankheiten zu heilen. Dies will man erreichen, indem man mit

CRISPR entweder die DNA der Gameten oder der Zygoten verändert. Diese Verände-

rung in der DNA wird an die zukünftigen Generationen weitergegeben. Daher wird

befürchtet, dass man die langfristigen Auswirkungen dieser Veränderung nicht vorher-

sehen kann (Gómez Tatay 2016).

Des Weiteren ist ein solches Verfahren bei dem aktuellen Stand der Technik überhaupt

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nicht gefahrenlos durchführbar. Der Grund für diese Befürchtung ist das Experiment

der chinesischen Forscher (s. 5.1.2), bei dem insbesondere die geringe Erfolgsquote

viele Kritiker beunruhigt. Bei dieser hohen Wahrscheinlichkeit für off-target cuts ist

CRISPR/Cas9 keinesfalls am Menschen anwendbar. Die kurze sgRNA kann sich durch

die Toleranz von wenigen Fehlpaarungen mit Sicherheit an mehreren Stellen im gro-

ßen menschlichen Genom anbinden, was gefährliche Folgen haben kann (Gómez

Tatay 2016; Lanphier, Urnoy u.a. 2015, S.410; Huth 2016).

In England hat man die Definition, ab wann eine Zygote als menschliches Individuum

gilt, auf den zwölften Tag nach der Befruchtung ausgedehnt. So ist die Grundlagenfor-

schung an Embryonen bis zum zwölften Tag erlaubt. In Deutschland ist das nicht der

Fall, da das Individuum laut Definition des Embryonenschutzgesetzes (§8), welches

2011 zuletzt geändert wurde, bereits durch die Befruchtung entsteht (Deutschlandfunk

2016, 29:22-29:51; BMJV b, §8).

Diese Entwicklung wird überwiegend negativ aufgefasst, weshalb über ein freiwilliges

Forschungsmoratorium in diesem Bereich diskutiert wurde. Es soll international gelten

und Zeit bieten, um „die wissenschaftlichen, medizinischen, ethischen, juristischen

und regulatorischen Implikationen der neuen Möglichkeiten des genome editing an

menschlichen Keimbahnzellen zu diskutieren.“ (DFG 2015).

Der problematischste Aspekt ist, dass diese Eingriffe letztendlich zur Optimierung von

Menschen führen könnten, was dramatische Folgen für die Gesellschaft mit sich brin-

gen würde (Arens 2016). Eine Bewegung, die dies fördert, ist der Transhumanismus.

Eine Hauptvertreterin dieser Richtung ist Elizabeth Parrish, Geschäftsleiterin des Bi-

otech-Start-ups namens BioViva. Sie hält den Alterungsprozess und die häufigen Be-

gleiterscheinungen wie beispielsweise Arterienverkalkungen, Alzheimer und Muskel-

schwund für eine Krankheit, die man mittels CRISPR heilen könne. Sie will mit A-

deno-assoziierten Viren und CRISPR bestimmte DNA einschleusen, die das Altern der

betroffenen Zellen rückgängig machen soll. Das Verfahren wurde angeblich erfolg-

reich an Tieren getestet und soll nun an der Geschäftsleiterin persönlich getestet wer-

den. So eine Therapie kann bis zu 80.000 US-Dollar kosten (Kewitz 2015).

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6. Fazit

Ich denke, CRISPR/Cas9 bietet generell großes Potential in sehr vielen verschiedenen

Anwendungsbereichen. Es hängt jetzt davon ab, wie man diese gentechnische Revo-

lution einsetzt. In Anwendungsbereichen wie der Medizin und der Biotechnologie wird

CRISPR meiner Meinung nach bisher besonders sinnvoll eigesetzt. Vor allem finde

ich die neue Möglichkeit, Krankheiten wie beispielsweise Krebs schneller heilen zu

können, sehr nützlich.

Allerdings muss meines Erachtens das Gentechnikgesetz mit der veralteten Definition

eines genetisch veränderten Organismus dem aktuellen Forschungsstand so angepasst

werden, dass alle gentechnisch veränderten Lebensmittel als solche gekennzeichnet

werden müssen. Die fehlende Nachweisbarkeit darf kein Kriterium sein, sondern nur

die in der Produktion angewandten Methoden. Außerdem könnte zwischen verschie-

denen Arten von Gentechnik unterschieden werden.

Ebenfalls relevant ist, was genau an der Pflanze verändert wurde. Einerseits sehen

viele Verbraucher das Einfügen von Antibiotikaresistenzgenen als problematisch an,

da so beim Menschen Antibiotikaresistenzen und Allergien entstehen können. Ande-

rerseits führt sonst notwendige übermäßige Einsatz von Pestiziden in der Landwirt-

schaft zu ökologischen und gesundheitlichen Problemen (BUND o.J.).

Eine deutliche Grenze muss meiner Meinung nach bei der Beeinflussung der mensch-

lichen Keimbahn gezogen werden. Die langfristigen Auswirkungen sind unkalkulier-

bar und ethische Probleme vorprogrammiert (Präimplantationsdiagnostik). Daher

halte ich das Moratorium für diese Forschungsrichtung für wichtig. Es sind internati-

onal gleich geltende Gesetzesstandards notwendig, weil meines Erachtens keine künst-

lich vorgenommene Veränderung im Genom an die nächsten Generationen weiterge-

geben werden darf, ohne die Langzeitfolgen zu kennen. Außerdem halte ich die Mög-

lichkeit, Menschen genetisch zu optimieren für ethisch nicht verantwortbar.

Insgesamt ist CRISPR/Cas9 also eine nützliche gentechnische Innovation, die in vielen

Bereichen großes Zukunftspotential bietet. Zu den vielversprechendsten Richtungen

14

gehören vor allem die medizinische und biotechnische Anwendung. Die Möglichkei-

ten werden allerdings auch noch durch berechtigte ethische Bedenken eingegrenzt.

Des Weiteren treten noch einige technische Probleme auf, die nur durch detailliertere

Erforschung der noch recht jungen gentechnischen Methode CRISPR gelöst werden

können. Daher denke ich, dass die Lösung dieser Probleme noch etwas mehr Zeit be-

nötigt und dass sich Politik und Gesellschaft intensiver mit diesem Thema auseinan-

dersetzen müssen.

15

7. Anhänge

7.1 Alina Huth Experteninterview

Antworten Fragenkatalog CRISPR

Technische Fragen:

1. Was konnten Sie genau durch Ihr Masterprojekt herausfinden und was werden diese Er-

gebnisse in der Krebsforschung verändern können?

Die Zielsetzung meiner Masterarbeit war es, die CRISPR/Cas Methode zu etablieren, um damit

später knockout-Studien in vitro und in vivo durchzuführen zu können. Bei knockout-Studien wird

ein Gen ausgeschaltet, hier mittels CRISPR/Cas9, und anschließend wird analysiert, welchen Ef-

fekt das Fehlen dieses Gens auf die Zelle hat. So kann man zum Beispiel ein Gen, das in Krebszel-

len im Vergleich zu gesunden Körperzellen besonders stark exprimiert wird, ausschalten. Führt das

Ausschalten dieses Gens in Krebszellen zum Zelltod, so könnte das Gen ein potenzieller Angriffs-

punkt für Medikamente gegen Krebserkrankungen sein. Nun kann nach einem Wirkstoff gegen das

Protein, das von besagtem Gen codiert wird, gesucht werden, um daraus ein Medikament zu ent-

wickeln. Das CRISPR/Cas System wird hier also indirekt zur Validierung von targets eingesetzt

und nicht direkt zur Therapie im Menschen.

2. Es gab Tierversuche von Daniel Anderson, bei denen große Mengen an Flüssigkeit in die

Blutgefäße injiziert werden mussten, um Cas9 und seine guideRNA in das Zielorgan des

Tieres zu bringen, was beim Menschen unmöglich wäre.

Wie kann man beispielsweise zur Krebsbehandlung das Cas9-Enzym und die guideRNA

an die richtige Stelle im menschlichen Körper bringen?

Daniel Anderson und sein Team benutzten CRISPR/Cas9, um Tyrosinämie zu heilen, eine gene-

tisch bedingte Krankheit, die durch eine einzige Punktmutation verursacht wird. Im Gen das für

das Enzym Fumarylacetoacetase codiert ist das letzte Nukleotid von Exon 8 GA (Guanin zu

Adenin) mutiert, was zur Produktion von defekten Enzymen führt. Dies wiederum führt zur An-

sammlung giftiger Stoffe in den Leberzellen und somit zu gefährlichen Leberschäden. Im Kontext

einer solchen Erkrankung, die durch die Mutation eines einzigen oder weniger Gene verursacht

wird, kann man durch das Einbringen des Cas9 Enzyms, der single guide RNA (sgRNA) und einer

DNA Vorlage die krankhafte Mutation präzise ausschneiden und korrigieren. Das funktioniert so,

dass Cas9 von der sgRNA zum Zielgen, in Daniel Anderson Fall zu besagter GA Mutation, ge-

führt wird, und dort einen Doppelstrangbruch herbeiführt. Dieser wird anschließend mithilfe der

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(hier einzelsträngigen) DNA Vorlage, die die Informationen für die gesunde Variante des Gens

enthält, repariert. Bei der so genannten „homology-directed repair“, die einen der beiden DNA

Notfallreparaturmechanismen der Zelle darstellt, baut die Polymerase den Doppelstrangbruch wie-

der zusammen, und orientiert sich dabei an der DNA Vorlage, die an den Enden mit dem geschnit-

tenen Gen überlappt. Durch das Wiederherstellen der „gesunden“ Version des Gens konnten Daniel

Anderson und seine Kollegen die Krankheit Tyrosinämie nachweislich lindern.

Bei Krebserkrankungen ist das leider nicht so einfach. Krebs ist ein Begriff, der viele verschiedene

Krankheiten zusammenfasst, die gewisse Gemeinsamkeiten aufweisen. Zum Beispiel sind Krebs-

zellen per Definition in der Lage, Metastasen zu bilden, und besitzen im Vergleich zu gesunden

Körperzellen eine erhöhte Proliferationsgeschwindigkeit und einen veränderten Stoffwechsel. Auf

molekularer Ebene unterscheiden sich die Zellen allerdings erheblich zwischen verschiedenen In-

dikationen (z.B. Brustkrebs und Lungenkrebs), aber auch zwischen Patienten, die an der gleichen

Art von Krebs erkrankt sind. Und sogar innerhalb eines Tumors eines Patienten können sich die

Zellen unterscheiden, weshalb es oft so schwierig ist, Krebspatienten vollständig zu heilen. Im

Laufe der Zeit häufen sich in Krebszellen immer mehr verschiedene Mutationen an, sodass die

direkte Therapie des Krebses mittels CRISPR/Cas9 nicht vielversprechend ist und technisch sehr

anspruchsvoll wäre.

Deshalb macht man sich die CRISPR-Technologie in der Krebsforschung auf andere Weise zunutze.

Eine beliebte Anwendung ist es, mithilfe von Cas9 und sgRNAs gezielt Gene auszuschalten, die in

Krebszellen besonders stark exprimiert werden, um anschließend den Effekt des Fehles dieses

Gens auf die Zellen in Zellkultur oder in der Maus zu untersuchen. Hierbei macht man sich den

zweiten DNA Notfallreparaturmechanismus der Zelle zunutze, das „non-homologous end joining“.

Hier werden die Enden des Doppelstrangbruches von Notfallreparaturenzymen wieder zusammen-

gefügt, wobei oft Nukleotide aus der ursprünglichen DNA-Sequenz verloren gehen oder zusätzli-

che Nukleotide eingefügt werden. Dadurch verschiebt sich in vielen Fällen die Codonabfolge nach

dem Bruch und es kommt zu Leserastermutationen. Beim Ablesen des Gens entstehen stark ver-

kürzte, nicht funktionstüchtige Varianten des Enzyms, man sagt das Gen ist ausgeknockt. Hat der

knockout eines Gens eine tödliche Wirkung auf Krebszellen, nicht aber auf gesunde Körperzellen,

ist es möglicherweise ein guter Angriffspunkt für ein Krebsmedikament. Man kann nun einen

Wirkstoff gegen das Protein entwickeln und auf sein Potenzial zur Krebsheilung testen.

CRISPR/Cas wird des Weiteren benutzt, um die Zellen des Immunsystems genetisch zu manipu-

lieren, sodass diese die Krebszellen besser erkennen und abtöten können. Krebszellen sind durch

verschiedene Mechanismen in der Lage, die körpereigene Immunabwehr zu umgehen (Immuneva-

sion). Zahlreiche Forschergruppen haben bereits gezeigt, dass man Immunzellen mittels

CRISPR/Cas so verändern kann, dass diese beispielsweise länger leben oder toxischer sind und die

Erkrankung so besser angreifen können. Hierzu wird dem Patienten oder einem Spender (z.B. bei

Leukämie) Blut entnommen und daraus die Immunzellen isoliert. Diese werden mit CRISPR/Cas9

verändert und dann in den Patienten injiziert, wo sie den Krebs eindämmen oder sogar vollständig

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beseitigen. Generell geht der Trend in der Krebsforschung aktuell Richtung personalisierter Krebs-

therapie, sprich Patienten sollen in Zukunft mit einer auf sie persönlich angepassten Therapie ge-

heilt werden.

Es ist also nur sinnvoll, CRISPR/Cas9 direkt zur Behandlung von Krankheiten einzusetzen, wenn

die Krankheit durch die Mutation eines oder sehr weniger Gene hervorgerufen wird und diese Mu-

tationen präzise korrigiert werden können.

Ein Hauptproblem bei der Verwendung von CRISPR/Cas9 in komplexeren Organismen ist der

Transport von Cas9 Enzym und sgRNA zum Zielorgan. Daniel Anderson benutzt die hydrodyna-

mische Injektion um beide Komponenten in die Leberzellen zu bringen, was nicht besonders effi-

zient ist. Durch die Injektion verdoppelt sich das Blutvolumen der Mäuse und es können zudem

Leberschäden auftreten. Dennoch werden die Symptome der Tyrosinämie in Mäusen deutlich ge-

lindert, was bedeutet, dass Daniel Andersons Herangehensweise prinzipiell funktioniert.

Mittlerweile sind Daniel Anderson und sein Team auf andere Transportmöglichkeiten umgestiegen.

Sie benutzen Lipid-Nanopartikel, um die Cas9 mRNA in die Zellen zu transportieren. Die Cas9

mRNA wird hierbei in Lipidvesikel (Hüllen aus z.B. Fettsäuren) eingeschlossen und über Endozy-

tose von den Zellen aufgenommen. Mit Adeno-assoziierten Viren bringen sie zudem die sgRNA

und die einzelsträngige DNA-Vorlage in die Zellen.

Viren sind ein beliebtes Transportmittel für das CRISPR/Cas9 System. Oftmals werden Adeno-

assoziierte Viren oder Lentiviren verwendet. Diese sind gentechnisch verändert, sodass sie sich

nicht mehr selbstständig vermehren können und keine Krankheiten mehr auslösen können. In ihr

Genom können Cas9 Gen, sgRNA und gegebenenfalls eine DNA Vorlage integriert werden. Die

Viren können anschließend Zellen infizieren und so Cas9 und sgRNA in die Zellen bringen. Ein

Nachteil der Viren ist die begrenzte Transportkapazität, sprich es kann nur ein kurzes Stück DNA

integriert und transportiert werden. Für Adeno-assoziierte Viren liegt die Obergrenze bei 4.7 Ki-

lobasen, bei Lentiviren immerhin bei 10 Kilobasen. Cas9 ist ein recht großes Protein und das zu-

gehörige Gen misst über 4 Kilobasen. Zudem ist gängige Praxis, zusätzliche Gene, die zusammen

mit Cas9 abgelesen werden und zur Überprüfung des erfolgreichen Einbringens von Cas9 dienen,

in das Virus einzufügen. Diese Reportergene verringern zusätzlich die Transportkapazität, sodass

der Platz auf dem Virus schnell knapp wird. Oft ist Effizienz von Viren als Transportmittel eher

gering. Auch ich habe in meiner Masterarbeit beobachtet, dass nach der ersten Infektion meiner

Zellen mit Cas9-Lentiviren nur ca. 2% der Zellen das Enzym tatsächlich exprimiert haben. Deshalb

wird vermehrt nach kleineren Varianten des Cas Enzyms und nach effizienteren und sichereren

Transportmöglichkeiten für das Cas9 Enzym und die sgRNAs gesucht.

3. Ich habe gelesen, dass es öfters zu off-target cuts des Cas9-Enzyms kommt. Gibt es mitt-

lerweile Fortschritte, um das Cas9-Enzym zu präzisieren?

18

Off-target Effekte sind tatsächlich ein großes Problem der CRISPR/Cas Technologie. Es wurde

gezeigt, dass fehlerhafte Basenpaarungen von sgRNA und genomischer DNA 8-12 Nukleotide hin-

ter dem protospacer adjacent motif (PAM) toleriert werden und es somit auch zu von Cas9 herbei-

geführten Doppelstrangbrüchen kommen kann, wenn die 20 Nukleotide lange sgRNA nicht perfekt

mit einem Gen übereinstimmt. Wenn man sich jetzt vor Augen ruft, wie groß das menschliche

Genom ist, kann man sich leicht vorstellen, dass solch eine kurze sgRNA an mehreren Stellen

binden kann und so gefährliche Mutationen in anderen Stellen als dem Zielgen verursachen kann.

Um Off-target Effekte zu vermeiden, werden vermehrt veränderte Versionen von Cas9 eingesetzt,

nämlich die Cas9 Nickasen. Diese Enzyme können keinen Doppelstrangbruch mehr herbeiführen.

Stattdessen schneiden sie nur einen DNA Strang. Es müssen also zwei Cas9 Nickasen gleichzeitig

von zwei verschiedenen sgRNAs zum Gen geführt werden und dort jeweils einen Einzelstrang-

bruch induzieren, um insgesamt einen Doppelstrangbruch zu erzeugen. Dadurch wird die Genau-

igkeit des Systems deutlich verbessert.

Alternativ werden auch Cas9 Enzyme verwendet, die so verändert wurden, dass sie komplett inak-

tiv sind, sogenannte „dead“ Cas9 (dCas9). An das dCas9 Enzym wird eine andere Endonuklease

gebunden, die nur dann schneidet, wenn sich eine zweite Endonuklease in unmittelbarer Nähe be-

findet. Auch hier wird also ein kooperatives System aus zwei Endonukleasen benutzt, um die Ge-

nauigkeit zu erhöhen.

Es wurde zudem gezeigt, dass das Verkürzen der sgRNA von 20 auf 17 oder 18 Nukleotide die

Zielgenauigkeit des Systems verbessert, vermutlich, weil so Fehlpaarungen von sgRNA und geno-

mischer DNA schlechter toleriert werden.

Veränderungen des Cas9 Enzyms reduzieren unglücklicherweise auch die Effizienz der Spaltung

des Ziel-Gens. Deshalb wird verstärkt nach neuen Versionen von Cas9 gesucht, die von Natur aus

präziser sind. Auch chemische Modifikationen der sgRNA könnten in Zukunft die Genauigkeit des

CRIPR/Cas Systems verbessern.

Ethische/ rechtliche Fragen:

1. Die DFG hat sich in einer Stellungnahme für „ein freiwilliges internationales Moratorium

für sämtliche Formen der künstlichen Keimbahnintervention beim Menschen, bei der Ver-

änderungen des Genoms an Nachkommen weitergegeben werden können.“ ausgesprochen.

Außerdem wird es eine Tagung des Deutschen Ethikrates bezüglich genome editing in

diesem Jahr geben.

Was denken Sie über diese Maßnahmen? Sind sie notwendig, um verantwortungsbewusst

zu forschen?

Der tschechische Forscher Martin Jinek, der zuerst das Potenzial von CRISPR/Cas für die Gen-

technik erkannte und die ersten sgRNAs entwickelte, hat kürzlich ein Interview in der Zeitschrift

19

Neon gegeben, in dem er sich auch mit der ethischen Vertretbarkeit von Veränderungen menschli-

cher Keimzellen auseinandersetzte. Er sagte darin, dass es von äußerster Wichtigkeit sei, sich mit

solchen ethischen Fragen intensiv auseinanderzusetzen. Der Mensch ist die erste und einzige Spe-

zies auf der Erde, die sein eigenes Erbgut modifizieren kann – mit unabsehbaren Folgen für alle

nachfolgenden Generationen.

Eine Gruppe aus China hat vergangenes Jahr eine Studie veröffentlicht, in der sie mittels CRISPR

die tödliche Erbkrankheit β- Thalassämie in einem menschlichen Embryo heilen wollten. Sie ka-

men zu dem Schluss, dass die Technologie noch nicht ausgereift genug ist, um sie an menschlichen

Keimzellen einzusetzen. In Europa sind die Gesetze zur Forschung an menschlichen Embryonen

zum Glück wesentlich strenger als in China und den USA. Dennoch dürfen, wie ich gelesen habe,

seit Februar 2016 englische Wissenschaftler mit CRISPR/Cas menschliche Embryonen modifizie-

ren, sofern diese 7 Tage später zerstört werden. Ich finde das ist eine sehr besorgniserregende Ent-

wicklung, da die Langzeitfolgen der dauerhaften Veränderung des menschlichen Erbguts überhaupt

nicht abschätzbar sind und off-target Mutationen dramatische Effekte haben könnten. Deshalb ist

es sehr wichtig, ethische Fragen intensiv zu diskutieren und Grenzen für solche Studien zu defi-

nieren, die nicht überschritten werden dürfen.

2. Ein weiteres Problem ist, dass man nicht nachweisen kann, ob ein Organismus genetisch

verändert wurde. So passiert es beispielsweise, dass gentechnisch veränderte Lebensmittel

verkauft werden, ohne dass sie gekennzeichnet sind. Es ist auch unklar, ob der Einsatz

von CRISPR in der Nahrungsmittelindustrie als Gentechnik zu betiteln ist, da CRISPR

ursprünglich ein natürlicher Vorgang war.

Was denken Sie über Gentechnik bei Nahrungsmitteln und die unklare Definition von gen-

technischer Veränderung in Nahrungsmittelindustrie?

Ich sehe die genetische Veränderung von Nutzpflanzen nicht sehr kritisch, da es Gentechnik in

seiner ursprünglichen Form als Kreuzung von besonders ertragsreichen oder widerstandsfähigen

Pflanzen schon seit sehr langer Zeit gibt. Die Gentechnik, und insbesondere CRISPR/Cas, ist nur

ein molekulares Werkzeug, dass es ermöglicht, diesen Kreuzungsvorganz stark zu beschleunigen

und präzisieren. Oft werden die Nutzpflanzen so verändert, dass Gene, die in anderen Pflanzenarten

schon natürlicherweise vorkommen, mittels Gentechnik eingefügt werden. Das finde ich prinzipi-

ell wenig bedenklich, auch wenn solche Pflanzen für die Verbraucher als gentechnisch verändert

gekennzeichnet werden sollte. Allerdings bin ich der Meinung, dass die Verbraucher in Deutsch-

land unbedingt besser über grüne Gentechnik aufgeklärt werden sollte. Die Gentechnik hat, beson-

ders in Deutschland, ein sehr schlechtes Image, was meiner Meinung nach absolut nicht gerecht-

fertigt ist. So wird es ohne zusätzliche Aufklärung schwer werden, gentechnisch veränderte Pro-

dukte hier zu verkaufen. Firmen, die gentechnisch veränderte Nutzpflanzen entwickeln, haben es

zurzeit sehr schwer in Deutschland, auch wenn ihre Produkte gesundheitlich unbedenklich sind.

20

Ich wünsche mir eine bessere Aufklärung der Allgemeinheit zum Thema Gentechnik in der Nah-

rungsmittelindustrie, damit Deutschland in der grünen Biotechnologie eine Zukunft hat und inter-

national wettbewerbsfähig wird.

Zukunft:

1. Wie relevant wird die CRISPR/Cas9-Technologie in Zukunft sein? Wird sie evtl. so wie

Zinkfingernukleasen oder TALEN-Nukleasen an Bedeutung verlieren?

Die CRISPR/Cas9-Technologie wird meiner Einschätzung nach auch in Zukunft von großer Be-

deutung für viele Bereiche der Biologie sein, sofern keine neue einfachere oder sicherere Techno-

logie entwickelt wird. Schon heute kann man sich CRISPR/Cas kaum noch entziehen und die meis-

ten Forschergruppen in meinem Umfeld nutzen die Technologie intensiv. Auch Zinkfingernuklea-

sen (ZFNs) und Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) sind nützliche Werk-

zeuge für die Gentechnik und sehr effektiv. Der große Nachteil beider Technologien ist es, dass

man für jedes neue Target die ZFNs oder TALENs auf Proteinebene modifizieren muss, während

man bei CRISPR/Cas nur eine neue sgRNA entwerfen muss, während das gleiche Enzym (Cas9)

verwendet werden kann. Das ist zeitlich und finanziell wesentlich weniger aufwändig. Der Grund,

warum ZFNs und TALENs sich letztendlich nicht durchsetzen konnte, war lediglich, dass nur kurze

Zeit später CRISPR/Cas entdeckt wurde. Dennoch funktionieren ZFNs und TALENs ähnlich zu-

verlässig wie CRISPR/Cas.

2. In welchen Bereichen (z.B.: Lebensmittelindustrie, Krebsbehandlung) sind die größten

Erfolge zu erwarten?

Ich denke, dass CRISPR/Cas viele Bereiche der Biologie revolutionieren wird. In der Krankheits-

forschung wird die Technologie, wie bereits weiter oben erklärt, schon auf die verschiedensten

Arten eingesetzt. Eine Anwendungsmöglichkeit, auf die ich bisher noch nicht näher eingegangen

bin, ist die Erschaffung von Mausmodellen mittels CRISPR/Cas. Mithilfe von CRISPR/Cas kann

das Mausgenom so modifiziert werden, dass menschliche Krankheitsbilder nachgeahmt werden.

Solche Krankheitsmodelle sind extrem wichtig, um diese Krankheiten auf molekularer Ebene un-

tersuchen und verstehen zu können. Des Weiteren können potenzielle Wirkstoffe im Tier in vivo

getestet werden, bevor klinische Studien im Menschen gestartet werden können. Bislang war die

Erschaffung solcher Tiermodelle sehr zeitintensiv und nur wenige der Nachkommen besaßen die

gewünschten Mutationen. CRISPR/Cas kann diesen Prozess wesentlich verkürzen, wodurch Zeit

und Geld gespart werden und weniger Mäuse geopfert werden müssen.

21

In der Industrie kann CRISPR/Cas, das ursprünglich als einzig bisher bekanntes adaptives Immun-

system der Bakterien entdeckt wurde, eingesetzt werden, um industriell eingesetzte Bakterien vor

Infektionen durch Bakteriophagen zu schützen und so die Herstellungsprozesse zu verbessern. In

gleicher Weise kann CRISPR/Cas auch eingesetzt werden, um Nutzpflanzen zu verbessern und

Erträge zu steigern. Im Zeitalter der Gentechnikgegner wird es allerdings, vor Allem in Deutsch-

land, schwierig werden, CRISPR/Cas in der Nahrungsmittelindustrie effektiv einzusetzen.

22

7.2 Abbildungen

Abb.1

23

Eigene Darstellung (in Anlehnung an Pflanzenforschung.de a)

24

8. Literaturverzeichnis

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28

9. Selbstständigkeitserklärung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Facharbeit selbstständig angefertigt

habe und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus Schriften oder Medien entnommen

sind, sind als solche kenntlich gemacht.

Aachen, den 10.04.2016